Souris
Effet d’une combinaison de nutriments sur la prévention du déclin cognitif lié à l’âge chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent pendant deux mois une alimentation enrichie en extraits végétaux et sont soumises à des tests comportementaux de mémoire que le porteur ne précise pas, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le projet répond à une collaboration avec un partenaire industriel visant à démontrer l'effet d'une supplémentation nutritionnelle. Le porteur affirme que l'étude de la mémoire ne peut se faire que sur des animaux vivants.
Objectifs
Le projet de recherche est porté par un laboratoire académique et répond à une collaboration avec un partenaire industriel. Il a été autorisé par la Direction d'Unité. Aucun projet ne sera initié sans validation par le donneur d'ordre. Les procédures décrites dans ce document ne font pas double emploi. Toutes les molécules testées dans ce projet sont des nutriments et ont déjà été validées sur le plan de l'alimentarité. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité d'une supplementation en extraits végétaux sur la prevention du déclin cognitif lié à l'âge.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif de démontrer qu’une supplémentation nutritionnelle en nutriments permet de prévenir des altérations cognitives qui apparaissent au cours du vieillissement physiologique mais qui impactent la qualité de vie des personnes. Ce projet s’inscrit dans le cadre de recherche portant sur la nutrition préventive et personnalisée. Les résultats attendus sont donc une prévention des altérations de mémoire classiquement observées au cours du vieillissement.
Procédures
Afin d’évaluer l’impact de nutriments sur la mémoire, les animaux seront supplémentés pendant 2 mois avec des nutriments provenant d'extaits végétaux. La supplémentation sera ajoutée directement dans les croquettes lors de leur fabrication . Les animaux adultes contrôles recevront un régime standard. Toutes les molécules testées dans ce projet sont des nutriments et ont déjà été validées sur le plan alimentairee. Afin d’évaluer les troubles de mémoire des animaux, les souris seront soumises, au cours de la supplémentation, à différents tests comportementaux couramment utilisés au laboratoire . Ces tests permetrtont d'évaluer les capacités d'apprentissage des animaux ainsi que leur mémoire.,
Impact sur les animaux
Il n'y a pas d'effets indésirables attendus qui seraient induits par le supplémentation car l'alimentarité du produit a été démontré. Les tests comportementaux peuvent induire un stress chez l'animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes, dont le cerveau en vue d’études biochimiques.
Remplacement
L'étude de comportements de la mémoire ne peut être réalisée que sur animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro.
Réduction
En effet, le nombre d'animaux sera réduit au mieux en se basant sur des expériences préalablement menées au laboratoire qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. Les effectifs seront determinés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgiques avant anesthésie) et l'inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l'hébergement) des animaux. Des points limites ont été définis et une grille de score sera appliqué. L'hébergement se fera en cages collectives et l'environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. La mise à mort sera réalisée via l’administration d’un produit euthanasiant sous analgésie générale.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. C'est un animal sur lequel les traitements nutritionnels et les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Les souris arriveront à l’animalerie à l’âge adulte de 7 semaines et/ou de 16 mois, âges à partir desquels les supplémentations seront administrées aux animaux.
Développement de vecteurs non viraux en vue du traitement des surdités congénitales
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux âgés de 2 à 30 jours subissent une chirurgie d'injection intra-cochléaire de vecteurs, sont séparés de leur mère le temps de l'intervention, puis tués par dislocation cervicale quinze jours plus tard pour étudier leur cochlée. Le porteur indique qu'aucun modèle in vitro d'oreille interne ne permet de tester la diffusion des vecteurs dans le temps. Une éventuelle application aux surdités humaines est renvoyée à une dizaine d'années, après des tests sur des porcs.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de corriger certaines surdités d’origine génétique, grâce au développement de nouveaux transporteurs (vecteurs) non viraux permettant d’acheminer l’information génétique corrigée aux cellules de l’organe de l’audition, la cochlée, afin de restaurer les capacités auditives. Ces tests seront réalisés sur des souris C57/Bl6, dont l'oreille interne est bien caractérisée et proche de celle de l’homme. Objectif : Optimiser les conditions d’utilisation (efficacité, localisation) de vecteurs non viraux au sein de la cochlée.
Bénéfices attendus
Le développement de vecteurs non viraux efficaces au niveau de l’oreille interne pourrait permettre leur utilisation pour corriger les surdités congénitales humaines. Celles-ci sont actuellement traités par appareillage auditif ou implantation cochléaire en fonction de l’intensité de la perte auditive. Bien que ces traitements soient dans la majorité des cas efficaces, les résultats sont imparfaits dans certaines conditions, notamment pour la compréhension de la parole en milieu bruyant. Le développement d’alternatives permettrait d’optimiser la correction apportée, et améliorer la qualité de vie des individus ayant une surdité congénitale. Le temps estimé du projet est de 2 ans. En fonction des résultats, notamment de l’efficacité et de la localisation, nous pourrons cibler au mieux certaines anomalies génétiques provoquant une surdité. Nous testerons l’efficacité de la thérapie génique sur des modèles murins, pour une durée estimée de 4 ans, car nécessitant un suivi plus prolongé. Si l’efficacité est confirmée, des tests sur modèles porcins seront nécessaires avant une potentielle utilisation chez l’homme, dans une dizaine d’années.
Procédures
180 souris auront une injection intra cochléaire (chirurgie d'une durée de 5 à 8 minutes sous anesthésie générale) à 2 ou 15 ou 21 ou 30 jours après la naissance et seront mises à mort 15 jours après l'injection.
Impact sur les animaux
Les procédures d’injection intra cochléaire peuvent être source d’inconfort pour les animaux (douleur, risque d’infection), pendant environ une semaine. Les pesées réalisées quotidiennement après injection seront source de stress, les 3 premiers jours, puis tous les 3 à 4 jours, soit 5 à 6 pesées par animal. Les souris à un âge précoce seront séparés de leur mère pendant une dizaine de minutes le temps de l'injection.
Devenir
Les animaux seront mis à mort par dislocation des vertèbres cervicales, pour étude des cochlées.
Remplacement
La conformation 3D des explants utilisés in vitro est incomplète, et ne permet pas de refléter la diffusion in vivo. De plus, ces explants ont une durée de vie limitée de 3 à 5 jours. Il n’existe pas actuellement de modèle d’oreille interne utilisable in vitro permettant de tester la transfection au cours du temps, et dans les mêmes conditions 3D qu’in vivo, et il n’existe pas non plus de lignées de cellules ciliées de cochlées , ou de culture primaire de cellules ciliées à partir de prélèvement, qui permettraient de cibler spécifiquement les cellules d’intérêt. Le remplacement est donc impossible.
Réduction
Des explants d’oreille interne ont été utilisés in vitro permettant de sélectionner les 2 vecteurs les plus efficaces, à partir de prélèvements réalisés sur animaux mis à mort hors champ réglementaire et autorisés par la structure bien-être de l'établissement. Après utilisation de 36 animaux, si l'analyse statistique intermédiaire (Test de Mann-Whitney) montre des résultats significatifs, le projet sera poursuivi sur 144 animaux.
Raffinement
En complément de l'anesthésie générale, des anesthésiques locaux seront utilisés pour gérer la douleur post-opératoire générée par l’injection de vecteurs et l’incision réalisée au niveau de l’oreille interne. Concernant le suivi journalier des animaux, des grilles de soin adaptées à notre procédure ont été établies afin d’identifier pour chaque animal les points limites et points limites terminaux permettant de prendre en charge immédiatement les signes de stress, d’angoisse ou de douleur.
Choix des espèces
L'utilisation de souris pour étudier de nouveaux transporteurs (vecteurs) au sein de l’oreille interne est pertinente car : -L’oreille interne de souris est morphologiquement proche de celle de l’homme -Nous maîtrisons la technique chirurgicale nécessaire à la mise en place de ce modèle, qui ne provoque pas de baisse d'audition. Les injections seront réalisées 2 ou 3 jours après la naissance, équivalent du stade embryonnaire chez l’homme, en termes de développement de l’oreille interne. Les souris étant sourdes à cet âge, à 15 jours de vie, au début du développement de l’oreille interne, à 21 jours de vie en cours de développement de l’oreille interne et à 30 jours de vie à la fin du développement de l’oreille interne. Différentes études ont montré des différences en termes de répartition des transporteurs (vecteurs) en fonction de l’âge des souris.
Étude de la peur chez le rongeur : rôle des réactivations neuronales en lien avec une mémoire aversive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
514 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'au sévère, déclaré sévère pour 380 d'entre elles. Elles subissent une injection intracérébrale de virus et l'implantation de fibres optiques ou d'électrodes, puis un conditionnement qui associe un environnement à des stimulations désagréables, avant la réactivation optogénétique des neurones et la mise à mort. Le porteur étudie la peur et l'anxiété et affirme que ce travail ne peut se faire ni in vitro ni chez des invertébrés, jugés trop simples. Les retombées annoncées pour les troubles anxieux humains restent hypothétiques.
Objectifs
Les troubles anxieux représenteraient d’un quart à la moitié des troubles mentaux à travers le monde. En France, la prévalence des troubles anxieux est de 21,6%. Malgré cette prévalence, les traitements ne sont efficaces que chez seulement 30% des patients. Cette faible efficacité peut être en partie expliquée par la difficulté de classer précisément les différentes réactions de peur (comme les crises de panique et l’anxiété) dans les modèles animaux. Or, de récentes études menées au sein de notre laboratoire ont montré qu'un nouveau protocole expérimental permettait l'identification chez la souris de 2 états similaires à la panique et l'anxiété. Avec cette nouvelle perspective, l'anxiété semble être liée a des réactivations de neurones liés à une mémoire négative dans le cerveau. Le but de ce projet serait alors d'étudier l'impact de la réactivation artificielle de neurones liés à une mémoire négative chez la souris afin de savoir si cela permet l'observation d'un état similaire à l'anxiété. L'ensemble de ces travaux permetrait une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux et corporels impliqués dans des situations aversives, comme la peur et l'anxiété.
Bénéfices attendus
Ces travaux apparaissent comme nécessaires afin de pouvoir améliorer notre compréhension des troubles liés à la peur car ils pourraient permettre une définition claire des troubles associés à la peur, notamment en se basant sur des critères objectifs, universels et mesurables. Cette meilleure définition pourrait alors permettre une meilleure identification et évaluation de troubles mentaux afin d'anticiper leur apparition et d'améliorer la prise en charge des patients. De par l'utilisation du modèle rongeur, nous espérons pouvoir transposer les résultats de nos travaux non seulement aux patients atteints de troubles mentaux, mais aussi à d'autres espèces animales comme les animaux de production ou domestiques. En effet, les résultats de ces travaux pourraient également permettre une meilleure évaluation de l'état émotionnel de l'animal, thématique d'importance croissante dans l'amélioration du bien-être animal.
Procédures
La plupart des animaux de ce projet subiront une injection intracérébrale de virus permettant l'expression de protéines fluorescentes et parfois d'opsines (molécules permettant l'activation du neurone après stimulation lumineuse). Un quart des animaux ne subira qu'une deuxième rapide chirurgie pour implanter des fibres optiques en position intracérébrale. Les autres subiront une chirurgie plus technique permettant notamment l'enregistrement de signaux électrophysiologiques et l'implantation de fibres optiques. Suite à ces chirurgies, la plupart des animaux suivront un protocole d'association d'un environnement donné à des stimulations désagréables. Ils seront ensuite replacés dans cet environnement pour étudier la mémoire qu'ils en ont. Dans un autre temps, les neurones associés à cet environnement seront réactivés dans un contexte neutre. Après ce protocole expérimental qui dure de 3 à 4 semaines, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes ainsi que les caractéristiques (niveau d'activation, nombre, localisation,..) des neurones qui ont été réactivés.
Impact sur les animaux
Pour réaliser les travaux de ce projet, il est nécessaire de réaliser des procédures invasives sur les sujets expérimentaux comme l'injection intracérébrale ou la chirurgie d'implantation des électrodes. De plus, le protocole de conditionnement aversif implique d'utiliser des stimulations désagréables pour l'animal afin de mieux pouvoir étudier la peur. Tout au long de leur hébergement, les animaux ont accès dans leur cage à des objets d’enrichissement (dôme, tubes). Le suivi par le personnel de l'animalerie est quotidien dans un contexte général et le suivi post-chirurgie est assuré par l'expérimentateur quotidiennement pendant une semaine avec relevé de signes potentiels de douleur et prise en charge analgésique si nécessaire.
Devenir
A l'issue de la procédure 1 et 2, les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes ainsi que les caractéristiques (niveau d'activation, nombre, localisation,..) des neurones qui ont été réactivés.
Remplacement
Notre objectif est de comparer les réactions de défense quand elles sont induites par une expérience réelle et quand elles sont initiées par le souvenir d’une expérience aversive. Ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Ces études ne peuvent pas non plus être réalisées chez les invertébrés, qui ont une structure cérébrale et un comportement trop simple De plus nous souhaitons étudier à la fois les réactions comportementales mais aussi les paramètres physiologiques comme la respiration ou le rythme cardiaque pour pouvoir faire un parallèle avec l’Homme (en plus de la proximité des agents pharmacologiques pour traiter les troubles anxieux). Enfin, les outils permettant de manipuler les neurones liés à un souvenir aversifs nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques et ont été le mieux caractérisés chez la souris. Le modèle rongeur est le seul modèle permettant de répondre à tous ces critères.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés nous adoptons une stratégie où nous vérifions méthodiquement et progressivement l’efficacité de la technique. En effet, la procédure 1 a pour but de mieux appréhender les caractéristiques des neurones réactivés par optogénétique et donc les effets observés dans la procédure 2. Le nombre d'animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire, pour pouvoir réaliser des tests statistiques, à partir de nos résultats. Étant donné que nos résultats dépendent de l’efficacité des injections virales, de l’efficacité du conditionnement, de l’efficacité de la procédure chirurgicale,... globalement de la bonne réussite dans l’enchainement des gestes techniques, le nombre d’animaux total doit être conséquent. Néanmoins, la quantité massive d’informations apportés par un seul animal opérationnel est telle qu’elle peut permettre des analyses de haut niveau pendant plusieurs années.
Raffinement
Nos procédures seront optimisées afin de minimiser la douleur et la souffrance des animaux. Les chirurgies se feront en conformité avec la règlementation (anesthésie et analgésie appropriées). Les animaux recevront un soin optimal après les chirurgies. Tout au long de leur hébergement, les animaux ont accès dans leur cage à des objets d’enrichissement (dôme, tubes). Le suivi par le personnel de l'animalerie est quotidien dans un contexte général et le suivi post-chirurgie est assuré par l'expérimentateur quotidiennement pendant une semaine avec relevé de signes potentiels de douleur et prise en charge analgésique si nécessaire.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car il s’agit de l’espèce pour laquelle nous avons le plus de données préexistantes dans ce domaine permettant de réduire au maximum les expériences préliminaires pour la validation des procédures. De plus, il s’agit de l’espèce, pour laquelle l’outil pharmacogénétique est le plus développé et le plus caractérisé. Nous utiliserons des souris de laboratoire sans modification génétique ainsi que des souris transgéniques. L’efficacité des infections virales au niveau du cerveau décroît avec l’âge de la souris. En revanche, la procédure de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance de l’os du crâne est stabilisée. C’est pourquoi, en accord avec la littérature, nous choisirons un âge compris entre 5 et 9 semaines pour réaliser les injections stéréotaxiques. Les implantations d’électrodes se feront 1 semaine après les injections de virus.
Etude des modifications de l’activité des gènes impliqués dans la croissance des cellules de cancers du sang
- Recherche fondamentale
- Oncologie
795 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes, elles sont irradiées puis greffées avec des cellules leucémiques humaines, subissent des prélèvements de sang à la joue et des ponctions de moelle osseuse au fémur, avant d'être tuées pour analyse. Le porteur indique que la maladie peut provoquer perte de poids, baisse de mobilité et, rarement, paralysie des membres. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet de cultiver ces cellules leucémiques, trop fragiles hors d'un organisme vivant.
Objectifs
La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une forme de cancer qui touche les cellules de la moelle osseuse, qui produisent normalement les globules rouges, les plaquettes et les globules blancs. La leucémie est caractérisée par la prolifération excessive et le blocage de la maturation de ces cellules immatures. Les leucémies affectent enfants et adultes, et bien que, ces dernières décennies, de nombreux progrès ont été fait du point de vue thérapeutique, des rechutes fatales sont observées dans 20 % des cas pédiatriques ; chez l’adulte, la survie globale à 5 ans est seulement de 30-40% chez les patients de moins de 60 ans, et de 20% pour les plus de 60 ans. Un sous type particulier de cancers du sang affectant les cellules myéloïdes (les leucémies aiguës à mégacaryoblastes) sont généralement observées chez l’enfant et sont de très mauvais pronostic. Elles résultent d’une prolifération accrue des cellules à l’origine des plaquettes, bloquant ainsi leur maturation en plaquette. Il est donc essentiel de poursuivre la compréhension des mécanismes conduisant à ces pathologies pour concevoir des thérapies ciblées afin d’améliorer la survie des patients leucémiques. L’objectif de notre projet est d’identifier des régions du génome humain qui régulent l’expression de gènes favorisant les cancers. Afin de réaliser cet objectif nous utiliserons un modèle de cancers du sang affectant les cellules myéloide humaine se développant dans des souris dépourvues de système immunitaire et ne pouvant rejeter la greffe, seule façon de modéliser cette maladie.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes conduisant au cancer doit nous conduire à concevoir des thérapies ciblées. Au terme de notre projet, les résultats obtenus devraient contribuer à l’amélioration des traitements proposés aux patients.
Procédures
Nous utiliserons des souris dépourvues de système immunitaire permettant ainsi l'amplification (absence de rejet de la greffe) des cellules tumorales de patients atteints de LAM. Les souris seront irradiées avec une dose suffisamment faible pour ne pas induire leur mort mais permettant la greffe de cellules humaines (durée de l'irradiation: moins de 2 min). Ces cellules seront injectées quelques heures après l’irradiation dans la veine de la queue, aucune anesthésie ou analgésie ne sera nécessaire (durée de l'injection: 30 s). Les souris recevront un traitement antibiotique dilué dans l’eau de boisson durant les 2 semaines suivantes afin d’éviter tout risque d’infection liée à la perte de leur système immunitaire. Des échantillons de sang seront prélevés sur souris éveillée de manière bi-mensuelle dans la veine de la joue, la durée d’un prélèvement est inférieure à une minute. Ces prélèvements seront effectués pendant 3 mois et demi suivant l’injection de cellules. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins deux semaines. Des prélèvements de moelle osseuse réalisés au niveau du fémur pourront être réalisés deux fois maximum à 2 semaines d’intervalle. Pour cela, une anesthésie gazeuse sera effectuée, la durée d’un prélèvement est inférieure à 5 minutes. Une analgésie est prévue afin d’éviter la douleur.
Impact sur les animaux
Une perte de poids, une réduction de la mobilité et une négligence du toilettage pourraient être observés chez les animaux lors de la progression de la leucémie. Une paralysie des membres inférieurs peut être observé dans de très rares cas. L’irradiation sublétale des animaux, conduisant à l’ablation des cellules immunitaires, peut rendre les animaux plus susceptibles aux infections. Les prélèvements sanguins itératifs et les biopsies de moelle osseuse peuvent représenter un risque hémorragique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à différents temps et les organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode alternative permettant de cultiver les cellules leucémiques primaires de patients in vitro. En effet, ces cellules sont extrêmement fragiles et ne peuvent pas être maintenues en vie en dehors d'un organisme vivant. En outre, la culture cellulaire ne permet pas de modéliser les différentes interactions entre les cellules tumorales et l’environnement dans lequel elles prolifèrent. Ces interactions ne sont possibles que dans un organisme entier vivant afin de conserver les interactions des cellules leucémiques avec les cellules des organes environnants.
Réduction
Grâce à des analyses statistiques, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements, ...etc.). De plus, un suivi clinique des souris sera également entrepris 2 fois par semaine pour détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. L'administration d'un antalgique sera réalisée en cas de douleur légère avant l'euthanasie de l'animal si son état se dégrade soudainement. Enfin, les cages où sont maintenus les animaux feront l’objet d’un change hebdomadaire, et nous nous assurerons d’y apporter le maximum d’enrichissements (Social : les souris seront en groupe de 5 pour favoriser les interactions sociales entre elles. Matériel : bûchettes en bois, papier kraft, tunnels, ...etc.).
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Les souris seront des souris adultes afin de maximiser la prise de greffe comme cela a été décrit auparavant dans la littérature scientifique.
Evaluation du profil d’élimination, de la tolérance et de l’efficacité d’un traitement pour une pathologie de l’os sur un modèle souris (2022-B-019)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
5 750 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 1 835 réutilisées pour entraîner le personnel aux gestes techniques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une fragilité osseuse décrite comme un phénotype dommageable, elles subissent tatouage, injections sous-cutanées répétées et prélèvements de sang, avant un prélèvement terminal sous anesthésie. Le porteur écarte l'adoption au motif qu'il s'agit de souris transgéniques. Il affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire et qu'aucune méthode in vitro validée n'offre d'alternative.
Objectifs
Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, l’efficacité et la tolérance de molécules à visée thérapeutique dans le cadre de traitement des problèmes de fragilité et densité osseuse sur un modèle de souris. Dans ce projet, nous allons tester des molécules en développement qui ont montrées un potentiel thérapeutique élevé in vitro et une bonne tolérance in vivo sur des animaux ne developpant aucune pathologie (objet d’une précédente Demande d'Autorisation de Projet).
Bénéfices attendus
Les maladies touchant la densité osseuse sont des pathologies lourdes, pouvant être létales. Elles se caractérisent chez les patients par des troubles du tissu conjonctif entrainant une faible masse osseuse, une fragilité osseuse et des fractures. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif, c’est pourquoi il est nécessaire de développer de telles thérapies. Ce projet permettra de sélectionner des molécules d’intérêts pour des études pré-cliniques et cliniques.
Procédures
- Identification individuelle à l'oreille, tatouage (
Impact sur les animaux
Ce projet sera réalisé sur des souris présentant des fragilités osseuses, il s'agit d'un phénotype dommageable. Les premiers animaux générés (autre établissement utilisateur) expriment le phénotype attendu dès 2 mois : faible masse osseuse, une augmentation de la fragilité osseuse et des risques de fractures. Ces animaux sont également de petite taille. Etant donné le phénotype, seuls les mâles porteurs de la pathologie seront utilisés pour la reproduction. Les portées sont de tailles normales. Les femelles porteurses de la pathologie seront utilisées lors des expérimentations. S'agissant d'une lignée nouvellement créée, nous seront particulièrement vigilant quant à tout nouveau phénotype observé.
Devenir
Procédure 1: Les animaux trop vieux pour la reproduction seront euthanasiés. Les animaux ne développant aucune pathologies et surnuméraires pourront être utilisés dans un projet de formation aux gestes techniques (nous estimons à 1 835 le nombre de mâles générés et ne développant aucune pathologie). Etant donné qu’il s’agit de souris transgéniques, l’adoption ne peut être envisagé ici. Procédure 2 :Tous les animaux utilisés dans l’étude sont mis à mort afin de réaliser des analyses ex vivo.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’une molécule à visée thérapeutique en développement pour une utilisation chez l’Homme. Pour cela un organisme entier est nécessaire. Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet.
Réduction
Les molécules évaluées dans ce projet auront été auparavant testées in vitro afin de n’administrer que les molécules présentant un potentiel thérapeutiques élevé sur les animaux et ainsi réduire leur nombre. Les molécules testées ici sur des animaux transgéniques ont également fait l’objet d’une précédente demande avec des animaux ne développant aucune pathologie et seules celles ayant démontré une bonne tolérance seront utilisées. Des groupes de maximum 10 animaux sont réalisés, puisqu’il a été observé lors d’études préliminaires (réalisées dans un autre établissement) que ce nombre permettait d’avoir des résultats statistiques significatifs.
Raffinement
Dans un but de raffinement des expériences, nous réalisons une évaluation précise de l’état de santé des animaux au cours de l’hébergement et des procédures expérimentales grâce à des grilles de suivis et l’établissement de points limites précoces. Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux (ex: recours à l'anesthésie avant certains prélèvements). Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation des signes cliniques, la pesée des animaux après la période d’acclimatation et lors des injections. Les points limites spécifiques mis en place seront appliqués. Etant donné le phénotype des animaux, ils seront manipulés le moins possible et avec précaution. Bien que les traitements testés dans ce projet aient déjà démontrées une bonne tolérance in vitro ainsi que sur des animaux ne developpant pas de pathologie, nous porterons une attention accrue sur les animaux en cours de traitement tout au long de l’étude : comportement, sites d’injection, sites de prélèvement, poids, signes cliniques…
Choix des espèces
Compte tenu des connaissances et des technologies actuelles, la souris est un modèle de choix pour les modifications génétiques. Nous utilisons ici un modèle de souris dans lequel a été modifié un gène codant pour une protéine de la matrice osseuse. Cette modification génétique est retrouvée chez 80% des patients et ce modèle permet de récapituler au mieux la pathologie étudiée. C’est pourquoi nous utilisons la souris dans ce projet. Pour l’élevage, les animaux seront mis en croisement à partir de l’âge de 8 semaines (âge de maturité sexuelle) jusqu’à maximum 10 mois d’âge (âge au cours duquel la fertilité des animaux diminue). Pour les expérimentations, les animaux seront utilisés à partir de 8 à 10 semaines d’âge minimum et jusqu’à 18 à 20 semaines. En effet le pic de densité osseuse chez les souris C57Bl6/J (maturité du squelette) est atteint à l’âge de 4 mois. Nous choisissons d’évaluer l’efficacité des molécules sur la densité osseuse sur des animaux entre 8/10 et 18/20 semaines (durée du traitement) afin d’inclure la période de puberté. Lors d’une étude pilote (réalisée dans une autre CRO), il n’y a pas eu d’effet observé de cette classe de molécule sur des souris jeunes (2 semaines) contrairement à l’utilisation de souris de 8 semaines.
Evaluation de l’activité pharmacodynamique d’un composé chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente et porteuse de tumeur greffée en voie sous-cutanée, intra-dermique ou intra-mammaire.
- Recherche appliquée
- Cancers
22 750 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 525 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules ou de fragments tumoraux en sous-cutané, intradermique ou intra-mammaire, des administrations de candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour et des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour prélever la tumeur. Le porteur fixe un point limite de volume tumoral de 1 500 à 2 000 mm3 et indique que les souris surnuméraires servent à entraîner le personnel aux gestes techniques. Il affirme que l'étape animale reste "indispensable" pour évaluer une molécule anticancéreuse dans un organisme complet.
Objectifs
Les études de pharmacodynamie ont pour but d’évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt par un candidat médicament, au sein d’un organisme vivant et complexe. Une série de tests in vitro (biochimiques et cellulaires) est réalisée en amont afin d’identifier le meilleur candidat. Parallèlement, des tests de pharmacocinétique (PK) in vivo sont réalisés en complément. Ces études faites sur animaux non greffés, (a minima des souris), et à des doses faibles permettent de compléter la première sélection sur la base des caractéristique ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme et Elimination). L’objectif est de sélectionner ainsi des candidats susceptibles d’atteindre leur cible d’intérêt avec une puissance cellulaire et une exposition plasmatique suffisantes dans l’organisme. En effet, une molécule très active sur la cible mais insuffisamment concentrée dans le plasma ne présentera par exemple aucune activité fonctionnelle sur la croissance tumorale. Dans ce projet, les tumeurs à étudier sont greffées sur souris et les doses testées sont plus fortes. Cela permettra d’établir une relation entre l’exposition du produit, la quantité de produit dans la tumeur et son niveau d’atteinte de la cible (PK/PD), chose que l’on ne peut pas faire sur souris non greffées. En fonction de la cible étudiée ou du candidat à caractériser, il est possible que ces études soient effectuées soit dans des conditions de système immunitaire fonctionnel sur des souris immunocompétentes (concernant dans ce cas des greffes de lignées tumorales murines), soit sur des souris immunodéprimées, classiquement utilisées en oncologie et présentant un système immunitaire altéré et permettant ainsi de recevoir des greffes de tumeurs d’origine humaine.
Bénéfices attendus
Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales qui ont acquis, au cours du temps, un certain nombre de mutations faisant qu’elles ne répondent plus aux différents mécanismes de régulation et prolifèrent indéfiniment engendrant la formation d’une tumeur maligne et/ou de métastases. Un enjeu majeur pour la recherche consiste à trouver de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. Ce projet permettra d’identifier les candidats médicaments qui agissent sur la cible d’intérêt (au niveau de la tumeur) et ainsi la sélection des produits qui feront alors l’objet d’études d’efficacité (effet sur la croissance tumorale) encadré par un autre projet.
Procédures
chez l'animal vigile : •Greffe sous-cutanée, 1 injection (durée environ 15 sec) •Pesée et Mesure de tumeur (environ 30 sec par mesure), 2 à 3 fois/ semaine le temps de l’étude (1 mois max + Mesure pour la randomisation) •Prélèvements de sang si nécessaire dans la limite de 10% du volume total de sang par prélèvement et limité à 15% de volume total de sang sur une période de 28 jours + Tonte de la patte arrière en vue du prélèvement sur animal vigile (en principe une seule fois sauf si un prélèvement a lieu longtemps après la randomisation et que les poils ont repoussé : 10 sec) •Administration de composés candidats médicaments : jusqu’à 2 fois /j suivant la nécessité de l’étude, entre 15 sec et 1 min selon les composés et la voie d’administration. Chez l'animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : •Greffe intra mammaire, intradermique ou intratumorale : 1 fois (durée Anesthésie + geste, environ 1min30)
Impact sur les animaux
Le but du projet est d’évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt par nos candidats médicament dans des modèles pathologiques. Pour ce faire, les souris reçoivent une greffe de cellules cancéreuses ou de fragments tumoraux en sous-cutanée, en intradermique ou en intra-mammaire pour développer une tumeur dont la taille cible est de 300mm3 environ (si la tumeur pousse de façon hétérogène, les critères d’inclusion peuvent être élargis entre 100-550 mm3) Concernant les traitements pharmacologiques, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet). Cependant, selon la cible du candidat médicament, même à des doses tolérées dans l’absolu, il peut y avoir une toxicité allant de faible à modérée. En effet, même si les efforts pour identifier des thérapies ciblées sont nombreux, les cellules tumorales sont à l’origine des cellules normales du soi : il est donc très difficile de trouver des traitements qui affectent uniquement les cellules cancéreuses en épargnant complétement les tissus sains. Par ailleurs, ce projet peut nécessiter l’utilisation de souches de souris transgéniques ou mutantes leur conférant un statut immunodéprimé. Ce statut peut être considéré comme un phénotype dommageable mais qui ne s’exprimera pas dans les conditions d’hébergement protégées strictes appliquées au laboratoire
Devenir
Les animaux inclus dans l’étude après traitement et randomisation sur la taille de la tumeur greffée seront euthanasiés en vue de prélever la tumeur/sang pour effectuer des mesures in vitro : Réalisation des tests biochimiques et/ou moléculaires, visant à évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt, à partir des lysats tumoraux (Western-blot, ELISA, MSD, immunohistochimie, qPCR, …). Dosage du principe actif dans les échantillons plasmatiques et/ou des lysats tumoraux, permettant la relation PK/PD. En cas d’animaux greffés surnuméraires, une ré-inclusion dans un autre projet pourra être prévue notamment pour des entrainements du personnel aux gestes techniques. A défaut, ils seront euthanasiés.
Remplacement
Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique
Réduction
Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires avant le début de l’expérimentation. De plus, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. C’est seulement sur la base de ces données préalables que les études de pharmacodynamie sont réalisées : seuls les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, des prélèvements de sang (entre 40 et 80 µl de sang) à la veine saphène latérale sont mis en œuvre chaque fois que possible pour avoir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées) et pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale en faisant, notamment, de la relation PK/PD. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excède pas les 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement peu invasive et rapide, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques. Si des volumes sanguins plus importants s’avèrent indispensables, les prélèvements seront réalisés en terminal, à la veine cave ou en intracardiaque, sous anesthésie gazeuse, juste avant le prélèvement de la tumeur. En cas d’animaux greffés surnuméraires après randomisation, une ré-inclusion dans un autre projet sera prévue.
Raffinement
Dans le cas d’un protocole avec traitement chronique, les animaux sont quotidiennement observés et les tumeurs sont mesurées au moins 2 par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour limiter la souffrance et appliquer les points limites si nécessaire. De plus, au-delà de 1500 mm3 (pour les tumeurs SC et ID) et de 1000mm3 (pour les tumeurs IMam), une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Si ce volume est atteint la veille du week-end, des dispositions seront prises en fonction de la croissance du modèle tumoral (déterminée lors des études de TK). Si la tumeur pousse rapidement et a un risque de dépasser les 2000mm3 avant le lundi, l’animal sera euthanasié. Dans le cas contraire, le volume tumoral sera réévalué dès le lundi. La progression du volume tumoral est mesurée via le pied à coulisse et permet un suivi dans le temps sur les mêmes animaux. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulation strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de prévenir tout risque d’infection et/ou contamination. Les souris immunocompétentes, quant à elles sont logées et manipulées dans un secteur conventionnel. Toutefois, pour des questions logistiques, elles peuvent être hébergées et manipulées dans le secteur à confinement spécifique dédié à l’expérimentation des souris immunodéprimées. Dans ce cas, elles sont de statut SOPF et sont logées et manipulées dans des salles dédiées et identifiées. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Pour répondre aux impératifs liés à l’expérimentation (nombre d’animaux par groupe/dose/temps…) ce nombre pourra varier, tout en restant dans les standards imposés de respect du nombre d’animaux maximum/superficie disponible Des éléments de nidification (ex : cocoon, sizzle…) sont apportés ainsi que des éléments d’enrichissement lavables (ex : tunnels...) permettent une complexification de l’environnement et l’expression des comportements naturels des souris
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans les publications en recherche préclinique. En effet, ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Le choix de la souche est dicté par les études de détermination de la prise tumorale réalisées en amont de toute évaluation de candidat médicament. Cela permet de déterminer tous les paramètres in vivo (taux de prise, temps de doublement, caractère éventuellement cachectique de la tumeur sur la souche, etc…). La souche sélectionnée sera conservée pour toutes les études ultérieures quelle qu’elles soient. En effet, il peut exister des différences significatives en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit fonction de la souche murine considérée, pouvant impacter les résultats. Femelle, sexe utilisé dans toutes nos études de pharmacologie et pour lequel nous avons un grand historique. Exceptionnellement, les mâles peuvent être utilisés dans le cas de produits dont la finalité est le traitement de tumeurs se développent spécifiquement chez la personne masculine.
Etude du métabolisme et du potentiel thérapeutique de la protéine X dans un modèle d’aplasie fébrile pédiatrique chez la souris C57BL/6
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, jusqu'à sept par animal, et du LPS qui provoque un état de type septique avec fièvre, diarrhée et tremblements, ces derniers servant de point limite, ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le porteur affirme que l'étude de la protéine visée ne s'envisage que dans un "organisme complet" et non sur un modèle cellulaire. Les débouchés annoncés pour l'aplasie fébrile de l'enfant restent formulés comme des perspectives.
Objectifs
Le traitement des cancers de l’enfant utilise la chimiothérapie, qui peut transitoirement entrainer un déficit d’immunité appelé aplasie. Durant cette période, les enfants présentent souvent des épisodes de fièvre, pouvant être sévères et entraîner la mort. Devant ce risque, des mesures importantes sont mises en place avec hospitalisation en urgence et utilisation d’antibiotiques. Les infections en cours d’aplasie fébrile restent une réelle complication avec risque de décès chez ces enfants malades. Onze à 24 % vont présenter une bactériémie (présence d’une bactérie dans la circulation sanguine), facteur de risque de décès en contexte d’aplasie fébrile. En effet, la mortalité au cours des aplasies fébriles chez l’enfant est estimée entre 0,2 et 3 %, pouvant s’élever jusqu’à 10% chez les patients avec une bactériémie. Les infections à Pseudomonas aeruginosa gardent une place majeure tant par leur fréquence que par leur sévérité. A ce jour, il n’existe pas de marqueur biologique pouvant prévenir la gravité d’une aplasie fébrile. Il existe des molécules de danger, libérées dans le corps en période d’infection, et qui sont néfastes pour l’organisme (inflammation majorée, formation de caillots sanguins). Des études publiées montrent que neutraliser ces molécules de danger peut avoir un effet protecteur, améliorant le pronostic au cours d’une infection sévère. Des travaux préliminaires réalisés chez l’adulte présentant une infection sévère et généralisée, suggèrent que la protéine X, naturellement produite par l’organisme, est capable d’inhiber les effets délétères de certaines molécules de danger. Notre projet repose sur l’hypothèse que, chez l’enfant présentant une aplasie fébrile, le taux sanguin de X peut prédire la sévérité de l’infection. Notre étude s’articule en 2 axes : (1) une étude clinique portant sur l’intérêt du dosage de X dans une population pédiatrique suivie en oncologie et (2) une étude chez la souris mesurant la synthèse et l’élimination de X au cours de l’infection et évaluant son potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les débouchés cliniques sont multiples : (i) évaluation de nouveaux marqueurs permettant de prédire la gravité d’un épisode d’aplasie fébrile, (ii) orientation vers le type de pathogène (bactérien, fongique, viral), (iii) proposition d’escalade ou de désescalade de la prise en charge anti-infectieuse, notamment dans le contexte des tumeurs solides pédiatriques et enfin (iiii) un potentiel impact thérapeutique.
Procédures
Dans les quatre procédures de l’étude, les animaux seront traités par des injections intrapéritonéales. Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Dans les quatre procédures de l’étude, des prises de sang seront réalisées. Sous anesthésie gazeuse (moins de 5 minutes), la prise de sang rétro orbitaire permet la récolte de 50 à 100µL de sang en moins de 2 minutes, sans traumatisme et sans douleur. Lorsqu’un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement (avec réveil). Procédure 1 : pour chaque animal • 1 injection intra péritonéale • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 2 : pour chaque animal • 2 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie • • Procédure 3 : • 3 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 4 : • 7 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’administration de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux des procédures 1, 3 et 4. Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre de sous-cutanées qu’un un animal pourra recevoir. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.
Impact sur les animaux
Ce projet étudie le sepsis, c’est-à-dire une inflammation systémique déclenchée par le LPS (lipopolysaccharide = endotoxine), mimant ainsi une infection bactérienne, chez le sujet soumis à une chimiothérapie aplasiante. Une inflammation systémique donne classiquement de la fièvre. Les souris pourront présenter, suivant la dose reçue (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une fatigue et une douleur potentielle. Une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une diarrhée transitoire, une modification de comportement par l’absence de mobilité pourront être observées. A une dose plus importante de LPS, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés. Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. 1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle concerne tous les animaux du projet. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle permet, sous anesthésie gazeuse, une récolte de sang rapide, sans traumatisme et sans douleur. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’injection de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.
Devenir
Nous souhaitons doser la molécule X ainsi que diverses molécules pro-inflammatoires dans le sang des animaux mais aussi dans des organes comme la rate, le foie, les poumons et les reins qui sont très touchés par l’orage cytokinique déclenché par le sepsis. Les animaux seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Le métabolisme de la protéine X est mal connu à ce jour. Sa synthèse est probablement mixte, avec une production (i) par les cellules sanguines), mais également (ii) par d’autres tissus, dont les endothéliums vasculaires (=vaisseaux sanguins). L’étude de cette protéine ne peut donc s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. Un modèle murin parait être le plus adapté à l’étude de cette protéine.
Réduction
Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre de contrôles internes obligatoires en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre minimal d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 40% d’écart type intra lot est de 10 (Berndston et al. J ANIM SCI 1991). La cinétique des réponses immunitaires pouvant varier d'une expérience à l'autre, celles-ci seront répétées au minimum deux fois pour renforcer l'approche statistique (Cf. chronogramme associé au dossier).
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, selon l’annexe III de la directive 2010/63/CE, les souris seront hébergées en cages collectives (5 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général selon les critères de Lloyd et al. (Lab animal management and welfare, 1994). Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la facilité d'introduire une modification génétique chez ces espèces, à la grande taille des portées, au temps de génération court et à la relative facilité d'hébergement et de soins. De plus, la littérature scientifique décrit de nombreux modèles murins de sepsis. Nous disposons au laboratoire, d’une lignée de souris de fond génétique C57BL/6 chez laquelle le gène de la protéine X, étudiée dans ce projet, est rendu non fonctionnel. Cette technique couramment utilisée en recherche pré-clinique permet de démontrer l’importance d’une protéine dans un modèle donné. Notre étude porte sur l’aplasie fébrile pédiatrique. Nous utiliserons donc des animaux de 4 à 5 semaines, sevrés mais n’ayant pas atteint la maturité sexuelle.
Evaluation de candidats médicaments sur un modèle murin de sclérodermie systémique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur pose chirurgicalement une pompe diffusant de la bléomycine pour induire une sclérodermie, puis on administre les composés à tester par des voies variées et on prélève 7,5 % de leur sang chaque semaine, avant la mise à mort. Le porteur revendique un modèle répondant à un "besoin important de santé" et affirme qu'aucune approche in vitro ne peut remplacer l'animal. La souffrance déclarée reste au niveau sévère, ce qui soumet le projet à une évaluation rétrospective.
Objectifs
La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie orpheline atteignant le tissu conjonctif. Son origine n’est pas connue mais son apparition et sa progression impliquent très certainement des facteurs environnementaux sur un fond génétique de susceptibilité. La physiopathologie est dominée par des lésions microvasculaires responsables de lésions endothéliales couplées à la production de nombreux médiateurs pro-inflammatoires favorisant un remodelage vasculaire. Un processus d’auto-immunité serait également impliqué supportant l’entretien, la progression et le maintien de la pathologie. Ces différents éléments soutiennent l’apparition de lésions fibrotiques liées à l’accumulation de dépôt multi-viscéral de matrice extracellulaire résultat d’une rupture de l’équilibre synthèse/dégradation de ces composés matriciels. La SSc est responsable d’une réduction significative de la survie, en particulier dans les formes diffuses au cours desquelles les atteintes viscérales sont fréquentes. Une meilleure compréhension de la physiopathologie de cette maladie permet de proposer des approches thérapeutiques afin d’optimiser la prise en charge des patients. Ce projet s’inscrit donc dans une étude préclinique visant à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients atteints de sclérodermie systémique. Ce travail permettra également de comparer les candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, le Tofacitinib. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagées afin de couvrir au mieux les potentiels effets recherchés sur la sévérité et la progression de cette maladie dans le modèle murin utilisé.
Bénéfices attendus
Le modèle animal de sclérodermie systémique (SSc) utilisé dans cette étude est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de la maladie afin de répondre à un besoin important de santé.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie préalable pour la pose d'une pompe Alzet par le fournisseur. La pompe Alzet est nécessaire au délivrement de la bléomycine en sous-cutanée afin d'induire la sclérodermie du modèle. Selon la demande de notre partenaire, la molécule à tester pourra être administrée dans l’eau de boisson, dans l’alimentation, par gavage, inhalation, injections intra péritonéale (à l'aide d'une aiguille 25-27G), intravasculaire (à l'aide d'une aiguille 29-30G), sous-cutanée (à l'aide d'une aiguille 25-27G), intradermique (à l'aide d'une aiguille 30G) intramusculaire (à l'aide d'une aiguille 29-30G). La fréquence/durée de l'administration est variable en fonction de la demande de nos partenaires, tout en respectant les caractères de l'éthique animale. Un volume maximum de sang de 7,5% du volume total sera collecté 1 fois par semaine. Un prélèvement en point final de sang, et d'autres organes/fluides auront lieu après euthanasie de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex-vivo afin d'évaluer l'efficacité des composés testés.
Impact sur les animaux
Les effets directs et indirects de la procédure chirurgicale de pose de la pompe Alzet par les fournisseurs des animaux sont décrit au sein de leur autorisation de projet (Voir numéro indiqué en 4.2). Ils regroupent la récupération post-opératoire (douleur et stress) dû à l’anesthésie et à la procédure chirurgicale. Cette chirurgie peut également induire une possible perte de poids, une mise en tension de la peau et un possible risque de nécrose en cas de tension trop importante, la création d’un espace vide en sous cutané, une gêne mécanique et une gêne dans les déplacements (troubles légers de l’équilibre dus à la présence d’un poids sur un côté). C'est pourquoi les animaux seront surveillés quotidiennement post-induction de la maladie et pendant toute la durée de l'étude. L'aspect général et le poids des souris seront évalués post-induction sous la forme d’un score prédictif de la douleur. Ce projet étant classé à un stade sévère, il fera l'objet d'une évaluation rétrospective.
Devenir
A l'issue de l'ensemble du projet les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.
Remplacement
Le remplacement de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible dans ce modèle. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Aucune étude pilote ne sera effectuée de part la robustesse du modèle utilisé (description et publications). Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante (test non-paramétriques de Mann-Whitney et Kruskal Wallis) pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience. Le nombre de 10 animaux par condition test correspond à la quantité minimale nécessaire pour cet objectif.
Raffinement
Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Le projet étant classé à un grade sévère, la Structure en charge du Bien-Etre Animal sera impliquée dans le bon déroulé de l'expérience et ce projet fera l'objet d'une évaluation rétrospective. Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs ayant connaissance du modèle (signes cliniques attendus) afin d'apporter les meilleurs soins aux animaux. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la sclérodermie systémique sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Dans ce projet, les expériences in vivo sont donc indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance de composés mais également leur efficacité sur la maladie. La souris est largement décrite pour être une espèce de choix dans ce modèle compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. La majorité des expériences sera réalisée chez la souris C57Bl/6J. Cependant, la souche peut différer en fonction des souhaits des sponsors. Les souris utilisées auront entre 7 et 12 semaines afin d'avoir des sujets adultes avec un système immunitaire mature.
Etude du rôle des cellules stromales mésenchymateuses et de l’expression des microARN lors du développement de tumeurs induites par les cellules B16-F10-C3a dans un modèle murin (C57BL/6).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules de mélanome pour développer une tumeur et des métastases, puis sont tuées par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever tumeur et organes. Le porteur indique que la tumeur peut atteindre 1 500 mm3, seuil déclenchant l'arrêt de l'expérience. Il affirme que la formation de métastases ne peut être modélisée qu'in vivo et conclut que l'étude sur animal est inévitable.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche CPER FEDER destiné à étudier le rôle des cellules stromales mésenchymateuses et à identifier l’expression des micro-ARN (miARN) lors du développement de tumeurs métastatiques. Les métastases sont une cause majeure de décès chez les patients atteints de tumeurs malignes. Les miARN sont des petits ARN régulateurs de l'expression génique. Une modification de l’expression de ces miARN peut contribuer au développement tumoral et à la dissémination métastatique par dérégulation de l’expression de gènes impliqués dans des processus clés du cancer. Le système du complément a démontré des rôles dans la régulation de la croissance tumorale, bien que ceux-ci puissent différer selon les types de tumeurs. C3a a une fonction prépondérante de médiateur dans les phénomènes inflammatoires au sein des tissus. Le ciblage spécifique du système du complément peut être d'une grande importance et valeur dans le futur traitement des tumeurs. Nous utiliserons le modèle de tumeurs induites par l’administration sous cutané de cellules B16-F10 chez les souris C57BL/6. Ce modèle permet le développement de tumeurs primaires et de métastases dites « spontanées », ce qui correspond étroitement à celles développées par les humains. Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée et seront réalisées dans les conditions les moins stressantes possibles pour les animaux. Dans un souci permanent du bien-être animal et afin de minimiser l’emploi des animaux de laboratoire, l’évaluation de l’expression des miARN dans un contexte cancéreux sera réalisée en priorité dans des modèles in vitro. Ce projet engagera des souris dans un nombre estimé à 45 individus pour la durée que couvrira ce projet. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque lot de chaque procédure est réduit, il correspond au seuil minimal qui puisse nous permettre d’apprécier, avec nos moyens techniques et en fonction de la variabilité inter-individus, les effets désirés. Par ailleurs, l’hébergement des animaux pendant la phase d’acclimatation et pendant l’expérimentation sera faite avec enrichissement du milieu afin d’améliorer leur bien-être. A terme, nos travaux permettront d’identifier les miARN impliqués dans l’angiogenèse et annonciateurs de formation tumorale et de dissémination métastatique. Ainsi les cancers pourraient être pris en charge à un stade précoce.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront l’identification des miARN annonciateurs de développement tumorale et ainsi permettre une prise en charge plus précoce des patients atteint de cancer, ainsi que de comprendre le mécanisme et l'implication du système du complément dans la tumorigenèse.
Procédures
Induction de tumeurs métastatiques par injection de cellules B16-F10 ou B16-F10/C3a par voie sous cutanée une seule fois à J1. - Prélèvement sanguin (1mL) par ponction cardiaque après anesthésie volatile des souris.
Impact sur les animaux
Les nuisances sur les animaux sont des douleurs légères suite aux injections IP des cellules tumorales et le développement de tumeurs métastatiques.
Devenir
Après l'injection sous cutanée, les souris seront maintenues en vie jusqu'à la fin de l'étude. Les indivisus seront mis à mort à la fin de l'étude par ponction cardiaque précédée d’une anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d'une dislocation cervicale. Les organes prélevés seront scindés en 5 : 1/5 protéine (analyse par western blot), 1/5 ARN, 1/5 miARN (quantification, qRTPCR), 1/5 isopentane, 1/5 paraffine (analyse immunohistologique). La tumeur sera récupérée.
Remplacement
Remplacement: Nos études in vitro avec les cellules stromales mésenchymateuses pulmonaire et un modèle de cellules cancéreuses apportent quelques résultats sur les miARN impliqués dans cette pathologie. Néanmoins, ce modèle cellulaire ne suffit pas a modéliser le processus de développement tumoral dans son ensemble. La formation de métastases est un processus complexe et ne peut être modélisé que in vivo. L’étude in-vivo est inévitable pour comprendre le rôle des cellules stromales mésenchymateuses dans le développement de tumeurs métastatiques, identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans cette pathogenèse et étudier la capacité du c3a à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression du développement tumoral.
Réduction
Réduction du nombre : Pour chaque condition testée, nous utiliserons un nombre minimal de souris pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Nous utiliserons pour l’étude statistique le test one way ANOVA suivi d’un un test de Bonferroni pour comparer les trois groupes d’animaux entre eux, ainsi qu'un t-test suivi d'un test de Student.
Raffinement
Raffinement : La ponction cardiaque sera réalisée sous anesthésie volatile (isoflurane). Le prélèvement des organes se fera après la mise à mort des animaux. L’évaluation de la qualité de l’anesthésie se fera en vérifiant les 4 étapes suivantes : -l’absence de douleur et/ou de réponse réflexe en exerçant une pression au niveau des doigts de l’animal -L’immobilisation de l’animal -La relaxation musculaire -L’état d’inconscience en vérifiant les mouvements respiratoires. Les souris seront observées 3 fois par jour pendant les 10 premiers jours, puis 1 fois par jour pour le reste de l’expérimentation, dans le but de déceler le plus rapidement possible des signes cliniques critiques dus à l’expérimentation (prostration, température trop élevée, perte de poids, …). Ceci sera basé sur une grille de scoring définie. Chaque situation d’animal montrant des signes d’inconfort ou de souffrance liés ou non à l’expérience sera rapporté au vétérinaire responsable de l’animalerie pour que l’animal soit pris en charge de manière individuelle afin d’améliorer son bien-être. Si l'état ne s'améliore pas au-delà de 24h, il sera euthanasié par ponction cardiaque sous anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d’une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés.. De plus, si la taille de la tumeur arrive à 1500mm3 avant J30, l’expérimentation s’arrêtera dès lors, afin d’éviter des expérimentations en durée « non-nécessaires » sur les animaux. La durée de l’étude principale sera de ce fait réduite d’autant. La mesure des tumeurs se fera mécaniquement à l’aide d’un pied à coulisse Caliper. Pour respecter le principe des 3R, un nombre réduit d’animaux a été choisi.
Choix des espèces
Les C57BL/6 sont des souris robustes, et sont déjà utilisées pour la formation de tumeurs métastatiques induites par les cellules B16-F10. Souris adultes de 6 à 8 semaines
Fructose-sensing 3: Rôle des microglies dans la sensibilité cérébrale au fructose
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'au modéré. Elles reçoivent une alimentation enrichie en fructose, des prélèvements de sang à la queue et une injection de LPS qui déclenche fièvre, perte d'appétit et perte de poids, avant d'être tuées pour analyser leur cerveau. Le porteur décrit des tests comportementaux censés mesurer les émotions sans préciser lesquels, et affirme que l'étude des comportements émotionnels ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les retombées annoncées, mieux cerner les risques d'une consommation excessive de fructose, restent renvoyées à un questionnement de sécurité nutritionnelle.
Objectifs
La consommation de fructose, qui a fortement augmenté ces dernières années notamment par l’utilisation de sirop riche en fructose dans les produits transformés, est parallèle à celle du nombre de patients atteints d’obésité. Ces données suggèrent un rôle de ce sucre dans le développement des désordres métaboliques et ont conduit l’Anses à émettre des recommandations pour développer des recherches plus approfondies sur « le lien entre consommation de sucres et pathologies associées ». Une question qui n’a jamais été adressée directement est la capacité du cerveau à détecter le fructose. Cette question est justifiée par le nombre croissant d’études montrant que la consommation de fructose peut, chez l’Homme et/ou dans des modèles animaux, moduler le comportement alimentaire, l’état émotionnel ou la mémoire. Néanmoins, aucune étude n’a testé l’effet direct du fructose sur l’activité des cellules microgliales du cerveau qui seraient les seules cellules cérébrales capables d'utiliser le fructose. Ainsi, le but de ce projet est de déterminer si le fructose joue le rôle de molécule signal au niveau cérébral, module l’activité des microglies et participe au contrôle des émotions. Pour cela, nous déterminerons par immunohistochimie si l'administration orale de fructose active des régions cérébrales et lesquelles; et si l'alimentation de souris avec du fructose (dans l'eau de boisson ou avec des croquettes enrichie en fructose) favorise une inflammation cérébrale et altère les émotions grâce à l'utilisation de tests comportementaux spécifiques. L'ensemble des expériences sera réalisé sur des souris sauvages contrôles ou déficientes pour le transporteur de fructose GLUT5 spécifiquement dans les microglies.
Bénéfices attendus
Notre projet est en parfaite adéquation avec les attentes des pouvoirs publics et de la communauté scientifique. Dans son dernier rapport de l’Anses de Décembre 2016, la nature des sucres ingérés, notamment le fructose, fait l’objet d’une attention particulière. De nombreuses observations ont conduit l’Anses à émettre des recommandations pour développer des projets afin, d’une part, « d’entreprendre de nouveaux travaux de recherche permettant d’éclairer la nature précise du lien entre consommation de sucres et pathologies associées » et, d’autre part, « d’explorer de nouvelles pistes dans le champ de la psychologie cognitive ou la neurophysiologie ». En identifiant des fonctions cérébrales qui peuvent être affectées par l’augmentation de la concentration cérébrale en fructose, ce projet permettra d’étayer le questionnement de sécurité nutritionnelle lié à une consommation excessive de ce sucre.lopper des projets afin d’une part, « d’entreprendre de nouveaux travaux de recherche permettant d’éclairer la nature précise du lien entre consommation de sucres et pathologies associées » et d’autre part, « d’explorer de nouvelles pistes dans le champ de la psychologie cognitive ou la neurophysiologie ». En identifiant des fonctions cérébrales qui peuvent être affectées par l’augmentation de la concentration cérébrale en fructose, ce projet permettra d’étayer le questionnement de sécurité nutritionnelle lié à une consommation excessive de ce sucre.
Procédures
Régimes alimentaires enrichis en fructose. Tests comportementaux (quelques minutes) et prélèvements de sang en vue de la mesure de la glycémie et de l'insulinémie. Un test comportemental sera réalisé en condition d'inflammation.
Impact sur les animaux
Le fructose est un sucre consommé par l'Homme. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Certaines nuisances ou effets indésirables sont néanmoins attendus comme le traitement au LPS qui induit un phénotype de maladie transitoire (fièvre, perte d'appétit et perte de poids). Les prélèvements de sang à la queue pourront également engendrer une légère douleur aux animaux. Cette douleur sera prise en charge par l'utilisation d'un anesthésique local (lidocaïne).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L'impact d'une alimentation déséquilibrée et l'étude de comportements émotionnels ne peuvent être étudiés que des animaux vivants et vigiles rendant impossible le Remplacement par l'utilisation de modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant la différence entre plusieurs groupes.
Raffinement
Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l'inconfort des animaux (manipulation régulière et hébergement avec enrichissement). Des experimentations seront réalisées sous anesthésie et avec l'utilisation d'analgésiques. Des points limites précis et précoces ainsi qu'une méthode d'évaluation pour la prise en charge des animaux ont été établis.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus étudiée avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisé. L’utilisation de tests comportementaux permettant d’apprécier les troubles emotionnels ont principalement été développés chez la souris au laboratoire. Des animaux adultes de 7-10 semaines seront utilisés au début des traitements. Cet âge est est le plus courament utilisé dans la littérature.
Identification de molécules thérapeutiques chez un modèle murin atteint du syndrôme de Wolfram
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Identifiées par un trou percé dans l'oreille, des souris porteuses de la même mutation que chez l'humain atteint du syndrome de Wolfram reçoivent dès l'âge de 15 jours une injection intrapéritonéale par jour pendant 15 jours, puis passent des tests vestibulaires à 21, 24, 27 et 30 jours. 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les souris de cette lignée développent un syndrome vestibulaire à 21 jours, une perte d'audition à 24 jours, une surdité à 27 jours et une cécité totale à 30 jours, et les composés fournis par des chimistes doivent prévenir ces atteintes. Le porteur qualifie ces tests de "non anxiogènes mais suffisants", sans dire lesquels, et précise seulement qu'ils durent cinq minutes par souris.
Objectifs
Le syndrome de Wolfram est une maladie génétique caractérisée par un diabète sucré, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. Cette maladie ne dispose aujourd'hui d'aucune thérapie. L'identification de la wolframine comme responsable de la pathologie et la compréhension récente du rôle cellulaire de la protéine dans les processus neurodégénératifs (comme Alzheimer, Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique ou la maladie de Huntington) permet aujourd'hui d'envisager des approches thérapeutiques. Le modèle d'étude est une souris qui présente la même mutation que l'Homme. Cette souris développe plusieurs déficits au cours du temps: à l'âge de 21 jours, celle ci développe un syndrome vestibulaire, à 24 jours une perte d'audition, à 27 jours une surdité et à 30 jours, une cécité totale. Il est important de caractériser les souris mutantes pour définir les paramètres d'efficacité des candidats médicaments testés et ainsi trouver un futur traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur le modèle mutant. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visées thérapeutiques pour des pathologies rares/orphelines pour lesquelles il n'existe actuellement aucun traitement
Procédures
Les animaux vont être identifiés par une petite perforation au niveau de l'oreille. Les animaux auront au cours de leur vie une injection par jour par voie intrapéritonéale pendant 15 jours (avec une durée d'injection inférieure à 30 secondes). Suite à ces traitements, une batterie de tests non anxiogènes mais suffisants seront réalisés à P21 (au 21e jour de son développement), P24, P27 et P30 d'une durée de 5 minutes pour l'ensemble des tests par souris afin de tester le déficit vestibulaire et ainsi voir la progression des symptomes, maximale à P30 pour établir in fine une preuve de concept d'efficacité de ces composés sur un modèle murin.
Impact sur les animaux
La procédure d'identification par perçage d'un petit trou à l'oreille est légèrement stressante mais permet une identification rapide, peu invasive, permanente et qui n’engendre pas de prélèvement d’une biopsie supplémentaire pour le génotypage de l’animal. Les injections péritonéales peuvent engendrer un léger stress. Les tests vestibulaires utilisés dans le projet n'engendrent pas de stress particulier pour les animaux car ils sont habitués à la manipulation au préalable
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post-mortem.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle mammifère est le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques du syndrome de Wolfram, type déficit vestibulaire, dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. L’utilisation de modèles animaux est essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.
Réduction
Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieures réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant la durée du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire l'euthanasie de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères.
Choix des espèces
Afin de mimer rapidement les symptômes du syndrome de Wolfram en vue d'un traitement curatif, la souris reste à ce jour le modèle se rapprochant au plus près de l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge de 15 jours pour des injections chroniques de molécules pendant 15 jours. Nous souhaitons traiter les souris en préventif c'est à dire avant l'apparition du déficit vestibulaire (âge 21 jours).
Tests précliniques chez la souris pour évaluer différentes stratégies thérapeutiques dans la leucémie aiguë myéloïde.
- Recherche appliquée
- Cancers
651 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines puis des traitements administrés cinq jours par semaine pendant quatre semaines, avec prélèvements sanguins et imagerie, avant d'être tuées pour prélever rate et os. Le porteur indique que le développement de la leucémie et la toxicité des composés peuvent provoquer perte de poids et apathie. Il affirme que les modèles animaux sont "indispensables" pour évaluer les traitements au stade préclinique, le contexte tumoral ne se reproduisant pas selon lui in vitro.
Objectifs
La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une maladie complexe, avec de nombreux sous-types porteurs de combinaisons d’altérations particulières. Cette maladie est caractérisée par un blocage de développement et l’envahissement de la moelle osseuse par des cellules immatures. De nombreux progrès ont récemment été apportés dans la caractérisation des altérations des LAM. Ces études ont permis une meilleure classification des patients. Cependant, la prise en charge des patients à la récidive de la maladie reste problématique ce qui explique les taux de mortalité. Environ 25-30% des patients atteints de LAM ont une altération du récepteur FLT3 qui est associée à des fréquences de rechutes élevées et à un pronostic défavorable. FLT3 est une cible thérapeutique avérée pour laquelle des traitements efficaces et sélectifs sont disponibles. Cependant, des résistances apparaissent très rapidement après ce type de traitement. A la rechute, le traitement initial devient en général inefficace pour cibler les cellules leucémiques. Les résistances sont les causes majeures de l’échec thérapeutique. Il y a donc un besoin urgent de traitements alternatifs pour prendre en charge les patients. L'objectif de notre projet est donc d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette maladie. La majorité de nos expériences sont réalisées sur des modèles simplifiés de cellules en culture. Cependant, les modèles animaux sont indispensables pour évaluer les traitements prometteurs pour les études au stade préclinique.
Bénéfices attendus
Notre projet fait appel au repositionnement de médicaments existants pour le traitement des LAM et à des modèles précliniques de LAM. D’autre part, nous interagissons régulièrement avec des cliniciens. En cas de succès, le projet a un fort potentiel de valorisation et de transfert vers la clinique.
Procédures
Une transplantation de cellules cancéreuses (1 minute/souris) sera réalisée une fois au début de l’expérimentation. Les animaux seront soumis à des traitements qui seront administrés au niveau de différents sites d’injection 5 jours consécutifs maximum par semaine pendant 4 semaines. L’intervention durera maximum 1 minute par souris. Des prélèvements sanguins (5 minutes/souris) seront effectués 1 fois toutes les 2 semaines (4 fois maximum) pour suivre l’évolution de la maladie dans le sang. Lorsque les cellules cancéreuses sont bioluminescentes, nous pourrons suivre également l’évolution de la maladie sans geste invasif grâce à une caméra pouvant quantifier la lumière émise par les cellules, localiser le signal donc les cellules cancéreuses au niveau des organes et mesurer son intensité (1 lecture/semaine sous anesthésie volatile). Cette manipulation prendra 10 minutes par souris. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien avec une pesée 5 fois/semaine pour estimer au mieux leur état physiologique global. Ce suivi prendra maximum 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables dus à la toxicité des composés à la plus forte concentration sont potentiellement à prévoir avec une perte de poids des souris possible. Après greffe des cellules leucémiques, le développement de la pathologie peut entrainer des diminutions de la motricité, un défaut d’entretien du pelage et une perte de poids. Les traitements quotidiens, selon les composés testés, peuvent provoquer une apathie des animaux avec une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasiés. Lors de greffe de cellules cancéreuses, après la mise à mort des souris, la rate et les fémurs/tibias seront prélevés, puis dissociés pour énumérer les cellules cancéreuses afin d'évaluer l'effet des traitements. Un stockage de cellules leucémiques issues de ces organes sera aussi effectué afin de réaliser des expérimentations pour évaluer la fréquence de cellules initiatrices de la leucémie et pour analyser in vitro différents marqueurs exprimés par les cellules en réponse aux traitements.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de développement chez l’homme en l’absence de données précliniques. La régulation de l’hématopoïèse normale et pathologique implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux (extrinsèques) et propres aux cellules hématopoïétiques (intrinsèques): ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma et du contexte cytokinien, sont cruciaux dans la réponse thérapeutique et ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.
Réduction
Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Nous ferons en sorte que le groupe contrôle, qui recevra le véhicule de solubilisation du/des composé(s), soit commun à plusieurs combinaisons ce qui nous permettra de réduire le nombre de souris. Afin de réduire le nombre d'animaux génétiquement modifiés issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés. Le sexe sera choisi en fonction du nombre d'animaux nécessaires et disponibles par cohorte.
Raffinement
Hébergement en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton pour nidification), et maintien des animaux en groupes de 3-5 afin d’éviter le stress de l’isolement. De même, les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. Les greffes de cellules seront réalisées sous anesthésie gazeuse. De plus, dans un souci de raffinement et de réduction, le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques de la charge leucémique circulante après prélèvement sanguin et par imagerie optique par bioluminescence (quand cela est possible) sous anesthésie gazeuse. Durant toute la durée d’un protocole, l’ensemble des animaux est observé quotidiennement et le bien-être est évalué à l'aide d'une grille de scores. La durée des protocoles sera fonction de l’atteinte des points limites ou de l’obtention de résultats validés statistiquement.
Choix des espèces
La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d’un individu d’une espèce donnée chez un individu hôte d’une espèce différente. Ainsi, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise de greffe de cellules leucémiques humaines et éviter la réaction de l’hôte vis-à-vis du greffon. Dans ce contexte, la lignée de souris NOD.Cg-Prkdc scid/J (NSG) est un des modèles les plus couramment utilisé et très bien documenté dans la littérature dans le cadre d’études précliniques réalisées à partir de xénogreffes de cellules leucémiques humaines. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules leucémiques, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.