Souris
Validation in vivo de nouvelles lignées tumorales murines génétiquement modifiées dans des souris syngéniques
- Recherche appliquée
- Cancers
3 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dont la croissance est suivie deux à trois fois par semaine, la mise à mort intervenant quand la tumeur dépasse 1,2 à 1,5 cm ou s'ulcère, seuils présentés comme des points limites. Le porteur valide de nouvelles lignées de cellules tumorales destinées à être commercialisées auprès de laboratoires travaillant sur des thérapies anticancéreuses. Il affirme que l'interaction entre l'hôte et les cellules tumorales ne peut être reproduite que chez un animal vivant.
Objectifs
Des lignées cellulaires tumorales murines génétiquement modifiées exprimant des cibles humaines sont développées pour valider des thérapies anti-cancer dans des souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non. Ces lignées cellulaires permettent de tester les composés spécifiques des cibles humaines sans passer par un composé de remplacement spécifique de la forme murine de la cible. Cet outil doit être validé pour ses propriétés tumorales in vivo, le meilleur clone sera choisi et la fonctionnalité de la cible humaine in vivo doit être démontrée. A la création d‘une lignée cellulaire murine tumorale génétiquement modifiée, différents clones sont obtenus. Ils sont testés in vitro pour leur capacité de croissance, l’expression et la fonctionnalité de la cible humaine d’intérêt. Après ces tests, 2 clones sont sélectionnés pour être testés in vivo. La validation in vivo comporte est en 2 étapes : Une 1ère étape de croissance tumorale en souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non, définit le pourcentage de prise tumorale et la cinétique de pousse. Les 2 clones sont comparées à un ou des clones non modifiés de la même lignée. L’expression de la cible d’intérêt dans la tumeur est testée. Sur ces critères, l’un des clones est sélectionné. L’injection de la lignée tumorale ne dure pas plus d’1 minute et le développement tumoral est suivi pendant 2 à 3 semaines La tumeur est mesurée par des techniques ni invasives ni douloureuses et dure au maximum 5 minutes. La 2ème étape valide la fonctionnalité in vivo de la cible humaine exprimée par le clone choisi. C’est une expérience d’inhibition de la croissance tumorale en souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non. Une thérapie spécifique de la cible humaine exprimée par la lignée cellulaire est utilisée pour inhiber la pousse tumorale (étape finale de validation). Cette étape comprend l’injection des cellules tumorales et la mesure et des tumeurs dans les mêmes conditions que la 1ère étape. S’ajoute l’administration du traitement pour valider la fonctionnalité de la cible thérapeutique. Son administration prend moins d’1 minute et il est administré au maximum 3 fois/semaine. La règle des 3R sera respectée en limitant le nombre d’animaux au strict nécessaire pour faire les analyses et assurer la pertinence des résultats. Les procédures ne doivent pas entrainer de souffrance aigue et longue. En cas de souffrance, des analgésiques seront administrés. L’environnement des animaux sera enrichi.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de valider in vivo dans des souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non des lignées cellulaires murines tumorales génétiquement modifiées pour exprimer des cibles humaines. Ces lignées auront pour application l’évaluation et la sélection de thérapies humaines contre le cancer en évitant de passer par un composé de remplacement spécifique de la forme murine de la cible d’intérêt. Elles seront suite à ce projet (cette validation) commercialisées pour être disponibles pour les laboratoires développant ce type de composés.
Procédures
La nature des procédures inclues dans le projet nécessite l’implantation de cellules tumorales (durée maximum de l’injection 1 minut)e, la pousse de tumeur (durée de 2 à 3 semaines) et leur suivi ( durée maximum de 5 minutes / souris / mesure à raison de 2 à 3 mesures par semaine). Le diamètre tumoral moyen défini comme point limite est de 1,2 cm pour une pousse tumorale sans traitement et 1,5 cm pour une étude thérapeutique. Par ailleurs, toute apparition d’ulcération sur les tumeurs est aussi un critère de surveillance et une ulcération de grade 4 de la tumeur est défini comme un point limite. Dans les 2 cas (diamètre moyen supérieur à 1,2 ou 1,5cm selon les cas ou ulcération grade 4), les animaux seront immédiatement mis à mort. Si des administrations répétées de composés sont réalisées, elles peuvent, selon la voie choisie et si le site d’administration est conservé, conduire à une souffrance passagère. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. L’administration du composé dure environ 1 minute et peut-être réalisé jusqu’à 3 fois / semaine. Dans la mesure du possible, le site d’administration sera changé entre 2 administrations et/ou l’application en local d’une crème anesthésiante sera réalisée afin de limiter la souffrance animale.
Impact sur les animaux
La nature des procédures inclues dans le projet nécessite l’implantation de cellules tumorales (durée maximum de l’injection 1 minut)e, la pousse de tumeur (durée de 2 à 3 semaines) et leur suivi ( durée maximum de 5 minutes / souris / mesure à raison de 2 à 3 mesures par semaine). Le diamètre tumoral moyen défini comme point limite est de 1,2 cm pour une pousse tumorale sans traitement et 1,5 cm pour une étude thérapeutique. Par ailleurs, toute apparition d’ulcération sur les tumeurs est aussi un critère de surveillance et une ulcération de grade 4 de la tumeur est défini comme un point limite. Dans les 2 cas (diamètre moyen supérieur à 1,2 ou 1,5cm selon les cas ou ulcération grade 4), les animaux seront immédiatement mis à mort. Si des administrations répétées de composés sont réalisées, elles peuvent, selon la voie choisie et si le site d’administration est conservé, conduire à une souffrance passagère. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. L’administration du composé dure environ 1 minute et peut-être réalisé jusqu’à 3 fois / semaine. Dans la mesure du possible, le site d’administration sera changé entre 2 administrations et/ou l’application en local d’une crème anesthésiante sera réalisée afin de limiter la souffrance animale. Une dégradation de l’état général de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement, une perte de poids peut se produire. Des critères de points limites seront appliqués afin de limiter la souffrance animale. Les modèles de tumeurs liquides sont connus comme plus aggressifs et la survillance des animaux pour ces modèles sera renforcée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de permettre des analyses sur les différents organes et complétés les observations faites sur le sang au cours de la procédure.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour ce projet car le projet est de valider les propriétés tumorales des lignées murines génétiquement modifiées in vivo pour leur utilisation ultérieure en modèles murins. L’interaction complexe hôte/cellules tumorales ne peut être mimée que dans le contexte d’un animal vivant complet pour valider les lignées tumorales développées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par lot est calculé pour obtenir des résultats qui soient statistiquement interprétables et en tenant compte de la variabilité potentielle de la taille des tumeurs au sein d’un même groupe afin d’obtenir des résultats exploitables et ne nécessitant pas la répétition de l’expérience utilisant des animaux additionnels. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité nécessaire mais sans excès de sérum afin de faire les mesures voulues. Cela doit permettre de prélever plusieurs fois le même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, nous limiterons les groupes contrôle, sans impacter pour autant l’interprétation de l’expérience. En fin d’étude, à la mise à mort des animaux, plusieurs organes pourront être prélevés pour faire diverses explorations et ainsi mutualiser l’utilisation des animaux pour explorer plusieurs questions et paramètres au sein de la même expérience et ainsi limiter le nombre global d’animaux utilisés pour répondre à la question scientifique posée.
Raffinement
Dans le cadre des études décrites ici, les animaux seront surveillés quotidiennement. Une crème anesthésiante pourra être appliquée au site d’injection en cas d’injection répétées sans changement de site et dans la mesure du possible, les injections répétées seront faites en changeant réguDans le cadre des études décrites ici, les animaux seront surveillés quotidiennement. Une crème anesthésiante pourra être appliquée au site d’injection en cas d’injection répétées sans changement de site et dans la mesure du possible, les injections répétées seront faites en changeant régulièrement de site d’injection pour limiter la douleur. Cette même crème pourra être appliquée pour les prélèvements sanguins répétés. Là encore le site de prélèvement voire la voie pourront être modifiés dans la mesure du possible et en cas d’apparition de lésion cutanée et de dommages au niveau de la veine prélevée. En cas de lésion, des soins seront réalisés (désinfectant et cicatrisant cutané) et l’évolution sera surveillée avec application des points limites le cas échéant. Les volumes et diamètres tumoraux seront mesurés 2 à 3 fois par semaine et les souris présentant une tumeur proche du diamètre moyen limite de 1,2 ou 1,5 cm selon le contexte de l’étude et/ou un début d’ulcération de la tumeur seront plus particulièrement surveillées au quotidien. Un analgésique pourra être administré à toute souris présentant un signe de souffrance (changement de comportement, de l’aspect de la fourrure, …etc…).
Choix des espèces
Le rongeur par sa taille et sa manipulation aisée, est un modèle de choix pour l’humanisation de certaines cibles thérapeutiques. Aujourd’hui les conditions zootechniques et le niveau d’ingénierie génétique sont tels que la construction à façon de lignées présentant l’humanisation d’une ou plusieurs cibles thérapeutiques est possible. En correspondance, des lignées cellulaires murines tumorales humanisées pour les cibles d’intérêt notamment en immuno-oncologie sont créées. Ces cellules doivent être validées dans des modèles de souris afin de permettre l’étude préclinique de nouvelles thérapies. Les souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non seront utilisées dès l’âge de 6 semaines et jusqu’à un âge d’environ 16 semaines, et au maximum 20 semaines. En effet, il faut que les souris inclues dans ces études soient suffisamment matures notamment d’un point de vue du système immunitaire pour que les résultats observés soient pertinents.
Caractérisation d’un nouveau gène candidat PLCB1 impliqué dans les myopathies congénitales à spirales cylindriques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Privées d'un gène, elles développent une myopathie avec une espérance de vie d'environ trois semaines et des organes anormaux, et subissent jusqu'à 28 tests de force, d'endurance et de locomotion avant une mesure musculaire sous anesthésie suivie de la mise à mort. Les animaux ayant servi à l'élevage de la lignée sont eux aussi tués une fois l'effectif atteint. Le porteur cherche à valider le rôle de ce gène dans une myopathie humaine et affirme qu'une étude sur cellules ne suffirait pas à évaluer l'atteinte de l'organisme entier.
Objectifs
Après avoir identifié une mutation candidate dans un gène engendrant une protéine impliquée dans la production de lipides chez une famille avec deux enfants atteints de myopathie à spirales cylindriques, nous souhaitons valider l'impact de cette mutation dans la maladie avec un modèle souris afin de valider un nouveau gène de myopathie et le diagnostic de cette famille. Cette mutation est présente sur les 2 copies présentes du gène chez les enfants et correspond à une perte de fonction, c'est-à-dire que nous avons démontré qu'elle entrainait une diminution de la lecture du gène dans les cellules entrainant donc une diminution de la production de protéine. Ce projet vise donc à caractériser un modèle souris ne possédant pas cette protéine dans le but de valider le rôle de la perte de fonction du gène dans la maladie grâce à des études du tonus et de la force musculaires et de la forme, de l'aspect et du fonctionnement moléculaire du muscle chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront tout d'abord de valider l'implication de ce gène dans les myopathies congénitales, et d'identifier une nouvelle cause génétique possible. De plus, ils permettront de mieux comprendre les protéines impliquées dans ces pathologies, dans le muscle sain et dans le développement de la maladie. Valider un nouveau gène dans les myopathies congénitales permet tout d'abord d'avoir de nouveaux diagnostics pour les familles de patients et aussi d'avoir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le développement de traitements de la maladie.
Procédures
Les souris sont marquées afin d'être identifiées et un suivi journalier sera assuré. Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques entre 3 semaines et 8 mois d'âge maximum : - La mesure de la force du corps : les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 3 min maximum et elle sera mesurée 1 fois par mois. - La mesure de la force des pattes : le test sera effectué pendant 30 sec maximum et sera réalisé une fois par mois. - L'évaluation de la capacité de l'animal à se mouvoir : les animaux sont placés dans une enceinte contenant des cages individualisées pour le suivi de l'activité locomotrice pendant 24h. Ce test se fera 1 fois par mois. - La mesure de l'endurance et de la résistance à la fatigue : le test dure 5 jours et les souris marcheront sur un cylindre rotatif pendant 5 à 15 min par jour. Ce test ne sera réalisé qu'une seule fois durant l'étude. - La mesure des propriétés contractiles musculaires in situ : il s'agit d'un test qui ne sera réalisée qu'une seule fois par souris et la durée totale, de l'anethésie jusqu'à la fin des mesures, sera de maximum 1h. Au maximum, 28 tests de phénotypages seront effectués sur les souris vivant jusqu'à 8 mois.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, un seul gène est muté générant chez la souris un phénotype sévère et dommageable entrainant une faible espérance de vie, de 3 semaines d'après la littérature existante. A ce jour, seul le modèle ne portant qu'une seule copie fonctionnelle du gène a été observé , les animaux ne portant pas le gène fonctionnel mourant pour la plupart au moment du sevrage, c'est-à-dire à trois semaines de vie. Les souris observées ont été décrites comme présentant une morphologie anormale des ovaires, un foie plus grand, une rate plus grande, des noeuds lympahtiques plus grands, une morphologie anormale des reins et des yeux. Les animaux ne présentent pas d'infertilité contrairement aux animaux ne portant pas le gène fonctionnel. Les caractéristiques musculaires de ce modèle n'ont encore jamais été évaluées, à notre connaissance. Les différents tests phénotypiques permettant de suivre et mesurer la force, la résistance à l'exercice et la capacité à se mouvoir de la souris pourront induire du stress pendant une durée pouvant aller de 1 min à 15 min maximum et pourront induire de la fatigue à la fin des tests.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour tous les tests jusqu'au test de la mesure des propriétés contractiles des muscles. A l'issu de ce test qui est réalisé sous anesthésie, les animaux sont mis à mort sous anesthésie et les organes seront prélevés pour des études moléculaires des muscles. Cela concerne l'ensemble des animaux d'expérience, soit 60. Pour ce qui est des animaux permettant le maintien de la lignée durant l'étude, une fois que le nombre souhaité d'animaux d'expérience sera atteint, les animaux ayant permis leur naissance seront mis à mort afin d'éviter la multiplication d'animaux alors que l'étude sera terminée.
Remplacement
Pour caractériser la myopathie à spirales cylindriques et identifier l'impact de la mutation du gène d'intérêt, nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l'Homme, il nous permet de valider la pathogénécité de cette mutation. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation de l'atteinte musculaire seraient impossible à évaluer.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les études réalisées. De plus, l'étude sera longitudinale afin de travailler sur les mêmes animaux sans en multiplier leur nombre. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d'accouplements avec deux femelles pour un mâle. L'observation des souris permettra d'optimiser au mieux leur nombre. Nous prévoyons cependant 185 animaux pour cette étude. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisée avec un test maximum par jour.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d'améliorer le bien-être de l'animal. Si des difficutés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l'animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupes de 2 à 4 par cage et la qualité de l'air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d'accouplements seront constitutées de deux femelles par cage facilitant l'élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance, il seront donc surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaines. Si une perte d'état rapide est observée chez les animaux, l'étude sera alors stoppée. De même, en cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l'étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d'évaluer et de comprendre l'impact de la perte de fonction de la protéine d'intérêt dans la myopathie en spirales cylindriques, une pathologie humaine, nous avons besoin d'étudier son effet sur les fibres musculaires, de préférence chez les mammifères. La protéine que nous étudions est très bien concervée chez la souris avec 97% d'homologie. Ceci suggère une fonction très similaire chez l'humain et la souris. De plus, la structure des muscles est similaire chez la souris et l'humain. Les myopathies causant des défauts structuraux du muscle, la souris nous permettra de reproduire le plus fidèlement possible les défauts observés chez l'humain et ainsi de modéliser au plus près la maladie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherche dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier l'impact de la mutation sur le phénotype d'un individu entier ainsi que sur la structure de la fibre musculaire. Le modèle utilisé étant déjà décrit comme ayant une faible espérance de vie, les études phénotypiques seront faites à 3 semaines de vie. Les souris seront néanmoins obervées et suivies attentivement de la naissance jusqu'à la mise à mort.
Production d’embryons chez la souris pour validation règlementaire de matériels par test d’embryotoxicité
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent deux injections intrapéritonéales sous contention pour déclencher une superovulation, puis sont tuées pour prélever leurs embryons. Ces embryons servent à un test réglementaire d'embryotoxicité vérifiant l'innocuité de matériels et de produits en contact avec les gamètes humains lors de la procréation médicalement assistée. Le porteur présente ce test comme réalisé en partenariat avec un industriel et affirme qu'aucune méthode validée par la loi ne peut s'y substituer.
Objectifs
Le test d'embryo toxicité chez la souris (Mouse Embryo Assay) est utilisé pour attester de l'absence de toxicité et vérifier la fonctionnalité des milieux, du matériel de laboratoire, des produits jetables ou de tout dispositif pouvant entrer en contact avec des gamètes ou des embryons pendant les processus de la procréation médicalement assistée.
Bénéfices attendus
Ce projet établi en partenariat avec un industriel permettra de délivrer sur le marché des lots de matériels, de produits jetables ou dispositifs qui entrent en contact avec les gamètes ou embryons humains pendant les process procréation médicalement assistée.
Procédures
Les animaux femelles seront soumis à des contentions pour pratiquer les injections IP. Deux injections séparées de 48h seront faites (0,1 ml chacune, aiguille 26G, en IP) par du personnel compétent.
Impact sur les animaux
Le processus de superovulation ne génère pas de douleur. Les nuisances résultent de la contention des animaux pour procéder aux 2 injections intrapéritonéales (0,1ml) qui seront effectuées par du personnel rompu à ce geste.
Devenir
La procédure aboutit au prélèvement d'embryons donc à la mise à mort des animaux.
Remplacement
Il n'existe pas en l'état actuel de test validé par la loi qui permette une substitution au MEA. Le test nécessite des embryons que la connaissance du modèle murin et de la superovulation permettent de se procurer facilement tout en utilisant un minimum d'animaux.
Réduction
La loi exige 2 lots chacun de 20 embryons (1 essai, 1 contrôle) et n'impose pas une lignée murine de référence pour ce test. Aussi nous avons chois la lignée B6CBAF1/J qui présente un taux naturel de fécondité élevé qu'il est possible d'augmenter par superovulation (obtention de plus de 10 embryons par femelle). Pour chaque test nous utiliserons 4 femelles qui seront mises en accouplement avec 2 mâles.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant 1 semaine avant de débuter le protocole de superovulation. Les animaux seront hébergés par couple avec eau et aliments ad libitum. La température, l'humidité et la luminosité sont contrôlées et du matériel de nidification sera systématiquement introduit dans les cages. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être.
Choix des espèces
Le test sur embryon de souris est requis par la loi. La souris B6CBAF1/J est une souris qui répond très bien au protocole de superovulation réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux seront commandés au stade pré-pubère (soit 4-6 samaines). Après une semaine d'acclimatation, les animaux femelle seront à un âge optimal pour répondre à un traitement de superovulation. Les mâles seront à cette même période des animaux pubères produisant des spermatozoïdes fécondants.
Rôle de la plasticité synaptique homéostatique dans les pertes de synapses et de mémoire dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
À trois mois, avant que leurs pertes de synapses ne soient observables, 108 souris transgéniques présentées comme reproduisant la maladie d'Alzheimer reçoivent soit une injection intraveineuse unique sous cinq minutes de contention, soit du chlorure de lithium dans leur nourriture pendant trois mois, avec un biberon d'eau salée pour compenser les déséquilibres ioniques. Le test de mémoire spatiale implique, selon les mots du porteur, de "forcer les souris à nager dans une piscine" pour trouver une plateforme immergée, six sessions par jour pendant cinq jours puis une le sixième jour, soit 31 sessions limitées à 60 secondes dans une eau à 20-22 °C, avec un risque de fatigue et d'hypothermie. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré. Les souris sont ensuite toutes tuées pour prélever leur cerveau et analyser l'effet des traitements.
Objectifs
Au cours de la maladie d’Alzheimer (MA), des pertes de synapses se produisent dans des régions particulières du cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Cependant, le mécanisme des pertes synaptiques reste mal connu. Des études ont montré une augmentation de la taille des synapses restantes. Comme cette augmentation est proportionnelle à la quantité de synapses perdues, il a été proposé qu’il s’agisse d’un mécanisme compensatoire, appelé plasticité synaptique homéostatique (PSH). Cependant, la relation entre perte de synapses et élargissement des synapses restantes pourrait se jouer dans la direction opposée. En effet on sait qu’un élargissement de synapses peut entrainer une diminution du nombre de synapses adjacentes. Notre objectif est de déterminer si les pertes de synapses dans la MA pourraient être dues à une PSH excessive. Pour cela nous allons déterminer si des traitements réduisant cette PSH permettent de prévenir les pertes de synapses et de mémoire dans un modèle murin de MA.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de déterminer si une modulation de la plasticité synaptique homéostasique est une cible thérapeutique envisageable contre la maladie d'Alzheimer (MA). Le chlorure de lithium est utilisé en santé humaine contre les épisodes maniaques. Nos travaux pourraient montrer son intérêt pour lutter contre les altérations synaptiques dans la MA.
Procédures
Les souris recevront soit à une injection intraveineuse unique nécessitant une contention durant au total 5 minutes, soit un ajout de chlorure de lithium dans leur nourriture durant 3 mois. Le test de mémoire spatiale implique de les faire nager dans une piscine, où elles doivent trouver une plateforme immergée. Les sessions (6/jour pendant 5 jours puis une le sixième jour) seront limitées à 60 secondes. Les souris seront ensuite euthanasiées en vue des prélèvements.
Impact sur les animaux
La réalisation d’une injection intraveineuse nécessite une contention qui entraîne un stress de la souris. Celle-ci est cependant très transitoire (5 minutes). L'ajout de chlorure de lithium dans la nourriture entraine des deséquilibres ioniques qui seront contrôlés par l'ajout d'un biberon de chlorure de sodium à 0.9% en plus du biberon d'eau. Le test de mémoire implique de forcer les souris à nager dans une piscine, où elles doivent trouver une plateforme immergée. Ces tests peuvent entraîner fatigue et hypothermie chez la souris. Les sessions (6/jour pendant 5 jours puis une le sixième jour) sont donc limitées à 60 secondes, et la température de l'eau est maintenue à 20-22°C.
Devenir
A la fin des procédures les souris seront euthanasiées afin de prélever leur cerveau pour analyser l'effet des traitements.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet ces modèles animaux sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de synapses adultes se produisant dans la maladie d’Alzheimer.
Réduction
Nous utiliserons 108 souris. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux étant définie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les méthodes sont choisies pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse : (i) les souris ont à disposition, comme élément d’enrichissement, des composants de nidification ; (ii) une surveillance quotidienne des paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie) et des animaux est effectuée, afin de détecter un état de stress ou de douleur nécessitant un traitement, ou la mise en place d’une procédure d’euthanasie. En cas de blessure, de pathologie, d’hypoactivité et de mouvement anormal, l’avis du vétérinaire sera demandé, et s'il le recommande les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris transgéniques modèle murin de maladie d'Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que les souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du projet. Les traitements seront commencés au 3ème mois, avant que les pertes de synapses ne soient observées chez les souris, et leurs effets seront analysés à 6 mois, quand ces pertes sont significatives.
Optimisation d’une stratégie de thérapie génique pour le traitement de la glycogénose de type III (GSDIII)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Atteintes d'une glycogénose, elles reçoivent une injection d'un virus-médicament dans la veine de la queue sous contention et un à deux prélèvements de sang, avant la mise à mort pour analyser la distribution du virus dans les organes. Le porteur cherche à optimiser cette thérapie génique pour corriger à la fois le foie, le cœur et les muscles, une étape présentée comme indispensable avant tout traitement de patients. Il affirme que le parcours du virus dans l'organisme n'est pas reproductible sur cellules et qu'il faut recourir aux animaux.
Objectifs
La glycogénose de type III (GSDIII) est une maladie génétique atteignant le foie, le cœur et les muscles, liée à une anomalie génétique dans le gène de l’enzyme débranchante du glycogène. Cette enzyme permet aux cellules d’utiliser le glycogène, qui joue le rôle de réserve de sucre pour les cellules. Dans la GSDIII, l’absence de cette enzyme conduit à une accumulation de glycogène dans les organes, conduisant à une atteinte du foie et des muscles. Il n’existe pas de traitement permettant de guérir cette maladie. Pour traiter cette pathologie, nous allons utiliser un virus médicament afin d’apporter le gène manquant dans les cellules du foie, du cœur et des muscles de souris ayant une GSDIII. Avant qu’une telle stratégie ne puisse être utilisée pour traiter des patients, il est indispensable de pouvoir optimiser ce virus médicament afin de guérir en même temps le foie, le cœur et les muscles.
Bénéfices attendus
Le traitement que nous souhaitons développer utilise un virus médicament afin d’apporter le gène manquant dans les organes cibles (foie, cœur et muscle). Afin de guérir la totalité de la maladie (GSDIII), il est nécessaire de corriger à la fois ces trois organes. Nous avons déjà montré la possibilité de guérir l’atteinte cardiaque et musculaire chez la souris ayant une GSDIII en utilisant cette stratégie, mais sans correction du foie. Il est donc indispensable de pouvoir optimiser le virus afin de traiter les trois aspects de la GSDIII, et ainsi pouvoir traiter des patients atteints de cette maladie.
Procédures
Procédure 1 : Injection du virus médicament au niveau de la veine de la queue, sur animaux vigiles au sein d’une boite à contention : 1 fois, ce geste dure 1 minute Prélèvement de sang au terme de la procédure (mandibulaire, animal vigile) : 1 fois, ce geste dure moins d’une minute Procédure 2 : Injection du virus médicament au niveau de la veine de la queue, sur animaux vigiles au sein d’une boite à contention : 1 fois, ce geste dure 1 minute Prélèvement de sang précoce et au terme de la procédure (mandibulaire, animal vigile) : 2 fois, ce geste dure moins d’une minute
Impact sur les animaux
Nous utilisons des virus médicaments non dangereux et à des doses non toxiques, de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Les nuisances seront donc uniquement liées aux gestes techniques qui seront pratiqués. Ces gestes comprennent l’injection du virus ainsi que, au plus, deux prélèvements de sang. Ces actes sont réalisés à l’aide d’aiguilles appropriées, par du personnel formé et auront donc des répercussions mineures pour l’animal (piqûre).
Devenir
Afin de pouvoir évaluer la distribution des virus médicaments dans le cœur, les muscles, le foie et d’autres organes (Rate, cerveau etc…), ces tissus doivent être prélevés et analysés. Les animaux seront donc euthanasiés à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Afin de sélectionner le virus médicament le plus performant, l’idéal serait de pouvoir le tester sur des cellules. Néanmoins, une fois dans l’organisme, le virus doit échapper au système immunitaire, traverser la paroi des vaisseaux sanguins et pénétrer dans les organes cibles (le foie, le cœur et les muscles) afin d’apporter le gène manquant. Malheureusement, ces étapes ne sont pas encore réalisables dans des cellules. Il est donc indispensable de devoir recourir à des animaux pour se rapprocher le plus possible de ce qu’il se passera chez l’Homme.
Réduction
Afin d’utiliser un minimum d’animaux, nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat fiable nous permettant de répondre aux problématiques posées. De plus, des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus de tous les animaux afin de s'assurer que le maximum d'informations possible est recueilli sur chaque animal.
Raffinement
D’une façon générale, toutes les mesures possibles permettant d’améliorer les conditions de vie des animaux seront prises. Les nouvelles mesures de raffinement feront l’objet d'une revue de la littérature, et les améliorations pertinentes seront appliquées au fur et à mesure qu'elles seront disponibles. Dès leur arrivée en zone d’expérimentation, les souris seront manipulées afin d’être familiarisées aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux, dans le but de réduire leur stress. Les souris utilisées lors de ce projet ne présentent pas de signes de douleurs évidents. Les virus utilisés sont non dangereux et les doses utilisées ne sont pas toxiques, et de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Néanmoins, les souris seront quand même surveillées au cours des protocoles avec une inspection quotidienne. Si des signes de souffrance venaient à apparaitre, la souris sera pesée et surveillée de manière assidue. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
Les souris atteintes de la glycogénose de type III présentent les différentes caractéristiques de la pathologie observée chez l’Homme. C’est un modèle validé par la communauté scientifique, prédictif de l’efficacité du traitement qui sera utilisé chez l’Homme. Par conséquent, nous allons optimiser notre traitement dans cette espèce animale.
Suivi scanner de l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons sur modèle souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
32 souris sans poils vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie, elles reçoivent une injection de microbulles et un traitement aux ultrasons pour ouvrir la barrière protégeant le cerveau, puis passent plusieurs scanners avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que des tirs trop puissants peuvent provoquer une hémorragie cérébrale, l'animal étant alors tué juste après l'observation de son réveil. Il présente la méthode comme un moyen rapide et peu coûteux d'imager cette ouverture, tout en affirmant qu'aucune alternative non animale n'existe.
Objectifs
Les ultrasons sont largement utilisés dans le domaine biomédical pour des applications de diagnostic mais aussi pour leurs effets thérapeutiques depuis les années 1990. La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le cerveau contre les molécules néfastes présentes dans le sang, mais limite également la pénétration de médicaments, notamment des chimiothérapies. Récemment, il a été démontré la possibilité d’ouvrir la BHE par ultrasons, ce qui ouvre la voie à de nombreuses applications dans le traitement d’atteintes cérébrales : cancer du cerveau, accident vasculaire cérébral, maladies dégénératives… la compréhension de l’ouverture de la BHE est complexe et pour l’observer, deux solutions sont utilisées : le suivi par IRM ou l’utilisation d’un grand nombre d’animaux mis à mort à différents intervalles. Cette dernière solution n’est pas envisageable en première intention pour des raisons éthiques, quant à l’IRM, son coût prohibitif réduit les possibilités. De récents résultats suggèrent le scanner comme modalité permettant d’imager précisément l’état d’ouverture de la BHE. L’objectif de ce projet est d’implémenter le scanner comme modalité de choix pour mesurer quantitativement la perméabilité de la BHE. Ainsi, des molécules mimant des traitements contre le cancer seront administrées avec ou sans traitement par des ultrasons. Des mesures grâce au scanner seront réalisées à différents temps pour évaluer si les molécules passent la BHE avec le traitement à ultrasons.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à courts termes de ce projet sont la mise à disposition d’une méthode permettant d’évaluer l’ouverture et la perméabilité de la BHE de façon rapide et relativement peu coûteuse. Cette méthode sera publiée et donc accessible à tous les chercheurs. A long terme, cette technique va accélérer la recherche sur la BHE et en réduire les coûts (financiers et en termes de bien-être animal par la réduction des effectifs utilisés).
Procédures
Les animaux vont être anesthésiés, recevoir une injection intraveineuse de produit de microbulles puis un traitement aux ultrasons de 2 minutes. Elles recevront ensuite une injection intraveineuse et de produit de contraste puis passeront deux scanners à 10 minutes d’intervalles. Elles seront ensuite réveillées, puis réanesthésiées et repassées au scanner toutes les 15 à 30 min 4 fois puis mise à mort.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables observés occasionnellement sont des dommages neurologiques dus à une hémorrhagie cérébrale lors de tirs ultrasonores à niveaux trop puissants. Ces effets sont de courte durée puisque l’animal est euthanasié dans la foulée, dès que le comportement au réveil a été observé. Un court examen neurologique consistant à observer le déplacement de l’animal à son réveil permettra d’évaluer si l’animal a plutôt un comportement normal, un déficit moteur mineur, ou est prostré.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau et de confirmer par histologie l’ouverture de la BHE.
Remplacement
La BHE est un système biologique extrêmement complexe, dont les mécanismes précis présentent toujours des zones d’ombre, et aucune alternative non animale n’est disponible à l’heure actuelle. La mise au point des réglages du scanner sera faite à base de données déjà effectuées au cours d’autres projets pour éviter d’utiliser des animaux pour le faire.
Réduction
Le nombre de conditions testées a été réduit au minimum nécessaire pour répondre à l’objectif scientifique. Le but de cette expérience est justement d’obtenir des données plus complètes que la méthode de référence (IRM) pour réduire le coût des expériences. Le passage des molécules à travers la BHE seront comparées entre groupe traités avec les ultrasons et groupes non traités par des tests statistiques. 8 animaux par groupe permettent d’assurer de pouvoir obtenir des données exploitables.
Raffinement
Une des raisons du choix du modèle souris est la faible épaisseur de crâne chez les souris jeunes, qui est donc transparent aux ultrasons. La bonne transmission des ultrasons est également conditionnée par l’absence de poils. Les souris « nude » (sans poils) sont choisie afin d’éviter la procédure de rasage et ainsi réduire le nombre de manipulation de l’animal. Les souris nude, immunodéprimées (système immunitaire affaibli), seront hébergées en portoir ventilé, cage filtrée.
Choix des espèces
Le modèle souris a été utilisé dans des études qui ont mené à des essais réussis chez l’humain. Il s’agit donc d’un modèle fiable. Les souris seront utilisées lorsqu’elles auront un poids d’environ 20 grammes (maximum 25g, soit environ 7 semaines), avant que le crâne ne devienne un obstacle trop important à la propagation des ultrasons.
Etude d’effets physiologiques de l’administration d’une solution probiotique lactofermentée chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Maintenues à la main, des souris reçoivent à la pipette, de façon répétée, un jus de fruit probiotique lactofermenté, après dix jours d'habituation à la même manœuvre avec de l'eau. 100 souris, jeunes adultes de huit semaines et souris âgées de 48 semaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec trois séries de prélèvements de sang, de selles et d'urine et 40 minutes de tests d'anxiété : boîte blanche, labyrinthe en croix dont deux bras donnent sur le vide, boîte à zone d'ombre et zone fortement éclairée. Le porteur écrit que l'administration manuelle "peut entrainer un stress chronique car répété", et promet dans le même résumé des soins "afin d'assurer un bien-être optimal tout au long de l'étude". À la fin, toutes sont tuées pour recueillir leur matériel biologique, dont du tissu intestinal et cérébral, des prélèvements qu'il dit impossibles chez l'humain.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de l’administration d’un jus de fruit probiotique lactofermenté sur la physiologie du microbiote et de l’intestin. Le projet a recours à un modèle de souris afin de permettre l’étude de la physiologie de l'intestin et du comportement. La physiologie des animaux sera étudiée à partir d’analyse des selles, des urines, du sang, et de prélèvements intestinaux, ainsi que sur un plan comportemental avec une batterie de tests pour évaluer leur état d’anxiété. Un maximum de 100 souris sera nécessaire pour une étude scientifique pertinente. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’améliorer la connaissance sur l’impact de produits probiotiques alimentaires vivants sur la physiologie de la muqueuse intestinale. Les bénéfices seront à destination des humains, pour valider l’effet sur la santé d’une administration de probiotiques vivants. Les bénéfices à long terme consistent à développer des aliments probiotiques vivants à effets dirigés et connus dans un but de personnalisation.
Procédures
Des prélèvements de sang, de selles et d'urine seront réalisées au moment des manipulations des animaux (3 fois pendant la durée du protocole et espacés de 14 jours). Les tests comportementaux consistent a l'étude de l'anxiété d'exploration. L'ensemble des tests dure 40 minutes. L'animal dans une boite blanche pour étudier son déplacement, dans un labyrinthe en forme de croix, avec deux bras donnant sur le vide et deux bras protégés, et enfin dans une boite présentant une zone d'ombre et une zone fortement éclairée.
Impact sur les animaux
L’administration manuelle de la solution peut entrainer un stress chronique car répété. Cependant, la qualité sucrée de la solution peut aussi induire un conditionnement de l’animal, de plus une période d'habituation de 10 jours d'administration d'eau à la pipette sera réalisée avant le début de l'étude. Les tests comportementaux peuvent induire un stress temporaire le temps de la passation.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir recueillir le matériel biologique pour les études au laboratoire.
Remplacement
Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes pour étudier le retentissement à un niveau physiologique de l'administration de probiotiques (actuellement recours à des organoïdes permet seulement l'étude au niveau cellulaire voir tissulaire). L'étude nécessite des investigations sur des prélèvements non possible chez l’homme (tissu intestinal total, tissu cérébral). L'utilisation d'animaux permet de garantir une qualité scientifique optimale, en contrôlant a maxima les influences du milieu extérieur, ce qui est impossible chez l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux destiné au projet a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux pour le protocole a été réduit au minimum mais reste élevé du fait de la variabilité importante et inhérente aux analyses comportementales. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons. Du fait du faible nombre de données les analyses seront menées par des tests non paramétriques.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue lors de l’exposition à la solution sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter la souffrance lors de l’administration de la solution, celle-ci n’est pas faite par gavage mais par délivrance orale à la pipette lors d’une manœuvre de contention manuelle. Pour limiter le stress engendré par la contention manuelle et l'administratin à la pipette, une période d'habituation de 10 jours d'administration de 20µL d'eau à la pipette lors d'une manoeuvre de contention manuelle sera réalisée, de plus l'habituation permettra de prévenir un biasi d'administration du volume par salivation ou régurgitation. Les cages d’hébergements seront enrichies (nid et bâton à ronger). Dans le cas où les souris mâles viendraient à se battre, il est prévu de les isoler en cages individuelles.
Choix des espèces
La connaissance de la physiologie intestinale et immunologique de la souris est avancée. Elle répond aux compétences de l’animalerie où l’expérimentation va être menée. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. 1 lot d'animaux sera acheté à l’âge de 6 semaines, et sera utilisé dans le projet à l’âge de 8 semaines, ce lot correspond à l'âge adulte jeune, et permet d'étudier le retentissement physiologique sur un organisme pleinement fonctionnel. 1 lot d'animaux « âgés » de 48 semaines sera utilisé pour l’étude afin d’étudier l’impact des produits sur la physiologie des sujets âgés.
Impact de la déplétion induite par le clodronate des macrophages alvéolaires sur le développement des dommages pulmonaires après irradiation en conditions stéréotaxiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 30 reçoivent une irradiation pulmonaire de 80 Gy sous anesthésie, 30 des instillations nasales répétées de clodronate pour supprimer certains macrophages, et l'ensemble passe des séances d'imagerie sous anesthésie avant les prélèvements. Le porteur étudie le rôle des macrophages dans les lésions pulmonaires après radiothérapie, en vue d'améliorer à terme la prise en charge des cancers du poumon inopérables. Il affirme que la réponse du tissu pulmonaire aux rayonnements ne peut être appréhendée qu'in vivo et présente l'irradiation choisie comme sans conséquence clinique notable d'après son expérience.
Objectifs
L’option thérapeutique de choix pour le traitement des tumeurs pulmonaires de stade précoce est la chirurgie. Cependant, environ 20 à 30% des patients sont à haut risque chirurgical, et le traitement en radiothérapie classique n’a qu’une efficacité limitée sur la tumeur. La radiothérapie en conditions stéréotaxiques consiste à irradier de très petits volumes avec une précision très importante. Cette option thérapeutique a depuis 10 ans grandement amélioré la prise en charge des patients inopérables atteints de cancer des poumons de stade précoce. La réduction du volume d’irradiation autorise l’utilisation de protocoles d’irradiation plus agressifs avec des doses plus fortes et assure alors un meilleur contrôle tumoral. Cependant, et malgré la précision, certains patients développent des effets secondaires pulmonaires. Irradier de très petits volumes chez la souris n’est possible que depuis quelques années grâce à la commercialisation d’outils capables de générer des mini-faisceaux. Depuis plusieurs années au laboratoire, nous travaillons sur un modèle d’irradiation stéréotaxique pulmonaire chez la souris. Nous avons acquis un recul important sur les effets de ces techniques. En particulier, nous avons mis en évidence une augmentation massive du nombre de macrophages au niveau du site et poursuivons les projets sur le rôle de ces nombreux macrophages dans le développement des lésions pulmonaires. Les projets en cours semblent démontrer qu’une population de macrophages présents dans les alvéoles pulmonaires pourrait être impliquée dans le développement des lésions pulmonaires après irradiation stéréotaxique. Le présent projet vise à compléter et confirmer ces premiers résultats en supprimant ces macrophages grâce à l’instillation de liposomes contenant du clodronate, et en suivant le développement des lésions pulmonaires en l’absence de ces macrophages.
Bénéfices attendus
Dans la bibliographie un intérêt majeur est porté aux macrophages dans de nombreux contextes pathologiques en particulier en ce qui concerne les dommages pulmonaires. Une meilleure compréhension du rôle des macrophages dans la réponse aux rayonnements ionisants, et en particulier des avancées dans la compréhension de leurs actions en réponse à l’irradiation de petits volumes pulmonaires pourrait permettre d’améliorer l’index thérapeutique de la radiothérapie thoracique, en offrant des perspectives préventives ou thérapeutiques sur les lésions radiques pulmonaires
Procédures
- Irradiation 80 Gy d’environ 45 minutes, sous anesthésie générale : 30 animaux concernés - Instillation intranasale de liposomes de clodronate, sous anesthésie légère, 6 instillations par souris espacé de 3 à 4 jours : 30 animaux concernés - Imagerie pulmonaire sous anesthésie générale,2 séances par animal : 60 animaux concernés
Impact sur les animaux
Pour les irradiations et les imageries, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements et pour limiter la douleur potentielle immédiate de ces actes (administration et irradiation localisée), il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration, ou encore un écoulement nasal. D’après le recul acquis au laboratoire, l’irradiation focale pulmonaire à la dose choisie ne génère pas par la suite de conséquences cliniques notables jusqu’à 6 mois post-irradiation. L’administration de clodronate est un modèle très décrit dans la bibliographie et ne génère pas de conséquence clinique notable chez les animaux.
Devenir
Tous les prélèvements seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet.
Remplacement
La réponse globale du tissu pulmonaire aux rayonnements ionisants ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un système biologique intégré
Réduction
Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer des tests statistiques paramétriques, il est donc nécessaire d’avoir un minimum de 8 animaux pour chaque groupe pour obtenir des résultats exploitables en fonction des analyses effectuées. Pour les analyses d’expression des gènes, le nombre d’animaux sera réduit à 3 à 4 par groupe, nombre suffisant pour obtenir des résultats robustes.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, les imageries et les instillations, hébergement en groupe avec enrichissement).
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est également l’espèce de référence utilisée au sein de notre laboratoire. Les précédents projets d’irradiation pulmonaire du laboratoire ont été menés sur souris. Les animaux seront utilisés entre 10 et 15 semaines, correspondant au stade adulte. Le stade adulte est choisi car la thématique de recherche concerne les séquelles des radiothérapies chez les adultes, les effets secondaires des tumeurs pédiatriques étant un domaine de recherche particulier.
Evaluation de l’efficacité de nouveaux anti-inflammatoires dérivés du naproxène dans le modèle murin d’arthrose induit par injection de monoiodoacétate (modèle MIA)
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent dans l'articulation une injection de monoiodoacétate qui provoque une arthrose douloureuse, avec douleurs spontanées, allodynie et boiterie, puis un traitement quotidien pendant 28 jours et des tests de douleur. Le porteur évalue cinq dérivés d'un anti-inflammatoire, le naproxène, censés cibler le cartilage en réduisant les effets indésirables, une évaluation sur modèle chirurgical étant envisagée si un composé se révèle prometteur. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas le microenvironnement inflammatoire et que le passage in vivo est inévitable.
Objectifs
Avec 10 millions de personnes atteintes en France, l’arthrose est une pathologie qui représente un réel enjeu socio-économique. En l’absence de traitement curatif, les Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens (AINS) sont largement prescrits, pour enrayer le phénomène inflammatoire responsable du cercle vicieux entrainant la destruction du cartilage, et ce malgré leurs effets secondaires importants (cardiovasculaires et gastrointestinaux). Ce projet d’expérimentation animale, s’inscrit dans un projet plus large dont l’objectif est de concevoir de nouveaux AINS ciblant spécifiquement le site arthrosique afin de diminuer les effets indésirables associés couramment à l’utilisation des AINS. Ainsi, 30 dérivés du naproxène, un anti-inflammatoire non stéroïdien, ont déjà été synthétisés et caractérisés par les chimistes de notre unité. Ces dérivés exploitent une stratégie développée au laboratoire et qui permet de cibler le cartilage en diminuant les effets indésirables. L’ensemble de ces composés a déjà été évalué in vitro et les composés les plus intéressants ont été évalués in vivo dans un modèle inflammatoire d’arthrite. Les résultats obtenus nous ont permis de sélectionner 5 composés plus intéressant que la molécule parent, le naproxène. Nous souhaitons désormais valider la pertinence de notre stratégie et évluer ces 5 dérivés du naproxène dans un modèle d’arthrose. Le modèle d’arthrose selectionné pour cette étude est le modèle induit par injection en intraarticulaire de monoiodoacétate (MIA) chez la souris. Ce modèle, facile à mettre en place et très inflammatoire, est très exploité pour évaluer des molécules ou des extraits végétaux ayant un impact sur la douleur arthrosique et l’inflammation.
Bénéfices attendus
Les résultats non permettrons d’évaluer l’intérêt de notre stratégie pour contrôler localement l’inflammation dans l’arthrose tout en diminuant les effets indésirables. Ces résultats apporteront également quelques informations précieuses qui guideront la pharmacomodulation des prochaines molécules. De plus, si l’un des composés se révèle être très prometteur, nous envisagerons alors son évaluation sur un modèle chirurgical
Procédures
Injection en intraarticulaire pour la mise en place du modèle (sous anesthésie, 5 minutes). Traitement par voie sous-cutanée sur animaux vigiles : 1 fois par jour pendant 28 jours, durée quelques secondes. Test d'allodynie ou de locomotion : 1 à 2 fois par semaine
Impact sur les animaux
Le modèle MIA est un modèle qui induit une douleur arthrosique. L’injection de MIA en intra-articulaire entraine une augmentation de la sensibilité nerveuse avec douleur spontanées, allodynies, hyperalgies de façon dose dépendantes. Les effets indésirables sont donc de la douleur ainsi que des problèmes de locomotion (boiterie, difficultés d’appuis, …). Une légère perte de poids peut être observée les premiers jours post induction. Concernant, les injections quotidiennes des traitements à la dose définie en sous-cutanée, ils ne génèrent ni douleur, ni effets indésirables.
Devenir
Du fait de l'injection en IA du MIA qui induit une arthrose inflammatoire, les animaux ne peuvent pas être réutilisés
Remplacement
La culture cellulaire ne représente pas la complexité du micro-environnement et notamment de sa composante inflammatoire. Les études in vitro et in tubo nous permettent de réaliser une première sélection des molécules mais doivent être complétées par des études in vivo, d’autant plus lorsqu’il s’agit de vectorisation, comme c’est le cas ici. Le passage sur un modèle in vivo est donc inévitable pour juger de façon optimale notre stratégie thérapeutique.
Réduction
Dans un but de réduction du nombre d’animaux, nous avons choisi d’effectuer dans un premier temps la procédure 1 qui consiste à définir la dose optimale de MIA injectée en intra-articulaire et valider le modèle avant de passer à la procédure 2. Lors de la procédure 1, nous évaluerons progressivement les doses en commençant par la plus faible de 30 mg/ml et nous nous arrêterons lorsque l’effet attendu souhaité (arthrose inflammatoire) sera atteinte. Le nombre d’animaux pour cette procédure est donc surexprimé et il est possible que les doses les plus importantes ne soient pas nécessaires. Dans ce cas, nous réduirons le nombre d’animaux. De plus, nous avons constitué des groupes de 10 souris ce qui correspond au nombre de souris minimal nécessaire à la réalisation des analyses de caractérisation souhaitées avec une bonne significativité (5 souris pour de l’histologie et 5 souris pour des western-blot). En ce qui concerne la procédure 2, ici aussi les groupes sont de 10 souris. Ce nombre correspond au nombre minimal de souris qui nous permettra d’obtenir les données suffisantes attendues et de façon significatif pour avoir une réponse définitive sur l’efficacité du traitement sans avoir besoin de recommencer le protocole.
Raffinement
Le modèle MIA étant un modèle de douleur, une surveillance accrue sera mise en place notamment par le suivi du score clinique. Une attention particulière sera effectuée quant à la locomotion et un suivi du poids tous les deux jours sera réalisé. En effet, un problème de locomotion pourrait gêner les déplacements et l’accès à la nourriture. Dans ce cas là des dispositions seront prises telles que la nourriture directement dans la cage.
Choix des espèces
Le modèle d’inflammation MIA que nous avons choisi dans ce projet est très couramment utilisés et caractérisés chez le rongeur (rats ou souris). Nous avons choisi ici le modèle souris. Les souris seront utilisées à 8 semaines, un stade pour lequel leur articulation est suffisamment développée pour l’injection en intra-articulaire.
Effet de candicats-médicaments dans un modèle murin de la maladie de Parkinson, basé sur l’injection stéréotaxique d’alpha-synucléine oligomérique et de l’inhibition de GBA1
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
516 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique du cerveau, des traitements chroniques quotidiens par gavage ou injection, des tests moteurs, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie avant le prélèvement des tissus. Le porteur évalue le potentiel neuroprotecteur de plusieurs candidats-médicaments dans un modèle de la maladie de Parkinson, un éventuel passage en clinique restant conditionné à des résultats positifs. La rubrique remplacement tient en une phrase, le porteur affirmant que la complexité de la maladie ne peut être atteinte qu'avec un modèle animal.
Objectifs
L’objectif de cette étude est d'évaluer le potentiel neuroprotecteur de plusieurs candidats médicaments dans un modèle murin de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats-médicaments pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le développement des candidats médicaments pourra être poursuivi, , et pourront à terme entrer dans des études cliniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à de la chirurgie stéréotaxique, sous anesthésie générale (isoflurane, 4 % induction puis 2%). Les souris récupèrent bien de la chirurgie. Les procédures incluent des traitements chroniques (quotidiens ou 3 fois par semaine) par gavage, injections sous-cutanées ou injections intra-péritonéales. Les fonctions motrices seront évaluées avec des tests de coordination motrice. Ces tests seront rapides (maximum 5 minutes par jour), sur deux jours. Les animaux subiront une perfusion intra-cardiaque sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Le traitement quotidien des souris par gavage peut induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Les tests de motricités peuvent également induire une nuisance chez les souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (ex. histologie).
Remplacement
Les processus pathophysiologiques de la maladie de Parkinson impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.
Réduction
Le nombre de souris (n par expérience) a été optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. À cette fin, des études antérieures disponibles dans la littérature scientifique suggèrent un nombre minimal de 12 souris par groupe, afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs en termes de (i) détérioration de fonctions motrices, et (ii) % de neurones morts (neurodégénérescence); deux caractéristiques essentielles et déterminantes dans la pathophysiologie de la maladie de Parkinson. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuel effets significatifs de candidats médicaments dans modèle animal de la maladie de Parkinson.
Raffinement
Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement, (ii) des approches d'analgésies avant, pendant et après l'opération, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (température corporelle) pendant et après l'opération (pour assurer un rétablissement rapide). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (5 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libidum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique (buprenorphine, 0.1mg/kg, 100µL) sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort..
Choix des espèces
La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la maladie de Parkinson. Le modèle reproduit notamment plusieurs caractéristiques de la ma La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiées aux études impliquant des souris.
Caractérisation de la composante inflammatoire de 4 modèles in vivo de chondrosarcome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 56
164 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules de chondrosarcome, tumeur du cartilage, dont le développement est suivi au pied à coulisse avant la mise à mort pour analyses. Le porteur compare quatre modèles de cette tumeur afin de choisir le plus pertinent pour tester ensuite un anti-inflammatoire vectorisé, le projet restant une étape préparatoire sans évaluation thérapeutique. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas le microenvironnement tumoral et que le passage in vivo est inévitable pour sa stratégie de vectorisation.
Objectifs
Le chondrosarcome, ou tumeur maligne du cartilage, représente 30 % des tumeurs malignes osseuses. Caractérisé par un microenvironnement peu favorable, il est radio- et chimio-résistant. Actuellement, le seul traitement efficace est la chirurgie pouvant entraîner de lourdes incapacités pour le patient. De plus, le taux de survie à 5 ans est inférieur à 50 % en cas de récidive pour les formes les plus agressives, rendant ce cancer redoutable. Dans le cadre d’un nouveau projet de recherche, notre unité s’intéresse à la composante inflammatoire du chondrosarcome dans le but de proposer une nouvelle prise en charge thérapeutique. La stratégie envisagée consiste à acheminer spécifiquement au niveau du cartilage tumoral anti-inflammatoire, le célécoxib. En effet, bien que peu étudié dans le chondrosarcome, la littérature démontre largement l’efficacité du célécoxib in vitro et in vivo dans les tumeurs tout en soulignant les effets indésirables qui limitent son utilisation. La stratégie que nous développons, pour acheminer spécifiquement le célécoxib, consiste à exploiter deux caractéristiques du microenvironnement du chondrosarcome : (i) sa richesse en protéoglycanes et (ii) la surexpression de certaines métalloprotéinases. Après des résultats in vitro encourageants, nous souhaitons évaluer les molécules développées in vivo. Dans le but de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous souhaitons dans un premier temps définir le modèle in vivo de chondrosarcome le plus adapté pour l’évaluation in vivo de nos dérivés. Ainsi, l’objectif de cette demande de projet sera de comparer 4 modèles de chondrosarcome classiquement utilisés et maitrisés au laboratoire, à différent stade du développement tumoral et d'évaluer l'expression des cibles exploitées pour notre stratégie. Les résultats obtenus nous permettrons de valider le modèle qui sera le plus pertinent pour envisager l’évaluation in vivo par la suite.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de caractériser la composante inflammatoire de 4 modèles in vivo de chondrosarcome et de valider le modèle le plus pertinent pour une évaluation des dérivés développés au sein de notre unité.
Procédures
Innoculation de cellules tumorales en sous cutanée et sous anesthésie (5min) (1 par souris) Suivi du volume tumoral au pied à coulisse et sous anesthésie (5min) (1 à 2 fois par semaine) Procédure chirurgicale (10 min) (1 par rat) Mise à mort (tous les animaux)
Impact sur les animaux
Cette demande de projet n'entraine que très peu de nuisance envers les animaux. L'induction du modèle impliquant une anesthésie peut engendrer un stress. A un stade plus avancé, le développement tumoral pourrait entrainer une légère gène au déplacement.
Devenir
Procédure 1 et 2 : Mise à mort pour analyses mécanistiques
Remplacement
La culture cellulaire ne représente pas la complexité du micro-environnement tumoral et notamment de sa composante inflammatoire. Une évaluation in vitro nous permettra de réaliser un premier screening des molécules développées dans notre unité mais nous ne permettra pas de valider notre stratégie thérapeutique, cette dernière étant basée sur une stratégie de vectorisation. Le passage sur un modèle in vivo est donc inévitable pour juger de façon optimale la stratégie de vectorisation que nous développons.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, chacune de nos études mécanistiques ont été réfléchi afin d’avoir la quantité de matériel tumoral adéquat.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliqués.
Choix des espèces
Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale comme en cancérologie. Trois des modèles d’étude sont des chondrosarcomes humains qui de ce fait doivent être implantés chez des souris immunodéprimées. Le dernier modèle d’étude est un chondrosarcome de rat pouvant être implanté directement chez le rat. Les souris seront commandées à 4 semaines afin de permettre le développement tumoral qui est relativement long.* Les rats seront commandés à 150g afin de permettre le développement tumoral qui est relativement long (3 semaines chez le rat).
Rôle des canaux TRP dans l’hypersensibilité viscérale générée par la consommation d’un régime riche en fer héminique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 24 modéré. Nourries trois semaines à un régime enrichi en fer héminique, 72 subissent une chirurgie d'une à deux heures pour poser un dispositif de mesure puis une pression douloureuse répétée dans le côlon, les 24 autres passant 24 heures en cage à métabolisme. Le porteur teste l'hypothèse que le fer des viandes rouges et charcuteries active des récepteurs de la douleur intestinale, en vue de futures pistes thérapeutiques contre le syndrome de l'intestin irritable. Il affirme qu'aucune approche in vitro n'évalue la sensibilité viscérale et que seule une approche in vivo intégrée le permet.
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable est une pathologie intestinale chronique très répandue (10-15% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées, et une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Bien que d’origine multifactorielle, des facteurs nutritionnels contribuent fortement à l’aggravation des symptômes. Les viandes rouges et charcuteries ne sont actuellement pas connues comme des aliments associés à l’exacerbation des symptômes de douleurs viscérales associées à ce syndrome mais une étude suggère que le fer héminique de ces produits carnés, de par le stress oxydatif induit dans le côlon, engendre une sensibilité viscérale accrue en réponse à un stimulus douloureux. Une étude complémentaire est nécessaire pour comprendre comment ce stress oxydatif induit cette hypersensibilité. Sur la base de la littérature scientifique et des métabolites identifiés dans le contenu du côlon de souris nourries avec un régime supplémentés en fer héminique, nous émettons l’hypothèse que les métabolites associés à ce stress oxydatif activent au niveau de l’épithélium intestinal certains récepteurs de la famille des TRP, et plus particulièrement 2 d’entre eux, TRPA1 et TRPV1, pour lesquels des inhibiteurs pharmacologiques sont connus et déjà utilisés chez la souris pour inhiber les voies de signalisation suspectées.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mettre en lumière un nouveau facteur alimentaire à prendre en compte dans le régime des patients atteints du syndrome de l’intestin irritable, à savoir la consommation de viandes rouges et charcuteries. Ces données contribueront par ailleurs à préciser les bénéfices/risques et les recommandations nutritionnelles en fer au sein de la population générale. Enfin et surtout, elles devront permettre, par l’approche mécanistique envisagée, de comprendre comment cet inconfort digestif survient. Il s’agit donc d’un prérequis pour envisager à l’avenir de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
24 souris nourries avec un régime supplémenté ou non en fer héminique pendant 3 semaines seront placées chacune 24 heures en cage à métabolisme. 72 souris nourries avec un régime supplémenté ou non en fer héminique pendant 3 semaines seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h-2h par intervention pour placer un dispositif de mesure des contractions abdominales. Le nombre de contractions sera compté en réponse à l’application d’une pression intracolique pendant 10 secondes à 4 reprises par palier. Un inhibiteur pharmacologique ou son solvant sera administré par injection intrapéritonéale 2 heures avant la mesure pour inactiver les récepteurs TRPA1 et TRPV1.
Impact sur les animaux
Le stress modéré induit par la stabulation sur grille en cage à métabolisme pourrait modifier la mesure des contractions abdominales, c’est pourquoi ces 24 souris seront uniquement destinées à la collecte des échantillons. Pour minimiser ce stress, une buchette de bois à ronger est ajoutée dans la cage à métabolisme. Pour les souris dont l’amplitude des contractions abdominales sera mesurée, la douleur sera palliée pharmacologiquement pendant l’intervention chirurgicale et en post-opératoire tout en veillant au maintien de la température corporelle par un hébergement dédié en armoire ventilée chauffée, et à la réhydratation des souris. L'injection intra-péritonéale est un geste, rapide et indolore qui sera conduit après convalescence sur les souris vigiles. La pression intracolique appliquée à 4 reprises est associée à un inconfort, un stress et une mobilité réduite de la souris. L’arrêt entre chaque palier permet de retrouver immédiatement un enregistrement de base, signifiant l’arrêt instantané du stimulus douloureux. Si, comme attendu, le/les inhibiteurs pharmacologiques suppriment les effets induits par le fer héminique du régime des souris, alors le ressenti sera similaire à celui des souris sous régime conventionnel. Un personnel compétent ayant l’expérience de ces procédures fera un suivi quotidien pour leur apporter tous les soins nécessaires et maximiser leur bien-être. Il leur assurera en parallèle des manipulations les moins stressantes possibles avec des conditions d'hébergement les plus optimales.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.
Remplacement
Les modèles cellulaires ont montré que le stress oxydatif généré dans la lumière colique lors de la consommation d’un régime riche en produit carné, pouvaient induire une cytotoxicité différentielle entre des cellules normales et précancéreuses. Cependant, aucune étude in vitro ou ex-vivo à ce stade du projet nous permet d’évaluer les conséquences d’un régime sur la physiologie digestive et plus particulièrement sur la sensibilité viscérale. Seule une approche in vivo intégrée nous permettra de prendre en compte la complexité des répercussions de l'exposition à ces contaminants d’origine alimentaire.
Réduction
Les études précédentes associées à ce projet nous ont permis d’améliorer la procédure en termes de technicité (expérience de l’expérimentateur) et de bien-être (de l’animal). L’amélioration de la prise en charge de la phase opératoire (technicité) et post-opératoire (augmentation de la température de l’hébergement sur 3 jours en armoire à 26°C) a permis de diminuer le nombre d’animaux requis pour aboutir à des résultats significatifs et fiables : de 15 souris initialement par groupe, 12 souris par groupe sont aujourd’hui considérées comme nécessaires pour compenser une variabilité interindividuelle résiduelle. Étant donné l’expertise technique acquise, la reproductibilité des mécanismes induits pour ce projet jusqu’ici, nous estimons qu’une répétition de cette étude ne sera pas nécessaire, ce qui permet de réduire également le nombre de souris requis.
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être de l’animal (conditions d’hébergement, libre accès à l’eau et à la nourriture, contrôle de l’environnement, respect du cycle jour nuit, manipulations douces). Des buchettes en peuplier disposées sur la litière leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Un abri en aluminium leur permettra de s’y loger. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Toutes les mesures seront prises pour réduire la douleur (anesthésie, prise en charge de la douleur post opératoire, tapis chauffant, hébergement transitoire en armoire chauffée en période post-opératoire, réhydratation...). En parallèle, une combinaison d'analyses statistiques intégratives permettra d'exploiter l'ensemble des données générées et explorer plus finement les intéractions entre l'hôte et son microbiote.
Choix des espèces
La souris est un modèle rongeur largement utilisé pour la mesure de la sensibilité viscérale. Nous avons choisi la lignée C3H/HeN car les travaux précédents de l’équipe avec cette lignée permettent d’avoir maintenant une bonne base de connaissance de sa barrière intestinale, son microbiote, son système immunitaire et de sa réponse à la sensibilité viscérale. Pour l’analyse de la sensibilité viscérale, les animaux seront âgés de 9-10 semaines car il est indispensable d'avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.