Souris

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie l'implantation d'une capsule de mesure de température dans l'abdomen, puis jusqu'à quatre injections dans la veine de la queue, pour évaluer un vecteur censé faire franchir la barrière hématoencéphalique à des candidats médicaments. Le porteur justifie la mise à mort par la présence de ce dispositif abdominal qui ne peut rester en place durablement. Il décrit de nombreux modèles in vitro de cette barrière et affirme que seul l'animal vivant permet d'étudier le passage des vecteurs les plus prometteurs.

Objectifs

Un vecteur innovant a été développé afin de faire franchir la barrière hématoencéphalique à des molécules incapables d’atteindre leur cible cérébrale. Le but de ce projet est d’évaluer in vivo les capacités de ce vecteur fusionné à des molécules prometteuses.

Bénéfices attendus

Actuellement, le franchissement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) est le plus gros frein au développement de nouveaux médicaments à cibles cérébrales. Plus de 90% des molécules évaluées par l’industrie pharmaceutique pour une maladie du système nerveux central (SNC) sont abandonnées en phase clinique faute d’atteindre leur cible. La validation de notre vecteur pour la délivrance de candidats médicaments au travers de la BHE est donc très attendue et permettrait de relancer la recherche de nouveaux médicaments en neurosciences.

Procédures

Les animaux seront soumis à l’implantation intrapéritonéale d’une capsule permettant le suivi de la température interne. La procédure est réalisée en 5 min environ sous anesthésie générale et la possible douleur post-opératoire est prise en charge par traitement avec un analgésique. Les composés testés seront injectés par voie intraveineuse dans la veine caudale, à raison d’un maximum de 4 injections étalées sur 8 jours.

Impact sur les animaux

La pose de la capsule mesurant la température ne doit pas provoquer de douleur autre que celle de l’intervention chirurgicale. Une médication préopératoire et post-opératoire et des points limites adaptés permettront de prendre en charge efficacement la douleur et le stress. Par ailleurs, une nuisance modérée pourrait survenir en raison des injections intraveineuses caudales successives.

Devenir

La mise à mort des animaux à l’issue de la procédure expérimentale est justifiée par la présence dans la cavité abdominale du dispositif de mesure, qui ne peut être chronique.

Remplacement

De nombreux modèles in vitro de la BHE ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Leur utilisation est limitée par la nécessité d'une isolation fraîche de microvaisseaux cérébraux et par leur durée de vie efficace qui est relativement courte (quelques heures). Les systèmes de co- et tri-cultures avec les autres cellules constituant la BHE permettent généralement d’améliorer les propriétés de barrière de ces modèles mais sont plus difficilement manipulables. Ces modèles nous ont cependant permis de cribler de nombreux vecteurs de franchissement de la BHE mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des vecteurs les plus prometteurs en raison de la combinaison de tous les aspects biologiques tels que les barrières physiologiques, les transporteurs et les voies métaboliques.

Réduction

Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux. En effet un faible effectif sera utilisé pour évaluer la faisabilité de la méthode lors de l’étude pilote, et l’étude principale ne sera réalisée que si cette première étude est concluante. De plus le dispositif implantable choisi permettant la mesure de la température participe à la réduction du nombre d’animaux utilisés grâce à la collecte de données fiables et continues.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce et le choix du dispositif implantable de mesure de la température préserve la mobilité et les conditions de vie en groupe. Ce dispositif favorise également le bien-être animal en limitant les manipulations, le stress et les contraintes appliquées aux mesures de températures corporelles conventionnelles. Une médication et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance.

Choix des espèces

Les études précédentes de biodistribution des composés utilisés ont été réalisées chez la souris de même que les études sur le passage de la BHE par la neurotensine sur lesquelles nous nous appuyons. Aussi, afin de pouvoir comparer nos futures données, nous restons pour cette étude sur la même espèce animale. Les animaux utilisés seront adultes, âgés au minimum de 8 semaines, pour que le dispositif implanté en intra-péritonéal soit le moins gênant possible.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est induit par injection, puis chaque animal subit l'ablation chirurgicale d'un rein et des séjours répétés en cage métabolique isolée, avant prélèvement sanguin terminal et mise à mort pour analyser les reins, dans une étude sur les complications rénales du diabète. Le porteur mentionne une douleur au point d'injection, une douleur post-opératoire et une possible atteinte du cœur, des reins et de la rétine. Il indique recourir aussi à des cultures cellulaires et affirme que le remplacement ne reproduit pas les interactions entre organes, d'où le recours à la souris.

Objectifs

Le diabète est la première cause de mise sous dialyse en Europe. L’insuffisance rénale est de sévérité variable au moment de la découverte de la maladie, mais la règle est que la néphropathie diabétique conduit à une altération lente et progressive des unités de filtration du rein, les glomérules. Nous recherchons les stimuli à l’origine des lésions des glomérules induites au cours du diabète. Nous avons identifié récemment un mécanisme de protection des glomérules. Nous allons maintenant étudier de façon plus précise le lien entre ce mécanisme et le développement de la néphropathie diabétique.

Bénéfices attendus

A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la néphropathie diabétique et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de cette complication sévère du diabète.

Procédures

Une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 2 jours (20 secondes/ jour). Une procédure chirurgicale: uninéphrectomie (20 minutes). 11 Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement par semaine). Un prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié (1 minute) .

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire soulagée par des analgésiques. Effets du modèle pathologique de diabète: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines).

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes rénales.

Remplacement

Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.

Réduction

Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur le logiciel en ligne https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/ avec un risque alpha de 5%, une puissance de 80%, une moyenne du groupe contrôle de 22, une moyenne pertinamment différente attendue de 26 dans le groupe traité, une déviation standard de 3 et un ajustement de 10%; ce qui donnait 15 animaux par groupe requis. 5 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental (pénétrance incomplète de la streptozotocine, mortalité liée à la chirurgie, point limites atteints). Nous optimisons l'utilisation des reins pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane 2%) avec une analgésie péri-opératoire (bubrénorphine 0,1mg/kg sc).

Choix des espèces

La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Souris adultes agées de 8-12 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.

80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'injection d'un vecteur viral dans le cerveau, puis un isolement en cage individuelle pour toute la durée du projet, des jeûnes prolongés jusqu'à quatorze heures, des tests de tolérance au glucose et de privation de glucose provoquant une hypoglycémie, avant mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur reconnaît que la récupération chirurgicale, le jeûne et l'isolement sont sources de douleur, de stress et d'inconfort, et cherche à les limiter par des contacts visuels entre cages. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier le rôle des cellules gliales dans le contrôle de la glycémie et du poids.

Objectifs

L’obésité et ses comorbidités représentent un grave problème de santé publique. Le contrôle de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques et les apports par l’alimentation) est assuré par le cerveau, avec un rôle important dévolu au complexe vagal dorsal (CVD) localisé dans le tronc cérébral caudal. Le CVD dispose de réseaux de neurones sensibles au glucose et à d’autres signaux informant des réserves énergétiques de l’organisme, mais aussi de cellules gliales dont la contribution au contrôle de la balance énergétique commence à être révélée. Cette procédure vise à réduire l’expression de la connexine 43 par interférence ARN et ainsi altérer, au sein du complexe vagal dorsal, les communications par jonctions communicantes entre cellules gliales et les communications paracrines depuis les cellules gliales via les hémi-canaux de connexines, puis à en tester les effets sur la croissance pondérale, la prise alimentaire, la tolérance au glucose et l’adaptation précoce à un régime riche en sucre et graisse (comportement alimentaire, marqueurs métaboliques circulants et morphologie des cellules gliales). Nous utilisons des vecteurs viraux adéno-associés pour inhiber la connexine la plus abondante du système nerveux central spécifiquement dans les cellules gliales du CVD et ainsi altérer leur communication. Nous avons vérifié la spécificité et la fonctionnalité de ces outils dans un précédent projet pilote. Dans le présent projet, nous souhaitons déterminer le rôle fonctionnel joué par cette molécule sur l’homéostasie glucidique et énergétique chez la souris. Les procédures décrites permettront de déterminer si la communication des cellules gliales intervient : 1) dans la tolérance au glucose et les réponses comportementale et neuronales à une privation en glucose ; 2) dans le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel sous un régime alimentaire standard ; 3) dans l’activation gliale et l’adaptation homéostatique lors d’une exposition brève à un régime riche en sucre et en graisses.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales du tronc cérébral caudal régulent la prise alimentaire et la glycémie. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle de la connexine 43 fortement exprimée par ces cellules gliales : 1) dans la régulation de la prise alimentaire et du poids corporel dans le cadre d’un régime alimentaire standard ; 2) dans les régulations de la glycémie en réponse à une surabondance ou une privation en sucre ; 3) dans les phases précoces de réaction à un régime alimentaire riche en sucre et en graisse, lors desquelles une surconsommation initiale laisse place à une normalisation de l’apport calorique. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous analgésie morphinique préopératoire et anesthésie générale (durée 45 minutes) pour l’injection intracérébrale d’un vecteur viral contrôle ou ciblant la connexine 43. Les animaux seront ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, pour leur sécurité (risque de blessures par les congénères) et pour les mesures individuelles nécessaires pour déterminer l’impact de la réduction de la connexine 43 sur le contrôle de la glycémie et la prise alimentaire. Après récupération chirurgicale, certains animaux subiront un test de tolérance au glucose (4h), au cours duquel une solution de glucose sera administrée par voie orale (moins d’1 min), puis des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale sous anesthésie locale pour suivre l’évolution du glucose sanguin (7 prélèvements en 4h, moins d’1 min par prélèvement). D’autres animaux subiront des tests de privation en glucose (par injection IP d’un analogue non métabolisable du glucose ; durée 2h), suivi de mesures de la glycémie (5 prélèvements de sang à la veine caudale en 2h) ou de la prise alimentaire. Les tests de tolérance au glucose et les tests de privation en glucose nécessitent une mise à jeun préalable, respectivement de 14h et de 5h. A la 9ème semaine post-chirurgie, les animaux ayant subi le test de tolérance au glucose seront soumis à un régime alimentaire riche en graisse et en sucre pour une durée de 12h ou 5 jours, ou maintenus sur régime alimentaire standard pendant 5 jours (groupes contrôles). A l’issue de ces régimes, les animaux seront mis à mort sous analgésie morphinique et anesthésie générale. Le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux ayant subi les tests de privation en glucose recevront à nouveau une administration IP d’un analogue non métabolisable du glucose (ou de solution saline) et seront mis à mort 3h après cette injection, sous analgésie et anesthésie générale. Le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem.

Impact sur les animaux

Les procédures utilisées ont pour objectif de tester la contribution des cellules gliales à la régulation du statut glycémique et de l’homéostasie énergétique. L’accomplissement de cet objectif implique le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement, pour leur sécurité durant la récupération post-opératoire et pour le suivi individuel de la consommation alimentaire et des régulations du statut glycémique dans la suite des procédures. La période de récupération post-opératoire est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après récupération postopératoire, l’administration orale de glucose ou l’administration intrapéritonéale d’un dérivé non métabolisable du glucose (2DG) causent un inconfort dû à la contention de l’animal et à l’administration elle-même. Ces administrations sont précédées d’une mise à jeun indispensable à la standardisation du statut glycémique, limitée à 14 h pour le test de tolérance au glucose et à 5 h pour la glucoprivation. Cette mise à jeun est une source de stress pour les animaux. L’hypoglycémie provoquée par l’administration 2DG et les contre-régulations physiologiques permettant le retour à la normo glycémie sont une source d’inconfort pour l’animal. Le suivi du statut glycémique requiert des prélèvements répétés d’une goutte de sang à la veine latérale de la queue. L’exposition à un régime riche en sucre et en graisse pendant 12h à 5 jours ne génère aucune douleur ou inconfort mais nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source d’inconfort. La récupération des cerveaux fixés, indispensable aux études immuno histologiques post-mortem, nécessite une mise à mort par perfusion intracardiaque.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, des analyses histologiques post-mortem sont indispensables : 1) Pour vérifier l’expression du vecteur viral par les cellules gliales dans la région d’intérêt ; 2) et caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales. Ces analyses post-mortem nécessitent donc une mise à mort des animaux.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de l’homéostasie glucidique, la consommation alimentaire et le poids corporel.

Réduction

Au total, 80 souris mâles sont nécessaire à ce projet. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Un précédent projet pilote nous a permis de vérifier l’efficacité de nos vecteurs viraux à réduire l’expression de la protéine Cx43 de façon ciblée dans la zone cérébrale d’intérêt. Il s’agit ici de déterminer l’impact fonctionnel de cette réduction d’expression. Les mesures terminales à effectuer consistent en une analyse immunohistochimique avec quantification : du nombre et de la morphologie des cellules gliales d’intérêt en réponse à l’exposition brève à un régime riche en graisse et en sucre (procédure 1) et de l’activation cellulaire neuronale et gliale en réponse à une glucoprivation (procédure 2). Le nombre de lots nécessaires à ces analyses dépend du nombre de variables testées dans chaque procédure. Pour la procédure 1 : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 3 conditions différentes de régime alimentaire (régime riche en graisse et sucre : 12 h ou 5 jours HFS ; régime alimentaire standard : 5 jours), soit 6 lots d’animaux. Pour la procédure 2 : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 2 traitements pharmacologiques (solution saline ou analogue non métabolisable du glucose), soit 4 lots d’animaux. Pour l’effectif par lot, la quantification du nombre et de la morphologie des cellules gliales nécessite 7-8 animaux par lot, compte-tenu de la variabilité des mesures. Un effectif de 8 animaux par groupe est choisi ici pour prendre en compte la variabilité de ciblage des injections de vecteur viral. Cet effectif par lot est pleinement compatible avec les mesures préalables de tolérance au glucose aux 3 délais post-chirurgie envisagés (4, 6 et 7 semaines), chacun de ces tests mobilisant deux lots d’animaux parmi les 6 de la procédure 1 (2 variables : vecteurs viraux contrôle et ciblant la connexine 43). Pour la procédure 2, les mesures de glycémie et prise alimentaire en réponse à la glucoprivation imposent un effectif de 8 animaux par lot. Ces expériences mobilisent chacune les 4 lots d’animaux de la procédure 2, en raison des 4 variables par expérience : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 2 traitements pharmacologiques (solution saline ou analogue non métabolisable du glucose).

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie de points limite et de points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et/ou anesthésie générale chimique. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie morphinique pré-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale chimique et analgésie post-opératoire. En période post-opératoire, un suivi renforcé est mis en place. Durant les deux premiers jours post-opératoires, une analgésie est systématiquement administrée et une alimentation sous forme de gel enrichi est disposée en fond de cage pour limiter la déshydratation et la perte de poids. Les prélèvements sanguins à la veine latérale de la queue pour dosages glycémiques seront réalisés sous anesthésie locale. Les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention avant les tests de tolérance au glucose et de glucoprivation. Ces phases d’habituation ont pour objectif de réduire l’angoisse animale et d’éviter des fluctuations importantes de la glycémie et de la prise alimentaire dû à la manipulation des animaux et à la contention. De plus, une habituation au retrait de la mangeoire (pendant 2h en phase diurne les deux jours précédant la mise à jeun de 14 h) et à la nourriture enrichie en sucre et en graisse (pendant 10 minutes en phase diurne les deux jours précédant la bascule sur ce régime) contribuera à diminuer le stress des animaux et évitera la néophobie lors du changement de régime alimentaire. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie d’injection intracérébral jusqu’à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. Les atlas stéréotaxiques se basent sur cet âge pour estimer les coordonnées stéréotaxiques des structures ciblées.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent des injections répétées de morphine sur cinq jours qui provoquent selon le porteur une tolérance et une hyperalgésie, puis subissent des stimulations mécaniques de la patte au filament de Von Frey déclenchant un retrait douloureux, pour étudier le rôle d'un récepteur dans les effets de la morphine chronique. Le porteur souligne que l'animal peut échapper à la stimulation faute de contention et décrit des points limites incluant vocalisations, automutilation et perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'étude in vivo car la douleur met en jeu de nombreuses régions nerveuses.

Objectifs

La morphine est un antalgique puissant qui appartient à la classe des opioïdes. Son utilisation, qui permet de soulager des douleurs intenses, peut être limitée en raison de l'apparition d'effets secondaires et de phénomènes de tolérance (accoutumance nécessitant d’augmenter la posologie pour maintenir l’effet antalgique) et d’hyperalgésie (amplification de la douleur suite à un stimulus nociceptif). Ses deux effets secondaires sont liés à l’utilisation de morphine de façon chronique. Il a récemment été mis en évidence l’importance du récepteur Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) au niveau périphérique dans le développement des douleurs neuropathiques. L’objectif général sera d’étudier le rôle de ce récepteur FLT3 au niveau central (plus précisément de la moelle épinière) dans les effets induits par la morphine administrée en aigue et par la morphine administrée en chronique. Les objectifs spécifiques du projet seront : Objectif 1) d’étudier les comportements d’analgésie et d’hyperalgésie des souris Wild type (WT) et des souris KO FLT3 après administration de morphine en aigue ou de morphine en chronique, Objectif 2) d’étudier les effets de ce même traitement (morphine aigue versus morphine chronique) sur les propriétés électrophysiologiques et morphologiques des neurones de la moelle épinière dorsale sur les souris WT et les souris KOFLT3 et Objectif 3) de déterminer si l’activation globale des neurones des couches superficielles de la corne dorsale est différente après morphine aigue ou chronique et si la suppression des récepteurs FLT3 modifie cette activation.

Bénéfices attendus

Ce projet présente un intérêt fondamental via l'étude des mécanismes d'action de la morphine au niveau central, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les effets secondaires dus à la prise chronique de morphine.

Procédures

Les animaux seront soumis à des piqures intrapéritonéales de morphine (1 à 10 piqures sur 5 jours). Par ailleurs, des stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey pour induire un retrait de la patte sera réalisé. Cette stimulation dure moins d’une seconde.

Impact sur les animaux

Les souris vont soit recevoir une seule injection de morphine (ou de liquide physiologique) en intrapéritonéale qui va induire un effet analgésique ou bien 2 injections/jours pendant 5 jours de morphine (ou de liquide physiologique), qui va provoquer une tolérance ou une hyperalgésie à la morphine qui n’empêche pas les mouvements de l’animal. Par ailleurs, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey induisent un retrait de la patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention.

Devenir

Tous les animaux des 2 procédures seront mis à mort. Les 2 procédures sont 2 expériences différentes ne permettant pas de réutiliser les animaux.

Remplacement

Il n’y a pas de méthode alternative permettant de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.

Réduction

Tout d'abord, une réduction sera réalisée dans la partie 1 du projet car les animaux de l'étude « comportement chronique morphine »(objectif 1) seront ré-utilisés pour l'étude des enregistrements électrophysiologiques (objectif 2). De plus, une réduction sera également réalisée dans la partie 2 du projet où nous ne ferons pas de groupe de souris "controle", nous utiliserons le coté contralatéral d'un même animal comme groupe contrôle. Enfin, le nombre de groupes de souris et le nombre de souris par groupe sera réduit au maximum tout en préservant une puissance statistique significative. Le nombre de souris par groupe a été déterminé sur la base des études précédentes et sur un calcul de puissance (http://www. 3rs-reduction.co.uk/html/6__power_and_sample_size.html). Ainsi le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 8 souris par groupe pour observer une différence de 50% entre les animaux contrôles et les animaux traités. Afin d'anticiper une perte éventuelle d'animaux liée à la procédure expérimentale (injection...), un nombre maximum de 10 animaux par groupe sera envisagé pour le comportement et les stimulations électriques. La période d’habituation avant le comportement est fondamentale afin d’assurer une reproductibilité des tests et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux réduisant le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les données récoltées seront analysés par une mesure de variance suivie d’un test de Tukey si normalité vérifiée (sinon test de Mann-Whitney) pour comparer 2 groupes et une ANOVA one-way ou two-way sera réalisée pour comparer plus de 2 groupes expérimentaux.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’un enrichissement social: elle seront par groupes de 4 à 6 par cages et environnemental: des rouleaux et des nids seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue)…mettrait fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort. Pour limiter l’angoisse due aux tests pratiqués, une habituation de minimum une semaine sera réalisée au cours de laquelle les animaux seront placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h puis ensuite seront exposés aux différents tests sans appliquer le stimulus. Cela permettra aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress lié à la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Il est nécessaire de réaliser ces études in vitro chez l’animal car aucune méthode alternative actuelle ne permet d’évaluer les effets de la morphine et les effets de délétion de FLT3 dans le développement de la chronicisation douloureuse. Les souris ont été choisies afin de pouvoir travailler en parallèle sur des souris transgéniques adaptées à nos recherches (dépourvues du gène FLT3) pour mieux comprendre les mécanismes d’action de la morphine dans l'induction de la tolérance/hyperalgésie, et sur des souris sauvages. Les souris auront entre 3 et 8 semaines, ce qui correspond aux âges utilisés dans la littérature.