Souris

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules humaines de cancer du foie puis des injections répétées d'un peptide cinq jours par semaine pendant environ un mois, avec surveillance de la croissance tumorale et du poids, pour évaluer l'effet antitumoral du peptide. Le projet fait suite à des résultats in vitro montrant une réduction des cellules cancéreuses. Le porteur affirme ne pas disposer d'alternative et juge nécessaire de tester l'effet dans un "système complet", la souris.

Objectifs

Le cancer du foie est selon l’OMS le septième cancer observé en termes d’incidence avec environ 782 000 nouveaux cas mondiaux par an. Malgré les progrès récents en matière de diagnostic et de traitement, ce cancer du foie est fréquemment diagnostiqué à un stade déjà avancé et avec un mauvais pronostic d’évolution. Les modèles animaux de greffes de tumeurs peuvent permettre de mieux comprendre la réponse aux médicaments chez l'Homme et de découvrir de nouveaux traitements anticancéreux. Les cellules hépatiques utilisées dans cette étude sont issues d'un patient atteint d'un cancer du foie. L’injection de ces cellules chez des souris permet ainsi d’étudier l’effet d’immunothérapies sur des cellules humaines. Le but de ce projet est d’analyser si le peptide thérapeutique a un effet anti tumoral chez des souris avec une greffe de cellules de patients atteints de cancer du foie. Ce projet est encouragé par des résulats in vitro précédents qui ont montré que ce peptide réduisait le nombre de cellules du cancer du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets d’un peptide sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre sa capacité d'action et l'impact de son injection sur des lignée tumorales connues. C’est un prérequis avant de tester notre stratégie thérapeutique dans différentes conditions expérimentales. Cette connaissance nous permettra à long terme de mettre en place des peptides thérapeutiques permettant de soigner certaines tumeurs du cancer du foie chez l'Homme.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons sur des souris vigiles à : - des injections par voie sous-cutanée (1X à l'age de 10 semaines) (20 animaux) (durée d'une injection : moins d'une minute) - des injections par voie intrapéritonéale (5X/semaine, sur une durée de 1 mois environ (20 animaux) (durée d'une injection : moins d'une minute)

Impact sur les animaux

Ce projet comprend le developpement de tumeurs, ainsi le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. De plus, les injections des cellules et les injections répétées de peptide peuvent également entraîner des nuisances.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences.

Remplacement

Le peptide utilisé dans cette étude a été testé in vitro sur des cellules de cancer du foie et a entrainé la réduction du nombre de cellules cancéreuses. Ces résultats nous encouragent à tester son effet dans une étude chez l’animal pour valider l’effet antitumoral. Actuellement, nous ne disposons pas d'alternative pour la validation de l'efficacité d'un traitement qui stimule le système immunitaire. Nous devons en effet étudier cet effet dans un système complet et compétent, tel que la souris, le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.

Réduction

Les effectifs de 10 animaux par groupe ont été mis en place suite aux prérequis statistiques, permettant, tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés, d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable. En fonction de la normalité des données (distribution des données en cloche) nous utiliserons les tests statistiques adéquates pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux (traitées avec le peptide vs traitées avec le véhicule).

Raffinement

Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. Par ailleurs, nous avons mis en place les points limites nécessaires, liés au volume des tumeurs portées par les animaux et à l'évolution probable de l'état de santé. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer que leur état de santé n'est pas détérioré et nous suivrons à chaque pesée (deux fois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Les tumeurs seront aussi palpées (pour détecter leur présence précoce), leurs volumes seront mesurés 2 fois par semaine et nous observerons aussi leur aspect. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. Les souris Balb/C nude sont particulièrement utilisées comme souris receveuses de greffe. En effet, le profond déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules humaines et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines chez un hôte murin. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. De nombreux outils permettent de caractériser les réponses aux traitements antitumoraux chez la souris. Par ailleurs, ce modèle est facile à manipuler et à héberger et nous disposons d'une bonne connaissance des mécanismes d'actions activés lors de la mise en place de tumeurs. Par ailleurs le cout d’hébergement est faible et la reproduction rapide. Les souris seront utilisées à l’âge de 10 semaines, soit à à un stade correspond à des jeunes adultes, permettant une bonne prise de greffe.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Rendues obèses par un régime gras, elles reçoivent un gavage quotidien, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des prélèvements de fèces répétés, avec des risques d'irritation du larynx ou de fausse route liés au gavage et des troubles digestifs, pour tester si une bactérie intestinale réduit l'inflammation liée à l'obésité. Le porteur ne détaille aucun test comportemental. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthode alternative", le modèle d'obésité alimentaire chez le rongeur étant présenté comme classique.

Objectifs

La littérature scientifique montre que l’obésité d’origine alimentaire est associée à une diminution de la prévalence d’une bactérie particulière du microbiote intestinal humain. De plus, il a été montré que l’obésité d’origine alimentaire provoque une inflammation systémique de bas grade, ou méta-inflammation. De précédentes études menées par une équipe de recherche ont montré que l’administration par gavage d’une souche particulière de cette bactérie permet de réduire la prise de poids de souris nourries par un régime riche en gras. L’objectif de l’étude est de déterminer si l’administration de cette bactérie permet également de réduire l’inflammation induite par l’obésité d’origine alimentaire chez des souris déjà obèses.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les potentiels effets anti-inflammatoires de Xla1 sur l’inflammation systémique induite par l’obésité. Dans un premier temps, il permettra de déterminer si la prise de Xla1 modifie l’inflammation systémique d’une souris mince. De plus, il permettra de déterminer si, dans un contexte d’obésité, Xla1 permet de réduire l’inflammation systémique ou locale, notamment au niveau du colon.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime normal ou riche en graisse pendant 8 semaines. Une partie des souris sera suivi pendant deux semaines, avec pesée journalière, prise de sang hebdomadaire et prélèvement de fèces 4 fois par semaine. Ces souris seront aussi gavées quotidiennement à partir d’une semaine après réception pendant une semaine. Le reste des souris sera suivi pendant 8 semaines, avec pesée journalière, prise de sang hebdomadaire et prélèvement de fèces 4 fois par semaine. Les souris seront aussi gavées quotidiennement à partir d’une semaine après réception pendant 7 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec un régime riche en gras pendant 12 semaines peuvent développer des effets indésirables liés à l’obésité. Notamment, un début de diabète entrainant une polyurie et/ou une polydipsie peuvent être observés. Pour le confort des animaux, la litière pourra être changée plus régulièrement et de l’eau sera à disposition ad libitum. La procédure de gavage peut entrainer des irritations du larynx ou des risques de fausse route pendant l’administration. La prise du traitement par Xla1 ou le véhicule peut entrainer des modifications du confort digestif des animaux, avec possibles diarrhées/constipations ou maux de ventre. Enfin, des saignements peuvent être observés à la suite des prises de sang.

Devenir

150 animaux sont inclus dans la procédure 1. Ces animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale : une partie 2 semaines après réception, une autre 8 semaines après réception.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à ce projet car la prévention de l'obésité d'origine alimentaire (DIO) chez le rongeur est le modèle classique pour étudier l'effet des médicaments anti-obésité. De plus, il est nécessaire d’effectuer ces expériences sur des souris déjà obèses afin d’observer un état inflammatoire induit par l’obésité et ainsi déterminer l’efficacité de Xla1 sur l’inflammation. Des expériences in vitro préliminaires ont conforté les résultats observés mais la confirmation de ces résultats sur un organisme complexe est nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé grâce à des expériences préliminaires : ces expériences ont montré que 10 animaux par groupes permettaient de réaliser des tests statistiques robustes (ANOVA) notamment sur le dosage de l’IL-6. De plus, le nombre d’animaux à sacrifier en début d’expérience a été réduit par 2 : les animaux n’ayant subi aucun traitement, la variabilité entre les souris sera réduite et permettra un test statistique robuste malgré un échantillon réduit. L’expérience sera répétée 3 fois pour confirmer les résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en groupe). Notamment, pour leur confort, les animaux obèses seront hébergés par 2 ou 3 maximum, et les animaux minces par 5. Les cages seront agrémentées d’un milieu enrichi avec des tunnels en carton, dômes et bâtonnets permettant la création de nids afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Les prises de sang submandibulaires seront réalisées sur des animaux vigiles. Pour leur confort et réduire le stress, les tentatives de piqûres seront réduites au minimum (deux tentatives maximum). L'inconfort et la souffrance seront limités grâce à l'utilisation d'un tableau de score, permettant l'établissement de points limites et la mise en place de mesures adaptées aux événements rencontrés (ex. injection d'anti-inflammatoire, utilisation de crème cicatrisantes, enrichissement des cages, adaptation de la nourriture).

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De plus, ces souris possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant d’étudier les effets de l’inflammation induite par l’obésité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 18 et 20 semaines) car le développement des organes sera terminé. De plus, il est nécessaire que les souris soient au moins nourries 12 semaines avec un régime riche en gras afin de pouvoir observer l’établissement de l’inflammation induite par l’obésité. Chez le fournisseur, après 6 semaines de croissance, les souris seront donc nourries au moins 12 semaines avec un régime riche en gras. Les souris contrôles seront sélectionnées parmi la fratrie des souris obèses et seront nourries à partir de 6 semaines et pendant la même durée que les souris obèses avec une alimentation standard. Toutes les souris seront donc âgées de 18 à 20 semaines lors de leur réception et du début de la procédure.

338 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis jusqu'à cinq injections de virus oncolytiques, avec des douleurs liées aux injections et à la croissance des tumeurs, la mise à mort intervenant à 20 % de perte de poids. Le projet teste des virus porteurs de protéines chimériques contre le cancer. Le porteur indique disposer de cultures 3D, sphéroïdes et puces microfluidiques, pour une partie de ses expériences, mais juge "l'organisme entier" nécessaire pour évaluer les effets immunitaires.

Objectifs

Les virus oncolytiques sont de nouveaux agents thérapeutiques dont les développements récents participent à l'essor des traitements par immunothérapie. Ces virus présentent 3 modes d’actions principaux, à savoir la capacité à 1) tuer directement les cellules tumorales, 2) induire une réponse immunitaire anti-tumorale et 3) vectoriser des protéines thérapeutiques qui seront uniquement produites dans le microenvironnement tumoral par les cellules cancéreuses infectées. Cette dernière propriété fait actuellement l’objet de nombreuses recherches au niveau international mais des questions importantes demeurent quant aux transgènes thérapeutiques à utiliser et aux conditions dans lesquelles ils doivent être administrés in vivo. Notre projet vise ainsi à étudier, chez la souris immunocompétente, les effets thérapeutiques de virus oncolytiques contenant un nouveau type de transgène codant pour des protéines chimériques qui cibleront plusieurs mécanismes immunitaires au sein du microenvironnement tumoral. Ces protéines chimériques, qui ont été développées dans notre laboratoire, comportent 3 domaines fonctionnels (inhibition des points de contrôle immunitaire, présentation antigénique, co-stimulation) et donnent des résultats très encourageants in vitro. Cependant, l’évaluation de ces différents mécanismes dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.

Bénéfices attendus

Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans de nombreux cas ces traitements présentent une efficacité limitée. De nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement très efficaces nécessitent une vectorisation appropriée pour profiter de leur efficacité tout en limitant les effets secondaires. Il a ainsi été montré qu’une vectorisation appropriée des agents anti-cancéreux permettait de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce type de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. L’utilisation de virus oncolytiques injectés par voie systémique pour vectoriser des molécules au sein même des tumeurs est une approche innovante destinée à répondre à ces problématiques. En créant de nouvelles protéines chimériques très actives et en les combinant au potentiel de vectorisation des virus oncolytiques, nous espérons pouvoir apporter des réponses thérapeutiques à des problèmes actuels en cancérologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales puis à des injections intraveineuses, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales répétées de traitements. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 5 injections (1 challenge + 4 traitements) par animal.

Impact sur les animaux

Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection de virus oncolytiques aux doses prévues n’entraîne pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Concernant la protéine thérapeutique ScFv-OVA-dm41BBL, nous n’avons pour le moment pas de données in vivo. Les données de la littérature sur les différents domaines protéiques qui la composent suggèrent que des effets secondaires auto-immuns pourraient être observés. Une attention particulière sera apportée au suivi de ces effets éventuels (peau, intestin et foie notamment). Chacune des procédures nécessitera la réalisation d'injections intraveineuse, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra aussi générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des virus et de leurs transgènes mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des virus oncolytiques en intraveineux, comme c’est le cas en clinique, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos virus sur un large panel de lignées cellulaires, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle et des effets systémiques de nos traitements une fois injectés dans un organisme, en particulier les effets immunitaires.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe légère à modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, poil ébouriffé, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental

Choix des espèces

L’objectif principal étant d’évaluer les effets immunitaires de nos nouvelles molécules chimériques et de leur vectorisation par des virus oncolytiques, l’utilisation de souris immunocompétentes et de modèles tumoraux syngéniques est essentielle. L’implantation sous-cutanée des cellules tumorales se justifie par le suivi facilité de la croissance tumorale et la comparaison avec les données de la littérature qui utilisent des approches similaires. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Elles subissent un protocole de stress chronique léger, confinement et inclinaison de la cage répétés, censé induire une anxiété transitoire, pour mesurer l'effet du stress de l'hôte sur le transfert de gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal. Le porteur décrit des nuisances minimes tout en classant les procédures en gravité modérée, et ne détaille comme test comportemental qu'un open field. Il affirme que le remplacement "n'est pas possible" car les effets du stress dépendraient de processus physiologiques que seuls des modèles in vivo permettraient d'appréhender.

Objectifs

Le microbiote intestinal est un écosystème microbien complexe dont l'équilibre et l'homéostasie sont entretenus par un afflux constant de micro-organismes commensaux. Sa composition est affectée à la fois par des facteurs intrinsèques tels que la génétique de l'hôte, et des facteurs extrinsèques comme les médicaments ou l'alimentation. De récents travaux, ont également montré que le stress de l’hôte, aigu ou chronique, pouvait avoir des effets profonds sur la composition et l'organisation du microbiote intestinal. Ces modulations peuvent être la conséquence soit de l'action directe des médiateurs du stress libérés dans la lumière intestinale sur les bactéries in situ, soit des modifications de la physiologie intestinale induite par le stress. Le microbiote intestinal est par ailleurs un réservoir majeur de gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) dont la dissémination pourrait également être influencée lors d’un stress de l’hôte. En effet, le microbiote intestinal représente un milieu extrêmement propice aux transferts de gènes de résistance entre bactéries dû à la grande diversité d’espèces incluant des souches résistantes aux antibiotiques, et un dialogue permanent entre les bactéries. En cas d’un stress de l’hôte, les bactéries constituant le microbiote vont se retrouver au contact de concentrations croissantes de marqueurs de stress (noradrénaline, glucocorticoïdes) provoquant des modifications de croissance et de virulence de certaines espèces. De plus, des données in vitro ont démontré que la noradrénaline stimulait le transfert de gènes entre deux souches bactériennes. Cet effet est inhibé par l’ajout dans le milieu de culture d’inhibiteurs de la noradrénaline. L’ensemble de ces observations suggère que le stress de l’hôte pourrait impacter la fréquence des transferts de gènes dans l’intestin, notamment des ARG, dans un contexte mondial préoccupant quant à l’expansion considérable des bactéries multi-résistantes. A l’heure actuelle, cette observation n’a pas été confirmée in vivo et nous souhaitons explorer cette hypothèse et évaluer la fréquence de transferts de gènes dans un modèle murin de stress léger chronique.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus ici permettront de conclure quant à la nature de l’effet d’un stress chronique vis-à-vis des transferts de gènes au sein du microbiote. Ces résultats seront donc tout à fait novateurs. Ces données permettront d’apporter un éclairage sur le rôle des facteurs liés au stress dans l’adaptation et l’évolution de l’écosystème digestif et notamment la mobilisation des gènes de résistance aux antibiotiques au sein du réservoir intestinal, ouvrant ainsi de nouvelles pistes de réflexion quant à la lutte contre la résistance aux antibiotiques. Dans le cas où une stimulation de ces transferts est observée, nous envisagerons de caractériser ultérieurement les voies impliquées dans ces phénomènes.

Procédures

Le protocole d'induction de stress chronique léger est basé sur l'utilisation de facteurs de stress sociaux et environnementaux. Aucun d'entre eux ne peut être considéré comme inducteur de douleur. Ce protocole de stress est léger car il y a des périodes pendant lesquelles l’animal n’est pas soumis à des stress et d’autre part ou il est exposé plusieurs fois dans la même semaine aux mêmes facteurs stressants (confinement, inclinaison de la cage). L’exposition répétée aux mêmes facteurs de stress donne généralement lieu à une habituation.

Impact sur les animaux

Aucun signe de douleur ou de détresse (telles qu’une position voutée, prostration, toilettage anormal (absent ou excessif) n’a été mis en évidence avec ces séquences comportementales sur 21 jours. Ce protocole de stress chronique entraîne l’apparition de traits d’anxiété mis en évidence en openfield. D’autres études montrent une disparition de l’anxiété et une récupération d’un état normal quelques jours après l’arrêt du protocole de 21 jours. Tous ces éléments indiquent qu'aucun effet indésirable n'est attendu. La seule nuisance attendue est une anxiété, induite par le protocole de stress chronique mais elle est transitoire.

Devenir

N/A

Remplacement

Les données in vitro de la littérature montrent un lien entre des molécules telles que les glucocorticoïdes, induites par le stress chronique, sur le transfert de gènes dans une souche bactérienne précise. Néanmoins, ces expériences ne prennent pas en compte la complexité du microbiote intestinal. De plus, le protocole d’induction du stress chronique léger comprend un ensemble de facteurs sociaux et environnementaux plus proche de la réalité physiologique que les modèles in vitro. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est donc pas possible dans ce contexte. En effet, les effets du stress chronique léger dépendent d’interactions cellulaires, de processus physiologiques et de l’état de l’être vivant. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que par l’utilisation de modèles in vivo.

Réduction

L'effectif total des animaux de ce projet a été déterminé par une analyse statistique permettant la réduction maximale du nombre de sujets inclus tout en garantissant une fiabilité forte des résultats qui seront obtenus dans ce projet.

Raffinement

Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude.

Choix des espèces

Des études récentes ont validé les effets de la procédure de stress chronique léger de 3 semaines sur des souris C57BL/6J. En effet, celui-ci induit une augmentation des glucocorticoïdes sanguins (marqueur du stress) et un phénotype anxieux (openfield). De plus, les expériences précédentes du laboratoire sur le transfert de gènes d’une bactérie donneuse au microbiote intestinal ont été optimisées sur les souris mâles C57BL/6J de 8 semaines. En particulier, la dose de bactéries donneuse capable d’induire une bonne implantation de la souche en 21 jours a été déterminée dans des souris C57BL/6J non soumises au stress. Pour toutes ces raisons, nous utiliserons le modèle murin C57BL/6J dans cette étude.

Les souris porteuses de gliomes ou de métastases cérébrales sont suivies jusqu'à une perte de 15 % de leur poids ou jusqu'à l'atteinte d'autres points limites, qui entraînent leur mise à mort immédiate. 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour comparer leurs images IRM à l'analyse de leurs tissus. Elles passent des examens IRM d'une heure au plus sous anesthésie générale, espacés d'au moins trois jours, avec à chaque fois une injection d'agent de contraste, et peuvent présenter titubation, léthargie, tête penchée, tremblements ou crises d'épilepsie. Le projet vise à distinguer par IRM la récidive d'une tumeur cérébrale de la nécrose due à la radiothérapie, mais le résumé ne décrit ni l'implantation des tumeurs, ni l'irradiation, ni le nombre d'examens par souris.

Objectifs

L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une méthode de choix pour la détection de tumeurs cérébrales. Cependant, les techniques d'IRM conventionnelles ne sont toujours pas capables de distinguer la progression tumorale de la radio-nécrose, car les deux présentent la même apparence sur les images IRM. Seuls des critères d'évaluation qualitatifs non reproductibles et subjectifs des lésions ont été proposés. Des performances modérées ont été rapportés grâce à l’implémentation de techniques d'IRM avancées. Ainsi actuellement, des séries d’examens IRM incluant l’ensemble de ces nouvelles techniques sont nécessaires pour affiner les pronostics sans pour autant atteindre 100% d’exactitude. L’actuel projet de recherche s'appuie lui sur la relaxométrie IRM. Cette technique permet de caractériser la microstructure du tissu et ainsi d'augmenter la spécificité de détection. De plus, pour résoudre le problème spécifique de la différenciation radio-nécrose/progression, ce projet adoptera une approche de pointe pour extraire des informations sur la microstructure du tissu au sein de chaque voxel (pixel en 3D). Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’IRM pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie de gliomes implantés ou de métastases cérébrales chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces données recueillies avec la nouvelle méthode IRM fourniront un point de départ solide pour 1) évaluer la possibilité d'éviter les biopsies et 2) évaluer plus précocement l'évolution de la maladie. Les résultats de ce projet bénéficieront à long terme aux patients atteints de cancers cérébraux. De nouveaux biomarqueurs permettant de distinguer la récidive tumorale de la nécrose seront développés et mis à disposition via des techniques d'IRM rapides et robustes compatibles avec l'environnement clinique. Cela facilitera le diagnostic et permettra une prescription de traitement adapté. De plus, cela devrait réduire la nécessité d'une biopsie chirurgicale et ainsi limiter les risques pour le patient. Finalement, cette nouvelle technique IRM améliorera le confort des patients (pas d’injection d’agents de contraste, acquisitions rapides, diagnostics plus précis, technique d’imagerie inoffensive).

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection d’agents de contraste IRM sous anesthésie générale à chaque examen IRM. Ces examens seront séparés d’au minimum 3 jours.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique. De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.

Devenir

A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés pour comparer les résultats obtenus en IRM avec des études histologiques, et ainsi valider le nouveau protocole IRM.

Remplacement

Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic plus précoces et fiables de la radionécrose (grâce à l’obtention d’images avec des résolutions spatiales et temporelles plus élevées, et des informations plus quantitatives). L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.

Réduction

Les séquences IRM sont déjà développées et ont déjà été évaluées sur des souris saines. Ainsi, seulement des souris pathologiques (portant soit des gliomes soit des métastases cérébrales) seront imagées. Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de trois jours entre chaque examen. De plus, les structures cérébrales contralatérales au gliome serviront de contrôle interne. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

L'utilisation d'anesthésies gazeuses, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. De plus, du gel ophtalmique sera utilisé pour éviter la secheresse oculaire. Il est à rappeler que l’expérience d’IRM en elle-même ne génère aucun signe de souffrance visible. Lors du positionnement de l’animal dans l’antenne IRM, la tête de l’animal est placée dans un masque surmonté d’un tuyau dans lequel circule de l'air etun anesthésique. Un ordinateur placé à côté de l’expérimentateur permet de contrôler en permanence la respiration de l’animal et d’adapter la dose d’anesthésique afin d’induire l’anesthésie la plus faible possible. Une expérience sur animal a une durée maximum de 1 heure. L’agent de contraste utilisé est un agent quotidiennement employé lors des examens d’IRM sur les patients. Cet agent de contraste n’entraîne pas d’effets secondaires. Les animaux seront injectés avec une dose 5 fois inférieure à la dose clinique. Les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Une grille de scorage a été instaurée pour surveiller la santé et le bien-être des animaux, comprenant des signes au niveau du comportement, de la mobilité, de la perte de poids, et de l’apparition de signes neurologiques. Si des signes de mal-être apparaissent, les animaux seront pris en charge par un analgésique. Des points limites ont aussi été instaurés, induisant une euthanasie immédiate. Les animaux seront observés au réveil pour une recherche de signes cliniques de la douleur.

Choix des espèces

Les souris C57Bl/6N et BalbC sont couramment utilisées dans la littérature, permettant de comparer nos résultats à des études précédentes. De plus, elles possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant de mimer la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.

Privées de la protéine p53, qui freine l'apparition des cancers, une partie des souris développe plus facilement des tumeurs spontanées en vieillissant, d'où leur emploi avant l'âge de 16 semaines. Au total, 2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les autres reçoivent par chirurgie sous anesthésie, sous la peau du dos, un fragment de tumeur du nasopharynx, puis chaque souris est traitée tous les jours pendant deux semaines, éveillée et sous contention, par injection intraveineuse ou gavage, et celles qui sont privées de p53 subissent en plus une prise de sang à la joue sans anesthésie chaque semaine pendant un mois. Après la mise à mort, les tumeurs sont analysées et la moelle osseuse prélevée. Le porteur affirme que "seul un animal vivant, entier, peut permettre d'étudier dans sa globalité l'effet des traitements", pour six composés déjà prescrits à des patients atteints d'autres cancers.

Objectifs

La protéine p53, appelée gardienne du génome, a pour rôle d’empêcher l’émergence et la prolifération de cellules cancéreuses lorsque des évènements favorisant leur apparition surviennent. En effet, dans de nombreux cancers cette protéine est modifié ou absente. Une autre protéine, MDM2, est décrite comme empêchant l’activité protectrice de p53 et jouerait donc un rôle dans l’apparition de cancers. Des composés thérapeutiques visant à empêcher la fonction de régulation de MDM2 sur p53 ont été développés, mais sans réel succès. Ceci signifie que MDM2 pourrait avoir un rôle plus important que ce qui est actuellement connu et agir sur d’autres molécules. Ce projet cherche à définir plus précisément l’implication de MDM2 dans le développement des cancers.

Bénéfices attendus

Les connaissances obtenues grâce à ce projet de recherche seront bénéfiques pour la communauté scientifique à court terme, afin de permettre d’appréhender la complexité du rôle de notre molécule d’intérêt dans la progression tumorale. A moyen terme, si l’un des composés que nous testons sur les cancers nasopharyngés est efficace (composés déjà indiqués pour un autre type de cancer en médecine humaine), cela pourra alors donner lieu à un essai clinique (dont l’objectif est d’évaluer la sécurité et l’efficacité du médicament) pour ce type de pathologie.

Procédures

Pour mener à bien ce projet, nous réaliserons deux types de protocoles expérimentaux utilisant des souris. Dans le premier axe, nous testerons l’effet de composés thérapeutiques déjà validés chez le patient pour certains cancers sur des tumeurs nasopharyngés (cancer où l’action protectrice de la molécule p53 est empêchée par notre molécule d’intérêt) qui auront été greffées sous la peau du dos de souris. Cette implantation se fait par chirurgie (petite incision de la peau) sous anesthésie générale et traitement anti-douleur (durée de la procédure maximum 10 minutes). Un mois plus tard, le traitement (6 composés différents administrés seul soit par voie intraveineuse soit par gavage) débute avec une administration quotidienne pendant 2 semaines. Chaque administration est réalisée sur souris éveillée et après contention et dure moins d’une minute. Dans le second axe, nous utiliserons des souris transgéniques n’exprimant pas la molécule p53. Cela nous permettra de caractériser l’effet des composés thérapeutiques en absence de l’action de notre molécule d’intérêt sur la protéine protectrice du cancer. Pour cela ces souris recevront les traitements comme décrits pour l’autre modèle. Chaque semaine pendant un mois, un prélèvement de sang au niveau de la joue (geste réalisé sans anesthésie et d’une durée de 10 secondes) permettra de suivre l’effet des traitements sur la composition du sang.

Impact sur les animaux

Dans la mise en place du premier axe de recherche, l’implantation chirurgicale du fragment tumoral va impliquer une suture avec un risque de mauvaise cicatrisation. Lorsque le fragment tumoral greffé va croître, sa taille pourra donc entraîner une gêne dans le déplacement des souris et une nécrose pourrait également apparaître. L’administration répétée des composés thérapeutiques (une fois par jour pendant deux semaines) pourrait entrainer une ulcération au site d’injection (pour les administrations dans la veine) et une irritation du tube digestif (dans le cas de l’administration orale avec une sonde de gavage). Enfin les souris transgéniques n’exprimant pas la molécule p53 peuvent développer plus facilement des cancers spontanés en vieillissant (apparition de tumeurs affectant le bien-être de l'animal: difficulté de déplacement, douleur liée à la présence de la tumeur).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Dans le cas du modèle de greffe d’un tissu tumoral sous la peau, cela permettra de faire l’analyse de ce tissu après le traitement avec nos différents composés thérapeutiques. Dans le cas des souris transgéniques n’exprimant pas la molécule pouvant jouer un rôle dans le développement du cancer, nous récupérerons la moelle osseuse après l’euthanasie afin d’en faire une fine caractérisation (effet des thérapies sur les différentes types de cellules présentes).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale (caractérisée par une régression de la tumeur), ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte normal ou pathologique. Cela est impossible à reproduire complètement dans des systèmes artificiels n'utilisant pas d'animaux. De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux.

Réduction

Nous utilisons le nombre minimal de souris nécessaires à l’obtention de résultats statistiquement interprétables. Des expériences in vitro, n'utilisant pas d'animaux, ont été réalisées au préalable.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement mis en place, les procédures de chirurgie seront réalisées sous anesthésie générale et avec une analgésie adaptée. Nous surveillerons dans les premiers jours la suture (absence d’infection, bonne cicatrisation). Une surveillance quotidienne (visuelle) sera mise en place et complétée par un suivi clinique toutes les 48h. Nous avons établi une grille d’évaluation clinique prenant en compte la croissance de la tumeur et l’état général de la souris nous permettra de mettre en place des actions correctives nécessaires (analgésie, euthanasie). Dans le cas de douleur liée à l’administration répétée des composés thérapeutiques, une analgésie sera administrée. Si aucune amélioration n'est observée dans les 24h, la souris sera euthanasiée. Enfin, les souris seront hébergées en groupe et dans des cages contenant un enrichissement (papier kraft pour faire des nids et buchettes en bois à ronger).

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont la génétique est bien connue ce qui nous permet d’utiliser un modèle transgénique bien établi. De plus, la connaissance de son comportement permet aussi l’évaluation du bien-être de la souris et la souffrance liée à l’expérimentation animale peut être aisément effectuée (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, prostration) permettant ainsi une prise en charge rapide et adaptée. Nous utiliserons des souris adultes (7 semaines au début du projet) car cette maladie touche essentiellement des sujets adultes. Dans le cas des souris transgéniques, nous les utiliserons avant l’âge de 16 semaines afin de ne pas être confrontées à l’apparition de tumeurs spontanées.