Souris

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées jusqu'à 20 mois, elles subissent des tests comportementaux dont le résumé ne précise pas la nature, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever cerveau et cellules. Le porteur étudie le rôle des oméga-3 et d'un récepteur sur l'humeur et la plasticité synaptique, et renvoie les applications thérapeutiques et nutritionnelles chez l'humain au long terme. Il affirme que le recours à des animaux vivants reste une "nécessité expérimentale majeure" et qu'aucune approche sur cellules, modèle informatique ou chez l'humain ne permet ces mesures.

Objectifs

D’après l’OMS, les troubles de l’humeur (dépression, troubles bipolaires) sont la première cause d’incapacité dans le monde et concernent 350 millions de personnes chaque année. Outre l’impact sur la qualité de vie des patients et de leurs familles, les troubles de l’humeur représentent des coûts de santé considérables. De plus, ~30% des patients demeurent résistants aux traitements pharmacologiques et autres approches thérapeutiques existants à ce jour. Ainsi, une alternative consisterait à développer des stratégies préventives, et notamment nutritionnelles, pour limiter ou retarder l’apparition des troubles de l’humeur. Au laboratoire, le rôle des oméga-3 sur le fonctionnement cérébral et la santé mentale est étudié depuis presque 10 ans. Le laboratoire a notamment démontré qu’une carence en oméga-3 exacerbe les comportements de type anxieux et dépressif chez l’animal, tandis qu’une supplémentation en oméga-3 les diminue. Ces études précliniques sont en accord avec les données chez l’homme, des essais cliniques montrant qu’une supplémentation en oméga-3 améliorerait certains symptômes dépressifs. Ainsi, une supplémentation en oméga-3 peut constituer une alternative intéressante dans la prévention des troubles de l’humeur, mais les mécanismes qui sous-tendent les effets positifs des oméga-3 dans les troubles de l’humeur restent encore très mal connus. Le laboratoire a récemment ouvert une nouvelle hypothèse, en démontrant que les apports en oméga-3 avaient un impact direct sur la plasticité synaptique ainsi que l'arborisation dendritique. La plasticité synaptique regroupe les phénomènes qui confèrent au cerveau sa capacité de s’adapter à l’environnement, par des modifications de la connectivité entre les neurones, au niveau des synapses. Les différentes formes de plasticités synaptiques sont indispensables aux mécanismes d’apprentissage et d’évolution. De plus en plus d’études suggèrent que les troubles de l’humeur sont associés à des dysfonctionnements dans les processus de plasticité synaptique et ces dysfonctionnements pourraient être à l’origine des symptômes neuropsychiatriques des troubles de l’humeur. Les oméga-3 sont des modulateurs importants des fonctions synaptiques, car, faisant partie des éléments structurels des membranes plasmiques, ils modulent la dynamique membranaire ainsi que la fonctionnalité et le trafic des protéines transmembranaires présentes à la synapse.

Bénéfices attendus

L’objectif de notre projet est désormais d’aller plus loin dans la compréhension des mécanismes neurobiologiques par lesquels les oméga-3 contenus dans l’alimentation permettent de protéger les animaux. L’objectif à long terme de ce projet est de transférer les connaissances acquises chez le rongeur à l’homme pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et nutritionnelles. Ces données pré-cliniques nous permettrons de comprendre un peu plus en quoi la nutrition influence les fonctions cognitives et la physiologie de la transmission synaptique. De plus, des applications thérapeutiques peuvent être envisagées, en particulier pour déterminer si une thérapie nutritionnelle peut atténuer les pathologies liées au stress chronique, comme par exemple les troubles de stress post-traumatiques. De façon similaire, des stratégies préventives, liées à une nutrition adaptée et équilibrée en lipides, pourraient être envisagées afin de limiter, réduire ou même d'endiguer l'apparition de troubles dépressifs et/ou anxieux.

Procédures

Les animaux subiront des tests comportementaux qui ne durent que 5 à 10 minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées , mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les piqures d'analgésique et anesthésique avant la perfusion intracardiaque durent quelques secondes et la contention peut stresser les animaux.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les piqures d'analgésique et anesthésique avant la perfusion intracardiaque durent quelques secondes et la contention peut stresser les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et rôle des acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la prévention des altérations cognitives et émotionnelles suite à un stress chronique. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées sur des cultures cellulaires ou dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de l’humeur reste une nécessité expérimentale majeure.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. Statistiquement, des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, 15 souris C57Bl6/j sont nécessaire par groupe.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui peut s’avérer nécessaire pour la poursuite à long terme de notre projet. Les expériences de comportement se feront sur des animaux adultes (6mois) et âgés (20 mois).

90 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée pour d'autres formations, le reste tué. Ils servent de support à une formation réglementaire pour concepteurs de projets, avec préhension, contention, injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins, puis un travail pratique de mise à mort et d'autopsie sous anesthésie. Le porteur affirme que la formation pratique est "indispensable" à l'acquisition de bases solides et qu'une partie des travaux pratiques "doit" passer par des animaux non-humains, malgré le recours annoncé à des démonstrations filmées et des outils de substitution. Il privilégie des individus de réforme et enchaîne les enseignements pour réutiliser les mêmes animaux d'un exercice à l'autre.

Objectifs

L'utilisation d'animaux à des fins scientifiques en France est réglementée par le décret 2013-118 et cinq arrêtés datés du 1er février 2013, publiés le 7 février 2013, en application de la directive 2010/63/UE. Ainsi, des règles strictes, basées sur le principe des 3Rs, encadrent le fonctionnement de la recherche dans le domaine. De ce fait, les personnes utilisant des animaux se doivent d'être formées et qualifiées pour travailler dans ce domaine. Différents niveaux règlementaires permettent donc de définir les taches que les personnels seront à-même de réaliser ainsi que les niveaux de responsabilité par rapport au projet donné. De ce fait, afin d'assurer une formation complète à la direction d'études utilisant des animaux, l'université de Caen a mis en place un diplôme universitaire pour la formation reglemenatire obligatoire et spécifique à la conception de projets utilisant des animaux à des fins scientifiques, approbée par le CNEA. La formation est réservée aux personnes disposant d'une formation initiale bac +5 minimum (études scientifiques, médicales, pharmaceutiques, vétérinaires) ou bac +2 avec 5 ans d'expérience. Une capacité maximale de 15-20 stagiaires est prévue. La formation se déroulera sur deux semaines en 71 heures : 58 heures de cours théoriques et 13 heures d'aspects pratiques en une séance par an. Cette formation a pour but de former les étudiants à la conception de projets scientifiques nécessitant d'animaux à des fins de recherche tant sur le plan théorique (réglementation, méthodes alternatives, anatomie comparée, recours aux procédures expérimentales faiblement invasives) comme théorique et pratique (anesthésie, douleur et analgésie, stress et enrichissement du milieu, ...) Cette formation privilégie autant que possible le recours aux méthodes alternative par l'utilisation de démonstrations filmées, organisations en groupes de travail et/ou réutilisation quand il est possible. L'enchainement des enseignements a été réfléchi afin de pouvoir effectuer des formations sucessives sur les mêmes animaux. L'utilisation d'outils pédagogiques de substitution est prévue de façon qu'un minimum d'animaux est utilisé par séance et se limite à 9 rats et 9 souris par an pour tous les stagiaires. Les stagiaires auront une base solide théorique et pratique pour la conception de projets utilisants des rongeurs à des fins scientifiques.

Bénéfices attendus

Les stagiaires qui auront réussi l'examen écrit auront un diplome universitaire de l'université de Caen "Formation à Expérimentation animale appliquée à la Recherche Biomédicale : conception des projets utilisant des rongeurs à des fins scientifiques" Formation spéciale destinée aux personnes assurant la responsabilité scientifique directe d’expérimentations conformément à la directive 2010/63/UE relative à l’expérimentation animale.

Procédures

5 rats et 5 souris suivront des procédures non invasives pendant 4 heures maximum (gestes zootechniques pour la préhension et contention; administration de produits; prélèvements sanguins). Ces gestes sans anesthésie étant réalisés par des personnes non habituées, nous ne considérons pas la possibilité de réutiliser ces animaux pour le reste de la formation, privilégiant une récupération du stress subi. 4 autres rats et 4 autres souris suivront également le TP de physiologie pendant 2h : techniques de surveillance de la physiologie normale sous anesthésie générale. Ces 4 rats suivront le TP d'anesthésie et analgésie avec les méthodologies exérimentales pendant 3h maximum. Ils suivront sans réveil le TP de mise à mort et autopsie. Les 4 souris suivront également le TP de mise à mort et autopsie. Un rat et une souris sont prévus en plus pour anticiper au cas ou un problème subviendrai rapidement après anesthésie par exemple pour ne pas handicaper un groupe de stagiaires si ce cas apparaissait. Si non utilisés, ces animaux pourront être réutilisés dans des formations du laboratoire en comportement.

Impact sur les animaux

Nuisances du TP 1 : Les animaux seront manipulés et contenus par du personnel non formé : du stress est à prévoir. Il y aura également des douleurs légères et de courte durée (injections de liquide physiologique) dues aux injections intrapéritonéales et aux prélèvements sanguins. Nuisances du TP 2 : Les animaux seront anesthésiés et ne souffriront pas de gestes invasifs, nous ne nous attendons pas à des nuisances. Nuisances du TP 3 : les animaux seront seront anesthésiés et auront une couverture analgésique nous ne nous attendons pas à des nuisances.

Devenir

La première procédure est légère mais réalisée par du personnel non habitué. Nous préférons laisser ces animaux récupérer et les inclure dans des apprentissages de tests comportementaux au lieu de les réutiliser cinq jours après pour une autre procédure (5 rats et 5 souris par année). La deuxième procédure inclut des démonstrations pour l'observation de la physiologie cardiaque et respiratoire sous anesthésie générale. Les animaux sont prévus d'être reutilisés le lendemain pour une démonstration procédure (4 rats et 4 souris par année). La troixième démobstration consiste au TP sur l'anesthésie et analgésie avec l'utilisation de méthodologies expérimentales fréquentes en recherche préclinique chez le rongeur (4 rats par année). A la suite de cette procédure et sans réveil entre deux, le TP de mise à mort et autopsie utilisera les 4 rats et les 4 souris de la procédure 2 qui seront anesthésiés profondément comme décrit dans la procédure avant mise à mort.

Remplacement

La formation pratique est indispensable à l'acquisition de bases solides pour les concepteurs de projets utilisant des rongeurs à des fins scientifiques. Bien que le maximum d'approches seront réalisées sur des systèmes de substitution et l'utilisation d'outils pédagogiques qui ne nécessitent pas l'utilisation d'animaux, une partie des travaux pratiques doit être pratiquée sur des animaux. De ce fait les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie par du personnel formé et expérimenté et sous la supervision dans chaque atelier d'enseignants experts dans les domaines abordés. Une partie des démonstrations est réalisés sur des techniques non invasives (comportement, techniques de préhension) et ne nécessitent donc pas de méthodes d'anesthésie.

Réduction

Les stagiares sont regroupés en groupes de travail afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire. Les thématiques de formation sont enchainées permettant la réutilisation des animaux d'un TP à l'autre. Néanmoins, un minimum de 9 rats et 9 souris par an est prévu pour la totalité des enseignements pour 20 stagiaires.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés par anesthésie gazeuse à l’isoflurane. L’induction est effectuée à 5% isoflurane dans un mélange gazeux 30%O2 / 70%N2O pendant 3minutes. Ils sont ensuite maintenus sous anesthésie par inhalation d’isoflurane (2% dans 30%O2 / 70%N2O) en respiration spontanée ou en ventilation mécanique (TP correspondant). Une vaporisation de Lidocaïne sera faite au larynx pour soulager tout incorfort. Une couverture analgésique est assurée par injection sous cutanée de buprénorphine (0.1mg/kg, 200μL) avant la manipulation et pose de cathéter (TP correspondant). La thermorégulation (37.5 ± 0.5°C) est assurée par une couverture chauffante (groupes anesthésiés) rétrocontrôlées par une sonde de température rectale.

Choix des espèces

La formation est destinée specifiquement aux concepteurs de projets nécessitant l'utisation de rongeurs. Cette formation est donc basée sur l'utilisation de rats et des souris. Nous privilégions de préférence l'utilisation d'animaux de réforme. Les animaux seront des adultes, aucune incidence d'age ou de sexe. Nous privilégions si possible l'utilisation d'animaux de réforme.

2 550 souris et lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les animaux servant aux tests étant tués et les autres pouvant être réutilisés pour d'autres projets. Les lapins subissent un jeûne alimentaire d'environ quatorze heures et un jeûne hydrique de trois heures, deux injections sous la peau et six prélèvements de sang à l'oreille, les souris deux injections et un prélèvement à la joue. L'objet n'est pas la recherche mais le contrôle libératoire de lots commerciaux d'insuline exigé par les pharmacopées américaine et chinoise. Le porteur indique qu'un test sans animaux existe mais n'est accepté par ces pharmacopées que pour certaines insulines, et que le nombre d'animaux est fixé par la réglementation.

Objectifs

L’objectif de ces tests de contrôle de la qualité est de pouvoir mettre à disposition de patients des lots contrôlés d’insuline utilisés notamment pour le traitement de maladies métaboliques comme le diabète. En effet ce projet supporte la réalisation de tests de contrôle qualité dits « libératoires » pour des produits pharmaceutiques. La référence réglementaire appliquée à la réalisation de ces tests est la Pharmacopée (Américaine – USP et Chinoise – CH). Deux procédures sont décrites dans ce projet : L’une utilisant des lapins (Pharmacopée Américaine - US) et l’autre utilisant des souris (Pharmacopée Chinoise - CH). Ces essais permettent de vérifier l’activité hypoglycémique du médicament après son injection à un groupe de lapins ou de souris, en comparaison avec une solution d’insuline de référence injectée à un groupe témoin de lapins ou de souris. La glycémie est ensuite mesurée grâce à différents échantillons de plasma prélevés à différents temps après l’injection.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments à des patients. Ces tests (Insuline – USP et Insuline – CH) sont demandés pour la libération des lots de médicaments à base d’insuline ou homologue à destination des marchés Américain et Chinois (obligation réglementaire pour libération sur le marché). Ces tests sont décrits dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Procédure avec les lapins (vigiles) : - Animaux : Les lapins seront séparés en 4 groupes de 2 lapins - Mise à jeun alimentaire effectuée +/- 14h avant chaque jour de test - Mise à jeun hydrique : au moment des injections, les animaux subissent une mise à jeun hydrique qui durera +/- 3h - Injections : Chaque lapin recevra 2 injections en sous-cutanées en un point d’injection. Volume d’injection maximum 0.3 mL/kg. Les 2 injections se font entre 2 et 7 jours d’intervalle. - Prélèvements : Chaque lapin se vera prélever 1mL de sang via la veine marginale (oreille) : avant injection ; 1h après injection et 2h30 après injection. Procédure avec les souris (vigiles) : - Animaux : Les souris seront séparées en 4 groupes de 5 souris - Injections : Chaque souris recevra 2 injections en sous cutanée en un point d’injection. Volume d’injection maximum 10 mL/kg. Les 2 injections se font avec à minima 3 heures d’intervalle. - Prélèvements : Chaque souris se fera prélever environ 150 μL de sang via la voie submandibulaire : 40 minutes après injection. - Après le premier prélèvement une réhydration est effectuée par injection de NaCl (300 μL) en sous cutanée.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : l’administration répétée des produits pharmaceutiques (2 injections par lapin et 2 injections par souris), prélèvements de sang (6 prélèvements par lapin et 2 prélèvements par souris), l’euthanasie en fin de protocole. Pour la procédure avec les lapins la mise à jeun alimentaire (+/- 14 heures) et hydrique (+/-3 heures) (procédure avec les lapins),

Devenir

Procédure avec les lapins : Les lapins non utilisés pour le test type Insuline pourront être utilisés pour d’autres projets après une période de 3 semaines de repos et si aucun signe clinique anormale est détecté ou être réutilisé pour un projet simialire (dégré de sévérité modéré). Procédure avec les souris : Les souris utilisées seront mises à mort et les souris non utilisées pour le test type Insuline pourront être utilisées pour d’autres projets.

Remplacement

Ce test est réglementaire et rentre dans le cadre de la pharmacopée Américaine et Chinoise. Ce test permet de valider l’activité des médicaments à base d’insuline. Aucun test équivalent sans animaux n’est proposé par la pharmacopée Chinoise. Le test équivalent sans animaux proposé par la pharmacopée Américaine n’est réglementairement accepté que pour certains types d’insuline à libérer (e.g. Insuline Lispro).

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser est fixé par les pharmacopées CH (souris ) et USP (lapins ). Au regard des contraintes opérationnelles liées à l’exécution de ces procédures des animaux supplémentaires peuvent être commandés : 2 lapins en plus et 4 souris en plus. En effet – la pharmacopée CH demande une différence de poids de 3g maximum entre toutes les souris utilisées pour tester un produit à J0. A noter que le transport des souris inhérent à la réalisation de ce test peut leur faire perdre jusqu’à 10% de leur poids à réception. Également, les 2 procédures demandes des timings entre les injections et les prélèvements serrés. En cas d’incident (opérationnel ou sur l’animal), un autre congénère pourra être utilisé. Cela permettra d’éviter le renouvellement d’un test en entier et donc d’éviter d’utiliser plus d’animaux in-fine. Les animaux non utilisés lors de ces procédures pourront être utilisés à des fins de formation ou dans d’autres projets éthiques approuvés.

Raffinement

Lors des essais : - Les animaux sont hébérgés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre d’individus et à l’âge de ceux-ci, - Le milieu d’hébergement sera enrichi avec des moyens adaptés à l’espèce, - Des points limites sont définis et appliqués durant l’étude, - Une observation journalière des animaux est réalisée dès leur réception jusqu’à la fin de l’étude afin de garantir leur bien-être et d’identifier au plus tôt l’apparition de potentiel point limite, - Durant le test les animaux sont surveillés en permanence par les techniciens animaliers - Un poids minimal pour les souris utilisées a été validé avec le vétérinaire - Une réhydratation par injection (300 µL) de NaCl 0,9 % en sous-cutané des souris est effectuée après le premier prélèvement (bien que non demandée par la Pharmacopée CH) - Les prélèvements des souris sont effectués via la voie submandibulaire alors que la pharmacopée CH demande un prélèvement par la voie sinus rétro-orbitale.

Choix des espèces

Les espèces des animaux à utiliser sont fixées par les pharmacopées USP (lapins – procédure 1) et CH (souris – procédure 2). Les critères de sélection des animaux sont : -Lapins (USP) : poids supérieur ou égal à 1.8kg au début du protocole (requis pharmacopée) -Souris (CH) : poids supérieur ou égal à 35g à J0 (décision interne) et 3g maximum d’écart entre les souris (requis pharmacopée)

1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur une durée pouvant atteindre 140 jours, elles reçoivent des injections par différentes voies et des prélèvements de sang répétés, pour comparer deux voies d'administration d'un vaccin thérapeutique contre l'hépatite B. Le porteur renvoie les bénéfices à "long terme" et à une éventuelle extension à d'autres pathogènes, et écarte le chimpanzé, seul modèle infectable, pour des raisons éthiques. Il affirme que le recours à "l'organisme entier" est "incontournable" et qu'il n'a pas d'autre solution que d'utiliser l'animal entier.

Objectifs

Plus de 3% de la population mondiale est infectée de manière chronique au virus de l’hépatite B, et 6% des populations africaines et de l’ouest pacifique souffriront à vie de cette maladie infectieuse. Le vaccin contre le virus de l'hépatite B est efficace mais seuls les pays développés y ont accès. Les prognostics pour le futur sont peu optimistes et la communauté scientifique insiste sur le besoin urgent de développer des solutions permettant de guerir contre ce virus. Malheureusement, les deux médicaments disponibles actuellement necessitent de prendre un traitement lourd pendant toute la vie du patient et ne permettent pas d’eliminer l’infection qui, trop souvent, évolue vers des maladies plus sévères du foie (cirrhose puis cancer dans 30% des cas, responsables de 1 million de décès/an). Ce projet a pour objectif de répondre, en partie, à ce besoin scientifique de développer une cure contre le virus de l’hépatite B afin d’accroitre la qualité et l’esperence de vie des patients. Pour ce faire, un médicament innovant a été développé. Il permet d'administrer en même temps deux molécules : un vaccin (antigène) et une molécule stimulante (qui amplifie la réponse due l'antigène). Les dernières années d’experimentation ont permises d’optimiser la 'formule chimique' de ce traitement et de démontrer l’efficacié de ces formulations par rapport aux formes libres de ces deux molécules. Une étude pilote sur souris a également permis de mettre en évidence une valeur ajoutée de la stratégie étudiée. A présent, l'efficacité de ces nouveaux médicaments nécessite d'être étudiée plus amplement par de nouvelles expérimentations afin d’explorer la distribution et l’effet antivirale des formulations en comparant deux voies d’administration : la sous-cutannée, qui a l’avantage de viser le compartiment lymphocytaire et qui est la voie la moins invasive, et l’intraveineuse, qui a l’avantage de déposer nos traitements directement dans l'organe pour le traiter localement. Ce projet se décline en trois procédures, dont deux qui utilisent un modèle murin d'infection au virus étudié.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrie dans la démarche globale de recherche d’une alternative efficace aux traitements conventionnels contre le virus de l’hépatite B. Les vaccins candidats étudiés ici permettent de véhiculer, dans le même médicament, un antigène du virus de l'hépatite B et un adjuvant capable d'amplifier la réponse immunitaire dirigée contre le virus. Un premier candidat médicament a déjà fait ses preuves dans sa capacité à contrôler la présence du virus dans les hépatocytes. Cette nouvelle stratégie thérapeutique sera capable de déclencher une réponse antivirale optimale : à la fois directe dans l’environnement du foie et indirecte en modulant le système immunitaire du patient. Pour toutes ces raisons, ce qui est proposé ici permettrait de pallier les problèmes des traitements actuels et de mieux traiter les patients souffrant du virus de l'hépatite B, avec une alternative qui promet une meilleure observance et une meilleure adhésion au traitement. Selon les résultats obtenus suite à ce projet, il pourra être envisagé de le porter à plus grande échelle. Enfin, l’utilisation de cette technologie est très prometteuse et pourra, à long terme, être adaptée à d’autres pathogènes responsables d’épidémies infectieuses.

Procédures

Les animaux seront susceptibles d'être soumis à : des injections par différentes voies d'administration sur animaux vigiles ou endormis (30 secondes/injection), des prélèvements sanguins sur animaux vigiles, (30 secondes/prélèvement), des marquages pour identifier les animaux (30 secondes/marquage). Ces interventions seront réalisées sur un total de 1056 animaux (sur une durée d'expérience maximale de 140 jours).

Impact sur les animaux

Les gestes de prélèvement et d'injection à l'oeil sont susceptibles d'engendrer un inconfort leger à modéré. Si une souris présente des signes de souffrance ou d’angoisse suite à ces gestes, ou de prostration, elle sera exclue de la procédure et mise à mort. De manière générale, les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par l’expérimentateur (observées 5 jours sur 7 et pesées toutes les semaines dans le cas où les animaux sont infectés) et, si une perte supérieure à 20% du poids maximal, ou tout type de douleur, d’absence de réponse aux stimuli extérieurs, d’inactivité, ou un quelconque comportement anormal est détectée, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. La lignée génétiquement modifiée utilisée dans ce projet n’est pas une lignée à phénotype dommageable. Les souris recevront exactement les mêmes soins et attentions que l’ensemble des animaux utilisées dans ce projet.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour procéder à des analyses biochimiques, biologiques, et tissulaires afin d'obtenir des résultats aux hypothèses formulées.

Remplacement

Des analyses approfondies ont déjà fait l’objet d’études : in vivo sur organisme entier de la biodistribution systémique des traitements grâce à une technique d’imagerie en temps réel et in vitro sur cellules du foie de l’efficacité antivirale des nanovaccins. A présent, il s’agit d’analyser finement la biodistribution intracellulaire des traitements ainsi que l’effet antiviral sur modèle entier. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et le foie, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable et le choix du modèle souris est le plus adapté afin d’évaluer l’efficacité d’un schéma vaccinal à deux voies d’administration. Nous n’avons pas d’autre solutions que d’utiliser l’animal dans son entier.

Réduction

Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé sera réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et la significativité statistique des experimentations. Il a été évalué pour 5 ans par une statisticienne à 1056 souris. L'ensemble des expériences sont construites pour réduire le nombre d’animaux, sans pour autant entrainer des contraintes pour ces animaux. Suivant la nature de l'experience, un minimum de 5 individus par groupe ou de 10 individus par groupe est nécessaire pour mettre au point l’expérience et pour avoir des résultats statistiquement fiables. De manière générale, l’ensemble des analyses statistiques seront réalisées en aveugle.

Raffinement

Les points limites sont assez prédictifs pour pouvoir anticiper tout stress et souffrance. A la reception des souris, elles seront acclimatées durant une semaine dans l’établissement utilisateur. Pour les injections intra veineuse, les animaux seront endormis le temps du geste. Avant les prélèvements sanguins, une goutte d'anesthésique local sera utilisée afin d’eliminer la douleur. Les points d’injection suite aux immunisations seront surveillés, comme pour les prélèvements sanguins. Le cas échéant, à partir du jour de l’infection (J0), les animaux seront surveillés 5 jours sur 7 et pesés une/semaine. De manière générale, tout animal montrant un signe de souffrance (tonicité, agitation extrême, prostation, qualité du poil, gonflement de l’absomen, ulcération cutanée, mobilité réduite, douleur, perte de poids, inactivité, stress, comportement anormal) sera immédiatement mis à mort. Une perte supérieure à 20% du poids initial sera considérée comme critère de point limite.

Choix des espèces

Les systèmes in vitro sont utiles pour tester les effets de molécules à visée thérapeutique sur les cellules, mais pas à l’échelle de l’organisme entier parce qu’ils n’incluent pas le microenvironnement hépatique et le système immuniaire. Le seul modèle entier infectable par le virus de l'hépatite B est le chimpanzé mais son utilisation au stade de notre projet est exclue pour des raisons éthiques. Dans ce contexte, la souris est une bonne alternative car bien que non infectable par le VHB, le modèle utilisé permet de mimer l’hépatite virale chronique et ce avec une stabilité sur un an, le tout dans un système immuno-compétent. L'ensemble de ce projet nécessite d'utiliser des animaux sevrés à partir de 6 semaines car le système immunitaire est décrit comme mature et non veillissant à partir de cet âge là.

390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 78 réutilisées ensuite et les autres tuées pour prélever la queue et la rate. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections sous les coussinets des pattes puis dans la queue, avant l'application d'une crème sur la zone dépigmentée, pour tester un inhibiteur contre le vitiligo. Le porteur reconnaît que l'injection dans le tarse peut entraîner une perte partielle de mobilité ou une infection de la plaie. Il indique qu'aucun système de co-culture in vitro ne reconstitue l'ensemble des réponses de la dépigmentation, ce qui rend selon lui le modèle souris "essentiel".

Objectifs

Le vitiligo est une pathologie de la peau qui provoque l’apparition de taches blanches de taille plus ou moins importantes et peut toucher l’ensemble du corps, y compris le visage. Ces macules blanches sont la résultante d’une altération des mélanocytes de l’épiderme qui sont les cellules responsables de la pigmentation cutanée. Environ 1% de la population mondiale souffre de cette pathologie qui affecte significativement la qualité de vie des patients. A ce jour, aucun traitement efficace et spécifique n’est disponible du fait de la complexité de cette pathologie et dont la compréhension et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques restent un enjeu majeur. L’origine de cette pathologie reste à ce jour mal définie mais l’implication de plusieurs facteurs (génétiques, environnementaux ou encore une altération du système immunitaire chez les patients) sont identifiés. Afin d’expliquer la perte des mélanocytes au cours du vitiligo, il a été récemment montré chez les patients atteints de vitiligo un défaut dans le système d’adhésion des mélanocytes au niveau de la peau, entrainant leur perte et ainsi la dépigmentation. Nos travaux ont montré qu’une protéine, la métalloprotéase MMP9, était impliquée dans ce défaut d’adhésion. De plus, la MMP9 a un rôle dans l’activation du système immunitaire, notre système de défense. Nous pensons donc un inhibiteur de MMP-9, seul ou en association avec des traitements en cours d’essais cliniques chez l’homme, représente une stratégie prometteuse pour bloquer la réponse inflammatoire et stabiliser le mélanocyte à la membrane basale de l’épiderme.

Bénéfices attendus

La validation de la métalloprotéinase matricielle MMP-9 comme une cible thérapeutique d’intérêt majeur dans le vitiligo et autres dépigmentations post-inflammatoires et le développement d’un inhibiteur de la MMP9 pour application topique. De plus, une association d’un inhibiteur de MMP-9 avec un inhibiteur de Janus Kinase (JAK) semble également une stratégie prometteuse pour bloquer la réponse inflammatoire et stabiliser le mélanocyte à la membrane basale de l’épiderme. Le projet pourrait permettre d’utiliser un inhibiteur de MMP-9 en application topique dans le vitiligo, une maladie dont les besoins thérapeutiques sont majeurs.

Procédures

Les souris auront à subir deux injections en sous cutanée sous les coussinets des pattes postérieures à une semaine d'intervalle et ensuite deux injections en sous cutanée au niveau de la queue à une semaine d'intervalle également. Le traitement des souris consistera à une application par massage de la crème au niveau de la queue (zone de dépigmentation).

Impact sur les animaux

Nous avons déjà validé le modèle de souris vitiligo par immunisation sans observer de signe indésirable. Bien que non observés, des erythémes au niveau du sites d'injection de la queue peuvent être observés. L’application en topique des inhibiteurs ne devrait pas engendrer d’effets nocifs sur les souris. Cependant,l’injection dans le tarse peut engendrer une perte partielle de mobilité de l’animal ou l’infection de la plaie

Devenir

A l'issue des procédures les souris seront mis à mort et nous prélèveront les queues et les rates pour analyses.

Remplacement

Au préalable nous avons évalué l’impact d’un inhibiteur de MMP-9 associé ou non au Ruxolitinib en application topique in vitro dans notre modèle 3D de dépigmentation induite en condition inflammatoire. Il n’existe malheureusement aucun système de co culture in vitro reconstituant l’ensemble des réponses cellulaires impliquées dans la dépigmentation de la peau. Le modèle de souris est donc une étape essentielle pour évaluer l’intérêt thérapeutique d’un inhibiteur de MMP-9 associé ou non à un inhibiteur de JAK tel que le Ruxolitinib.

Réduction

L’étude in vitro au préalable permet de choisir les doses optimales des inhibiteurs à tester sur l’animal et donc de réduire la quantité totale de souris. Nous allons dans un premier temps valider la dépigmentation des souris puis nous identifierons dans la seconde procédure la dose adéquate de JNJ0966 pour réduire cette dépigmentation. Dans un troisième temps l’association avec le Ruxolitinib sera étudier puis nous évaluerons l’intérêt d’une thérapie prévisionnelle. Ces 4 procédures sont importantes pour réduire au mieux le nombre minimal d’animaux afin d’obtenir des analyses comparatives et statistiques suffisantes à la démonstration de l’effet des traitements inhibiteurs utilisés.

Raffinement

Le développement d’un érythème au niveau de la zone d’injection et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement au cours de la procédure. Les animaux seront hébergés à raison de 5 souris/cage dans un environnement propice à leur bien-être (litière en copeaux de peuplier, tunnels en polycarbonate). Si un impact environnemental est observé (bagarre des mâles entre eux, signes de stéréotypie, prostration, isolement d’un animal...), l’animal sera soigné et mis en isolement. La durée de l’isolement dépendra du comportement de l’animal, en cas de plaie le vétérinaire suivra la guérison et jugera de l’état de l’animal. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie : l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux de Lloyd et al.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris transgénique B6.Cg-Tg(KRT14-Kitl*)4XTG2Bjl/J de 4 semaines. Ces souris ont un phénotype noir car elles présentent des mélanocytes au niveau de l’épiderme sur tout le tégument (l’expression du ligand de Kit au niveau du promoteur épidermique kératine-14 permet la rétention des mélanocytes au niveau épidermique) ce qui permet de mieux observer la dépigmentation. De plus, par la persistance des mélanocytes, ces souris ont la capacité à repigmenter. Nous utilisons des souris jeunes de 4 semaines pour s'assurer que le système immunitaire n'est pas altéré du fait du vieillissement de la souris.

266 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet enchaîne laparotomie de femelles gestantes, électroporation d'embryons in utero et injections intracérébrales de vecteurs viraux, l'objet étant de mettre au point une méthode d'imagerie du cerveau par bioluminescence. Le porteur précise que tous les animaux recevant une substance neuroexcitatrice développeront une crise d'épilepsie et que les nouveau-nés rejetés par leur mère seront tués. Il affirme qu'il n'existe "aucune alternative non-animale" à l'étude des activités neuronales et que le travail doit se faire sur "l'animal entier".

Objectifs

Les fonctions cérébrales reposent sur l’activité de populations largement interconnectées de neurones très divers, dont la complexité nécessite l’étude in vivo qui préserve l’interconnexion entre neurones et entre structures cérébrales. Ces études in vivo requièrent le plus souvent de ménager un accès à travers le crâne pour insérer des électrodes ou effectuer des mesures optiques dans l’encéphale. Le but de ce projet est d’utiliser la bioluminescence pour développer une imagerie trans-crânienne à invasivité minimale des activités neuronales chez la souris in vivo. En effet, la bioluminescence permet d’obtenir, à l’échelle de populations de neurones ciblés, des informations sur les activités moléculaires et cellulaires grâce à l’utilisation de biosenseurs codés génétiquement. Elle repose sur l’utilisation d’une luciférase (protéine à activité enzymatique) exprimée par transfert de gène, et d’un substrat (luciférine) injecté par voie intrapéritonéale ou intraveineuse, dont la dégradation par la luciférase produit des photons. La bioluminescence présente un fort contraste et fournit des données très quantitatives ; elle est non-toxique et permet des enregistrements de longue durée (heures/jours). Il existe maintenant des biosenseurs dont la luminescence rouge traverse le crâne. Par comparaison avec d’autres biosenseurs luminescents, les biosenseurs choisis pour ce projet fonctionnent à des doses largement subtoxiques de luciférine, et n’émettent quasiment pas de lumière en l’absence d’activité neuronale.

Bénéfices attendus

A terme, ce type d’imagerie permettrait un suivi non-invasif de l’activité cérébrale sur des mois dans des modèles murins de pathologies neurologiques ou psychiatriques humaines. Il serait ainsi possible d’analyser l’évolution pathophysiologique des activités cérébrales et l’implication des différents types de neurones dans cette évolution, afin de mieux comprendre et soigner ces pathologies chez l’humain.

Procédures

1) Laparotomie des femelles gestantes sous analgésie et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 2) Electroporation in utero (sous analgésie et anesthésie générale gazeuse) de biosenseurs luminescents non pathogènes dans les cellules pyramidales du cortex cérébral d’embryons de souris, afin de comparer leurs performances pour l’enregistrement optique des activités cérébrales. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 3) Injections intracérébrales par stéréotaxie de vecteur viraux luminescents sous analgésie et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 4) Injections intracérébrales par stéréotaxie de substance neuroexcitatrice (4-aminopyridine) sous anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 40 min maximum. 5) Enregistrement in vivo par bioluminescence des activités cérébrales sur animal vigile et sur animal anesthésié. Durée d’enregistrement 30 min. 6) perfusion intracardiaque afin de réaliser des études histologiques et de quantifier l'expression des biosenseurs.

Impact sur les animaux

Les procédures de chirurgie peuvent être à l’origine d’une perte de poids transitoire (inférieur à 20% de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seules ces chirurgies permettent de cibler spécifiquement des régions corticales. Tous les animaux recevant une injection de substance neuroexcitatrice développeront une crise unique d’épilepsie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de vérifier par immunomarquage l’expression des biosenseurs.

Remplacement

Le cerveau est un organe très complexe qui comprend des milliards de neurones de centaines de types différents, dont chacun établit des milliers de connexions avec d’autres neurones, et qui sont rassemblés en structures largement connectées entre elles et/ou avec d’autres organes. En raison de cette complexité, il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative non-animale à l’étude des activités neuronales qui sous-tendent les fonctions cérébrales. C’est pourquoi ce projet, qui propose de développer une méthode d’imagerie trans-crânienne des activités de populations neuronales, avec une invasivité minimale, doit être réalisé in vivo sur l’animal entier.

Réduction

Les expériences de bioluminescence et de transfert de gène réalisées précédemment dans l’unité nous ont permis d'optimiser le nombre d’animaux nécessaire. Nous utiliserons 266 animaux pour ce projet. Ce nombre est très largement inférieur au nombre d’animaux qui serait nécessaire en cas d’utilisation de lignées transgéniques. L’électroporation in utero sera réalisée sur femelle gestante de la lignée C57BL/6, qui porte peu d’embryons (en moyenne 7), assure un meilleur accès pour l’électroporation de chaque embryon, et donc une proportion de nouveau-nés électroporés élevée (en moyenne 3 animaux électroporés par portée) et un rendement d’électroporation par individu assez homogène. Ceci réduit le nombre de nouveau-nés non-électroporés et la variabilité des résultats, et donc le nombre total d’animaux utilisé. Les animaux non-électroporés seront utilisés pour la procédure avec transfert viral. Compte tenu de la variabilité observée dans les rendements d’électroporation in utero et de transfert viral, nous avons estimé à 10 le nombre d’animaux nécessaires pour la plupart des conditions testées afin de révéler des différences significatives. Le nombre d’animaux a été porté à 20 pour deux des conditions testées afin de permettre une analyse plus détaillée des différences quantitatives et qualitatives attendues. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés à l’analyse des petits échantillons. Les expériences d’imagerie permettant une acquisition des résultats en temps réel, le nombre d’animaux sera réduit au maximum grâce à une analyse quotidienne des données. Enfin, les expériences prévues étant échelonnées sur les 8 premières semaines de la vie post-natale, les résultats obtenus à un âge donné permettront d’optimiser les expériences conduites à un autre âge et de limiter le nombre d’âges testés, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés 5 à 7 jours dans une zone d’hébergement A2 avant la procédure. Ils sont hébergés par fratrie ou en groupe de 2 à 4, en portoir ventilé dans un environnement à température (20-24°C) et hygrométrie de 55% contrôlées, avec cycle diurne/nocturne de 12h, et eau et nourriture fournies ad libitum. Les animaux sont dans un environnement enrichi par la présence de matériau végétal pour édifier un nid. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Ils sont visités chaque jour et manipulés par l’expérimentateur pour réduire le stress le jour de la procédure. Les animaux ne sont séparés que le temps de la procédure et de la récupération post-opératoire. Pendant la chirurgie, l’animal est sous anesthésie générale induite par l’isoflurane et placé sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’animal reçoit une injection d’un analgésique et d’un anesthésique local pour prévenir la douleur pendant et après la chirurgie. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Après chirurgie, l’animal reçoit en SC une injection de solution saline afin de prévenir la déshydratation. Les animaux sont placés dans une cage de réveil posée sur un tapis chauffant à 37°C jusqu’à leur réveil. Lorsque l’animal a récupéré, il réintègre sa cage d’origine, son comportement est surveillé et la suture est sous observation quotidienne pour évaluer sa bonne cicatrisation. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le Structure locale de bien-être animal et les conseils vétérinaires. Après chirurgie, une surveillance accrue permettra de détecter tous signes de douleur ou stress et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les nouveau-nés seront observés en continu durant l'heure qui suit le retour à la mère pour vérifier la prise en charge maternelle. En cas de rejet, le nouveau-né sera euthanasié. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une surdose d’anesthésique.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système nerveux central avec celui des humains, de l’existence de lignées génétiquement modifiées permettant de cibler l’expression des biosenseurs dans des populations neuronales spécifiques, et de l’existence de nombreux modèles de pathologies neurologiques ou psychiatriques humaines auxquels la méthode d’imagerie non-invasive des activités cérébrales que nous développons pourra être appliquée. Les animaux seront utilisés pour des enregistrements optiques réalisés en semaines postnatales 1 à 8 afin de tester l’effet de l’épaississement de l’os crânien avec l’âge sur l’imagerie de l’activité cérébrale par bioluminescence trans-crânienne. En effet, la croissance du crâne de la souris ralentit fortement après la 7e semaine. Les électroporations s'effectueront sur des embryons au stade embryonnaire E13.5 afin de générer des animaux exprimant les biosenseurs luminescents de la naissance à la semaine 3. Les injections stéréotaxiques de virus recombinant seront réalisées durant les semaines 3 à 7 postnatales afin de générer des animaux exprimant les biosenseurs luminescents durant les semaines 4 à 8 postnatales.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour modéliser l'ataxie de Friedreich, elles reçoivent une anesthésie par injection puis une électromyographie mesurant l'activité du nerf sciatique, l'objet étant d'améliorer la détection d'une onde difficile à enregistrer. Le porteur indique que ces souris développent des déficits moteurs dès cinq semaines et une mortalité par crises d'épilepsie vers vingt semaines, et prévoit de les tuer à quinze semaines. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet ces mesures et qu'il est "indispensable" de les réaliser sur l'animal.

Objectifs

L’ataxie de Friedreich est une maladie neurodégénérative progressive incurable à ce jour. Cette maladie se manifeste par des troubles de l’équilibre et de la coordination des mouvements volontaires (ataxie) liés à une dégénérescence des neurones sensitifs. L’ataxie de Friedreich rare touche environ 1 personne sur 50 000, soit environ 1 300 patients en France. Apparaissant généralement vers l’âge de 9–14 ans, son évolution et ses symptômes varient d’un patient à l’autre. Toutefois, une incapacité à marcher survient généralement 10 à 20 ans après les premiers symptômes. L’électromyographie (EMG) permet d’analyser l’activité électrique des nerfs et des muscles chez l'Homme. En complément de l’examen clinique, il aide au diagnostic de différentes pathologies nerveuses et musculaires. L'EMG est utilisée chez la Souris pour étudier les maladies neuromusculaires. Après stimulation électrique du nerf sciatique, la réponse électrique au niveau du muscle du pied est enregistrée. Deux ondes sont présentes dans cette réponse électrique, une onde motrice (onde M), correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres motrices du nerf sciatique, et une onde sensitive (onde H) correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres sensorielles du nerf sciatique. Cette onde H est difficile à détecter à l’heure actuelle. L'objectif de ce projet est d'améliorer la détection de cette onde grâce à un électromyographe plus performant et des modifications du protocole d’enregistrement. Pour valider cette nouvelle méthode d’enregistrement, nous souhaitons mesurer l'onde H chez des souris génétiquement modifiées qui présentent une diminution de l’amplitude de l’onde H à partir de l’âge de 5 semaines et qui sont utilisées pour la recherche de nouvelles thérapies contre l'ataxie de Friedreich.

Bénéfices attendus

L'optimisation de la mesure de l'onde H permettra d'améliorer la détection de la dégénérescence des neurones sensitifs et ainsi de mieux caractériser l'effet de potentiels traitements sur cette dégénérescence présente dans l'ataxie de Friedreich. En améliorant la qualité des études précliniques, nous augmenterons les possibilités de trouver une thérapie efficace chez l'Homme pour traiter l'ataxie de Friedreich.

Procédures

Les animaux seront soumis aus interventions suivantes: - Injection intra-péritonéale du mélange kétamine - xylazine (durée = 5 secondes). - Electromyographie permettant la mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes). - Injection sous-cutanée d'antisedan (durée = 5 secondes).

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement modifiées permettant d'étudier l'ataxie de Friedreich, présentent une mortalité liée à l'apparition de crises épileptiques à partir de l'âge de 20 semaines, âge qui ne sera pas atteint au cours de notre protocole, les animaux étant euthanasiés à l'âge de 15 semaines. Par ailleurs, des déficits de coordination motrice apparaissent à l' âge de 5 semaines. Ces déficits augmentent au cours du temps et à l'âge de 15 semaines, ces animaux présentent des troubles de la démarche marqués mais non délétères. De la nourriture en gelée sera placée sur le sol de la cage durant toute l'étude. Ce modèle a été décrit de manière précise par une équipe de recherche sur notre site, notamment dans son décours et sa sévérité. Lors de l'EMG, si un animal commence à se réveiller au cours du test, l'expérience sera immédiatement stoppée. Si un animal présente des difficultés respiratoires, l'expérience sera également stoppée.

Devenir

Les souris utilisées commencent à mourir à l'âge de 20 semaines. Tous les animaux seront mis à mort à l'âge de 15 semaines.

Remplacement

L'électromyographie est couramment utilisée chez l'homme pour étudier les neuropathies. Ces neuropathies sont généralement associées à des troubles moteurs visibles. Les modèles murins de ces neuropathies présentent également des troubles moteurs. Pour étudier l'efficacité thérapeutique d'une molécule d'intérêt, ces troubles moteurs sont évalués au cours du temps et les mesures électromyographiques viennent compléter les phénotypes observés. Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique sur la coordination motrice. Il est donc indispensable de pouvoir réaliser des mesures électromyographiques sur l'animal.

Réduction

Pour cette étude, nous avons prévu d'utiliser 12 animaux par groupe expérimental. Ce nombre de 12 animaux par groupe a été établi par étude de puissance sur les mesures électromyographiques réalisées précédemment dans notre laboratoire. Il constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. La latence et l'amplitude de l'onde H seront les paramètres analysés et nous comparerons les résultats obtenus chez les souris génétiquement modifiées avec ceux obtenus chez les souris non génétiquement modifiées. Nous utiliserons 24 souris au total pour cette étude.

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole et à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement d'un modèle d'intérêt pour étudier l'ataxie de Friedreich. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les souris utilisées pour modéliser l'ataxie de Friedreich montrent une diminution progressive de l'amplitude de l'onde H à partir de l'âge de 5 semaines. Un premier EMG sera réalisé à l'âge de 5 semaines, avant que l'amplitude de l'onde H ne commence à diminuer. Un deuxième EMG sera réalisé à l'âge de 15 semaines, lorsque l'amplitude de l'onde H est fortement diminuée chez ces souris. Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole , à l'âge de 15 semaines, avant l'apparition des crises d'épilepsie.