Souris

1 632 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection d'un vecteur viral portant une forme humaine mutée de l'APP, la pose d'une fenêtre crânienne et une imagerie sous microscope tête fixée à l'état éveillé, avec des tests comportementaux nommés, reconnaissance d'objet et boîte clair-obscur. Le porteur décrit une douleur de trois à cinq jours après la chirurgie et un inconfort lié à la contention de la tête, et met au point ce modèle pour étudier le récepteur nicotinique dans la maladie d'Alzheimer. Il affirme que la souris est "irremplaçable pour l'instant" pour étudier ces circuits neuronaux.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neuro-dégénérative qui affecte principalement les personnes âgées et représente un problème majeur de santé publique, surtout dans les populations vieillissantes. Afin de pouvoir étudier les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à cette pathologie, différents modèles ont été développés chez la souris. Cependant, ces modèles présentent de nombreuses limitations, notamment pour l’étude des différentes étapes du développement de la maladie. Le but de ce projet est de mettre au point une nouvelle approche innovante pour étudier le stade précoce de la maladie dans le cerveau des souris, ainsi que pour explorer l’implication de structures cérébrales spécifiques dans son étiologie et enfin étudier le rôle du récepteur nicotinique dans la MA L’une des caractéristiques majeures de la MA consiste en l’accumulation du peptide beta-amyloïde (Aβ) qui est obtenu par clivage séquentiel de la protéine APP (Amyloid Precursor Protein). Pour cette étude, nous avons construit un vecteur viral adéno-associé (AAV) qui exprime la séquence humaine de l’APP contenant des mutations pathogènes identifiées chez les patients ( « Swedish », « London » et « Austrian »). Il s’agit de mutations ponctuelles qui changent un seul acide aminé de l’APP humaine et augmentent la quantité du peptide Aβ produite. Au sein du cerveau des mammifères, les récepteurs nicotiniques sont constitués de 5 sous-unités protéiques α(2-7) et β(2-4) qui s’assemblent selon différentes combinaisons et donnent lieu à des récepteurs fonctionnels aux propriétés pharmacologiques et cinétiques diverses. Au cours de la MA, le nombre des récepteurs nicotiniques se trouve diminué et leur activité altérée. De plus, des données bibliographiques suggèrent une interaction entre certains récepteurs nicotiniques, notamment les sous-types contenant α7 ou β2, et l’Aβ. Tout d'abord, nous allons caractériser l’activité neuronale dans le cortex de la souris en présence et en absence de l'APP, chez les souris wild-type et chez des lignées de souris exprimant la protéine cre recombinase dans des populations spécifiques de neurones pyramidaux, et d'interneurones. Ensuite, pour identifier l’implication des différents sous-types de récepteur dans le développement de la MA, nous allons appliquer la même technologie des vecteurs AAV à des lignées de souris transgéniques .

Bénéfices attendus

L’utilisation de ces nouveaux modèles animaux devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes biologiques qui sous-tendent la maladie d’Alzheimer. D’autre part, ils devraient faciliter l’étude de l’implication des récepteurs nicotiniques, plus particulièrement au cours de la phase précoce du développement de la maladie. Ceci pourrait permettre à plus long terme de développer et tester des médicaments pour lutter de façon précoce contre le développement de la pathologie..

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’injection du vecteur AAV contenant le gène de la protéine d’intérêt (durée estimée : 2 heures). Pour les animaux qui seront imagés sous le microscope à deux photons, l’indicateur calcique sera également injecté et une fenêtre crânienne pour l'imagerie chronique du cortex sera implantée au moment des injections (durée maximale de toute la chirurgie : 3 heures). Des tests comportementaux seront menés pour évaluer la mémoire (test de reconnaissance d’objet) et l’anxiété (boite claire obscure). En ce qui concerne le test de reconnaissance d’objet (RO), la préférence pour un nouvel objet nous permet d’estimer si la mémoire à court-terme est altérée et aussi de vérifier les capacités exploratoires et motrices des animaux ; la souris est placée dans une boîte pendant 30 minutes en présence d’objets. En ce qui concerne le test d’anxiété « clair-obscur » (CO), le dispositif expérimental se compose d'un petit compartiment noir et d'un grand compartiment blanc, connectés par un passage ; la souris est alors mise dans cet appareil pendant 30 minutes en libre exploration.

Impact sur les animaux

Nous estimons que les souris sont susceptibles de ressentir une douleur pendant les 3-5 jours après la chirurgie, pour laquelle nous administrerons des analgésiques. Habituellement, aucune perte de poids significative n'est enregistrée - les souris peuvent perdre jusqu’à 5% de leur poids initial dans les 24 heures suivant la chirurgie, mais ce poids est repris le lendemain. Pendant les premières 24 heures, des périodes de mobilité réduite peuvent aussi être repérées. Dans ces 3-5 jours qui suivent, nous remarquons que quelques animaux peuvent gratter un peu la zone immédiatement autour du ciment dentaire, mais ce comportement disparaît durant la première semaine de récupération. À part cela, nous prévoyons que la barre métallique qui est utilisée pour fixer la tête de la souris à la structure de support du microscope est une source supplémentaire d'inconfort. Néanmoins, après quelques jours (jusqu’à 2 semaines) la souris s’habitue et l’implant ne la gêne plus visiblement. Cette période de récupération après les craniotomies est cruciale et quelques problèmes peuvent être détectés, mais après 2 semaines, les souris ne manifestent plus de signes de stress, douleur ou altération d’activité. L'entraînement des animaux pour l’imagerie in vivo éveillée et leur habituation au microscope biphotonique est aussi susceptible de provoquer des nuisances. Après les premières séances d’entraînement, quelques souris sont plus stressées et leurs comportements sociaux peuvent devenir plus agressifs (pendant l’heure suivante). La préhension de la pièce métallique de la tête et la fixation de l'animal sont les étapes les plus stressantes et les plus inconfortables pour la souris, ce qui exige toujours la mise en place d'un protocole d'habituation minutieux.

Devenir

Toutes les procédures sont basées sur une injection de vecteur AAV localement dans le cortex pré-frontal (PFC). Il est essentiel pour l'analyse des données en imagerie et comportement de pouvoir confirmer la bonne qualité de l'injection, sa localisation précise, le volume du cortex couvert, et la quantité d'amyloide bêta produit. Les souris seront donc mises à mort, perfusées, le PFC coupé et analysé par histochimie.

Remplacement

Dans le cadre de cette étude il n’est pas possible de remplacer la souris par aucun autre modèle. Pour atteindre notre objectif d’identifier l’interaction entre l’amyloïde-beta et les récepteurs nicotiniques et son impact dans l’activité des neurones, il n'est pas possible d'utiliser des modèles mathématiques et bio-informatiques. Ces approches in silico peuvent seulement être utilisées à posteriori pour complémenter et modéliser les résultats in vivo. Il n’est pas non plus possible d'utiliser des lignées cellulaires ou des cultures de tissus, car celles-ci ne présentent pas la connectivité fonctionnelle requise pour ce projet. Concernant les organoïdes cérébraux, bien qu’ils commencent à être explorés pour analyser l’activité neuronale, les populations de neurones et l’organisation ne ressemblent pas à ceux du cerveau des mammifères en conditions physiologiques. Principalement pour étudier des circuits neuronaux axées sur le vieillissement et la neurodégénérescence, les modèles mammifères (comme la souris ou le rat) apportent des avantages significatifs et sont ainsi irremplaçables pour l'instant. De plus, notre étude implique des tests comportementaux s’intéressant à la mémoire, autre aspect critique de cette pathologie, qui ne peut pas être investigué par des études in vitro.

Réduction

L'estimation du nombre d'animaux à utiliser a été basée sur les résultats précédents obtenus avec ce modèle. Nous avons eu recours à des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaire pour garantir des résultats significatifs. Le projet inclut 3 procédures d'imagerie chez la souris éveillée. L'estimation des individus à utiliser a été réalisée sur la base du précédent projet et d'autres articles publiés, et adaptée selon les effets attendus dans chaque procédure. En outre, nos articles d'imagerie in vivo dans le cortex et des études comportementales précédentes ont confirmé notre calcul. Afin de garantir l'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, toutes les analyses post-mortem sur la caractérisation des lignées ou l’expression et distribution des protéines spécifiques, seront réalisées sur des animaux injectés et imagés précédemment. Sans compromettre l’obtention de résultats exploitables et fiables, seulement les expériences considérées comme indispensables seront réalisées et toutes répétitions inutiles seront éliminées. Pour utiliser moins d’animaux en expérimentation, nous allons aussi rédiger nos protocoles à l’avance et les optimiser. Chaque manipulation expérimentale sera planifiée dans le but de prévenir des problèmes éventuels, de décider des stratégies et de définir des critères d’interruption (« humane endpoints »).

Raffinement

Pour garantir que les animaux ne soient pas blessés et souffrent le moins possible, différentes mesures seront appliquées. Uniquement des souris adultes (8 semaines) seront soumises à des procédures chirurgicales et autant que possible les frères et sœurs resteront ensemble dans les cages, en groupe de 2 à 6. Les animaux seront injectés avec Buprenorphine 0.1mg/kg 30 min avant et l’analgésique local Lidocaïne (6mg/kg) 10 min avant la craniotomie. Durant les 30 min qui précèdent la chirurgie, les souris resteront sur un tapis chauffant. Pour une anesthésie profonde, on utilisera l’isoflurane. L’induction sera faite dans une chambre ventilée par un mélange d’isoflurane 4% et O2 2L/min. Pendant la procédure, les souris resteront anesthésiées sous un mélange d’isoflurane 1.5-2% et O2 0.6L/min. Leur température corporelle sera surveillée et maintenue à l’aide d’un tapis chauffant équipé d’une sonde rectale et la respiration et l’absence de réflexe de retrait de la patte seront également surveillées. Une solution saline isotonique (0.9%NaCl) sera chauffée et injectée à la fin – le volume dépend du poids de l’animal et de la chirurgie (lors de saignement nous injecterons plus). L’anti-inflammatoire Meloxicam 1mg/kg sera injecté 30 min avant la chirurgie pour prévenir la « soupe inflammatoire », et le jour suivant. Pour les 3 jours, la forme orale de Meloxicam 0.1mg/mL sera diluée dans une boite de complément alimentaire purifié Dietgel (7.5mL/souris/jour) et donnée aux souris. Pendant les 24 heures la souris restera dans sa cage sur un tapis chauffant pour empêcher une diminution brusque de sa température corporelle, garantir une meilleure récupération. Pendant les 5 jours, le poids, mouvement et comportement social des animaux seront surveillés de près, ainsi que la cicatrisation de la suture ou de la fenêtre crânienne. (Si la procédure chirurgicale a été correctement réalisée dans des conditions d'asepsie, aucune infection ne devrait se produire). Si aucun changement n'est remarqué ou si il y a une évidence de douleur ou un comportement anormal, des niveaux de surveillance seront mis en place. Si une souris souffre visiblement et reste en position prostrée, si elle a complètement cessé de manger ou s’il y a une perte considérable de poids (20% de son poids initial) la souris sera mise à mort. Chaque cage sera enrichie avec des petits cylindres de coton/morceaux de papier et un igloo en carton.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle rongeur disponible actuellement, car elle nous permet d’étudier plus profondément les circuits neuronaux. Elle est petite et relativement facile à gérer dans le contexte d’un laboratoire, par rapport à d'autres modèles mammifères plus complexes. Un autre atout de l'utilisation des souris est la vaste liste de boîtes à outils disponibles, ce qui permet d'optimiser les pipelines expérimentaux plus rapidement, réduire l’utilisation de ressources et identifier plus facilement des problèmes possibles (comme la douleur post-chirurgie). En effet, elle est classiquement utilisée pour des études de modification de l’expression des gènes (modèles transgéniques ou expression induite par un vecteur viral). De plus, la plupart des tests comportementaux utiles dans le cadre d’un projet étudiant la MA (comportements liés à une perte de mémoire ou à une dégénérescence des synapses due à l’accumulation de plaques amyloïdes dans le cerveau) ont été développés chez la souris. Les injections intracérébrales seront faites sur des animaux adultes, d’au moins 8 semaines, afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des injections. Les analyses fonctionnelles débuteront un mois après les injections, pour garantir que l’expression des vecteurs est assez élevée, et s’étendent jusqu’à 12 mois. Pour l’étude à long terme, les animaux seront également injectés à l'âge de 8 semaines, mais la fenêtre crânienne ne sera implantée qu'un an après l'injection de la protéine APP. Cela évitera que l'indicateur de calcium ne forme des agrégats et que la fluorescence ne s'estompe. Les études de comportement seront menées après vieillissement, à partir de 5 mois d’âge des souris, c’est à dire 2 mois après injection. Les mises à mort pour prélèvement des cerveaux seront effectuées après vieillissement, dans le cas du modèle AAV, qui nécessite un certain temps d’expression, jusqu'à 16 mois, procédure 2.

Tuées à l'issue de chaque procédure pour récupérer leurs organes, 1 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles sont nourries 16 semaines d'un régime riche en graisses pour les faire grossir, soumises 16 semaines à un exercice d'endurance sur tapis de course, et subissent des prises de sang éveillées, jusqu'à sept en deux heures lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Les effets néfastes se limitent, selon le porteur, à un risque d'irritation et d'infection aux points d'injection. Pour justifier le choix de la souris, le porteur cite sa "natalité importante", son "faible coût d'élevage" et la possibilité d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses, puis conclut : "Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée."

Objectifs

Ce projet concerne l'étude d'une protéine cible de l'hypoxie et induite en réponse aux stress. Nous étudieorns son implication dans le développement de la résistance à l'insuline induite par un régime riche en graisses et nous déterminerons si la délétion de cette protéine dans les adipocytes potentialise les effets bénéfiques de l’activité physique. Ce projet ne duplique pas d'études déja publiées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir d'une part, le rôle d'une protéine adipocytaire dans le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline, et d'autre part si son invalidation peut avoir des effets bénéfiques sur le traitement de l'obésité.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines afin d'induire une prise de poids. Les souris seront soumises à un protocole d'exercice d'endurance (tapis de course adapté à la souris) pendant 16 semaines. Les souris seront soumises à des prélèvements de sang sur souris vigiles lors des tests de tolérance au glucose (GTT) ou à l'insuline (ITT). Lors de ces tests, une goutte de sang est prélevée pour mesurer la glycémie au cours du temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes). Un prélévement de sang sur souris vigile sera effectué à la semaine 6, 14, 20, 22, 24 et 28 (max 100µl) de la procédure 1 et à la semaine 6, 20, 26 et 29 de la procédure 2.

Impact sur les animaux

Lors des injections en intra-péritonéale (lors des GTT, ITT ou tamoxifène) il pourrait y avoir un risque d'irritations et d'infection aux zones d'injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer les organes.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études sur des cellules adipocytaires cultivées in vitro et nous avons montré que la protéine d'intérét est impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline in vitro. Pour comprendre l’implication de cette protéine chez l’Homme, il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de la physiologie et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer trop d’animaux en excès. Chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Le nombre d’animaux a été calculé pour limiter les variations inter-individus et atteindre un niveau statistique validé par une analyse prédictive. Les procédures seront répétées 3 fois. Cependant, si une différence statistiquement significative est observée après 2 répétitions, nous ne ferons pas la troisième répétition.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux (par les expérimentateurs ou l'équipe zootechnique), ce qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal facile à utiliser grâce à sa natalité importante, son faible coût d’élevage et notre expertise nous permettant d’avoir des locaux d’hébergements et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de leur patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont réalisées sur des souris et cette espèce nous permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques et génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Seules les souris adultes seront utilisées dans ce projet. Pour l’étude du métabolisme, les souris seront mises sous régime alimentaire à 6 semaines. Ceci permet de diminuer la variabilité inter-animaux et donc de réduire les effectifs.

Selon leur groupe, des souris sont gavées six jours sur sept pendant quatre semaines, ou reçoivent chaque jour pendant deux semaines des injections intrapéritonéales ou des administrations par le nez, puis passent des tests comportementaux, un par jour, que le résumé ne nomme pas. 484 souris, dont des souris transgéniques qui développent des plaques amyloïdes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leur cerveau. Une partie est exposée de façon chronique à l'acroléine, un composé qui provoque un stress carbonylé, pour tester un dérivé du phloroglucinol, le Phloro-OiP-DHA, censé contrer ce stress. Le porteur attend de cette exposition des "troubles comportementaux et de neurodégénérescence", et ne cite comme effet néfaste que l'inconfort des gavages et des administrations répétés.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de maladie neurodégénérative associée à une démence chez les sujets âgés. L'élaboration et la mise sur le marché de nouveaux traitements pour lutter contre ce fléau est un défi sanitaire et économique majeur. Le stress oxydant induit par de nombreux facteurs environnementaux (notamment l'exposition à des polluants chimiques) est un évènement extrêmement précoce et jouant un rôle majeur dans la maladie. En effet, l’oxydation des lipides et du glucose favorise l’accumulation d’espèces carbonylées réactives (ECR, stress carbonylé) dont la réaction avec les acides aminés entraîne des modifications et pertes de fonctions irréversibles des protéines cellulaires. Parmi les molécules capables de combattre ce phénomène, les polyphénols, métabolites secondaires du règne végétal, présents dans de nombreux fruits et légumes de notre alimentation, ont été largement étudiés. L'obstacle majeur à l'utilisation de ces composés en thérapeutique est leur très faible biodisponibilité. Pour contourner ce problème, une équipe de chimistes a synthétisé un composé capable de réduire à la fois le stress oxydant et le stress carbonylé. Un polyphénol naturel, le phloroglucinol (Phloro) a été modifié chimiquement afin de pouvoir piéger les espèces responsables du stress carbonylé. Afin d’augmenter sa biodisponibilité, le phloroglucinol modifié a ensuite été couplé à un acide gras à longue chaîne (DHA) pour donner le Phloro-OiP-DHA. Son activité a été validée in vitro et in vivo dans un modèle murin présentant une dégénérescence des photorécepteurs induite par la lumière. L'objectif de ce projet est de déterminer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle de stress carbonylé induit par une exposition chronique à une ECR (l'acroléine), mimant le développement de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : -de confirmer que l'exposition chronique à l'acroléine, conduisant à l'apparition d'un stress carbonylé, s'accompagne de troubles comportementaux et de neurodégénérescence. -de déterminer le potentiel thérapeutique du lipophénol Phloro-OiP-DHA dans ce modèle. Avec cette étude, nous posons donc l'hypothèse d'un mécanisme reliant le stress carbonylé aux processus neurodégénératifs asssociés à la maladie d'Alzheimer, et en particulier ceux associés à la formation des dépôts amyloïdes et l'hyperphosphorylation de la protéine tau. Ce projet nous permettra d'en appréhender les mécanismes biochimiques sur le long terme et de tester le potientiel thérapeutique d'une molécule ciblant le stress carbonylé, le Phloro-OiP-DHA.

Procédures

Les animaux, en fonction de leur groupe, pourront être soumis à : -un gavage quotidien pendant 4 semaines (6j/7) -des injections intrapéritonéales ou intranasales quotidiennes pendant 2 semaines - des tests comportementaux (un test par jour) - ils seront euthanasiés en fin de projet.

Impact sur les animaux

La dose d'acroléine utilisée est basée sur des travaux précédemment publiés . L'inconfort lié au traitement peut provenir de la répétition quotidienne du gavage pendant 4 semaines et/ou des administrations intranasales pendant 2 semaines.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses biochimiques et immunohistologiques du tissu cérébral.

Remplacement

De manière générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveau sur des modèles simplifiés (in vitro ou in silico) et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs (in vitro ou in silico) validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans leur globalité. Il est primordial d’avoir des circuits neuronaux in vivo associés aux cellules gliales et vasculaires, pour caractériser les modifications moléculaires liées à la maladie d’Alzheimer d’un point de vue spatiotemporel. Les modèles utilisés sont acceptés, bien documentés, et très utilisés par la communauté des neurosciences.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour répondre aux objectifs du projet. Le nombre d'animaux dans chaque groupe, ainsi que le nombre de groupes est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe et a été déterminé par une analyse de puissance statistique basée sur nos études précédentes. Pour les analyses comportementales, histologiques et biochimiques, les tests seront de type non appariés, paramétriques sur les moyennes à variances égales ou différentes suivants les résultats des analyses précédentes. Ici, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour observer d’éventuels changements. A ce nombre d’animaux une marge de 10% sera ajoutée afin de compenser les aléas expérimentaux.

Raffinement

Afin de minimiser les effets du stress qui pourraient fausser les résultats (en particulier sur les analyses comportementales), mais également de contrôler l’état général des animaux, les souris seront manipulées chaque jour par l’expérimentateur en charge de l’expérience, avant la procédure expérimentale. Tous les incidents et toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmis à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental.

Choix des espèces

Il s'agit d'une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. La maladie d'Alzheimer étant une maladie se déclarant chez l'adulte voire la personne âgée, les animaux seront utilisés et sacrifiés à l'âge adulte (6 mois). De plus, la caractérisation du modèle de souris transgéniques a déjà été effectuée dans notre laboratoire et nous avons montré que : -les déficits comportementaux commencent à partir de 3 mois -les modifications biochimiques (augmentation de la charge amyloïde, de la phosphorylation de la protéine tau, principaux marqueurs de la maladie d’Alzheimer) et histologiques (formation des plaques amyloïdes) sont visibles à l’âge de 6 mois

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies du genou droit, une injection intra-articulaire d'un vecteur viral puis une déstabilisation du ménisque pour induire une arthrose, avant d'être tuées pour analyses. Le porteur cherche une preuve de concept d'une thérapie génique augmentant la protéine alpha-Klotho contre l'arthrose post-traumatique, avec l'espoir d'un passage en clinique humaine. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace l'animal pour tester un traitement de l'arthrose.

Objectifs

L'arthrose, est la plus commune des maladies rhumatismales et touche plus de 500 millions de personnes dans le monde. L’arthrose atteint l’ensemble des tissus de l’articulation (cartilage, os, membrane synoviale, muscle). A ce jour, aucun traitement n’est capable de reverser ni même de ralentir les atteintes arthrosiques et les traitements proposés aujourd’hui ne corrigent que les symptômes de la maladie. Étant donné que le vieillissement est l’un des principaux facteurs de risque de l’arthrose, nous proposons de tester un facteur anti-âge, la protéine alpha-klotho (a-KL), pour le traitement de cette maladie. En effet, un risque accru d’arthrose a été mis en évidence chez des patients qui présentaient des différences dans la séquence du gène codant pour la protéine a-KL. D’autre part, des niveaux différents d'ARN messager d’a-KL ont été rapportés entre le cartilage articulaire sain et arthrosique. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’une thérapie génique visant à augmenter l’expression d’a-KL dans le traitement de l’arthrose. Cette approche de thérapie génique sera effectuée par l’injection intra-articulaire d’un vecteur viral codant pour la protéine d’a-KL dans un modèle d’arthrose chirurgicalement induite chez la souris.

Bénéfices attendus

La prise en charge des patients atteints d’arthrose est insuffisante puisqu’elle ne traite que les symptômes. Ce projet permettra de faire une preuve de concept sur l’efficacité d’un nouveau traitement de thérapie génique contre l’arthrose dans ce modèle d’arthrose post-traumatique chez la souris. Ce traitement adapté pour la clinique pourra ensuite être proposé pour des essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux chirurgies d’environ 15 minutes chacune consistant en une injection intra-articulaire du genou droit et une semaine après, une déstabilisation du ménisque médial unilatérale (genou droit) effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et traitement anti-douleur pré et post-opératoire.

Impact sur les animaux

Dans les trois premiers jours suivant la chirurgie, si de la douleur est ressentie par l’animal celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Cette douleur pourrait être notamment causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait intervenir au niveau des sutures post-chirurgicales. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) seront attentivement regardés.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires, ainsi que d’un liquide synovial à prendre en considération dans les modalités du transfert de gène en intra-articulaire. D’autre part, cette pathologie à des causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet de tester l’intérêt thérapeutique de traitements dans le cadre de l’arthrose.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà effectuées, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum (20 maximum par groupe compte tenu de la variabilité du modèle chirurgical) mais suffisant pour démontrer des différences statistiquement significatives entre les groupes en utilisant les tests statistiques non paramétrique Kruskal-Wallis pour pouvoir comparer toutes les conditions, suivi du test de comparaison multiple de Dunn pour déterminer où sont les différences observées. Pour élucider les mécanismes moléculaires, le traitement est également testé in vitro sur des modèles de cellules en culture afin de limiter le nombre de souris par groupe.

Raffinement

Une analgésie chimique est assurée en pré- et post-opératoire. Les souris sont anesthésiées par inhalation d'un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les souris seront ensuite transférées dans une cage également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec de l'enrichissement de type frisottis (Sizzle-Dri) et si besoin ajout d’un dôme (Cello dome). Les souris sont observées quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Si des signes cliniques sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit : 1 signe notable: visite 3 fois/semaine des animaux, mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage; 2 signes notables: administration d'un analgésique chimique toutes les 12h; 3 signes notables ou un signe sévère (point limite): euthanasie. -Signes notables: Plaie/Traumatisme: Lésion sans effraction cutanée; Comportement/Mouvement : Agitation/Agressivité, Hypomobilité/Hyporéactivité, incoordination modérée, mouvement répétitifs; Aspect général: Poil piqué, Coloration anormale de la peau, muscle flasque, Gonflement abdominal, Zone ano-génitale souillée; Excrétion : Fèces liquides; Evolution pondérale : Perte de poids inférieure à 15%; Consommation de nourriture : diminution/absence de prise de nourriture -Signes cliniques sévères : Plaie/Traumatisme: Lésion sévère (automutilation, plaie suintante,…), Traumatisme, Saignement incontrôlable; Comportement/Mouvement: absence de mouvement, Difficulté/ Impossibilité de mobilisation, Incoordination marquée, tremblements généralisés, Convulsions; Aspect général: , Coloration jaune/bleue des muqueuses, courbure du dos; Excrétion: Absence de fèces, Urines rouges; Evolution pondérale: Perte de poids supérieure à 20%; Consommation de nourriture: absence de prise de nourriture>2 jours

Choix des espèces

Pour la majorité des études portant sur la thérapie génique, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée par l'existence de plusieurs modèles murins d’arthrose qui en fait l’espèce la plus décrite dans la littérature internationale dans l’étude de cette pathologie. D’autre part la possibilité de constituer des groupes d'animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des calculs statistiques (n=20 par groupe) est nécessaire. Le modèle murin envisagé (C57BL/6J) est couramment utilisé dans le domaine de la thérapie génique et dans le domaine de la pathologie arthrosique. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose est possible et correspond aux autres études que nous réalisons dans le domaine.

6 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue et une centaine réutilisées. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules ou de fragments de tumeurs humaines ou murines sous la peau ou dans la mamelle, avec suivi de la croissance tumorale et prélèvement terminal des tumeurs et organes. Le porteur situe ce projet en amont d'études d'efficacité de candidats médicaments anticancéreux et fixe un point limite à un volume tumoral de 2 000 mm³. Il affirme que seul "un organisme vivant complet" permet de mesurer les effets d'une molécule et qu'une mauvaise connaissance du modèle serait "incompatible avec la règle des 3R".

Objectifs

Le but de ce projet préliminaire, situé en amont des études d’activité et d’efficacité anti-tumorale de candidats médicaments, est de définir les caractéristiques de croissance, les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, souche de souris,…), ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études de pharmacologie. Des greffes de tumeurs humaines ou murines, à partir de cellules ou fragments, vont ainsi être effectuées en sous-cutanée, en intra-mammaire ou en intradermique chez des souris. Des souris immunodéprimées seront utilisées pour limiter les problématiques de rejet. Les caractéristiques de croissance tumorale peuvent être évaluées selon deux méthodes : -par mesure au pied à coulisse ,technique non invasive et la plus classiquement utilisée. -par mesure via l’imagerie optique ,technique également non invasive, plus en plus utilisée en recherche car elle permet la détection beaucoup plus précoce de tumeurs en croissance, non visibles à l’œil nu ou non mesurables au pied à coulisse. Cette approche est fondamentale pour évaluer l’efficacité de nos traitements anti-cancéreux dans des modèles bien caractérisés.

Bénéfices attendus

En Europe comme aux Etats-Unis, le cancer est actuellement la seconde cause de mortalité après les maladies cardiovasculaires. En France, le cancer provoque environ 33% des décès chez les hommes et 23% chez les femmes. Il est donc primordial de s’intéresser à cette maladie et de trouver de nouvelles thérapies. Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales qui ont acquis, au cours du temps, un certain nombre de mutations faisant qu’elles ne répondent plus aux différents mécanismes de régulation et prolifèrent indéfiniment engendrant la formation d’une tumeur maligne et/ou de métastases. Un enjeu majeur pour la recherche consiste à trouver de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. Ce projet va ainsi consister à déterminer les conditions optimales de greffe de tumeurs et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de candidats médicaments. Ces modèles de souris greffées par des cellules tumorales doivent au préalable être mis au point et caractérisés pour chaque modèle qui va être étudié (tumeurs d’origine humaine ou de souris). Ces mises au point sont primordiales puisqu’elles permettent d’acquérir une bonne connaissance des modèles et constituent un paramètre essentiel pour une évaluation pharmacologique optimale de nos produits anti-cancéreux. Une mauvaise connaissance du modèle conduirait à des études inexploitables et serait incompatible avec la règle des 3R.

Procédures

- Puçage : un dispositif sous cutané est implanté à chaque animal quelques jours avant l’étude par trocart afin d’être identifié - Greffe de cellules ou de fragments tumoraux : 1 fois dans l’étude (Pour la greffe de cellules tumorales par voie sous-cutanée et intradermique il est possible de le faire anesthésié ou vigile en fonction de l’aisance du technicien, injection en quelques secondes). Les greffes par voie intra-mammaires et de fragments de tumeurs (par trocart) sont toujours réalisées sous anesthésie (temps d’anesthésie gazeuse 5 minutes, geste 1min30) - La mesure du volume tumoral est réalisée soit chez l’animal vigile par mesure au pied à coulisse (avec légère contention de l’animal de quelques minutes 2 fois minimum par semaine voir 3 fois lors du pic de croissance tumorale(environ 30 sec). - Soit chez l’animal anesthésié par mesure par imagerie 2 fois minimum par semaine voir 3 fois lors du Pic de croissance tumorale (anesthésie gazeuse de quelques minutes) - Prélèvement de sang en fin d’étude sur animal anesthésié et sans réveil consécutif par ponction à la veine cave ou par ponction cardiaque (anesthésie + geste 2min environs). - Prélèvement terminal de tumeur : la tumeur sera prélevée sur les animaux préalablement profondément anesthésiés à l’Isoflurane et euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Croissance tumorale sous cutanée limitée à 2000 mm3 (1500 mm3 pour les tumeurs intra-mammaires) Stress léger lié à la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de : puçage sous cutanée (1 implant, 15sec), greffe sous-cutanée, (1 injection. Environ 15 sec) ; pesée et mesure de tumeur par pied à coulisse (environ 30 sec, 2 à 3 fois/ semaine le temps de l’étude). Au cours de ce projet, nous serons vigilants sur les effets indésirables rares qui peuvent survenir tout au long des études : Perte de poids >20% du poids maximal pouvant être associée au développement de la tumeur ou ascite.

Devenir

Lorsque le volume tumoral est proche de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et/ou d’autres organes. Ces prélèvements seront utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Les animaux ne développant pas de tumeur pourront être réutilisés dans un autre protocole, dans la mesure du possible et à la suite d’une validation par SBEA et/ou vétérinaire de leur bon état général.

Remplacement

Pour tester l’activité de nouveaux composés, des tests in-vitro sont systématiquement mis en place sur des cellules en culture, mimant artificiellement la pathologie de l’homme. Grâce à ces tests in-vitro, des molécules actives sont sélectionnées avant d’être testées, en seconde intention, dans des modèles in-vivo de souris porteuses de tumeurs afin de démontrer leur activité et leur efficacité anti-tumorale. C’est en effet dans un organisme vivant complet que l’on peut mesurer les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in-vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales ou de fragments tumoraux chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux.

Réduction

Deux techniques d’évaluation de la croissance tumorale peuvent être employées : par pied à coulisse ou par imagerie optique (bioluminescence ou fluorescence). Ces 2 techniques, non invasives pour l’animal, présentent chacune leurs avantages et seront choisies en fonction des besoins expérimentaux. Le pied à coulisse permet ainsi une mesure rapide du volume de la tumeur chez l’animal éveillé. La bioluminescence permet une détection plus précoce des tumeurs ainsi qu’une détection de la prolifération métastatique pour certains types de tumeurs mais nécessite une anesthésie de la souris pendant la durée d’acquisition des données. Elles permettent toutes deux d’effectuer des mesures non douloureuses pour l’animal et de suivre l’évolution des tumeurs au cours du temps, ceci concourant à la réduction du nombre de souris nécessaires dans une même étude. D’autre part, un travail a été initié avec l’équipe de biostatistiques pour définir par simulation à partir des données observées dans l’étude de mise au point, des métriques quantitatives pour aider dans le choix des conditions pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. Ces métriques donneront des informations sur le jour de randomisation optimal, , la potentielle fenêtre thérapeutique ainsi que la taille de l’effet traitement qui pourra être évaluée avec 5 à 10 animaux par groupe en fonction de la variabilité de la croissance tumorale observée (utilisation d’un modèle statistique longitudinal basé sur une équation). Mais l’impact sur la réduction du nombre d’animaux est surtout présent pour les études qui seront effectuées grâce aux conditions prédéterminées dans le cadre de ce projet. Car si cette étape est optimisée techniquement et permet avec l’aide des biostats de quantifier la variabilité et le timing idéal pour la randomisation nous pourrons ajuster le nombre d’animaux. Et en connaissant au préalable le temps de la fenêtre thérapeutique nous pourrons garantir d’évaluer l’efficacité des candidats médicaments de la façon la plus relevante possible.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les souris sont hébergées en groupes sociaux et un enrichissement de milieu adapté est apporté de manière à favoriser leur instinct de nidification. Cet enrichissement va également permettre de surveiller l’état général des animaux par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci. L’état général des souris est surveillé régulièrement et les volumes tumoraux sont mesurés au minimum 2 /semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour identifier les éventuels signes de souffrance et appliquer les points limites prédéfinis dès que nécessaire. De plus, au-delà de 1500 mm3, (1000 mm3 pour tumeur mammaire) une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures est mise en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite lié au volume tumoral.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. La même souche de souris est utilisée pour l’ensemble des études in-vivo pour une tumeur donnée (DMA/DMT, pharmacocinétique, pharmacodynamie, efficacité). En effet, il peut exister des différences importantes en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit en fonction de la souche murine considérée, pouvant impacter les résultats. Le choix de la souche ainsi que les conditions optimales de greffe seront déterminés dans le cadre de ce projet, en amont des études de pharmacologie. Les souris sont utilisées à l’âge jeune adulte, à partir de 7semaines soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments.