Souris

78 souris âgées d'un an vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une minipompe implantée sous la peau diffuse deux composés provoquant une hypertension, puis les souris subissent chaque semaine une échographie cardiaque sous anesthésie et des prélèvements de sang, pour mesurer le rôle de deux protéines dans la réponse du cœur. Le porteur indique refaire une étude déjà menée, dont le protocole comportait une incertitude sur la durée de diffusion des composés, et fixe une mise à mort en cas de perte de poids supérieure à 20 %. Il affirme qu'aucun modèle sans animaux ne reproduit une hypertension sur un organisme complet et retient la souris pour l'accès à des lignées génétiquement modifiées.

Objectifs

Nous souhaitons étudier le rôle de deux protéines spécifiques dans la fonction cardiaque, et plus particulièrement dans le cadre d'une hypertension. Ces protéines semblent liées notamment à certaines atteintes musculaires d'origine génétique. Ce projet vise ainsi à comprendre comment la suppression de l'une ou de l'autre de ces protéines pourrait modifier les réponses du système cardiaque lors d'une hypertension. Cette dernière sera mise en place par le biais d'une exposition prolongée à deux composés (l'angiotensine II et la phenylephrine) dont l'infusion continue dans l'organisme impacte le système cardiaque. Ces travaux sont une étape nécessaire dans le développement de traitements potentiels de ce type de maladie ne disposant actuellement d'aucun traitement. Le modèle Souris nous permet d'accéder à des animaux génétiquement modifés, permettant d'étudier l'ensemble des fonctions d'une protéine au sein d'un organisme complet adulte. Il s'agit d'une approche très utile pour déterminer la fonction d'une protéine dans un organisme vivant et ainsi orienter le développement de nouveaux médicaments. Dans ce projet, nous prévoyons donc d'analyser des animaux génétiquement modifiés, ne disposant plus de l'une ou de l'autre des protéines. Nous avons pu constater que ces animaux ne présentent aucun déficit majeur durant leur vie, et que leur fonction cardiaque basale n'est pas altérée. Nous comparerons donc des animaux génétiquement modifiés pour l'une ou l'autre des protéines, avec ou sans hypertension induite pharmacologiquement. De premières données ont été générées lors d'une étude préalable et montraient un effet significatif de ces mutations sur la réponse à l'hypertension. Malheureusement, le protocole présentait une inconnue concernant la durée de diffusion des composés. Nous avons entre temps revu ce point et voulons donc conclure de manière robuste sur ce résultat. Chaque groupe expérimental sera constitué de 12 animaux, cet effectif étant suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables dans les protocoles d'analyse prévus (échographie cardiaque et électrocardiogramme). Nous prévoyons six animaux additionnels afin d'anticiper l'atteinte de point limite durant le protocole. Nous souhaitons donc employer un total de 78 souris pour ce protocole, comparant des animaux exprimant ou non un récepteur d'intérêt, dans des conditions physiologiques ou avec une hypertension (4 conditions au total pour chaque protéine étudiée).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de comprendre si la fonction cardiaque est altérée par l'absence de protéine, et comment ce système évolue durant une hypertension. Il vise aussi à confirmer des données préalables collectées durant un protocole précédent mais contenant une incertitude sur les modalités de diffusion des composés pharmacologiques.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs échographies pour surveiller leurs fonctions cardiaques - durée d'environ 35 minutes. Elle seront anesthésiées par voie gazeuse. Des prélevements sanguins (durée environ 2 minutes) seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la décision du manipulateur, afin de favoriser le bien-être de l'animal (le prélevement vigile se fait à la veine temporale superficielle et s'avère moins stressant qu'une anesthésie gazeuse couplée au prélevement au sinus orbital). Une implantation de minipompe sera réalisée sous la peau lors d'un geste chirurgical (durée environ 30 minutes). Celui-ci sera couplé à l'utilisation d'antalgiques avant, pendant et après l'incision pour éviter toute souffrance aux souris.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une implantation sous-cutanée des mini-pompes. Celles ci restent sous la peau durant l'ensemble du projet, et ont une longeur de 3 cm et un diamètre de 0.7 cm. La chirurgie est simple et maitrisée pour cette implantation et aucune complication n'a été observée dans le projet précédent. Une couverture analgésique durant l'implantation et dans les jours suivant celle-ci, couplée à des conditions antiseptiques permettent de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions optimales. Suite à cette implantation, les animaux subiront une anesthésie gazeuse pour passer une échographie cardiaque chaque semaine. Celle-ci dure environ 30 minutes et les animaux se réveillent spontanément. Durant cette anesthésie, un prélevement sanguin à la veine temporale superficielle sera effectué.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem biochimiques et histologiques.

Remplacement

Etant donné que ce protocole vise à modéliser un phénomène cardiaque complet, à savoir la mise en place d'une hypertension, nous ne disposons pas actuellement de modèles alternatifs n'utilisant pas l'animal.

Réduction

Dans ce protocole, nous avons planifié d'utiliser 14 animaux par groupes expérimentaux. En effet, nos études précédentes nous ont montré que l'effectif idéal se situe entre 12 et 14 animaux par groupe expérimental selon la variabilité de la réponse au mélange pharmacologique observée. De ce fait, nous prévoyons un total de 78 animaux recevant une minipompe, pour obtenir des conclusions statistiques tout en anticipant une variabilité possible. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (analyse de variance et test de Student).

Raffinement

Les animaux seront hebergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec un enrichissement, nourriture et boisson à volonté. Les animaux recevront un antalgique par injection intra-péritonéale avant leur anesthésie. Ils auront un antalgique en post-opératoire pour couvrir les douleurs possibles lors de la cicatrisation. Lors des échographies, les animaux seront anesthésies par voie gazeuse. Chaque semaine, les animaux seront pesés et évalués pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 20% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système cardiaque peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les animaux seront agés de 1 an, afin d'être dans des conditions similaires à notre étude précédente.

48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie injecte un vecteur viral dans le cerveau pour bloquer une protéine des cellules gliales, puis les souris, logées seules, passent des tests d'anxiété en arène, de préférence alimentaire et un jeûne de 24 heures, afin d'étudier la régulation de la balance énergétique. Le porteur reconnaît que la récupération après chirurgie, l'isolement et le jeûne sont sources de douleur, de stress et de perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'étudie le rôle de ces cellules gliales et renvoie au long terme d'éventuelles voies contre l'obésité.

Objectifs

L’obésité et ses comorbidités représentent un grave problème de santé publique. Le contrôle de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques de l’organisme et les apports par la prise alimentaire) est assuré par le cerveau, avec un rôle important dévolu à une région cérébrale appelée complexe vagal dorsal (CVD). Le CVD dispose de réseaux de neurones sensibles à de multiples signaux informant du niveau des réserves énergétiques de l’organisme, mais aussi de cellules gliales dont la contribution au contrôle de la balance énergétique commence à être révélée. Les cellules gliales sont équipées de protéines appelées connexines qui leur permettent d’envoyer des signaux aux neurones et d’établir une communication directe entre cellules gliales adjacentes. Nous utilisons des vecteurs viraux pour inhiber la fabrication des connexines spécifiquement dans les cellules gliales du CVD. Notre objectif global est d’évaluer le rôle joué par les connexines des cellules gliales du CVD dans le contrôle de la balance énergétique chez la souris. Les procédures décrites permettront de déterminer si les connexines des cellules gliales sont impliquées : 1) dans les préférences alimentaires des animaux ; 2) dans le maintien du métabolisme énergétique, le contrôle de la prise alimentaire et hydrique, ainsi que la régulation des dépenses énergétiques ; 3) dans les réponses comportementales, hormonales, et cellulaires à une réalimentation après mise à jeun.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales du tronc cérébral caudal régulent la balance énergétique chez le rongeur. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle des connexines 43 fortement exprimées par ces cellules gliales : 1) dans les choix alimentaires entre une nourriture standard et une nourriture enrichie en graisse et sucre ; 2) dans le contrôle fin de la prise alimentaire, de la prise hydrique, des dépenses énergétiques, ou encore de l’activité locomotrice ; 3) dans la réponse au jeûne et à l’hyperphagie consécutive à un jeûne. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous analgésie morphinique et anesthésie générale (durée 45 minutes) pour l’injection intracérébrale d’un vecteur viral contrôle ou ciblant la connexine 43. Les animaux seront ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, pour leur sécurité et pour les mesures individuelles de prise alimentaire et la réponse au jeûne et à l’hyperphagie consécutive à un jeûne. Après récupération chirurgicale, un tiers des animaux subira un test comportemental, au cours duquel ils sont placés dans une arène pendant 30 minutes pour mesurer leur activité exploratoire et établir leur niveau d’anxiété. Une semaine après, un test de préférence alimentaire sur une durée de 8 jours sera employé. Les souris auront accès, à deux régimes différents : un régime standard et un régime enrichi en graisse et en sucre qui ne génère aucune douleur ou inconfort. A l’issue de ces régimes, soit à 6 semaines post-chirurgie, les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie générale et le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem. Après récupération chirurgicale, les autres animaux seront transitoirement hébergés dans des cages couplées à un système de calorimétrie indirecte pour étudier le métabolisme des animaux. Cet hébergement dure 3 jours, et aura lieu au cours de la 6e semaine post-chirurgie ou au cours de la 4e puis de la 7e semaine post-chirurgie. Le premier jour permet à l’animal de s’habituer à son environnement. Les enregistrements sont réalisés au cours des 48h suivantes. A la fin de la 9e semaine post-chirurgie, ces animaux sont utilisés dans un protocole visant à mesurer l’hyperphagie consécutive à un jeûne, les niveaux de signaux métaboliques en réponse au jeûne ou à la réalimentation, ainsi que la réponse neurale à ces modifications du statut nutritionnel. Ce protocole a lieu après une habituation de 3 jours, au cours de laquelle la nourriture est retirée de la cage pendant 2h afin de minimiser l’angoisse des animaux vis-à-vis du jeûne. Les souris du groupe contrôle sont mises à jeun pour une durée de 24h et les souris du groupe test sont mises à jeun pendant 21h et sont réalimentées pendant 3 heures. Après ces 24h, soit à 9 semaines post-chirurgie, les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie générale et le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem.

Impact sur les animaux

Les procédures utilisées ont pour objectif de tester la contribution des cellules gliales à la régulation de l’homéostasie énergétique. L’accomplissement de cet objectif implique le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement, pour leur sécurité durant la récupération post-opératoire et pour le suivi individuel de la consommation alimentaire dans la suite des procédures. La période de récupération post-opératoire est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après récupération postopératoire, l’hébergement de 3 jours dans les Physiocages nécessaires pour l’exploitation du système de calorimétrie indirecte est une source d’inconfort, dû à l’environnement hermétique qui limite les contacts olfactifs avec les congénères. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal, entrainant une perte de poids corporel importante chez les animaux ainsi que des modifications du statut métabolique. L’exposition aux régimes riches en graisse et en sucre ne génère aucune douleur ou inconfort mais la pesée toutes les 12 heures pourrait également constituer une nuisance. La récupération des cerveaux fixés, indispensable aux études immuno-histologiques post-mortem, nécessite une mise à mort par perfusion intracardiaque.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, des analyses histologiques post-mortem sont indispensables : 1) Pour vérifier l’expression du vecteur viral par les cellules gliales dans la région d’intérêt ; 2) et caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la consommation alimentaire et du poids corporel.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 48 souris mâles, réparties en 6 lots de 8 animaux. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Un précédent projet pilote nous a permis de vérifier l’efficacité de nos vecteurs viraux à réduire spécifiquement la fabrication des connexines des cellules gliales dans la zone cérébrale d’intérêt. Il s’agit ici de déterminer l’impact fonctionnel de cette réduction. La procédure 1 mobilise deux lots de 8 animaux pour tester l’impact de la réduction des connexines sur les préférences alimentaires des souris. La mesure des préférences alimentaires entre un régime alimentaire standard et un régime riche en gras et en sucre nécessite un effectif de 8 animaux par lot, compte-tenu de la variabilité des mesures. Deux lots d’animaux sont à comparer dans cette procédure, l’un ayant été traité avec le vecteur viral permettant de réduire la fabrication des connexines, et l’autre avec un vecteur viral contrôle. L’effectif de 8 animaux par lot est également compatible avec les autres mesures prévues dans cette procédure 1 (comportement exploratoire des animaux, qui donne une mesure du niveau d’anxiété) et analyse post-mortem du nombre de cellules gliales ayant incorporé les vecteurs viraux). La procédure 2 mobilise 4 lots de 8 animaux pour tester l’impact de la réduction des connexines sur les réponses à un jeûne ou la réintroduction de nourriture après un jeûne : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la fabrication des connexines) x 2 statuts nutritionnels différents (à jeun pendant 24h et à jeun pendant 21h puis réalimenté pendant 3h). Les mesures à effectuer nécessitent 8 animaux par lot compte tenu de la variabilité des mesures (mesure de la consommation alimentaire des animaux renourris ; mesure post-mortem sur le tissu cérébral analyse de la morphologie des cellules gliales, cartographie des neurones activés). Cet effectif par lot est compatible avec les mesures préalables prévue dans la procédure 2 (suivi de la consommation alimentaire et analyse du métabolisme énergétique par mesure de la consommation d’oxygène et de la production de dioxyde de carbone).

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie des points limites et points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et anesthésie. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie morphinique pré-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale et analgésie post-opératoire. En période post-opératoire, un suivi renforcé est mis en place. Durant les deux premiers jours post-opératoires, une alimentation sous forme de gel enrichi est disposée en fond de cage pour limiter la déshydratation et la perte de poids et une analgésie est systématiquement administrée. La mise à mort sera réalisée sous analgésie préopératoire et anesthésie générale. Le recours à un système de calorimétrie indirecte s’inscrit dans une démarche de raffinement puisqu’il permet, en une seule étude et par des méthodes non invasives, la mesure de plusieurs paramètres relatifs au métabolisme énergétique. Les mesures sont effectuées simultanément sur un même animal pour faciliter les études de corrélations entre les différents paramètres mesurés. Avant les tests de réponse au jeûne, les animaux seront habitués à la manipulation et au retrait de la mangeoire (pendant 2h en phase diurne les trois jours précédant la mise à jeun de 24 h). Cette phase d’habituation a pour objectif de réduire l’angoisse animale, notamment causée par l’absence de nourriture en fond de cage et d’éviter, au cours de la phase de réalimentation, des fluctuations importantes de la prise alimentaire dû à la manipulation des animaux. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie d’injection intracérébral jusqu’à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. Les atlas stéréotaxiques se basent sur cet âge pour estimer les coordonnées stéréotaxiques des structures ciblées.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par inhalation de CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules d'ostéosarcome sont injectées dans le tibia sous anesthésie, y compris chez de très jeunes animaux, pour reproduire cette tumeur osseuse de l'enfant et suivre sa progression. Le porteur indique que l'apparition de métastases peut provoquer une gêne respiratoire entraînant une mise à mort immédiate, et un boitement traité au paracétamol. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité du microenvironnement tumoral et retient une lignée conservant un système immunitaire.

Objectifs

L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus fréquente chez les enfants et les adolescents (âge médian au diagnostic 15 ans). Pour mieux comprendre l’ostéosarcome et donc mieux le traiter, il est nécessaire de développer des modèles animaux récapitulant les interactions entre les cellules tumorales et l’environnement osseux prenant en compte l’âge de survenue. La majorité des modèles d’ostéosarcome sont établis à partir de lignées cellulaires humaines hors de l’os et ne permettent pas alors de reproduire l’interaction de la tumeur avec l’environnement osseux. De plus ces modèles ne possèdent pas le système immunitaire afin d’éviter le rejet de greffes des cellules humaines. Pour mieux comprendre la biologie de cette tumeur, un modèle récapitulant les caractéristiques environnementales et pédiatriques (immaturité du système immunitaire et influence hormonale notamment) serait nécessaire. Nous avons un modèle d’ostéosarcome de souris établi dans le tibia chez des animaux avec le système immunitaire (immunocompétents) et âgés de 5 semaines. Nous souhaitons à présent établir une greffe dans le tibia chez des animaux plus jeunes afin de reproduire l’ostéosarcome de l’enfant (survenue et traitement de l’ostéosarcome avant 13-15 ans). Nous souhaitons le caractériser en termes de progression, histologie, signature moléculaire et immunitaire.

Bénéfices attendus

Nous avons un modèle d’ostéosarcome implanté dans le tibia chez des souris immunocompétentes âgés de 5 semaines. Cet environnement d’origine influe sur le comportement de la tumeur (progression, résistance). Or, les hormones, notamment sexuelles, ont été démontrées comme agissant également sur le développement des os. Un modèle d’ostéosarcome au niveau de l’os établi chez des animaux plus jeunes récapitulerait les étapes essentielles de l’ostéosarcomagenèse d ans le contexte du système immunitaire immature avec une influence hormonale. Un tel modèle permettrait d’avancer les connaissances biologiques de l’ostéosarcome et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques en tenant compte de ses particularités notamment celles liées à l’âge de survenue de cette tumeur pédiatrique avec un pic à la puberté.

Procédures

Les animaux vont subir une injection orthotopique des tumeurs en intratibiale dans toutes les procédures sous anesthésie et de durée 5 min au maximum.

Impact sur les animaux

En cas d’apparition des métastases, une gêne respiratoire peut subvenir (fréquence respiratoire irrégulière ou accélérée). Cette gêne est rapidement repérée grâce aux observations cliniques régulières et l’animal sera mis à mort immédiatement pour éviter sa souffrance. Dans le cas de la douleur de l’animal, le plus souvent observer par le boitement de l’animal qui ne pose pas sa patte au sol, on administrera un antalgique (paracétamol, 300 mg/kg) dans la boisson des animaux. En cas de non amélioration de l’état de l’animal jusqu’à 3h après l’administration du paracétamol, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par l’inhalation de CO2 à la fin des procédures et les tissus seront récupérés pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Le microenvironnement de la tumeur étant très complexe, il n’existe pas un autre moyen i.e. in vitro, pour reproduire sa complexité avec tous ses composants, notamment immunitaires et d’autres modèle in vivo sont insuffisants.

Réduction

Ces expériences de la mise en place du modèle par l’injection intratibiale des cellules tumorales de souris seront réalisées de façon séquentielle par les procédures afin de réduire le nombre d'animaux. A la fin des procédures les animaux seront mis à mort et les tissus collectés afin de construire une banque tissulaire pour d’autres analyses histologiques et moléculaires. Il n'y aura pas de statistiques pour les procédures 1 et 3 avec une détermination de la quantité des cellules à injecter par la voie intratibiale. Pour les procédures 2 et 4 des tests paramétriques ou non-paramétriques, selon les règles de leur application, pour la caractérisation de l’environnement tumoral pourront être appliqués.

Raffinement

Toute intervention d’injection intratibiale sera faite sous anesthésie générale. Les animaux seront manipulés sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale. Une définition précise des points limites conduisant à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux. Une surveillance adaptée des animaux, une pesée bihebdomadaire et une observation au minimum 3 fois par semaine permettront d’éviter toute douleur ou souffrance de l’animal. Dans le cas de la douleur de l'animal, le plus souvent observer par le boitement de l'animal qui ne pose pas sa patte au sol, on adminsitrera un antalgique (paracétamol) sans influence sur le système immunitaire dans la boisson des animaux. Les animaux plus jeunes à l’implantation tumorale seront surveillés avec attention accrue sur la journée après le réveil afin de vérifier que la mère ne les rejette pas. En plus, pour éviter le rejet par la mère nous minimiserons le temps de séparation des petits avec la mère. Nous remettrons les petits dans le nid après qu’ils aient été frottés avec de la litière de la cage d’origine.

Choix des espèces

Nous disposons d’un modèle d’ostéosarcome établi par l’injection dans le tibia dans les souris âgées de 5 semaines. Ce modèle est à notre connaissance le plus proche de l’ostéosarcome humain (agressivité, pouvoir métastatique, environnement immunitaire) hormis les cancers spontanés. Les cellules utilisées sont une lignée cellulaire d’ostéosarcome d’origine des souris de la même souche ; ce modèle peut donc être établi sur un animal immunocompétent, condition nécessaire pour étudier l’environnement immunitaire de cette tumeur. L’âge plus jeune ne devrait pas influer le taux de prise tumorale, voire le taux de prise peut être améliorer avec le système immunitaire immature avec moins de rejet de greffe.

110 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une tumeur humaine greffée, elles reçoivent cinq injections dans la veine de la queue puis sont imagées pour suivre la colonisation de la tumeur par des bactéries, avant mise à mort par surdose d'anesthésique et dislocation cervicale. Le porteur précise que le projet est une prestation de service pour un client privé cherchant à utiliser ces bactéries comme vecteur thérapeutique. Il affirme que la physiologie globale de l'animal ne peut être remplacée pour étudier cette colonisation.

Objectifs

Ce projet est réalisé dans le cadre de la contractualisation de prestations de services pour un partenaire privé. Cette étude vise à imager la colonisation par des bactéries d'un modèle de cancer implanté en sous-cutané grâce au 18F-fluorodeoxysorbitol (18F-FDS).

Bénéfices attendus

La visualisation des bactéries grâce au 18F-FDS permettra de valider la colonisation des tumeurs par les bactéries. Ainsi, elle permettra à notre client de définir si les bactéries utilisées dans cette étude pourraient être interessantes pour vectoriser des molécules d'intéret vers les tumeurs dans une optique d'utiliser ces bactéries comme un nouvel outils de ciblage thérapeutique.

Procédures

Les animaux recevront au total 5 injections en intraveineuse dans la veine caudale en vigile dans un système de contention dédié: J0: 1 injection intraveineuse des bactéries ou du véhicule (volume environ 50µL; durée moins de 1min) et 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J1: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J4: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J6: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). NB: la demi-vie du 18F étant de 110min, il est nécessaire de réinjecter les souris pour chaque point de suivi soit à J1, J4 et J6.

Impact sur les animaux

Aucun effet délétaire de l'injection de 18F-FDS ou des bactéries n'est attendu sur la durée du suivi en imagerie. Les effets indésirables pourraient être liés à la pousse tumorale et à une nécrose précoce de la tumeur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par surdosage d'anesthésie gazeuse suivie d'une dislocation cervicale en vue des analyses de comptage des organes ex vivo.

Remplacement

La physiologie globale de l'animal entre en jeu dans le processus étudié (colonisation de bactéries depuis le tractus digestif vers des tumeurs). Ainsi, l'animal ne peut être remplacé dans cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience de notre client sur ces modèles murins de tumeurs et le nombre d'animaux nécessaires pour apporter une valeur statistique à l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire est réduit au maximum en sélectionnant uniquement les expérimentations essentielles.

Raffinement

Un enrichissement des cages d’hébergement sera assuré par l'ajout de briquettes de bois. Les animaux seront suivis de façon quotidienne. Ainsi tout signe d’inconfort pourra être détecté rapidement ce qui permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est classiquement utilisée pour les études en cancerologie. Son statut immunitaire permettant de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines. Les animaux seront inoculés avec une xénogreffe chez notre client à 5 semaines. Ils seront transférés par un transporteur agréé vers notre établissement à 6 semaine et seront hébergés pour une durée estimée à 4 semaines (le temps de la croissance tumorale).

225 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une greffe de cellules cancéreuses humaines sous la peau y fait pousser une tumeur, suivie d'injections de cellules immunitaires modifiées et de séances d'imagerie sous anesthésie répétées, pour évaluer des thérapies cellulaires contre plusieurs cancers. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des injections et renvoie l'intérêt pour les patients au conditionnel, "en cas de résultats positifs". Il conclut que ces souris sont le seul modèle disponible pour vérifier in vivo la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées.

Objectifs

Les immunothérapies, stratégies privilégiées contre le cancer, visent à stimuler le système immunitaire du patient pour éliminer les cellules cancéreuses. Il est possible de récupérer et modifier les cellules immunitaires du patient, afin qu’elles reconnaissent les cellules cancéreuses, avant de les réinjecter au patient, avec une efficacité clinique démontrée. Nous avons généré des cellules immunitaires capables de reconnaître un sous-type de cancer du sein très agressif et d’autres cancers (ovaire, sarcome, glioblastome, mélanome) et capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier le potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, nous utiliserons des souris permettant l’étude de la croissance des tumeurs en présence des cellules immunitaires spécifiques de la tumeur, avec pour objectif de valider la capacité de ces cellules immunitaires à éliminer les cellules tumorales in vivo.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle opportunité thérapeutique pour les patients atteints de cancer, du sein, de l’ovaire ou de sarcome. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.

Procédures

Pour réaliser l'injection sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines, la souris est maintenue environ 15 secondes. Une seule injection de 0.1 ml est effectuée par animal. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine: l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. L’injection intraveineuse, de 0.2 ml maximum, se fera au niveau de la veine de la queue (1 min d’immobilisation), une fois par animal. Injection intrapéritonéale de molécules de soutien des cellules T : 100 µl tous les 2 à 3 jours pendant 4 à 8 semaines maximum (d'après ce qui est décrit en moyenne dans la littérature). Pour l'imagerie, les souris sont anesthésiées (anesthésie gazeuse) au maximum 7 fois (avant injection et 2h, 4h, 24h, 7 jours, 14 jours et 28 jours après injection), pour une durée de 2 à 10 min suivant l'intensité du signal lumineux. L'injection de produit pour le suivi de l'imagerie correspond à 0.1ml en intrapéritonéal, 7 fois sur l'ensemble de la durée expérimentale.

Impact sur les animaux

Xénogreffes : les cellules tumorales seront injectées en sous-cutané dans le flanc droit de la souris, sur animal vigile. Pour cela l’animal est tenu en contention. Le volume injecté est faible (100µl). Une seule injection est réalisée par animal, d’une durée d’environ 15 secondes. Suite à cette injection la souris développera une tumeur. La croissance tumorale sera suivie par mesure au pied à coulisse (3x/sem, 15 sec) sur animal vigile. Le traitement consiste en une injection intraveineuse de cellules T modifiées. A ce jour, aucun effet indésirable associé au transfert cellules T modifiées chez la souris n’a été rapporté dans la littérature. Nous n’envisageons donc pas d’effets indésirables liés à ce traitement. De même aucun effet indésirable n’a été reporté dans la littérature concernant l’injection en intrapéritonéale de cytokine. Pour l'imagerie les animaux seront anesthésiés pour permettre leur immobilisation lors de l'acquisition des images.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir analyser la composition du système immunitaire dans le sang et au sein de la tumeur.

Remplacement

Les cellules thérapeutiques utilisées dans cette étude in vivo ont été testées aupréalable in vitro et ont montrés des effets bénéfiques. Néanmoins, l'efficacité de ces cellules thérapeutiques doit être testée dans un environnement plus complet et complexe que la culture celllulaire. Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires, notamment avec des cellules immunitaires, puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponibles dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude.

Réduction

Les procédures décrites seront réalisées de manière séquentielle. Une première procédure pilote permettra de déterminer si les cellules sont capables de former des tumeurs chez la souris (pas d'échec de croissance tumoral anticipé dans le modèle de souris utilisé). La mise en place des modèles tumoraux se fera indépendemment pour chaque type cellulaire, après validation in vitro. Si des tumeurs se développent alors la procédure 2 sera conduite pour déterminer l’effet d’un traitement avec des cellulaires immunitaires sur le développement des tumeurs. Là aussi la procédure 2 se fera de manière séquentielle, en testant des cellules tumorales validées in vitro au fur et à mesure (test d'abord sur la première lignée de cellules tumorales, puis la deuxième, etc.). L’utilisation d’un outil statistique permettant de définir le nombre minimal d’animaux nécessaires et suffisants pour satisfaire la validité scientifique de l’étude, a été utilisé. Par ailleurs, un nombre optimal d’échantillons et de données seront collectés pour chaque animal pour utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour répondre à l’ensemble des questions de l’étude

Raffinement

Les analyses de croissance des tumeurs sont non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par la pesée des animaux, et la mesure du développement tumoral. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Aucun effet indésirable lié à l’injection des cellules immunitaires humaines dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Les souris seront anesthésiées pour le suivi longitudinal réalisé par imagerie. Leur réveil est facilté en plaçant la cage sur un tapis chauffant à 37°C.

Choix des espèces

Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes sous-cutanées et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.

54 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par gavage une molécule dérivée d'une plante, sont maintenues en cage individuelle pour mesurer leur prise alimentaire, puis mises à mort par perfusion intracardiaque d'un fixateur afin d'examiner les réseaux nerveux de l'appétit. Le porteur reconnaît que le gavage entraîne un inconfort et que l'isolement est imposé pour la mesure. Il présente cette molécule comme un futur coupe-faim et complément alimentaire contre l'obésité, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier la prise alimentaire.

Objectifs

L’obésité, qui se définie par un excès de poids en raison d'une augmentation excessif de la masse adipeuse, est connue pour augmenter la prévalence des maladies cardiovasculaires, du diabète de type 2 et de certains types de cancer. L’obésité est reconnue comme une maladie par l’organisation mondiale de la santé depuis 1997. A l’échelle mondiale, on estime à plus de 600 millions le nombre de personnes obèses et à 2,8 millions le nombre de personnes décédant chaque année de surpoids ou d’obésité. Ces chiffres ne font qu’augmenter depuis des décennies, que ce soit dans les pays développés ou dans les pays émergeants. Souvent associé à l’obésité, le diabète de type 2 ou diabète sucré est l'une des maladies dont la croissance est la plus rapide au monde. Cette pathologie métabolique se caractérise par une hyperglycémie résultant d'une anomalie de la sécrétion d'insuline, d'une résistance à l'insuline ou des deux à la fois. Depuis l'Antiquité, diverses plantes ont été utilisées à des fins médicinales dans le monde entier. Cleistocalyx operculatus est une plante largement répandue dans l’Asie du sud dont l’extrait est couramment utilisé en médecine traditionnelle. Il a été récemment montré que l’extrait de Cleistocalyx operculatus exerçait une activité anti-hyperglycémique. La 2 ', 4'-dihydroxy-6'-méthoxy-3',5'-diméthylchalcone (DMC), un composé majeur de cet extrait de plante, exerce des effets anti-tumoraux, antioxydants et anti-inflammatoires. Récemment, il a été montré que le DMC empêche le développement excessif du tissu adipeux et limite les effets toxiques de l’hyperglycémie. Synthétisé à partir de la molécule DMC naturelle, une molécule X résistante à la dégradation par le foie et donc susceptible d’avoir des effets plus marqués. Dans une première étude, nous avons déjà montré l’effet coupe faim de la molécule X (65 mg/kg de poids corporel) chez des animaux obèses. Dans ce contexte, le présent projet vise à poursuivre le travail en cours i/en étudiant l’action coupe-faim d’une molécule X d’origine végétale chez la souris obèse (ob/ob) et chez la souris non obèse (C57Bl/6), ii/ en déterminant si la molécule induit des nausées et iii/ en identifiant les réseaux neuronaux activés suite à l’administration de cette molécule. Ce travail s’inscrit dans un contexte général d’études précliniques de compléments alimentaires ciblant le traitement des troubles de la balance pondérale (diabète, obésité).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les effets de la molécule X sur le comportement alimentaire. Les résultats obtenus permettront de préciser la nature des réseaux neuronaux activés par cette molécule et ainsi déterminer si elle est capable d’affecter la prise alimentaire en agissant sur l’hypothalamus et le tronc cérébral, principales structures nerveuses impliquées dans la régulation de l’appétit. La mise en évidence d’un effet anorexigène « coupe faim » de la molécule X en ferait un bon candidat comme complément alimentaire pour le traitement des troubles de la balance pondérale.

Procédures

Les animaux recevront la molécule X ou son véhicule par gavage. Le gavage est réalisé à l’aide d’une canule d’intubation de taille adaptée, délicatement introduite dans l’œsophage jusqu’à l’estomac. L'administration par gavage étant donné le volume administré ici durera une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

Le gavage entraine un inconfort chez l’animal. L'isolement des souris pendant les périodes néccésitant une mesure individuelle de la prise alimentaire est indispensable.

Devenir

Les analyses histologiques post-mortem permettront de vérifier l'histologie des tissus prélevés afin d'écarter un effet potentiellement indésirable de la molécule. Une partie de tissus prélevés constituront un banque de tissu pour de future exploration histologique et immunohistochimique.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact de la consommation de la molécule X sur l’homéostasie énergétique et la prise alimentaire.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 54 souris mâles. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Pour la procédure 1. Pour minimiser, le nombre d’animaux, chaque animal recevra le véhicule puis les différentes doses de la molécule X, avec une période de 72h entre chaque administration. Pour la procédure 2 : Pour minimiser les tests, seule une dose de la molécule X, validée lors de la procédure 1, sera utilisée ici. Pour la procédure 3 : Pour minimiser les tests, seule une dose de la molécule X, validée lors de la procédure 1, sera utilisée ici Pour l’effectif par lot dans les procédures 1 et 2, le nombre minimum de souris nécessaires pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives dans l’évaluation de la prise alimentaire entre les lots a été établi à 6 animaux par lot compte-tenu de la variabilité des mesures. Pour la procédure 3, le nombre d’animaux par lot est de 6 et a été déterminé à partir de nos résultats obtenus au cours d’études précédentes. Ce nombre tient compte des variabilités que nous avons pu observer dans l’expression de la protéine c-Fos d’un animal à l’autre.

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie de points limite et points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et anesthésie. La mise à mort par perfusion intracardiaque de PFA sera réalisée sous analgésie pré-opératoire et anesthésie générale. Les animaux seront habitués à la contention et au gavage. Ces phases d’habituation ont pour objectif de réduire l’angoisse animale et d’éviter des fluctuations importantes de la prise alimentaire due à la manipulation des animaux et à la contention. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire pour une analyse fine de la prise alimentaire de chaque souris. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque, d’une part, c’est le modèle le plus documenté dans la littérature scientifique, et d’autre part notre projet implique l’utilisation de souris génétiquement obèses permettant d’étudier l'impact de la molécule X sur la prise alimentaire. Des souris adultes de 8 semaines entreront dans chacune des procédures. Ainsi, les souris seront accueillies en hébergement à 7 semaines. Les expérimentations devront être terminées à la fin de la 15ème semaine car le profil hyperglycémique des souris obèses ob/ob tend à diminuer au-delà de cet âge.

4 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la tête provoque l'occlusion d'une artère cérébrale par injection de thrombine, suivie d'une IRM sous anesthésie et de tests comportementaux pendant deux semaines, puis d'une ouverture du thorax et d'une ponction cardiaque terminale, pour tester huit stratégies contre l'accident vasculaire cérébral à trois doses. Le porteur nomme les tests employés, neuroscore, force d'agrippement et retrait d'adhésif, et indique des déficits sensorimoteurs et des pertes d'équilibre possibles. Il affirme que la souris est le modèle de référence de l'AVC et qu'aucune méthode sans animaux n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester huit stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos huit stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC ischémique chez la souris par administration intrapéritonéale (i.p), par administration intra veineuse ou bien par voie orale (per-os), pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 3 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit moteur ainsi que du volume lésionnel.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la murine alpha-thrombine, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM). Cet acte chirugical durera 20 minutes. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire pour l’infusion des traitements. Une moyenne de 5 minutes est à prévoir pour cette pose. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Nous comptons un total de 10 minutes pour la prise du neuroscore, 25 à 30 minutes pour la réalisation du test de force d’agrippement puis 10 minutes pour la mise en place et la mesure de la sensibilité digitale par le test de retrait d’adhésif. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme : l’animal peut continuer à s’alimenter, s’abreuver ou encore se fabriquer un nid. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Aucune nuisances n'est attendues concernant l'administration des traitements, les test comportementaux ainsi que pour l'examen IRM.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 15. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et demi-sphère de cellulose), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine administrée en sous-cutanée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Une anesthésie locale de lidocaïne est appliquée (spray ou crème) dans les conduits auditifs. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection à la Chlorexidine et enfin l’application d’une dose de lidocaïne en crème. Le choix de la technique de sutures se porte sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, la concentration d’isoflurane et le débit de N2O sont ramenés à zéro, et le débit d’O2 est élevé à 1 L/min pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 5. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Il pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS et de 25g pour les C57BL6J. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

200 souris porteuses d'une mutation humaine reproduisant la dystrophie myotonique vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des tests de force et de course sur tapis, des examens cardiaques sous anesthésie et des injections de vecteurs de thérapie génique, avant mise à mort par injection de chlorure de potassium pour prélever leurs tissus. Le porteur indique que la lignée présente elle-même une forte mortalité précoce, un retard de croissance et des incisives à couper, symptômes recherchés du modèle. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace le test d'une thérapie génique in vivo dans un "organisme entier" et présente l'étude comme préparatoire à un futur essai de dose.

Objectifs

La dystrophie myotonique (DM1) est la forme la plus courante de dystrophie musculaire chez l'adulte. Elle se caractérise par diverses manifestations cliniques multiples, notamment une faiblesse musculaire progressive, des défauts cardiaques et des symptômes extramusculaires tels qu'une cataracte, une atrophie testiculaire, un dysfonctionnement endocrinien et cognitif. Une mutation du gène DMPK (pour DM1 Protein Kinase) est responsable de la DM1. La mutation de ce gène le rend toxique, avec de nombreuses conséquences moléculaires qui peuvent expliquer les nombreux symptômes de la DM1. Plusieurs modèles animaux de la DM1 ont été développés. Parmi ces modèles, l'un des plus puissant aujourd'hui est le modèle de souris transgénique DMSXL, qui présente plusieurs symptômes associés au DM1, notamment un retard de croissance, des défauts musculaires, des défauts cardiaques et des troubles cognitifs. Les souris DMSXL semblent être aujourd'hui un des meilleurs modèles pour étudier le trouble multisystémique de la DM1, et surtout évaluer des approches thérapeutiques. Nous souhaitons aujourd’hui utiliser ce modèle de souris DMSXL afin d’évaluer des produits thérapeutiques de thérapie génique (visant à corriger le défaut génétique), avec la réalisation à terme d’une étude de dose qui sera support à une demande d’essai clinique chez des patients DM1. Avant la réalisation de cette étude de dose (qui fera l’objet d’une demande d’autorisation distincte), le présent projet a 2 objectifs : (1) La réalisation d’une courte étude d’histoire naturelle du modèle de souris DMSXL, qui nous permettra de concevoir au mieux le plan de l’étude de dose à venir. En effet, si des informations sur ce modèle DMSXL si disponibles dans la littérature, elles restent incomplètes (effet du sexe sur la pathologie ? phénotype précis à certains âges ? etc). Il est également important que notre équipe puisse se familiariser avec la manipulation et le suivi de ces souris. (2) La réalisation d'études pilotes lors desquelles l’efficacité de différents produits de thérapie génique sera évaluée, uniquement au niveau moléculaire. Ces études pilotes permettront de réaliser un criblage de différents produits thérapeutiques, afin d'aider à identification du produit de choix qui sera ensuite évalué lors de l’étude de dose.

Bénéfices attendus

La dystrophie myotonique (DM1) est la forme la plus courante de dystrophie musculaire chez l'adulte, sans traitement curatif à ce jour. Elle est caractérisée par de nombreux symptômes (neuromusculaire, respiratoire, cardiaque, endocrinienne, neurologique centrale, oculaire, digestive…), a un impact sur de nombreux aspects de la vie des patients et est responsable d’une réduction de l’espérance de vie et de la participation sociale. La prise en charge des patients est aujourd'hui essentiellement basée sur des consultations multidisciplinaires régulières et la mise en place de physiothérapie, d'ergothérapie, de mise en place d'appareils d'aide à la mobilité, et de soins de soutien pour la gestion de complications respiratoires et cardiaques. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie, au moins au niveau des atteintes musculaires et cardiaques. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, mieux connaître le modèle animal qui sera utilisé pour les études précliniques à venir (notamment la détermination de la dose thérapeutique des produits) est essentielle. C’est ce que nous visons avec le présent projet, via l’étude d’histoire naturelle de la souris DMSXL. De plus, les études pilotes qui seront réalisées pour tester l’efficacité moléculaire de différents vecteurs de thérapie génique dans ce modèle de souris DMSXL, nous permettront de réaliser un criblage de ces différents produits thérapeutiques, afin d’identifier le produit de choix qui sera ensuite évalué lors de la future l’étude de dose.

Procédures

Pour l'étude d'histoire naturelle de la souris DMSXL, les animaux seront soumis aux interventions suivantes: dans la semaine précédent leur euthanasie: test de mesure de force d'agrippement réalisé sur animal vigile (1 test par animal / durée maximale du test = 10 minutes) + test à l'effort sur tapis roulant réalisé sur animal vigile (1 test par animal / durée maximale du test = 15 minutes) + évaluation de la fonction cardiaque (électrocardiogramme et échocardiographie) sur animaux anesthésiés (1 test par animal) / durée maximale du test = 45 à 50 minutes). A 1 mois ou 4 mois d'âge, selon la durée de leur suivi, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie, avant euthanasie par une injection IV d'une dose létale de chlorure de potassium. Pour les études pilotes pour le criblage de produits thérapeutiques, les souris DMSXL seront soumises aux interventions suivantes: à 1 mois d'âge, injection unique (soit par voie intramusculaire, soit par voie intraveineuse) d'un vecteur de thérapie génique, sous anesthésie. Puis à 2 mois ou 4 mois d'âge, selon la durée de leur suivi, anesthésie puis euthanasie par une injection intraveineuse d'une dose létale de chlorure de potassium.

Impact sur les animaux

La majorité des gestes réalisés sur ces animaux seront non ou peu invasifs (tests musculaires non invasifs réalisés sur animaux vigiles, évaluations cardiaques non invasives réalisées sur animaux anesthésiés, injections intramusculaires ou intraveineuses réalisées sur animaux anesthésiés, et prélèvements sanguins réalisés sur animaux anesthésiés avant euthanasie). L’injection intramusculaire ou intraveineuse d’un vecteur de thérapie génique chez la souris est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Lors de l’expression des transgènes thérapeutiques, aucun effet indésirable n’est non plus attendu. Au contraire, en cas d’effet thérapeutique, une diminution des symptômes liés à la maladie pourraient être réduits chez les souris DMSXL. Les seules nuisances attendues sur les animaux sont finalement celles liées au phénotype de la maladie chez les souris DMSXL. En effet, elles présentent un phénotype dès la naissance: forte mortalité subite pendant les 3 premières semaines de vie (55%), retard de croissance (jusqu’à 50% du poids des souris contrôles au moment du sevrage puis les souris rattrapent jusqu’à 70-80%), anomalies musculaires (baisse de la force), anomalies du comportement. Cela correspond à différents symptômes observés chez les patients DM1. Les souris DMSXL présentent également souvent des anomalies des incisives qui s'allongent de façon anormale. Les souris sont donc surveillées régulièrement et les incisives seront coupées (sur animaux vigiles, le geste étant sans douleur) si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires nécessaires au projet.

Remplacement

Ce projet de caractérisation de l'histoire naturelle de la souris DMSXL (à différents âges et avec des évaluations adaptées) nous permettra à terme de réaliser l'évaluation préclinique de traitements potentiels de la DM1 dans ce modèle animal adapté, et donc de raffiner le nombre d'animaux utilisés dans ces futurs projets, notamment dans une étude de dose d'une produit thérapeutique qui est prévue à suivre. D'autre part, il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d’administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation du modèle DMSXL, modèle animal de la DM1, est donc essentiel pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques. D'autre part, pour les criblage des produits thérapeutiques, si des études in vitro sur des cellules de patients DM1 seront également réalisées, des études pilotes chez la souris DMSXL restent essentielles, afin de valider également la fonctionnalité de ces vecteurs au niveau moléculaire dans ce modèle de souris qui diffère légèrement des modèles in vitro, de part la nature transgènique du gène DMPK humain présent dans ces souris.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe (pour l'étude d'histoire naturelle: minimum 8 animaux et maximum 15 animaux / pour les études pilotes pour le criblage de produits thérapeutiques: minimum 3 et maximum 5 animaux) a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets et des données de la littérature sur le modèle de souris DMSXL, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles. Pour l'étude d'histoire naturelle, notre objectif est d'obtenir des données complètes sur 8 à 12 animaux par groupe, notamment pour les tests d'évaluation des fonctions musculaires et cardiaques. Mais vu la mortalité potentielle observée chez les souris DMSXL, notamment lors du 1er mois de vie, un nombre plus important d'animaux (maximum 15 par groupe) pourra être inclus afin de réussir à avoir des données complètes sur un total de 8 à 12 animaux par groupe. Pour les études pilotes de criblage de produits thérapeutiques, de la même façon, le nombre d'animaux par groupe sera entre 3 et 5, 3 étant le minimum pour obtenir des données robustes d'évaluation de l'efficacité des produits au niveau moléculaire.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (cages équipées de mezzanine et mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des papiers froissés et des morceaux de bois). 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement, coupage des incisives si nécessaire). 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire)

Choix des espèces

Les souris DMSXL portent une insertion de séquence génomique humaine comprenant le gène DMPK humain muté. Les souris DMSXL présentent plusieurs symptômes associés à la pathologie DM1 (dystrophie myotonique de type 1), notamment un retard de croissance, des défauts musculaires, des défauts de conduction cardiaque et des troubles cognitifs. En raison de l'expression du transgène DMPK humain muté, les souris DMSXL constituent aujourd'hui un des meilleurs modèles pour étudier le trouble multisystémique de la DM1, et surtout évaluer des approches thérapeutiques. Lors de l'étude d'histoire naturelle de la souris DMSXL, les animaux seront analysés à l'âge de 1 et 4 mois, afin d’évaluer le potentiel processus évolutif de la maladie, et obtenir des données de référence aux âges qui ont été ciblés pour la future étude de dose. En effet, lors de cette future étude de dose, il est prévu d’injecter les animaux à l’âge de 1 mois, et de les euthanasier 3 mois après injection, soit à l’âge de 4 mois. Lors des études pilotes de criblage de produits thérapeutiques, les animaux seront injectés à l'âge de 1 mois. Puis, selon la nature du vecteur thérapeutique (c’est à dire le principe d’action moléculaire du produit thérapeutique testé), les souris seront suivies entre 1 mois et 3 mois post-injection du vecteur avant euthanasie et analyses moléculaires sur les tissus prélevés post-mortem.

6 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des souris dites humanisées vendues à des laboratoires. Elles reçoivent une irradiation puis une greffe de cellules humaines par voie intraveineuse, avec des prélèvements sanguins de contrôle, et une partie développe une réaction du greffon contre l'hôte se traduisant par une perte de poids. Le porteur indique que les souris ayant pris la greffe sont expédiées vivantes aux chercheurs, tandis que les échecs et les animaux en fin de protocole sont euthanasiés. Sur le remplacement, il affirme que ces modèles reproduisent la réponse immunitaire "dans son ensemble" et ne peuvent être remplacés, tablant sur un taux de succès de 80 %.

Objectifs

L’étude des pathologies humaines et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques sont souvent limités par l’absence de modèle animal approprié. La souris est le modèle le plus fréquemment utilisé pour la compréhension du fonctionnement du système immunitaire ainsi que l’étude des maladies infectieuses et des cancers dans l’espèce humaine. Cependant, les résultats expérimentaux obtenus chez la souris ne sont pas toujours transposables à l’homme car les systèmes immunitaires des 2 espèces présentent des différences marquées. Dans certaines conditions expérimentales, la greffe de cellules humaines permet de générer des souris dites humanisées récapitulant une partie du système immunitaire humain. L’objectif de ce projet est de proposer à la communauté scientifique la production de souris humanisées qui serviront de modèles pour la recherche scientifique et médicale. Le type cellulaire greffé (cellules souches ou cellules périphériques du sang) déterminera la spécificité du modèle.

Bénéfices attendus

Le système immunitaire est impliqué dans beaucoup de maladies humaines : cancer, maladies métaboliques, infections virales, phénomènes allergiques. Cependant, il existe des différences importantes entre les systèmes immunitaires humain et murin. Une façon de dépasser ces différences est d’utiliser des modèles murins greffés avec des cellules ou des tissus humains — c'est-à-dire des rongeurs « humanisés » au niveau de leur système immunitaire. Les modèles rongeurs « humanisés » présentent un système immunitaire humain compétent et constituent par conséquent des modèles pertinents pour la recherche dans les domaines de l'immuno-oncologie, la biologie tumorale, les maladies infectieuses, les rejets de greffe et les études de transplantation tissulaire. Quelques-uns des domaines clés dans lesquels les souris humanisées ont considérablement contribué à la compréhension scientifique de la maladie humaine sont décrits ci-après. Les premières études sur des souris humanisées ont permis d'identifier les voies inflammatoires impliquées dans le développement du cancer du sein. Les modèles humanisés ultérieurs ont également permis d'étudier les interactions complexes entre les cellules immunitaires au sein de tumeurs humaines. Il est ainsi possible d’étudier le potentiel thérapeutique de médicaments, seuls ou en combinaison, pour réduire la progression tumorale. Ce type d’approche est aussi à la base du développement des immunothérapies qui rencontrent un succès spectaculaire dans certaines pathologies et pour certains patients. Les modèles murins humanisés sont également de bons modèles d’infection par les virus (ex : HIV, Hépatites, Zika), les bactéries (ex : Salmonelles, Streptocoques…) et les parasites (ex : Leishmania). Notre plateforme d’humanisation de rongeurs proposera à la communauté scientifique des modèles humanisés « prêts à l’emploi ». La préparation des modèles rongeurs humanisés est longue (jusqu’à 15 semaines), délicate et coûteuse. Sur notre plateforme, le process d’humanisation de l’animal sera hautement standardisé et réalisé par des équipes spécialisées afin d’autoriser une reproductibilité maximale des données scientifiques et de réduire le nombre d’animaux requis.

Procédures

En fonction des modèles développés, les animaux pourront recevoir dans un premier temps un traitement de radiothérapie afin d’être à même de recevoir la greffe. Les cellules humaines leur seront ensuite injectées par voie intraveineuse en guise de greffe. Une fois la greffe suffisamment développée dans l’organisme des souris, un ou des prélèvements sanguins pourront être réalisés pour s’assurer que le niveau de greffe est suffisant ou pour analyser d’autres paramètres biologiques d’intérêt.

Impact sur les animaux

Les étapes de radiothérapie, d’injection de cellules et de prélèvement sanguin seront des sources potentielles de douleur et/ou de stress pour l’animal. La radiothérapie endommage le système immunitaire et peut endommager certains organes. L’injection veineuse des cellules humaines nécessite l’utilisation d’une boîte de contention afin de maintenir l’animal immobile pendant quelques minutes. Le prélèvement sanguin nécessitera également une contention de l’animal. Cette contention sera réalisée de façon manuelle ou à l’aide d’une boîte de contention en fonction de la voie d’abord. Par ailleurs, chez les modèles de souris humanisés générés via injection de cellules humaines la maladie du greffon contre l'hôte(GvHD) survient (ce qui n’est pas le cas chez les modèles générés via injection de cellules souches). La GvHD se traduit généralement par un eperte de poids ainsi qu’une activité réduite de l’animal.

Devenir

Les souris ayant été humanisées via injection de cellules du sang ou ayant développé un système immunitaire humain après injection de cellules souches : sont expédiées au scientifique -les souris n’ayant pas réussi à reconstituer un système immunitaire humain ainsi que celles ayant répondu favorablement à la greffe cellulaire mais en fin de protocole seront euthanasiées.

Remplacement

Les modèles constitués par les souris humanisées permettent d’étudier les réponses immunitaires de l’organisme dans son ensemble. Il n’est donc pas possible de les substituer par d’autres méthodes non animales.

Réduction

Nous anticipons un taux de succès de 80% (% de souris développant un niveau suffisant de cellules humaines dans le sang), ce qui représente 4800 animaux validés disponibles pour la recherche pour les 5 ans du projet. Nous travaillerons tout le long du projet à augmenter ce taux de succès au fur et à mesure de l’expérience acquise pour atteindre une réduction maximale d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux utilisés étant immunodéficients, ils seront hébergés dans un environnement indemne de tout germe susceptible de les rendre malades. Ils seront également toujours manipulés sous hotte, de manière à éviter tout risque de contamination. Tout le long de la procédure, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter une éventuelle dégradation de leur état de bien-être. Le cas échéant, de l’aliment humidifié leur sera mis à disposition sur le sol de la cage et une surveillance accrue sera mise en place avec un suivi vétérinaire. Des soins adaptés seront apportés selon les préconisations de ce dernier (ex : réhydratation, soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, soins intensifs, …). En cas d’atteinte de point limite, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Concernant l’injection des cellules en intraveineux : les animaux seront placés au préalable dans une armoire chauffante à 38°C (maximum 30 minutes) pour obtenir une vasodilatation et faciliter l’injection. La même approche pourra être suivie pour les prélèvements sanguins. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire (pour injection ou prélèvement), un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l’animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate. Une réhydratation systématique sera réalisée après prélèvement sanguin, au moins équivalent au volume prélevé.

Choix des espèces

Nos modèles humanisés seront développés chez la souris. Seuls des animaux immunodéficients se prêtent à la reconstitution d’un système immunitaire humain fonctionnel. Les seuls modèles animaux immunodéficients disponibles à l’heure actuelle correspondent à des modèles souris et rats. D’autre part, la souris est, à l’heure actuelle, l’espèce la plus utilisée en recherche biomédicale. De nombreuses données expérimentales ont déjà été collectées à l’aide des modèles humanisées murins. Ces choix sont dictés par les données scientifiques internes et externes (publications scientifiques) à notre entreprise quant à l’efficacité de la prise de greffe et les applications spécifiques de ces modèles.