Souris

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie, elles subissent des injections, des examens RMN et une électrostimulation musculaire sous anesthésie, certaines recevant un vecteur de thérapie génique quelques jours après la naissance, avant mise à mort pour prélever plusieurs muscles. Le porteur présente ces atteintes comme compatibles avec "une vie tout à fait normale" et met en avant le caractère non invasif de la RMN et de l'électrostimulation. Il conclut qu'aucune culture de cellules musculaires ne reproduit les mesures physiologiques recherchées et revendique une étape "indispensable" avant l'application à l'homme.

Objectifs

Le récepteur à la ryanodine de type 1 (RyR1) est une protéine essentielle à la contraction musculaire. Chez l’homme, une mutation (notée RyR1I4895T) dans le gène RyR1 est à l’origine de la myopathie à cores centraux. Cette affection neuromusculaire génétique et héréditaire se caractérise par la présence de lésions rondes dans les cellules du muscle et par une faiblesse musculaire (réduction de la capacité à produire de la force, fatigabilité accrue) de sévérité variable. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif contre cette pathologie, et la prise en charge des patients se réduit à de la kinésithérapie et à de la corticothérapie, ce qui conduit à une légère amélioration de leur état général. Afin d'étudier le rôle de la protéine RyR1, un modèle de souris portant la mutation RyR1I4895T a été développé. Des études préliminaires ont montré que, comme chez l’homme, ces souris développent une myopathie à cores centraux et une faiblesse musculaire modérée. Ce projet vise à caractériser les muscles de ces souris myopathes d’un point de vue fonctionnel par le biais d’une analyse de leurs performances musculaires en lien avec le métabolisme énergétique. Cette étape est indispensable d’une part pour mieux comprendre la physiopathologie de la maladie mais également pour la mise en place d’approches thérapeutiques chez les patients souffrant de cette myopathie. Ainsi, nous envisageons dans un deuxième temps d'évaluer le potentiel thérapeutique de différents agents pharmaceutiques à rétablir un phénotype sain chez ces souris.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’une part de mieux comprendre l’histoire naturelle de la myopathie à cores centraux et d’autre part d’identifier des approches thérapeutiques susceptibles d’engendrer une augmentation de la force musculaire (agents thérapeutiques) voire de restaurer un phénotype sain (par thérapie génique). Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette myopathie, ce projet est une première étape indispensable avant l’application à l’homme.

Procédures

Les animaux subiront : des injections intrapéritonéales de molécules thérapeutiques sur animaux vigiles, des ingestions de croquettes ou de boisson supplémentées en molécules thérapeutiques, des examen RMN sous anesthésie générale, et des contractions musculaires induites par électrostimulation transcutanée sous anesthésie générale. Les injections d’AAV seront réalisées par l'organisme partenaire nous fournissant les animaux, avant le transfert de ces derniers dans nos locaux. Ces injections d'AAV seront réalisées en intrapéritonéal sur animaux vigiles, quelques jours après la naissance pour augmenter l'efficacité du traitement, réduire la quantité de virus à injecter et augmenter l'immunotolérance.

Impact sur les animaux

D’après la littérature, les souris RyR1I4895T hétérozygotes âgées de 4-5 mois présentent une diminution de leur masse corporelle de 15% et une perte de force musculaire de 25% par rapport à des souris contrôles du même âge. Ces modifications n’entraînent pas de signes dommageables et les animaux ont une vie tout à fait normale. Concernant les nuisances associées aux actes expérimentaux, seules les injections IP de molécules thérapeutiques sur animaux conscients pourront entrainer un léger stress et une faible douleur lors de l'acte. L’administration de molécules par le biais de la nourriture (croquettes à façon) ou de l'eau de boisson, ainsi que les examens RMN et l’électrostimulation musculaire sur animaux anesthésiés ne devraient pas entrainer de nuisances particulières si ce n’est un léger stress lors du réveil de l’anesthésie générale. En particulier, le protocole d’électrostimulation musculaire transcutanée que nous mettrons en œuvre (comparable à ceux utilisés chez l’homme en kinésithérapie) est strictement non invasif et ne provoque ni blessure ni séquelle, les animaux retrouvant dès leur réveil leur mobilité initiale.

Devenir

Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort une fois qu’elle sera terminée, en l’occurrence 3-4 jours après leur 3ème exploration non invasive du métabolisme énergétique et la fonction musculaire, de manière à laisser aux muscles (qui seront prélevés post mortem afin de réaliser des dosages biochimiques et de l’histologie) le temps de récupérer d’un point de vue métabolique et fonctionnel. Les euthanasies seront réalisées par dislocation cervicale pratiquée sur animaux anesthésiés par inhalation d’isoflurane. Plusieurs muscles (gastrocnémiens, soléaire, EDL, tibialis antérieur) seront prélevés sur les animaux euthanasiés. Ces tissus musculaires seront ensuite conservés à -80°C. Le cœur et les tissus adipeux seront également prélevés pour d’éventuels dosages ultérieurs.

Remplacement

Ce projet a pour objectifs de mieux comprendre le rôle physiologique de RyR1 et de réaliser des essais précliniques afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de différents agents pharmaceutiques à rétablir un phénotype sain. Les critères métaboliques et fonctionnels (mesure des performances mécaniques) que nous allons étudier sont de types physiologiques, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux de manière longitudinale ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours aux techniques RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal des mesures du métabolisme énergétique dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques de biochimie qui auraient nécessité de sacrifier des cohortes d’animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser des dosages métaboliques sur biopsies musculaires.

Raffinement

Les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation (coton), d’abris en plastique permettant aux animaux de se cacher, et de bûchettes de bois destinées à être rongées. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. Par ailleurs, l’utilisation des techniques RMN sur animaux anesthésiés par inhalation gazeuse permettra de par leur caractère non invasif et totalement indolore de réduire le stress des animaux. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal : un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation de la douleur par score avec indices pour différents critères physiologiques et comportementaux, et des actions seront à mener en fonction des scores obtenus. A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale induite par inhalation d’isoflurane afin de réduire au maximum leur douleur et leur détresse.

Choix des espèces

Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’Homme pour sa physiopathologie et qui soit génétiquement modifiable. Pour toutes ces raisons, le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les souris seront utilisées entre leur 2ème et 5ème mois d’âge : dès que la force musculaire commence à diminuer, à l'âge de 2 mois d'après les données de la littérature et pendant les 3 mois suivants de manière à suivre de manière non invasive et longitudinale l’évolution de la pathologie et les effets des approches thérapeutiques.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est provoqué par injection de streptozotocine, puis les animaux subissent des mesures répétées de glycémie par piqûre de la queue, des tests auditifs et une électrophysiologie du nerf caudal sous anesthésie, avant prélèvement des cochlées, pour préciser l'atteinte auditive liée au diabète. Le porteur prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 20 % de leur poids ou montrant prostration, léchage excessif ou automutilation, ce seuil déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace ces tests menés sur animal vivant et retient la souris pour la "similitude" de sa fonction auditive avec celle de l'homme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche C57Bl/6J Rj (souris présentant une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie, modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie).

Bénéfices attendus

Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.

Procédures

- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives seront effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).

Impact sur les animaux

Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).

Devenir

A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie des animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).

Remplacement

Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez une souche de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la streptozotocine fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris C57Bl6/JRj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation gazeuse de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.

Raffinement

Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, - une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence à un document « points limites », tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2.

Choix des espèces

La souris de souche C57Bl/6J Rj présente une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie (modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie). L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris présentant une dégradation spontanée de leur fonction auditive. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent un traitement induisant chez leurs embryons des mutations qui reproduisent une carence complète en vitamine A, puis sont tuées par dislocation cervicale pour que les fœtus soient prélevés, observés et fixés, certains fœtus étant refroidis puis plongés dans un fixateur histologique. Le porteur décrit une "douleur minime" pour les femelles et reconnaît que la souffrance fœtale est "difficile à évaluer", les prélèvements étant programmés un jour avant la mort ou la naissance attendue. Il affirme que seul l'animal permet d'étudier l'organogenèse et conclut à l'impossibilité d'un remplacement in vitro.

Objectifs

Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), les anomalies congénitales sont définies comme des anomalies de développement qui surviennent durant la vie intra-utérine et qui peuvent être identifiées avant la naissance, à la naissance ou plus tard dans la vie. Pour mieux appréhender la pathogénie des anomalies congénitales, nous proposons de comparer des reconstructions tridimensionnelles (3D) d'embryons de souris porteurs de mutations connues avec leurs congénères normaux, entre le début de la formation des organes (9.5 jours post-fécondation ; E9.5) et la fin de la gestation (E18.5). Pour les stades de développement compris entre E9.5 et E15.5, nous utilisons une nouvelle technologie d’imagerie, l’HREM (microscopie épiscopique haute résolution), qui génère des images comparables, en termes de résolution, à l’histologie : elle permet de visualiser les surfaces et les volumes des organes internes et des cavités, dans le système nerveux, le poumon, le cœur et les vaisseaux, l'intestin et le système urogénital. Les embryons et fœtus mutants pour les récepteurs de l’acide rétinoïque (Rara, Rarb et Rarg) développent des anomalies congénitales. Ce modèle imite un état de carence complète en vitamine A qui, pour des raisons techniques, n’avait jamais été analysé auparavant puisque cette vitamine est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères. Ces mutants seront utilisés comme modèle d’anomalie congénitale dans notre étude en imagerie.

Bénéfices attendus

Les anomalies congénitales affectent 1 nourrisson sur 30 partout dans le monde et entraînent annuellement 3 millions d'incapacités physiques, fonctionnelles et mentales. Les anomalies congénitales ne sont diagnostiquées qu'après la naissance ou, plus rarement, en fin de grossesse. Pourtant, la plupart d'entre elles sont déterminées très précocément, au cours des toutes premières semaines qui suivent la fécondation. De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de l’ensemble de ses gènes, la souris est un excellent modèle pour comprendre les maladies humaines. Les études cliniques et les approches expérimentales ont révélé que la vitamine A et ses dérivés actifs (les rétinoïdes dont l’acide rétinoïque) exercent une grande variété d'effets sur l’embryogenèse. Ces anomalies sont retrouvées chez l’un ou l’autre des mutants combinés pour les récepteurs de l’acide rétinoïque (Rara/b, Rara/g et Rarb/g) ce qui suggère une redondance fonctionnelle entre les RARs. Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension du moment propice d’action de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque pour permettre les différentes étapes de l’organogenèse. Cet objectif sera atteint en étudiant les conséquences de l’inactivation de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. Ceci sera réalisé par l’ablation conditionnelle (à un moment donné du développement embryonnaire) des trois gènes codant pour les RARs.

Procédures

Les souris femelles gestantes sont traitées pour permettre la mutation (recombinaison). Une contention simple qui dure 15 à 20 secondes pour administrer avec soin le traitement. Les souris femelles sont euthanasiées par dislocation cervicale (cela prend entre 5 secondes et 5 minutes selon la méthode utilisée). Les fœtus à E18.5 sont sortis des cornes utérines en incisant longitudinalement le muscle utérin. Après une observation macroscopique, ils sont ensuite euthanasiés par administration d’un euthanasiant chimique (contention de 10 secondes pour administrer l’euthanasiant). Les fœtus à E14.5 sont sortis des cornes utérines. Après une observation macroscopique sous loupe binoculaire, ils sont rendus inconscients par le froid. Ensuite, les foetus sont euthanasiés par immersion dans le fixateur histologique.

Impact sur les animaux

Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux animaux. La souffrance des femelles gestantes est limitée à la contention pour l’administration du traitement permettant la mutation (recombinaison). Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables de nos manipulations génétiques chez la femelle gestante traitée, mais tous les animaux sont surveillés soigneusement. La souffrance foetale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour ne pas que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort anticipée ou un jour avant la naissance.

Devenir

Tous les animaux décrits dans ce projet (Femelles gestantes et fœtus) seront euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus à E14.5 et à E18.5 sont euthanasiés pour les analyses HREM ou les analyses sur coupes. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.

Remplacement

L’organogenèse fait intervenir plusieurs types cellulaires de l’embryon. Notre étude vise à évaluer les périodes pendant lesquelles l’acide rétinoïque intervient dans la formation des structures embryonnaires dans un système physiologique. Seule une approche expérimentale avec des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

La stratégie des accouplements permet d’obtenir la moitié des animaux contrôles et l’autre moitié des animaux seront mutants après le traitement utilisé pour permettre la mutation (recombinaison). La stratégie de prélèvement des embryons ou des fœtus permet aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés car les stades sont choisis à des moments clés de l’organogenèse et permettent d’éviter la dissection au hasard. Les mâles et les femelles sont utilisés pour l’étude quand l’organogenèse s’y prête. Par exemple pour les études sur le développement du crâne ou des poumons, nous pourrons analyser les deux sexes. Par contre, pour les études sur le système urogénital, nous aurons besoin d’analyser à la fois des mâles et des femelles. Les nombres d’animaux sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique. A chaque stade nous analyserons 3 embryons/foetus contrôles et 3 embryons/foetus mutants. La réduction du nombre d’animaux (2e R de la règle des 3R) est donc appliquée dans notre projet.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour le bien-être des animaux, la surveillance de l’état de santé et des actions appropriées sont réalisées à l’animalerie si nécessaires (soins, analgésie, …). Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes (traitement utilisé pour permettre la mutation par recombinaison). Le bien-être est surveillé en permanence et toute altération du comportement des animaux (souffrance, angoisse) sera immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires. Les malformations congénitales attendues suite à la mutation des gènes Rar entrainent généralement une létalité embryonnaire ou foetale. La souffrance foetale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour ne pas que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort attendue ou un jour avant la naissance. Le raffinement (3e R de la règle des 3R) est donc appliqué dans notre projet.

Choix des espèces

De part sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal de la souris est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome; temps de génération court; génome connu, outils moléculaires). D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant l’acide rétinoïque dans l’organogenèse sont conservés chez l’homme. Afin d’évaluer les périodes pendant laquelle l’acide rétinoïque intervient dans la formation des structures embryonnaires (développement du crâne ou de la tête, du tractus urogénital, du tractus gastrointestinal, du système cardiovasculaire ou du système respiratoire), nous allons procéder à une ablation conditionnelle (à un moment donné du développement embryonnaire) des trois gènes codant pour les RARs chez la souris. Cette ablation sera réalisée au moment où les RARs sont supposés être nécessaires aux processus de : neurogenèse, cardiogenèse, développement des bourgeons des membres, développement de l’oeil, etc.. Nous allons prélever les embryons à des stades précis pour pouvoir observer l’organogenèse. Stade traitement des femelles (Stade prélèvement embryons/foetus) E8 (E9 et E10) E8.5 (E10.5 et E11.5) E9.5 (E11.5, E12.5, E13.5 et E14.5) E10.5 (E12.5, E13.5 E14.5 et E18.5) La liste des observations qui vont être faites et qui sont énumérées ci-dessous n’est pas exhaustive : E9 à E10 = Vasculogenèse, développement des cavités cardiaques E10.5 = Trachée et arcs aortiques E11.5 = Artères iliaques, développement des poumons, de l’œil ou des cavités nasales, E12.5 = Cœur, aorte, cavités nasales, œil, rétine, E13.5 = Glandes salivaires, Vessie E14.5 = Paupières, Gonades, Canal de Muller, Rein E18.5 = Morphologie complète de l’embryon

175 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lignée de glioblastome humain est greffée dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique, avec une pompe implantée diffusant une molécule tumorale rechargée chaque semaine, pour étudier son effet sur la croissance de la tumeur et l'épilepsie. Le porteur décrit des crises d'épilepsie, des troubles moteurs et une perte de poids liés à la tumeur, un petit groupe étant gardé jusqu'à des signes de souffrance inévitables. Il affirme que ce microenvironnement cérébral ne peut être reconstitué in vitro et retient la souris immunodéficiente pour accepter la greffe humaine.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales restent souvent sans thérapeutique efficace. Certains types de ces tumeurs produisent de grandes quantités d’une molécule nommée D2HG, et sont alors associées à une survie prolongée mais à un risque d’épilepsie accru. Nous émettons l’hypothèse et possédons des résultats préliminaires suggérant que le D2HG peut affecter l'excitabilité des cellules cérébrales neuronales par la régulation des principaux récepteurs excitateurs. En conséquence, une excitation déséquilibrée peut déclencher des crises épileptiques. C'est pourquoi, l'objectif de ce projet est de mieux comprendre les effets de l'accumulation de D2HG sur la croissance des tumeurs cérébrales et sur développement de l’épilepsie. En complément d’études réalisées sur des tissus humains épileptiques postopératoires, nous souhaitons étudier les effets D2HG in vivo sur un modèle de souris de tumeur cérébrale. Le modèle de souris permet de reproduire les interactions de la tumeur humaine avec l'environnement cérébral et d'administrer en même temps des quantités contrôlées de D2HG. Les effets seront évalués sur la taille des tumeurs (identifiée par imagerie), la survie des animaux et sur l’épilepsie. Cette étude pourrait ouvrir la voie à de nouveaux développements thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet étudie le rôle du D2HG dans la neurobiologie des gliomes, translatant des concepts et des outils de l'électrophysiologie à la neuro-oncologie. Il vise à mieux comprendre comment le D2HG module la signalisation glutamatergique, influence l'excitabilité neuronale et la croissance tumorale, et comment les processus d’infiltration tumorale et de remodelage épileptique peuvent se co-localiser et permettre de développer de nouveaux biomarqueurs peropératoires. Les modèles animaux xénogreffés permettent d’étudier la croissance des cellules tumorales cérébrales placées dans un micro/macro-environnement récapitulant au plus près celui observé chez l’Homme et jouant un rôle clé dans le développement des cellules tumorales. Il n’est pas parfaitement modélisable in vitro. Il permet de plus d’étudier la réaction du tissu cérébral à la croissance de la tumeur et notamment l’épilepsie. De plus, il est maintenant reconnu que le microenvironnement neuronal joue un rôle majeur dans la croissance des gliomes, cette dernière ne pouvant se modéliser en cultivant ex vivo une ligne cellulaire. Les résultats de ce projet aideront à comprendre le rôle de la D2HG dans la croissance tumorale et l'épileptogenèse et son interaction avec d'autres effets de la mutation de l'IDH dans le meilleur modèle de glioblastome humain disponible aujourd'hui.

Procédures

Injection stéréotaxique de cellule tumorale - 1 fois (20 min, anesthésiée et analgésiée). Implantation de canule et d'une pompe - 1 fois (40 min, anesthésiée et analgésiée). Recharge de la pompe avec solution D2HG - 1 fois par semaine (5 min, anesthésiée). Imagerie bioluminescente - 1 fois par semaine (10 min, anesthésiée).

Impact sur les animaux

L'hypothermie pendant l'anesthésie. Les saignements à cause de l'endommagement des vaisseaux sanguins pendant l'intervention chirurgicale. Déshydratation pendant l'intervention chirurgicale en raison de l'hémorragie et pendant la période de récupération en raison de la difficulté à boire. Une inflammation excessive à cause des lésions tissulaires provoquées par l'intervention chirurgicale ou à une contamination accidentelle. Crises d'épilepsie et problèmes moteurs à cause de la développement de la tumeur. Perte de poids à cause de la réduction de la capacité à s'alimenter et au développement de la tumeur.

Devenir

Un petit groupe d'animaux sera conservé jusqu'à lorsqu’ils atteignent des signes de souffrance inévitables vu la croissance tumorale, selon les points limites, ils seront euthanasiés. Cela permettra d'estimer et de comparer la survie dans trois groupes d'étude différents (30 animaux au total). Le reste des animaux sera euthanasie pour des analyse électrophysiologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes qui ne peuvent se résumer exclusivement à des cellules tumorales se multipliant. Dans une tumeur cérébrale, il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement (notamment neuronal) qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro. De plus ce travail évalue les effets du glutamate (produit par le tissu nerveux et par les cellules tumorales) et du D2HG (produit par les cellules tumorales) sur le tissu tumoral et sur le tissu cérébral avoisinant. Ces interactions ne sont pas étudiables in vitro. Les études préalables des effets de la mutation IDH et du D2HG sur tissus humains aigus ex vivo et en culture in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au minimum requis pour disposer de souris dans lesquelles des cellules tumorales humaines xénogreffées peuvent survivre. L’utilisation de cellules tumorales transduites par le gène de la luciférase permet un suivi en temps réel de la croissance tumorale. Cela évite le euthanasie séquentiel d’animaux au cours du temps. Compte tenu de la complexité des procédures chirurgicales impliquées dans ce projet, nous estimons la perte possible d'animaux à environ 15%, c'est pourquoi le nombre total d'animaux utilisés doit être porté à 175. Cela nous permettra d'avoir un nombre suffisant d'animaux pour l'analyse finale (150). Le nombre d'animaux à inclure dans les groupes lors des procédures a été a été estimé grâce à un calcul de puissance et les résultats seront évalués à l'aide de l'analyse statistique. Chaque animal sera exploité au mieux dans les différentes techniques pour obtenir un maximum d'informations. Chaque souris sera greffée dans l'hémisphère droit, et l'hémisphère gauche constituera un contrôle, limitant ainsi l'emploi de souris contrôles surnuméraires. Les mêmes animaux seront utilisés pour évaluer la survie et le volume tumoral. Les mêmes animaux seront utilisés pour étudier le volume tumoral et l’épilepsie.

Raffinement

Les animaux sont analgésiés à la Buprénorphine en pré-opératoire puis au Métacam en post-opératoire et anesthésiés à l’Isoflurane avant toute procédure chirurgicale. Les yeux sont protégés du dessèchement par un gel oculaire. Les animaux seront placés durant la chirurgie et le temps de réveil sur une plaque chauffante à 37°C jusqu’à leur réveil total (la température est monitorée à l’aide d’une sonde rectale durant la chirurgie). Après la greffe, une observation quotidienne des animaux sera effectuée jusqu'à l'euthanasie de l'animal. Une pesée quotidienne permettra de vérifier la régularité de leur prise de poids. Dès l'apparition de douleurs ou souffrances supérieures au tolérable (posture, amaigrissement, mauvais état du poil, apparition de lésions de grattage, etc.) la souris sera euthanasiée. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvage automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (12 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté.

Choix des espèces

Les rongeurs (souris) sont les modèles animaux classiquement utilisés dans les expériences et les études, cognitives ou thérapeutiques, menées en cancérologie. La taille et le poids de souris permet d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques, compte tenu du faible volume de distribution, et d’utiliser un faible volume expérimental dans l’animalerie. Les souches de rongeurs consanguines immunodéficiences (Athymic-Nude) permettent d’utiliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. Les lignées de souris immuno-compromises sont disponibles chez au moins 2 des éleveurs agréés en France. Des travaux pionniers utilisant ce type de matériel cérébral humain, ont été réalisés par des équipes internationales de recherche, validant ainsi ce choix. Les manipulations commenceront à partir de la 8ème semaine d’âge chez animaux sevrés et ayant atteint une taille et un poids adulte. La 8ème semaine chez les souris est le début du stade adulte le glioblastome étant une tumeur de l’adulte chez l’Homme.

441 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation est provoquée par injection intracérébrale d'un détergent sous anesthésie, complétée par des injections d'un marqueur de prolifération, pour étudier la régénération de la myéline dans la sclérose en plaques chez des souris génétiquement modifiées. Le porteur indique une mise à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque d'un fixateur pour prélever le cerveau. Il affirme que la myélinisation ne peut être reproduite que chez un animal vivant "dans son intégrité" et retient la souris comme modèle de référence des récepteurs de la vitamine A.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune affectant le système nerveux central (SNC). Causée par une dysfonction du système immunitaire, elle engendre des lésions de la myéline qui provoquent des perturbations motrices, sensitives, cognitives, visuelles et autres. Les traitements actuels sont insuffisants pour empêcher la progression du handicap à moyen terme. La myéline est une membrane biologique, essentiellement composée de lipides, qui forme une gaine autour des fibres nerveuses. Cette gaine est nécessaire pour une bonne conduction de l’influx nerveux. Lorsque la myéline est dégradée, son remplacement est effectué par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL). Toutefois, dans la SEP, la myéline est la cible du système immunitaire qui engendre une réaction inflammatoire excessive. A long terme, cette inflammation empêche les OL de reformer la myéline conduisant aux symptomes cités précedemment. Il est important de comprendre pourquoi les OL ne forment plus la myéline. En effet, une stratégie thérapeutique serait de stimuler ces OL pour qu’ils régénèrent la myéline à nouveau. Grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées, nous étudierons des facteurs impliqués dans la génération des OL pour mieux comprendre comment les stimuler à régénérer la myéline. De plus, dans la SEP les cellules immunitaires du SNC, les cellules microgliales (CM), contribuent à la pérennisation de la signalisation inflammatoire mais assurent aussi l’élimination des debris de myéline pour stimuler la remyélinisation. Les déterminants moléculaires impliqués dans le contrôle de ces fonctions opposées des CM ne sont pas connus, alors que leur connaissance est critique pour le développement de nouveaux traitements. Afin de caractériser ces déterminants, nous étudierons les CM et la progression de la remyélinisation par les OL en induisant une perte minime de myéline chez des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

La myéline est une gaine biologique composée majoritairement de lipides qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine est synthétisée par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL) et est nécessaire pour la bonne conduction des influx nerveux. La dégradation de la myéline est un processus physiologique naturel au cours duquel les cellules immunitaires du système nerveux central, les cellules microgliales (CM), éliminent les débris de myéline. Ceci stimule ainsi à nouveau les OL à renouveler la myéline. Toutefois, chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), la myéline est la cible du système immunitaire qui entraine une réaction inflammatoire importante. Une des conséquences de cette réaction inflammatoire est d’empêcher les OL à régénérer la myéline. Différents acteurs ont été identifiés comme facteur stimulant la formation de myéline dans la SEP, notamment des récepteurs de la forme bioactive de la vitamine A. En utilisant des souris modifiées génétiquement, nous déterminerons l’implication de ces récepteurs dans la formation des OL pour comprendre comment ceux-ci favorisent la myélinisation aussi bien en conditions physiologiques qu’en conditions pathologiques. Ceci pourrait mettre en lumière un mécanisme de remyélinisation précis qui pourrait également ouvrir une nouvelle voie de recherche dans la SEP et vers de nouvelles pistes thérapeutiques impliquant la vitamine A. D’autre part, nous caractériserons comment la myéline et notamment les lipides la composant sont pris en charge par les cellules microgliales (CM) pour être éliminés en utilisant des souris génétiquement modifiées. Cette information peut orienter des stratégies thérapeutiques basées sur un apport d’acides gras spécifiques dans la SEP.

Procédures

Une injection intrapéritonéale d’un produit marquant les cellules en prolifération cellulaire sera effectuée sur 231 animaux lors de la procédure 2, et sur 120 animaux lors de la procédure 3, soit sur un total de 351 animaux. Cette injection ne dure qu’une dizaine de secondes entre le moment où l’animal est saisi et le produit injecté. Nous réaliserons également une injection intracérébrale d’un produit détergent pour induire la démyélinisation unilatéralement sous anesthésie générale. Cet acte chirurgical sera réalisé sur 90 animaux en procédure 1, et sur 231 animaux en procédure 2. Cette procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes par animal. Au total, 321 animaux recevront une injection intracérébrale une seule fois.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales vont génèrer un stress chez l’animal. Les procédures des injections intracérébrales peuvent être douloureuses et générer un stress/déconfort à l’animal. Ces procédures seront effectuées par un expérimentateur entraîné sous anesthésie générale avec des propriétés analgésiques et ne devraient pas engendrer de troubles majeurs visibles de comportement car les lésions induites par l’injection seront unilatérales et très limitées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permet de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires (de type Western Blot). D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque d’un agent fixateur sera réalisée. Ceci permet la fixation complète et homogène des tissus, y compris du cerveau. Les organes pourront ainsi être prélevés et utilisés à des fins d’imagerie.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les modèles murins par un autre modèle animal dans cette étude pour trois raisons principales : (i) la myélinisation développementale ou remyélinisation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités des types cellulaires différents et ne peut être reproduit que chez un animal vivant dans son intégrité; (ii); une analyse de remyélinisation est espèce-dépendant et la souris reste un très bon modèle de la myélinisation chez l’homme; (iii) la souris est notre modèle de référence dans la recherche sur les récepteurs des formes bioactives de la vitamine A car c’est dans ce modèle que nous avons déjà identifié les programmes moléculaires contrôlées par ces récepteurs ainsi que les traitements pharmacologiques pour les futurs développements de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, ce projet émane des nombreuses analyses in vitro réalisées sur des cultures cellulaires qui nous ont amenées à proposer ce projet et tester in vivo nos hypothèses de travail.

Réduction

Dans notre projet nous utilisons le nombre minimal d’animaux permettant d’effectuer les analyses statistiques afin de révéler les différences significatives (n=3). En effet, ces effectifs ont été déterminés à partir de données de la littérature et sont suffisants pour voir si on obtient des différences en comparant la moyenne (et autres paramètres) des différentes conditions, notamment par l'utilisation d'un test de Wilcoxon, ou de Kruskall-Wallis. De plus nous utilisons les deux sexes pour ne pas produire de façon inutile les femelles qui sont plus rarement utilisées pour ces analyses à cause d’effets possibles dus aux différences hormonales ou sexuelles au niveau des fonctions de cellules étudiées. C’est un risque dans cette étude, que nous allons contrôler par une comparaison des résultats provenant des mâles et des femelles pour chaque condition expérimentale et génotypique. Pour minimiser le nombre d’animaux nous allons injecter qu’un hémisphère pour utiliser le deuxième comme contrôle. De plus, les effets de l’intervention chirurgicale (injection de solution saline) seront évalués sur un groupe d’animaux contrôle.

Raffinement

En vue de raffiner les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales (dans des portoirs ventilés, en groupe, et avec un nid) et ils font l’objet d’un suivi adapté et régulier et de soins vétérinaires au besoin. Sont mis à la disposition des souris ad libitum des croquettes et de l’eau. La litière est renouvelée une fois par semaine. Ici, nous minimiserons la douleur chez les animaux. En effet, la dose de lysolécithine utilisée étant très faible, les dégradations de myéline seront mineures et ne devraient pas générer de troubles chez l’animal durant le suivi expérimental. Les procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie générale accompagnée d’analgésiques (Xylazine/Kétamine) afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. De plus, durant la chirurgie, les yeux des animaux sont protégés du dessèchement. Ils sont préservés du refroidissement provoqué par l’anesthésie par l’emploi d’isolant durant l’opération, et leur réveil se fait dans une enceinte chauffée. Les injections intrapéritonéales engendrent un stress chez l’animal. Les animaux ayant reçu l’injection seront remis en groupe en cage et surveillés. Les mises à mort des animaux seront effectuées par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

La myéline est une gaine biologique qui entoure les neurones, assurant ainsi leur protection d’une part, et la transmission des messages nerveux d’autre part. La synthèse de myéline (ou myélinisation) est assurée par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL). Chez des patients atteints de sclérose en plaques, la myéline est dégradée par le système immunitaire. La régénération de myéline par les OL (ou remyélinisation) est très limitée voire inexistante. Par conséquent, la transmission des messages nerveux est moins efficace et les patients souffrent de différents symptomes tels que des déficits moteurs et cognitifs. Une stratégie thérapeutique serait de stimuler les OL, notamment via la vitamine A, à régénérer la myéline similairement à leur génération lors du développement embryonnaire En effet, la formation des OL se déroule durant le développement pré et post-natal. Leur formation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités de différents types cellulaires qui ne peut être reproduit que sur un animal vivant dans son intégrité. Pour comprendre comment les OL sont ainsi formés, un modèle d’étude ayant un système nerveux proche de l’Homme est nécessaire. La souris est un très bon modèle puisqu’elle récapitule très bien la formation des OL et de la myéline chez l’Homme. Bien que le rôle de la vitamine A dans la formation des OL n’est pas encore élucidé, il est nécessaire d’avoir un modèle où la vitamine A est caractérisée. La souris reste le modèle de référence sur les travaux de la vitamine A. En effet, les mécanismes d’action de la forme bioactive de la vitamine A sont très bien caractérisés chez la souris et différents traitements pharmacologiques sont déjà disponibles pour évaluer son mode d’action. Les étapes clés de la formation de myéline chez la souris ont lieu au jour de la naissance 0 (dit P0), P7, P14, P21 et à l’âge adulte (8 semaines). Pour suivre et comprendre comment la myéline est formée, nous devrons étudier des souris à ces stades de développement. Pour étudier la régénération de myéline en conditions pathologiques comme la sclérose en plaques, des souris adultes (8 semaines) seront utilisées afin d’évaluer le processus d’élimination et de régénération de la myéline.