Souris

150 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection cérébrale de vecteurs viraux sous anesthésie, reçoivent du tétrahydrocannabinol, passent des tests de comportement moteur et sont isolées une semaine, avant d'être tuées pour vérification histologique. Le porteur étudie le rôle du récepteur CB1, cible des molécules du cannabis, dans le contrôle moteur et les maladies neurodégénératives. Il affirme que les simulations numériques ne sont pas fiables et que le recours à l'animal "demeure nécessaire".

Objectifs

Le « système moteur » est principalement composé par le groupe de noyaux appelé « les ganglions de la base ». Ce système fortement conservé chez les mammifères, y compris l’homme, est un système complexe des connexions entre différents noyaux fortement régulé par plusieurs mécanismes agissant en différentes étapes, et toujours ces mécanismes sont à clarifier complètement. Le système des ganglions de la base est aussi la principale cible des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. Pour nous, un possible candidat qui pourrait être important dans le control des ganglions de la base est le système endocannabinoide. Dans le cerveau, l’action du principal composé psychoactif du cannabis passe par un ensemble de molécules, appelées collectivement « système endocannabinoïde ». Ce système contrôle de très nombreuses fonctions du corps humain. Il est notamment impliqué dans le contrôle moteur et la coordination. Avec ce projet (que est un complement de un projet deja en cours) nous voulons comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes agissent sur les fonctions motrices, et leurs implications possibles dans les maladies neurodégénératives affectant ces fonctions.

Bénéfices attendus

Le récepteur CB1 est la cible endogène des molécules psycho-actives du cannabis. Au niveau endogène, ce récepteur est activé par des molécules lipidiques (endocannabinoïdes) qui jouent un rôle crucial dans les mécanismes de protection et régénération neuronales. De plus, l’administration de drogues dérivées du cannabis a été suggérée comme un outil thérapeutique pour plusieurs maladies du système nerveux centrale et des ganglions de la base. Ce projet nous aidera à mieux comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes régulent l'activité de ce circuit neuronal en visant donc au development d’outils thérapeutiques pour les troubles moteurs associé aux maladies neurodegeneratives.

Procédures

Nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées. Sur certaines souris, nous allons injecté des vecteur viraux pour reduire la signalisation du recepteur CB1 dans des regions specifiques du cerveau. Cette procédure chirurgicale se fera sous anesthésie générale, avec un traitement analgesique pour prévenir la douleur (durée total de 30 minutes). L'intervention aura une durée de 30 minutes. Dans la période postopératoire (intevention de 3 jours), une injection sous-cutanée de Buprénorphine sera administrée 6 heures apres la premiere injection et répétée une fois par jour pedant 3 jours. Trois semaines apres chirurgie, les souris seront en isolement une semaine avant injection et seront injecteé avec differentes drogues: Tetrahydrocannabinol et leur vehicule (Durée total de 45 minutes). Apres traitments, les souris seront soumis a des tests de comportement moteur (Durée de 5minutes ). Apres le comportement, les souris seront mis a mort selone les modalité decrites.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de risque majeur lié à l’acte chirurgical et la douleur associée est traitée par une anesthésie approprié et des analgésiques. Il n’y a pas de signe perceptible des douleur après l'opération, durant la récuperation et lieés au procedures de injection et comportement. Néanmoins, il y a des points limites bien décrit dans les procédures. Le taux d’apparition des signes d’infection de la plaie suite à la chirurgie est très faible.

Devenir

Les souris issue de la procedure de chirurgie seront en suite traité avec des drogues suivi par des tests comportamentales. En suite les animaux seront mis a mort pour fin experimentation et verification hystologique des injectiones virales.

Remplacement

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux n'excèderont pas 15 animaux, c'est à dire le nombre minimal d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine et aussi décrit dans la literature scientifique sur le sujet. Au regard du faible nombre d'individu par groupes expérimentaux, les analyses statistiques basées sur des tests non paramétriques seront privilégiées par rapport aux tests paramétriques. De cette facon, les nombres prévus permettent de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience nous montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Un protocole de surveillance et un suivi quotidien et rigoureux seront mis en place par l’experimentateur et le personnel zootechnicien. En cas de blessure légère, un protocole de soins et désinfection sera mis en place (antiseptique topique et antiinflammatoire systémique) jusqu’à la guérison. En cas d’atteinte du point limite terminal, l’animal sera mis à mort. Pour les traitments pharmacologiques, les injections IP sont bien maitrisées dans le laboratoire et ils n’induisent pas de mal-être chez l’animal. En plus les produits utilisés (et leur doses) sont bien tolérés chez les animaux. Les souris seront néanmoins bien observées suite aux injections, par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. Pour certaines experiences de comportement moteur, les souris seront isolées pedant 7 jours avant injection. Toutes les mesures pour reduire l'impact de ce type d'hébergement seront mise en place (congénères à proximité et enrichissement approprié). Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant et après manipulation, sauf pour certaines experience de comportement moteur que prevoi une semaine d'isolement. Les souris seront hébergés avec un milieu enrichi (matériel de nidification en coton et 2 tunnels par cage), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs, formés selon la règlementation en vigueur et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général et comportemental des animaux comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, pré- et post-opératoire, prévoit aussi l’utilisation d’analgésique pour la prise en charge de la douleur. Elles seront effectuées par des experimentateurs formés à la chirurgie chez les rongeurs, selon la règlementation en vigueur.

Choix des espèces

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur CB1), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont équipées pour être destinées à l’étude des rongeurs. L'age des animaux sera de 8-12 semaines car les protocoles que nous avons établis seront développés à l'âge adulte des souris en évitant les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le terrain.

Jusqu'à 3 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des injections de tamoxifène déclenchent chez des souris génétiquement modifiées des lésions précancéreuses de la prostate, qui peuvent évoluer vers des tumeurs volumineuses provoquant douleur abdominale et perte de poids, la mise à mort étant prévue à 2 000 mm3 de tumeur ou à 20 % de perte de poids. Les animaux sont tués à différents temps pour prélever la prostate et d'autres organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique des lésions et conclut à la "nécessité" d'expériences in vivo.

Objectifs

Le cancer de la prostate ( CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine de l’agressivité des tumeurs est donc requise afin de d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate, développés au laboratoire, répliquent les mutations du gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines. Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme. L'objectif de ce protocole est le suivi et caractérisation des lésions précancéreuses de la prostate. Suite à l'invalidation du ou des gènes, des lésions, nommées néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), se développent. L'évolution des PIN sera suivie pendant un délai suffisant à l'apparition des formes agressives. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes d'apparition des formes agressives du cancer de la prostate afin d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et des outils diagnostiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des gènes étudiés dans cette évolution. Les prélèvements de fluides (urines et sang) nous aideront à mettre en évidence des biomarqueurs du cancer de la prostate permettant un diagnostic précoce de la maladie.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène réalisés au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, 100 µL du sang sera prélevé sur 20 animaux à chaque point de la cinétique ( 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12 et 15 mois après injections du tamoxifène), un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Une injection en intra péritonéale prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris.

Impact sur les animaux

Suite à l'injection du tamoxifène, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. La taille de tumeur sera donc un point limite clé(2000 mm3). Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

L’effectif demandé a été calculé afin d’obtenir les groupes des souris mutantes à différents points cinétiques de taille suffisante pour réaliser les tests statistiques de sorte à pouvoir tirer des conclusions pertinentes de nos expériences. Pour un type de souris donné et un point cinétique donné, 20 souris seront utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction de nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. En revanche, sur les points clés, des expériences supplémentaires pourront être réalisées, toujours dans la limite de 3200 souris maximum.

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Après injection, les souris seront observées pour détecter les éventuels signes de douleur ou de souffrance, à savoir la posture inhabituelle, le dos vouté, le poil hérissé, les grimaces, les vocalisations. Si ces signes persistent dans la journée suivant l'injection, les souris seront sorties de l'étude. De plus, lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, elles seront observées par l'expérimentateurs et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler la taille de la prostate par palpation et l’apparence générale de la souris. Les points limites de l’expérience seront le volume de la prostate et le poids de la souris. Si le volume de la prostate est supérieur à 2000 mm3, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est supérieure à 20% et/ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Après chaque prélèvement sanguin, un volume équivalent au prélèvement de sérum physiologique sera injecté en sous-cutanée. De plus, le lieu de l'injection sera surveillé dans les journées suivantes afin de détecter des signes d'une éventuelle inflammation (rougeur, gonflement).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans des gènes Pten et Trp53 le plus fréquemment mutés dans les cancers de la prostate humain pour générer nos modèles. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte. Les animaux utilisés seront adultes, les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses puis une radiothérapie, avant des examens IRM répétés sous anesthésie avec injection d'agents de contraste, et sont tuées pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer titubation, léthargie, perte de poids et crises d'épilepsie, la mise à mort intervenant à 15 % de perte de poids ou à l'atteinte d'autres points limites. Il conclut que l'imagerie du petit animal vivant est un maillon "indispensable" pour mettre au point une IRM de la radionécrose transposable à la clinique.

Objectifs

La radiothérapie est une option thérapeutique qui peut engendrer des phénomènes nécrotiques et inflammatoires intenses, appelés radio-nécrose, 6 mois à 2 ans chez près de 25% des patients. Cette radio-nécrose est un effet secondaire de la radiothérapie et limite la précision de l'évaluation de la réponse tumorale à la thérapie. En effet, ces lésions dues aux radiations peuvent être confondues avec la progression tumorale, d'où le terme parfois utilisé « pseudoprogression ». A ce jour, seule l’analyse d’échantillons extraits par biopsie s’avère être totalement fiable pour différencier ces deux phénomènes. Mais la biopsie reste une intervention chirurgicale pouvant présenter certains risques pour le patient et le résultat peut s’avérer peu informatif étant donnée la petite taille de l’échantillon vis-à-vis du volume et de l’hétérogénéité tumorale. Diagnostiquer précisément le plus tôt possible une radionécrose ou une récidive est essentielle afin d’adapter au mieux le traitement. L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une méthode de choix pour la détection de tumeurs cérébrales. Cependant, les techniques d'IRM conventionnelles ne sont toujours pas capables de distinguer la progression tumorale de la radio-nécrose, car les deux présentent la même apparence sur les images IRM. Ainsi actuellement, des séries d’examens IRM incluant l’ensemble de ces nouvelles techniques sont nécessaires pour affiner les pronostics sans pour autant atteindre 100% d’exactitude. L’actuel projet de recherche s'appuie lui sur la relaxométrie IRM. Cette technique permet de quantifier les propriétés tissulaires pour caractériser la microstructure du tissu et ainsi augmenter la spécificité de détection. De plus, pour résoudre le problème spécifique de la différenciation radio-nécrose/progression, ce projet adoptera une approche de pointe pour extraire des informations sur la microstructure du tissu au sein de chaque voxel (pixel en 3D). Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie de gliomes implantés ou de métastases cérébrales chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de cette partie du projet est la proximité et un accès facilité à la plateforme IRM pour des examens réguliers et la possibilité de suivre les animaux quotidiennement. Les bénéfices globaux de ce projet sont: 1) le modèle tumoral suivi d'une session de radiothérapie est représentatif de cas chez l’homme, donc la méthodologie IRM pourra être transférée rapidement; 2) Les données recueillies avec la nouvelle méthode IRM fourniront un point de départ solide pour a) évaluer la possibilité d'éviter les biopsies et b) évaluer plus précocement l'évolution de la maladie; 3) Les résultats de ce projet bénéficieront à long terme aux patients atteints de cancers cérébraux. En effet, nous sommes en cours d’implémentation de ces séquences de relaxométrie multi-compartiment sur une IRM clinique. De nouveaux biomarqueurs permettant de distinguer la récidive tumorale de la nécrose seront développés et mis à disposition via des techniques d'IRM rapides et robustes compatibles avec l'environnement clinique. Cela facilitera le diagnostic et permettra une prescription de traitement adapté. De plus, cela devrait réduire la nécessité d'une biopsie chirurgicale et ainsi limiter les risques pour le patient. Finalement, cette nouvelle technique IRM améliorera le confort des patients (pas d’injection d’agents de contraste, acquisitions rapides, diagnostics plus précis, technique d’imagerie inoffensive).

Procédures

Les 100 animaux seront soumis à une injection de cellules cancéreuses (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique) ou pas. Ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite transportés dans une autre animalerie d’hébergement, permettant un accès facilité aux instruments d’imagerie. Les animaux seront soumis à une injection d’agents de contraste IRM sous anesthésie générale à chaque examen IRM. Ces examens seront séparés d’au minimum 3 jours. En fin de suivi IRM, ils seront euthanasiés sous analgésie et anesthésie générale pour un prélèvement propre du cerveau en vue de réaliser des examens IRM post-mortem et des coupes histologiques.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique. De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.

Devenir

Les examens IRM n’induisent pas de souffrance donc ces examens peuvent être répétés pour suivre l’évolution de la tumeur et de la radionécrose. Cependant, afin de confirmer la détection de la radionécrose par IRM, les animaux doivent être euthanasiés pour extraire le cerveau et réaliser des études histologiques.

Remplacement

Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic plus précoces et fiables de la radionécrose (grâce à l’obtention d’images avec des résolutions spatiales et temporelles plus élevées, et des informations plus quantitatives). L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.

Réduction

Les séquences IRM sont déjà développées et ont déjà été évaluées sur des souris saines. Ainsi, seulement des souris pathologiques (portant soit des gliomes soit des métastases cérébrales) seront imagées. Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de trois jours entre chaque examen. De plus, les structures cérébrales contralatérales au gliome serviront de contrôle interne. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Pendant les chirurgies, l'utilisation d'anesthésies gazeuses, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle visuel de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Une grille de scorage a été instaurée pour surveiller la santé et le bien-être des animaux, comprenant des signes au niveau du comportement, de la mobilité, de la perte de poids, et de l’apparition de signes neurologiques. Si des signes de mal-être apparaissent, les animaux seront pris en charge par un analgésique. Des points limites ont aussi été instaurés, induisant une euthanasie immédiate. Les animaux seront observés une fois par jour. La fréquence d’observation passera à 2 fois par jours dès le début de la perte de poids (10%). Les souris seront hébergées dans des cages avec un environnement enrichi par des objets (bâtonnets de bois à ronger, matériaux de construction de nid, maisonnette, tubes en carton) contenant de la paille, de la nourriture et de l’eau à volonté.

Choix des espèces

Les souris C57Bl/6N et BalbC sont couramment utilisées dans la littérature, permettant de comparer nos résultats à des études précédentes. De plus, elles possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant de mimer la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.

671 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Elles reçoivent des greffes de cellules cancéreuses par voie sous-cutanée, intraveineuse ou intracardiaque, puis un agent anticancéreux deux fois par jour ou par pompe implantée, avec des tumeurs pouvant s'ulcérer et se nécroser, une perte de poids et des hématomes, pour évaluer une pro-drogue activée dans le microenvironnement tumoral. Le porteur suit la croissance des tumeurs par IRM, la mise à mort étant déclenchée à un score de souffrance défini. Il affirme qu'il est "indispensable" d'utiliser des animaux vivants car le système immunitaire et les tissus environnants seraient nécessaires.

Objectifs

L'agent anticancéreux que nous étudions sont des pro-drogues activables par des enzymes qui libèrent des agents toxiques. En effet, la présence d’activité enzymatique permanente est une caractéristique du microenvironnement des tumeurs. Ces enzymes actives peuvent provenir des cellules tumorales, des cellules infiltrées ou encore des cellules environnant la tumeur. L'agent anticancéreux activé par les enzymes ont un effet toxique qui permettrait de tuer plus spécifiquement les cellules cancéreuses qu’une drogue de chimiothérapie classique qui s’attaque à toute cellule en division indistinctement. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer l'effet thérapeutique du nouvel agent anticancéreux sur des modèles de tumeurs et de métastases, non seulement, pour la prévention de formation de tumeurs mais aussi pour le traitement de tumeurs déjà formées.

Bénéfices attendus

Tout d'abord, basées sur nos résultats in vitro, le traitement par le nouvel agent anticancéreux devrait être efficace sur le développement de tumeurs et de métastases. De plus, du fait de sa cible, la dissémination des cellules cancéreuses devrait être réduite, limitant le développement métastatique. Contrairement aux agents chimiothérapeutiques actuels, la toxicité induite par le nouvel agent anticancéreux devraient être ciblée aux cellules tumorales, et induire peu, voire pas du tout, de résistance. Ainsi, du fait de sa spécificité d'action, les effets secondaires obtenus lors de chimio-thérapie classique devraient être absents. Le nouvel agent anticancéreux pourrait être utilisé pour traiter de nombreux cancers solides.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. 264 souris seront injectées en sous-cutané avec des cellules cancéreuses (durée de l'intervention: 10min par animal) puis traitées avec l’agent anti-cancéreux soit deux fois par jour par voie intraveineuse, intrapéritonéale, ou intra-tumorale (durée de ces injections: 2-3min par animal), soit en continu grâce à une pompe osmotique implantée en sous-cutanée. Ce traitement sera réalisé jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. 73 souris seront injectées en intra-cardiaque avec des cellules cancéreuses (durée de l'intervention: 10min par animal) puis traitées avec l’agent anti-cancéreux soit en continu grâce à une pompe osmotique implantée en sous-cutanée, soit par des injections intraveineuses ou intra-péritonéales biquotidiennes (durée des injections: 2-3min par animal). Ce traitement sera réalisé jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. 264 souris seront injectées en intraveineux avec des cellules cancéreuses (durée de l'intervention: 10min par animal) puis traitées avec l’agent anti-cancéreux soit en continu grâce à une pompe osmotique implantée en sous-cutanée, soit par des injections intraveineuses ou intra-péritonéales biquotidiennes, soit par des instillations biquotidiennes (durée de ces injections: 2-5min par animal). Ce traitement sera réalisé jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. 70 souris saines seront injectées avec l’agent anti-cancéreux par voie intraveineuse ou intrapéritonéale deux fois par jour (durée de ces injections: 2-3min par animal) pendant la même durée que celle déterminée sur les souris portant des tumeurs ou métastases. Puis les animaux seront soumis à un examen IRM sous anesthésie générale toutes les semaines jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. Lors de cet examen, une injection intraveineuse d'un agent de contraste (durée de l'injection: 1min par animal) sera réalisée.

Impact sur les animaux

Du fait de la haute spécificité de substrats des alkoxyamines, celles-ci ne devraient pas entrainer de nuisance ou d'effets secondaires. Cependant, en théorie une baisse de tension est possible due à la présence des nitroxydes. Selon notre expérience elle n’entraine jamais de séquelle ou de perte d’animaux. Les effets indésirables attendus à cause des modèles tumoraux devraient être détectables au niveau de l’apparence physique (prostration, pilo-érection, chromadacryorrhée), du comportement, de la respiration (respiration rapide/superficielle), d’alimentation (perte de poids), de température corporelle. De plus, les tumeurs sous-cutanées peuvent aussi être sources de nuisances (ulcération, nécrose, difficulté de mobilité). Les instillations intra-trachéales pourraient induire une irritation de la gorge associée à des signes d’inconfort respiratoire (dyspnée, respiration orale). Les injections intraveineuses biquotidiennes pourraient provoquer des hématomes, et une mauvaise perfusion sanguine.

Devenir

Nous souhaitons déterminer si le nouvel agent anti-cancéreux permet de réduire la croissance tumorale ou empécher la formation de métastases. Un suivi longitudinal est donc nécessaire.

Remplacement

Il est indispensable d’utiliser les animaux vivants, car nous souhaitons évaluer l'efficacité thérapeutique d'un nouvel agent anticancéreux sur des tumeurs, dont le micro-environnement inclut des enzymes actives qui proviennent souvent des cellules non tumorales qui infiltrent la tumeur ou des cellules qui entourent la tumeur. Ainsi, le système immunitaire et les tissus normaux environnants sont particulièrement nécessaires pour évaluer leur efficacité.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser pour ce projet, des expérimentations in vitro ont été réalisées (et seront réalisées) en amont, pour étudier l'effet du nouvel agent anticancéreux sur chacune des cellules cancéreuses en culture. De plus, comme nous avons déterminé que les cellules de fibrosarcomes répondaient au traitement in vitro, nous débuterons nos expérimentations avec ces cellules. Selon les résultats sur ce modèle, le nombre d'animaux nécessaires pour déterminer la concentration optimale et la voie d'injection appropriée pourra être diminué pour les autres modèles de tumeurs primaires et métastases. En effet, nous pourrons réduire le nombre de concentrations à tester ainsi que les voies d'injection, afin de limiter le nombre d'animaux total. L'imagerie par Résonance Magnétique (IRM) permet d'imager l'animal plusieurs fois pour évaluer un traitement (ici pour suivre l’évolution de la croissance tumorale) sans avoir recours à des euthanasies à différents temps au cours du traitement pour réaliser de l'histologie. Cette méthode a été choisie car elle permet de limiter énormément le nombre d'animaux. Nous avons évalué que 3 souris par concentration d’agent anticancéreux suffiront pour déterminer si la molécule entraine un effet thérapeutique. Ensuite, 10 souris par groupe seront utilisées afin de pouvoir comparer les groupes statistiquement.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi par des objets contenant de la paille, de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésies gazeuses et la présence d'un tapis chauffant permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Du gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux afin de compenser la sécheresse oculaire lors des anesthésies. Afin d'administrer l'agent anticancéreux, nous testerons l'utilisation de pompes osmotiques implantables sous la peau de l'animal et reliées via un cathéter à la veine jugulaire. Ceci permet une administration continue des molécules, et réduira le stress de l'animal comparé à des injections quotidiennes nécessitant une contention voire une anesthésie générale. Une grille de scorage a été établie pour permettre de suivre l’état des animaux deux fois par semaine minimum. Différents critères ont été établis pour évaluer le bien-être tant au niveau de l’apparence physique, du comportement, du poids de corps, de la respiration, de la température corporelle et de signes cliniques au niveau tumoral. Chaque critère est noté sur 3. Si le score total est supérieur à 4, une prise en charge analgésique de l’animal devra être réalisée. Si le score atteint 10, l’animal sera euthanasié dans la journée, après une dernière session IRM. Les souris seront pesées juste avant les procédures de mise en place d'un modèle tumoral, puis deux fois par semaine. Lorsque une perte de poids de 10% sera mesurée (signifiant l’entrée en phase critique), les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Lors de ces pesées, les volumes des tumeurs sous-cutanées seront mesurés grâce à un pied à coulisse. Dès les premiers signes de mal-être (score supérieur à 4), les animaux seront pris en charge par un analgésique. Si besoin, une crème sera appliquée pour désinfecter les lésions tumorales; 1 goutte dans l’oeil d’un désinfectant oculaire sera déposée 2 fois par jour en cas de besoin de soins oculaires. Du gel diet sera mis-à-disposition dans les cages dès que les animaux auront perdu 10% de leurs poids initial. Une réhydratation pourra être réalisée grâce à une injection sous-cutanée de glucose 5%. Le nombre d’animaux par cage pourra être réduit pour isoler les animaux les plus affaiblis, et un enrichissement renforcé pourra être appliqué. Des points limites ont été instaurés prenant en compte le modèle tumoral, induisant une euthanasie dans la journée après une dernière session IRM.

Choix des espèces

La souris permet de développer de nombreux modèles tumoraux, dont nous avons l’expertise. Les cellules cancéreuses d'origine murine seront injectées dans des souris possédant un système immunitaire actif. Les souris immunodéficientes seront injectées avec des cellules cancéreuses d'origine humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge jeune adulte (à partir de 10 semaines), car nous souhaitons mimer le développement d'un cancer chez l'homme adulte.