Souris

148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent des tumeurs mammaires spontanées ou reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses, afin d'étudier le rôle de protéines appelées intégrines dans les cancers du sein liés au gène BRCA1. Le porteur indique que les tumeurs restent localisées et que des ulcérations sont rares. Il décrit les souris transgéniques comme des "modèles incontournables" et affirme qu'il est "indispensable" de travailler in vivo malgré les cultures cellulaires utilisées en complément.

Objectifs

Le cancer du sein représente la première cause de décès par cancer chez la femme, principalement dû à une connaissance encore incomplète des mécanismes moléculaires et cellulaires qui induisent le développement tumoral. La glande mammaire est une structure épithéliale constituée d’un système de canaux ramifiés et d’alvéoles. L’épithélium mammaire adulte est composé de cellules luminales sécrétrices du lait et de cellules basales myoépithéliales qui, en se contractant, aident à l’expulsion du lait vers les canaux. Ces deux types de cellules dérivent de la prolifération et de la différenciation de cellules souches mammaires. Or, des études récentes ont montré que l’amplification aberrante des cellules souches est à l’origine de cancers du sein agressifs associés à des mutations du gène BRCA1 (Breast Cancer 1), un gène connu pour être un suppresseur tumoral. Ces cancers appartiennent à un groupe des tumeurs pour lesquelles les thérapies ciblées utilisées dans le traitement d’autres types de cancers du sein (par exemple, les thérapies hormonales) se sont avérées inefficaces. Les intégrines sont des protéines présentes dans la surface des cellules qui permettent leur adhésion et régulent de nombreuses fonctions. Certaines intégrines sont indispensables à la multiplication et la différenciation des cellules souches nécessaires à une gestation et lactation normales. Nous souhaitons étudier le rôle de ces intégrines dans un modèle murin connu pour développer des tumeurs mammaires dont l’origine et les caractéristiques sont très similaires aux cancers du sein avec mutation en BRCA1 chez la femme. Nos premiers résultats indiquant que la perte des intégrines dans ce modèle diminue l’apparition des tumeurs mammaires, nous projetons d’analyser les mécanismes qui expliquent cette inhibition. On déterminera en particulier l’impact de la perte des intégrines dans la glande avant l’apparition des tumeurs (statut pre-néoplasique) et sur son contenu en cellules souches tumorales, connues pour leur implication dans les récidives et la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

L’interaction des intégrines avec la matrice extracellulaire qui entoure les cellules joue un rôle important au cours des différentes étapes de la progression tumorale mammaire, du carcinome in situ (tumeur en stage initiale, souvent bénin) à l’invasion tissulaire (tumeur invasif mais encore localisé à la glande mammaire) et la métastase (invasion d’autres tissues). De façon notable, certaines intégrines sont surexprimées dans les tumeurs du sein et leur expression est associée à un mauvais pronostic et à des taux de survie réduits. Notre étude permettra de déterminer la contribution des intégrines dans le développement tumoral de la glande mammaire et la régulation des cellules souches tumorales, responsables des récidives et de la dissémination métastatique. Notre approche permettra d’évaluer la contribution de ces intégrines dans les anomalies de croissance cellulaire, différenciation et invasion observées dans les carcinomes mammaires humains. A long terme, ces informations permettront de mieux appréhender les mécanismes impliqués dans la communication entre cellules épithéliales et matrice extracellulaire et notamment d’évaluer si des signaux anormalement émis par les intégrines dans le contexte tumoral peuvent constituer des cibles thérapeutiques efficaces pour le traitement de certains cancers du sein.

Procédures

Un suivi des animaux développant spontanément des tumeurs mammaires (observation et palpation) sera réalisé pendant toute la durée de l’expérience (au maximum 4 semaines après la détection des tumeurs). Des expériences de transplantation (greffe) de cellules tumorales dans le tissu adipeux mammaire de souris receveuses seront réalisées. Cette intervention chirurgicale est peu invasive, le péritoine (membrane entourant la cavité abdominale), restant intact. Elle est de courte durée (15-20 min par animal) et s’effectue sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nos souris transgéniques sont viables et ne présentent aucun problème sévère de santé à l’âge adulte. Le modèle de tumorigenèse que nous étudions n’entraînent pas de souffrance notable. Les nuisances liées au développement tumoral sont faibles et les souris portant des tumeurs seront analysées en moyenne 2 semaines après leur détection, avec un maximum de 4 semaines pour les tumeurs à croissance lente. Les tumeurs restent localisées à la glande mammaire et ne sont pas métastatiques dans notre fenêtre expérimentale. L’apparition de tumeurs sur d’autres organes reste extrêmement rare dans ce modèle. De possibles mais rares ulcérations peuvent se produire dans les tumeurs mammaires chez certains animaux. Les animaux opérés pourront éventuellement développer des tumeurs mammaires qui, d’après la littérature, reproduiront le phénotype de la tumeur originale avec, notamment, une absence de développement métastatique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

Notre projet repose sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées (souris transgéniques) pour définir les mécanismes qui régulent les cellules souches et leur contribution dans les cancers du sein. La glande mammaire est un tissu spécifique aux mammifères dont le fonctionnement normal est contrôlé par un ensemble complexe de régulateurs hormonaux et locaux. La souris reste à ce jour le modèle le plus pertinent pour étudier la biologie des cancers du sein. Les souris transgéniques sont reconnues comme des modèles incontournables pour explorer les mécanismes de tumorigénèse et développer des thérapies. Bien que nous utilisions des méthodes alternatives réduisant l’utilisation des animaux, en particulier des cultures pour modéliser le comportement des cellules tumorales in vitro, il est indispensable d’effectuer des expériences in vivo pour comprendre la formation et la progression des tumeurs dans leur environnement physiologique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible pour maintenir une signification statistique. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements de glande mammaire, on utilise chaque glande mammaire d’une même souris donneuse, celle-ci étant pourvue de 5 paires de glandes. Des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées.

Raffinement

Les animaux seront manipulés le moins possible. Les souris seront surveillées soigneusement pour détecter tout signe de détérioration des conditions cliniques. L’apparition de tumeurs sera surveillée à partir de l’âge de 4 mois (l’âge moyen d’apparition de tumeurs dans ces souris est de 7,5 mois). Des palpations seront effectuées trois fois par semaine. Un examen complet au moins hebdomadaire (fréquence adaptée à l’évolution) des souris développant des tumeurs permettra de détecter des signes précoces de détresse et de maladie. Les points limites sont soigneusement définis avec une surveillance attentive des signes cliniques. Des fiches d'évaluation clinique sont mises en place pour ce projet spécifique. Les expériences de transplantation se font sous anesthésie générale. Pour minimiser les risques d’infection, les instruments de chirurgie sont stérilisés et les surfaces et la loupe utilisées, soigneusement lavées et rincées à l’éthanol. Pendant l’opération un gel de protection oculaire est appliqué aux animaux pour éviter le desséchement. Des analgésiques, sont administrés 20 min avant l’anesthésie (buprenorphine, carprofen), puis relais 24h après l’opération (ibuprofène). Après l’intervention, nous utilisons du fil de suture stérile résorbable pour refermer la plaie. En post-opératoire, les souris encore anesthésiées sont réhydratées et placées sur une platine chauffante pour éviter l’hypothermie. Les souris greffées sont surveillées tous les jours afin de déceler tout signe de mal-être et pour détecter l’apparition de tumeurs (palpation trois fois par semaine). Si elles présentent des signes de mal-être (amaigrissement, prostration), elles sont mises à mort avant la fin programmée de l’expérience.

Choix des espèces

Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Par ailleurs, la connaissance du génome murin, sa forte homologie avec le génome humain et l’existence de divers modèles génétiques murins rendent ce modèle puissant. Enfin, c'est un animal facile à anesthésier, ce qui permet de réduire au maximum le stress qui pourrait être provoqué chez l'animal. Ainsi, ce modèle animal est le meilleur compromis entre l’étude d'un modèle animal mammifère et l’obtention de réponses pertinentes aux questions posées. Pour l’analyse des tumeurs, les souris avec un phénotype potentiellement dommageable sont euthanasiées à l’âge adulte (à partir de 5-6 mois d’âge lors de l’apparition des tumeurs ou avant, pour analyse de la glande pre-néoplasique). Les tumeurs sont analysées avant qu’elles ne génèrent de signes de souffrance chez les souris. Les souris receveuses utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles pré-pubertaires âgées de 3 semaines. A ce stade, l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du tissue adipeux resté intact.

4980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome puis un ou deux traitements, avant d'être tuées pour prélever la tumeur et les organes du système immunitaire, afin de tester un composé naturel censé activer l'immunité contre la tumeur, seul ou associé à des immunothérapies. Le porteur indique que les injections et la croissance tumorale peuvent provoquer des douleurs. Parmi les bénéfices attendus, il cite l'amélioration de la prise en charge des patients mais aussi la publication de ses travaux.

Objectifs

Nous avons montré qu’un composé naturel (CN) inhibe la progression des tumeurs de la peau (mélanomes) et qu’il stimule l’infiltration des cellules immunes dans les tumeurs. Les expériences réalisées sur des cellules de tumeur en culture montrent que le CN induit la libération de petites vésicules extracellulaires (pVE) et la mort des cellules cancéreuses qui vont libérer des signaux (lysats cellulaires). Nous avons montré que les pVE et les lysats cellulaires induits par le CN stimulent l’activation de certaines cellules immunes mises en culture. Les objectifs du projet sont d’étudier sur différents cancers de la peau (mélanome) implantés chez la souris, si le CN active le système immunitaire contre la tumeur et de caractériser si les pVE ou les lysats cellulaires participent aux effets du CN. Il sera également étudié si l’activation du système immunitaire et l’inhibition de la progression de la tumeur par le CN peut augmenter l’efficacité d'autres immunothérapies déjà utilisées en clinique en testant leur association.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra de compléter les études réalisées in vitro sur des cellules en culture et montrera l'impact du CN et des mécanismes qu'il active sur la réponse immune contre la tumeur et déterminera si l’association du CN avec d’autres immunothérapies utilisées en clinique peut augmenter leur efficacité. Ce projet aura pour bénéfice de pouvoir étudier dans un système intégré l'action de nouvelles thérapies qui stimulent le système immunitaire contre la tumeur dans le but d’améliorer la prise en charge des patients ayant un mélanome et qui ne répondent pas aux immunothérapies proposées en clinique et et permettra de publier nos travaux.

Procédures

L'animal sera soumis à un ou deux traitements avec une durée inférieure à 1 minute par traitement. Il n'y aura pas de prélèvements sur animaux vigiles et aucune procédure chirurgicale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur l'animal seront dues aux injections des cellules tumorales et des traitements qui entrainent des douleurs sur le site de l'injection ainsi que la croissance des tumeurs qui peut entrainer des douleurs. Le CN a déjà été testé in vivo sur plusieurs modèles de tumeurs et aucun effet indésirable, ni perte de poids n'ont été observés. Les immunothérapies ont déjà été utilisés chez la souris (rapporté dans la littérature) sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées. Par contre, les combinaisons du CN avec les immunothérapies n'ont pas été testées. Dans tous les cas, pour chaque traitement ou combinaison de traitements, nous serons vigilants et nous surveillerons de façon quotidienne les animaux afin de s’assurer que les traitements ou combinaisons n’auront pas d’effets indésirables et ne provoquerons pas de souffrance, et de même nous surveillerons si la croissance des tumeurs induit des douleurs. Si une souffrance est observée, un traitement mis dans l’eau de boisson pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire de la zootechnie.

Devenir

Procédure 1: Les souris seront gardées en vie après la formation des tumeurs car elles seront soumises à des traitements pendant une durée déterminée. Procédure 2: A la fin du temps des traitements, les souris seront mises à mort car la tumeur et les organes du système immunitaire seront récupérés afin d'isoler et de caractériser les différentes populations de cellules immunes qui sont activées ou inhibées par les traitements.

Remplacement

Le CN a été montré comme activant l'infiltration des cellules immunes dans les tumeurs mammaires et de mélanomes implantées chez la souris immunocompétente par des études d'immunohistochimie. Des expériences in vitro sur des cellules immunes ont été préalablement réalisées et ont montré les effets du CN et des mécanismes activés (sécrétion des pVE ou mort des cellules tumorales) sur la réponse immune. Nous nous sommes ainsi assurés de la pertinence d'étudier la réponse immune anti-tumorale chez la souris.

Réduction

Le nombre de souris utilisé sera le nombre minimal d’animaux qui permettra d’avoir des résultats significativement exploitables compte tenu de la grande variabilité des réponses immunitaires anti-tumorales des souris et pour répondre aux objectifs du projet qui sont d’évaluer la réponse immune anti-tumorale de plusieurs traitements et d’isoler et de caractériser les différentes populations de cellules immunes qui ont infiltrées les tumeurs et qui sont minoritaires comparé aux cellules tumorales. Les lignées choisies sont des lignées utilisées dans la littérature et en immunothérapie..

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général, pesée) afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur. Si une souffrance est observée, un traitement mis dans l’eau de boisson pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire de la zootechnie.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et permet de comparer les effets obtenus à d’autres molécules développées dans d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour étudier cette espèce. Le système immunitaire est un système complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires et plusieurs organes immuns qui communiquent entre eux. Ainsi, l'utilisation des souris immunocompétentes ou immunodéficientes pour montrer l'implication du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale du CN, des pVE et des lysats cellulaires est essentielle pour cette étude qui nécessite un système intégré.

2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, l'injection d'un candidat-médicament marqué à un isotope radioactif puis jusqu'à dix prélèvements sanguins, certaines étant isolées jusqu'à 96 heures en cage à métabolisme, pour suivre la distribution du produit dans les organes. Le porteur précise que ces études sont commandées par des entreprises clientes, selon un schéma répétitif de sélection de candidats-médicaments. Il indique que la tumeur peut atteindre 1500 mm3 ou se nécroser et que la toxicité peut entraîner une perte de poids supérieure à 20 pour cent, et affirme qu'aucun modèle ex vivo ou sur organoïdes ne reproduit la complexité physiologique de l'animal.

Objectifs

Les études de pharmacocinétique sanguine, de distribution tissulaire et d’élimination de candidats médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Dans le cadre d'études en cancérologie, il est également crucial de vérifier le ciblage spécifique des candidats médicaments pour les cellules cancéreuses que ce soit à but diagnostic ou thérapeutique. Ces études in vivo s’inscrivent dans un contexte d’études répétitives car elles seront réalisées selon un même schéma directeur expérimental ayant pour unique objectif l’étude pharmacologique de sélection de candidats médicaments biologiques. Les variations peuvent porter sur la souche de souris sélectionnée pour l’évaluation du candidat, le mode d’administration du candidat, le nombre d’animaux par groupe et le nombre de groupes (différentes doses et/ou différents temps d’euthanasie à analyser). Ces études in vivo sont menées à partir de l’administration de candidats médicaments préalablement marqués par un isotope radioactif de faible énergie afin de tracer et de quantifier ces candidats dans les différents tissus dont le tissu tumoral et fluides biologiques d’intérêt. La radioactivité est administrée à des doses ne présentant aucun effet nocif pour la santé de l’animal.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont que la molécule testée soit spécifique du tissu tumoral ciblé afin dans un second temps de développer des candidats-médicaments spécifiques de ces tumeurs à but diagnostique et/ou thérapeutique.

Procédures

Toutes les souris sont injectées en sous-cutanée avec des cellules cancéreuses ; fréquence : 1 fois/animal durée : 30 sec. Les souris recevront toutes une injection d'un candidat-médicament ; voies possibles : IV, SC, IM, IP, voie orale et intravésicale fréquence : 1 fois/animal durée : 30 sec à 3 min. A l'exception des souris en cage à métabolisme, toutes les souris seront prélevées en sang : - Cas du microsampling : fréquence max 3 fois sur 24 heures puis 1 fois par 24 heures pendant 7 jours = 10 prélèments durée/prélèvement : 1 min - Cas des autres techniques de prélèvements: fréquence max 2 fois avec un intervale minimum de 1 heure et maximum de 5 jours durée/prélèvement : 1 min Les souris en cage à métabolisme sont isolées pendant 96 heures au maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables inattendus sont: - tumeur aggressive dépassant les 1500 mm3 et/ou nécrosante entrainant l'arrêt de l'étude pour les animaux concernés. - toxicité de la molécue testée se traduisant par une perte de poids >20% et/ou un état général dégradé ( poils piqués, réduction de la motricité , perte d'appétit...) entrainant l'arrêt de l'étude pour les animaux concernés.

Devenir

Tous les organes d'intéret doivent être prélevés d'où l'impossibilité de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Ces étude ne peuvent pas être remplaceées étant donné que le système d'intéraction tumeur et molécule à tester est complexe et qu'à l'heure actuelle ex-vivo, sur organoides ou modélisation ne permet de reproduire la complexité physiologique de l'animal.

Réduction

Un groupe composé de 6 individus au maximum est nécessaire et suffisant à la détermination d'un coefficient de variation prenant en compte la variabilité interindividuelle. La mesure radioactive est très précise et répétable ne nécessitant pas l'intégration d'animaux supplémentaires. Aucun test statistique n'est envisagé. Il sera uniquement prévu de calculer la moyenne et l'écart-type obtenus sur chaque groupe de 6 animaux.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place: Une une période d'acclimatation de 5 jours minimum avant l'entrée dans le protocole ; Des conditions d'hébergement adéquates incluant un enrichissement avec du papier accordéon et des tunnels teintées un suivi quotidien des animaux ; la mise en place de méthodes d'anesthésie et d'euthanasie reconnues et validées ; l'instauration de points limites pertinents et précoces le respect des volumes d'injection , de la fréquence et des volumes de prélèvements sanguinss

Choix des espèces

Les souris sont des animaux préférentiellement utilisés dans les phases précoces de recherche de biodistribution tissulaire. Le choix de la souche et du sexe dépendra ensuite des résultats antérieurs de la Société cliente. Les animaux sont utilisés à l'âge de jeune adulte (environ 6-8 semaines). Le système immunitaire à cet âge est mature.

199 animaux non-humains, 162 souris et 37 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des matrices implantées sous la peau, les rats une ostéotomie du fémur avec injection d'un gel puis une thoracotomie terminale, pour tester des matériaux à base d'ARNm censés induire la réparation osseuse. Le porteur indique un risque de boiterie après la chirurgie osseuse et décrit la thoracotomie comme une procédure douloureuse réalisée sous fortes doses d'anesthésie en condition péri-mortem. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la réparation osseuse et conclut au recours "nécessaire" à l'animal.

Objectifs

Le processus spontané et naturel de réparation du tissu osseux est pris en défaut lors d’un traumatisme trop étendu, d’une non-consolidation, d’une résection osseuse de grande taille. Dans ces situations, l’autogreffe osseuse est le traitement de référence mais présente des inconvénients de morbidité et de quantité disponible. L’utilisation de biomatériaux est l’alternative usuelle pour la chirurgie orthopédique; néanmoins, ces matériaux inertes sont dépourvus de propriété biologique induisant la formation osseuse (dit ostéo-inductrice) limitant leur efficacité à la réparation de défaut de petite taille. Une approche en médecine régénérative osseuse consiste à rendre ces matériaux implantables biologiquement actifs, en leur associant des molécules induisant la formation osseuse. Les molécules les plus connues pour induire de l’os sont les protéines de la morphogénèse osseuse ou Bone Morphogenetic Proteins (BMPs). La BMP2 délivrée sous forme de protéine est/a été utilisée en clinique dans certaines pathologies mais se heurte à des effets secondaires importants en raison des fortes doses utilisées ; elle a d’ailleurs été retirée du marché dans de nombreux pays. Il est nécessaire d’évaluer de nouvelles alternatives à l’utilisation de BMP-2 sous forme protéique. Le projet propose d’évaluer le potentiel d’induction de formation osseuse de matériaux chargés non pas de protéines mais d’ARNm codant pour les protéines de BMPs (les ARNm sont des molécules, en principe produites dans les cellules, qui permettent de transformer l’information génétique situé dans l’ADN (dans le noyau) en protéines (cf https://www.afm-telethon.fr/glossaire/arn-messager-2717)); dans ce projet, nous synthétiserons l’ARNm codant pour différentes types de BMP et l’associerons à un gel ; l’utilisation d’ARNm présente de nombreux avantages tels que de délivrer des doses infiniment plus faibles qu'en utilisant des protéines de BMP. Une première étape consistera à évaluer le potentiel de différentes types de BMP (sous forme ARNm) à induire du tissu osseux en site sous cutané chez la souris (potentiel ostéoinducteur) ; cette évaluation se fera sur des animaux mâles et femelles pour évaluer l’impact du sexe de l’animal hôte sur la réponse biologique des BMPs. La seconde étape consistera à valider le potentiel de réparation d’u gel chargé d’ARNm codant pour la BMP la plus efficace dans un grand défaut osseux chez le rat.

Bénéfices attendus

D’un point de vue technologique, notre projet donnera des données quant à l’intérêt de cette technologie à base d’ARNm pour une application d’ingénierie tissulaire. Pour la première fois, nous connaitrons le potentiel ostéoinducteur de différents homo- et hétérodimères de BMP (ces protéines sont composées de 2 sous-unités identiques (homodimère) ou différentes (hétérodimère)) délivrés sous forme d'ARNm en comparaison avec la stratégie actuelle en clinique, mais néanmoins controversée, consistant à utiliser la protéine recombinante rhBMP2. Nous obtiendrons aussi des véritables données sur l'influence du sexe de l’animal receveur (et donc présence ou non d’œstrogènes, hormones qui modulent la signalisation des BMP dans les cellules ostéoprogénitrices) sur la réponse des BMPs. Enfin, d’un point de vue médical, ce projet permettra d’évaluer une nouvelle stratégie pour la réparation de grands défauts osseux.

Procédures

Pour les souris : 1-Implantation sous cutanées de matrices ( 1X ; durée ~30 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (4X; durée 15 min) 3- Imagerie en bioluminescence in vivo (8X; durée 40 min) Pour les rats : 1- Osteotectomie diaphysaire fémorale avec injection d’un gel ostéoinducteur (1X, durée 60 min) ; 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (6X; durée 15 min) ; 3- Thoracotomie suivie d'une perfusion intracardiaque d'un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

Les implantations sous-cutanées sont généralement bien tolérées chez la souris; il sera en éponge de collagène qui s’écrase. Un effet indésirable est l’élimination des points de suture trop rapidement (le lendemain) ; si la cicatrice est belle, rien ne sera fait ; si la cicatrice est mal fermée (> 2 mm), l’animal sera anesthésié sous isoflurane, et les bords seront recoupés et resuturés. Pour les implantations intra-osseuses, un risque est l’apparition d’une boiterie de l’animal post-chirurgie ; les animaux seront étroitement surveillés durant les 3 jours post-chirurgie. Il peut aussi arriver une faillite de l’ostéosynthèse (vis se dévissant); tous les animaux seront scannés toutes les 2 semaines, permettant de contrôler l’ostéosynthèse ; en cas de faillite, nous surveillerons étroitement la démarche de l’animal ; si une persistance de boiterie apparait, il sera mis à mort. Ce projet comprend aussi une thoracotomie en point terminal (ouverture de la cage thoracique pour accéder au coeur). La thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet permettant des analyses post-mortem (analyse au μCT à une résolution de 9 μm + histologie des explants ou analyses de l'expression génique)

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe . Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Les études quantitatives nécessiteront 8 animaux pour obtenir un pouvoir statistique suffisant, compte tenu des variations de résultats pouvant être observées dans les études in vivo. Pour les études en site ectopique 4 implants ou 2 implants seront implantés par souris pour diminuer le nombre d’animaux. Pour les études en site ectopique 4 ou 2 implants seront implantés par souris pour diminuer le nombre d’animaux. L’imagerie noninvasive pour petits animaux (suivi de l’expression d’une protéine modèle luciférase par bioluminescence (phénomène d’émission de lumière telle qu’observée chez les vers luisants) et de la formation osseuse par microscanner) sera utilisée pour suivre les mêmes animaux dans le temps et permet ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

La souffrance sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant les 3 premiers jours. Après chirurgie, les animaux seront surveillés en per-opératoire puis régulièrement (2X/j pendant 3 jours, puis 1X/j pendant 3 jours puis finalement 2 X/semaine jusqu'à la fin de l'expérimentation). Pour chaque analyse (micro-scanner ou bio-imageur) les souris seront anesthésiées par inhalation à l’Isoflurane dont les effets se dissipent 1 à 2 minutes après l’arrêt du contact direct avec le produit. La thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), dômes et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. Les souris et rats initialement hébergés ensemble (3 animaux/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum. Les points critiques (plaie, démarche..) seront surveillés, scorés et reportés sur une feuille de score permettant d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures à prendre pour chaque situation clinique (Perte de poids, Comportement général altéré, Apparence extérieure altérée, Site d’implantation infecté, boiterie) et en cas d'atteinte des points limites sont listées sur cette feuille de score.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour les implantations sous-cutanées est la souris Swiss. Le modèle souris permet d’évaluer le potentiel ostéoinducteur d’implants chargés d’un facteur de croissance induisant la formation osseuse (en particulier la Bone Morphogenetic Protein 2/ BMP2), aussi bien que le rat ; la souris a l’avantage d’être plus petite et moins chère. La souche SWISS est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin et donc diminuant le biais d’utiliser une population trop homogène ; par ailleurs, son poids à 8 semaines (~30 g) permet l’implantation de 4 implants par souris sans problème. Le modèle animal choisi pour les implantations intra-osseux est le rat Wistar. La taille du rat est plus pertinente que la souris pour évaluer la réparation d’un grand défaut osseux. La souche Wistar est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin. Pour les souris, jeunes adultes de 8 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30g et dont le potentiel de réparation osseux est optimal. Pour les rats, jeunes adultes (12 semaines) car de taille suffisamment importante pour permettre l’implantation en site osseux et leur phase de croissance est terminée.