Souris

152 souris athymiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules cancéreuses prostatiques par implantation sous-cutanée ou par chirurgie intraprostatique, pour évaluer le rôle d'une isoforme protéique dans la croissance tumorale et les métastases. Le porteur mentionne une possible perte de poids et une mobilité réduite en cas de cachexie liée aux métastases. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico ne permet d'étudier la progression tumorale dans un "organisme entier".

Objectifs

Malgré les nombreux progrès réalisés au cours des dernières années dans les domaines de la prévention, de la détection précoce et du traitement du cancer, cette maladie reste un problème majeur de santé publique. Lors de la croissance tumorale, certaines cellules cancéreuses acquièrent la capacité d’envahir les tissus environnants avant de disséminer dans des organes éloignés de la tumeur d’origine. Contrairement aux tumeurs primaires, cette capacité de dissémination n’est ciblée par aucune thérapie spécifique alors qu’elle est la cause majeure des décès par cancer. L’acquisition de la capacité d’invasion et le développement de métastases représentent donc un défi thérapeutique majeur qui nécessite d’en élucider les mécanismes moléculaires. Or, les mécanismes activés pendant la migration et l’invasion tissulaire sont complexes. Des travaux antérieurs ont pu préciser qu'une protéine structurale des jonctions communicantes intercellulaires, lorsqu’elle est localisée à la membrane plasmique, jouait un rôle important dans ces mécanismes moléculaires favorisant les capacités invasives des cellules de cancer de la prostate et dans la sensibilité au microenvironnement osseux dans le contexte des métastases. Il a également été rapporté qu’une isoforme courte particulière de cette protéine, située en intracellulaire, favorise, lorsqu’elle est surexprimée, le transit de la forme structurale longue vers la membrane des cellules cancéreuses prostatiques, les rendant alors plus agressives in vitro. Le présent projet a pour objectif d’évaluer in vivo le rôle protumoral de cette isoforme courte en étudiant l’effet de sa surexpression sur la croissance tumorale et sa capacité à induire et former des métastases.

Bénéfices attendus

Dans le domaine de recherche très peu exploré de cette isoforme courte, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à la présence membranaire de la forme longue de la protéine structurale et son rôle dans la sensibilité au microenvironnement dans le cadre des métastases osseuses. La validation in vivo de l'isoforme courte en tant facteur pro-tumorigénique permettra d’une part de la reconnaitre comme un marqueur prédictif de progression du cancer de la prostate et d’autre d’en faire une cible thérapeutique anti-cancéreuse. Ce dernier aspect nous semble particulièrement important car à l’heure actuelle aucun traitement ne cible particulièrement cette capacité métastatique.

Procédures

Pour cette validation in vivo, 3 procédures expérimentales différentes vont être mises en place mais utilisant toujours les 4 mêmes clones de cellules tumorales à des fins de comparaison. Chacune des procédures correspondra à un site d’implantation/injection différent. La procédure 1 correspondra à une implantation sous-cutanée des différents clones de cellules prostatiques à des souris anesthésiées par voie gazeuse (durée de l'intervention entre 5 et 10 min). La procédure 2 correspondra à une implantation chirurgicale intraprostatique des différents clones de cellules prostatiques à des souris anesthésiées par voie gazeuse (durée de l'intervention entre 20 et 30 min). Enfin, la procédure 3 correspondra à une injection intravasculaire des différents clones de cellules prostatiques à des souris vigiles afin d'étudier l'impact de l'isoforme courte sur leur capacité à développer des métastases dans différents sites secondaires (durée de l'intervention environ 10 min). Le suivi du développement tumoral primaire ou métastatique se fera par imagerie in vivo sur animaux anesthésiés par voie gazeuse au maximum deux fois par semaine pendant 4 semaines pour la procédure 1 et pendant 5 semaines pour les procédures 2 et 3 (durée totale de chaque mesure entre 5 et 10 min).

Impact sur les animaux

Il existe une possibilité de perte de poids et une mobilité réduite en cas de développement de métastases liées à une potentielle cachexie pour les procédures 2 et 3.

Devenir

Tous les animaux des trois procédures seront mis à mort en fin d'expérience par anesthésie gazeuse (isoflurane) puis dislocation cervicale. Les tumeurs primaires seront ensuite systématiquement récupérées lors des procédures 1 et 2. En cas de signal in vivo révélant la présence de métastases, les tissus correspondants seront prélevés. Ces animaux, ayant subi une induction tumorale et développant potentiellement des métastases, ne pourront pas être réutilisés pour un autre projet.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale sur souris par d'autres alternatives in vitro en l'absence de modèles virtuels ou in silico disponibles pour etudier la progression tumorale et la dissémination métastatique dans un organisme entier.

Réduction

Par une approche statistique (Snedecor et Cochran), la réduction au maximum du nombre d'animaux nécessaires en expérimentation a été prise en compte, tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour conduire une étude statistiquement interprétable. Le suivi de la croissance tumorale par bioluminescence par un imageur dedié au petit animal permet non seulement de suivre la croissance tumorale au cours du temps mais également de réduire le nombre d'animaux utilisés en permettant de collecter un nombre important de données par individu.

Raffinement

Ce projet fait suite à des projets antérieurs qui nous ont permis d'affiner au mieux les procédures expérimentales, notamment pour la définition de points de contrôle et limites (comportementaux et physiques). Ainsi, les modalités d'injection des cellules tumorales sont réalisées sous anesthésie générale, avec contrôle de la température corporelle, en présence d'antalgiques et d'anti-inflammatoires en péri et post phase opératoire afin de limiter au maximum la douleur. Des grilles de suivi ont été élaborées pour suivre au plus près le bien être animal. En cas d'apparition de signes de mal-être, un traitement à base de dérivés morphiniques est mis en place immédiatement. De plus, les conditions d'élevage sont optimisées au mieux (hébergement en groupe social de 4 à 5 souris, environnement enrichi avec des conditions de température et d'hygrométrie controlées) afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales et de l'absence d'interférences sur les résultats. Ce projet utilise des animaux immnodéprimés. Les conditions d'hébergement sont adaptées et compatibles pour le maintien du statut sanitaire requis pour ces animaux génétiquement altérés.

Choix des espèces

Afin de pouvoir comparer les résultats que nous obtiendrons à ceux de la littérature, l’utilisation de souris est complètement justifiée. C’est également un modèle animal où l’induction des tumeurs dans les souches Nude est rapide et le suivi de leur croissance facilité par un imageur du petit animal. Les souris athymiques Nude sont très largement usitées dans les études oncologiques qui utilisent des cellules cancéreuses humaines rendant impossible le recours à des souris non immuno-déprimées. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience pour les 3 procédures expérimentales. Cet âge correspond à des animaux matures sexuellement et dont la prostate est suffisamment développée pour permettre une injection standardisée.

1500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenues vigiles par contention, elles reçoivent des injections de nanoparticules lipidiques puis cinq injections quotidiennes de luciférine, avant prélèvements sanguins et imagerie sous anesthésie. L'expérience ne teste pas encore un vaccin mais sert à choisir la meilleure formulation lipidique à l'aide d'un ARNm marqueur. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue la réponse à un vaccin et juge le recours à la souris "incontournable".

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la surexpression ou dérégulation de certaines cytokines et conduit à l’apparition de la pathologie. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie d’immunothérapie active (stimulation du système immunitaire du patient) reposant sur la production d’anticorps anti-cytokine après administration d’un vaccin appelé ‘Kinoïde’. Ce dernier est présenté soit sous forme de protéine, soit sous forme de vaccin ARN véhiculé par des lipides. L’injection du vaccin Kinoïde™ a pour but d’induire chez la souris des anticorps contre la cytokine d’intérêt. Il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous oblige à les tester chez la souris. Afin de développer ces nouveaux candidats vaccins, nous devons sélectionner dans un premier temps les transporteurs lipidiques permettant de protéger l’ARN et de l’acheminer aux bonnes cellules afin d’induire la production d’anticorps. PPour cela, nous souhaiterions définir la composition des formulations lipidiques (nanoparticules lipidiques ou NPL) optimale dans lesquels seront encapsulés les ARNm afin de permettre une meilleure délivrance aux cellules et ainsi une meilleure expression de la protéine d’intérêt. Pour ce faire, nous utiliserons comme modèle un ARNm codant pour la Firefly luciférase (ARNm-FLuc). Cette dernière, après réaction avec son substrat, la luciférine, émet un photon lumineux, qui permettra d’évaluer par imagerie optique, technique non invasive et non traumatisante, le profil de distribution des différentes formulations lipidiques et l’expression de la protéine en fonction du temps. Ces travaux nous permettrons de sélectionner la meilleure formulation lipidique pour encapsuler nos constructions d’ARNm constituant ainsi une nouvelle voie de protection contre les pathologies allergiques chez l’homme.

Bénéfices attendus

L’évaluation du profil de distribution des différents transporteurs lipidiques en fonction du temps nous permettra de sélectionner la formulation lipidique optimale pour encapsuler nos ARN pour pouvoir ensuite évaluer leur d’immunogénicité .

Procédures

Les 1500 animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes recevront une injection unique de formulation lipidique NPL par voie intramusculaire dans le muscle de la patte arrière (750 souris) ou une injection sous-cutanée dans le flanc (750 souris). De plus, chaque animal vigile maintenu par contention pendant 30 secondes recevra au total 5 injections de luciférine par voie péritonéale, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours. L’anesthésie des souris lors des injections n’est pas prévue. Le prélevement sanguin est réalisé en moins de 30 secondes sur souris anesthèsiees à l'isoflurane. Chaque animal subira 3 prélèvements au total. L’imagerie sera réalisée sous anesthèsie isoflurane sur une durée de 15min, au total. Chaque animal sera imagé 1 fois par jour pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Ainsi, la température de la pièce, la ventilation et l’éclairage seront contrôlés pour limiter le stress des animaux. De plus, le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage afin de leur assurer l’espace nécessaire. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau sera fourni ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal. Les animaux disposent d'une période d'acclimatation (minimum 7 jours) avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter l'angoisse subie. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées par voie intramusculaire, sous-cutanée ont lieu de façon unique et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Seul le stress de la contention impacte brièvement leur comportement. Des effets indésirables peuvent se produire aux sites d’injection (intramusculaire, sous-cutané) tels que des rougeurs, des gonflements ou des lésions pouvant durer quelques heures à quelques jours. Une douleur musculaire localisée pourra entre autres être détectée si l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. Après la dernière imagerie réalisée, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.

Remplacement

Des tests cellulaires in vitro seront effectués au préalable pour sélectionner les formulations NPL constituées de différents lipides par analyse de l’expression de la luciférase par les cellules. Cette première sélection permettra de ne tester chez l’animal que les formulations optimales et de réduire ainsi le nombre d’animaux.

Réduction

L’utilisation de l'imagerie nous permet de suivre l’évolution de l’expression et de la biodistribution des formulations lipidiques encapsulant l’ARNm injectées chez la souris en fonction du temps. Cette technique non invasive nous permet ainsi de réduire le nombre d'animaux. Si une absence de réponse pour une formulation est observée, l’étude sera interrompue et de ce fait le nombre d’animaux sera réduit.

Raffinement

Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les animaux subissent des contraintes très modérées puisque les procédures effectuées seront légères. Les injections, réalisées par voie intramusculaire et sous-cutanée ont lieu de façon unique et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Seul le stress de la contention impacte brièvement leur comportement. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance (Buprénorphine à 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée) Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. Si un animal présente l'un des points limites à un seuil critique, une injection d’analgésique sera effectuée ou en fonction du grade il sera mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Les souris utilisées seront des souris adultes, de 7 semaines avec un système immunitaire mature pour tenir compte de leur réponse humorale. En effet, il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immune à un vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, préférentiellement la souris, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins.

148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie développe des tumeurs mammaires, d'autres reçoivent une greffe de cellules tumorales, y compris des femelles pré-pubères de trois semaines, pour étudier le rôle d'intégrines dans le cancer du sein lié à BRCA1. Le porteur renvoie les retombées thérapeutiques au long terme et au conditionnel, l'étude visant d'abord à comprendre des mécanismes. Il revendique la souris comme un "modèle incontournable" et juge "indispensable" le recours à l'expérimentation in vivo.

Objectifs

Le cancer du sein représente la première cause de décès par cancer chez la femme, principalement dû à une connaissance encore incomplète des mécanismes moléculaires et cellulaires qui induisent le développement tumoral. La glande mammaire est une structure épithéliale constituée d’un système de canaux ramifiés et d’alvéoles. L’épithélium mammaire adulte est composé de cellules luminales sécrétrices du lait et de cellules basales myoépithéliales qui, en se contractant, aident à l’expulsion du lait vers les canaux. Ces deux types de cellules dérivent de la prolifération et de la différenciation de cellules souches mammaires. Or, des études récentes ont montré que l’amplification aberrante des cellules souches est à l’origine de cancers du sein agressifs associés à des mutations du gène BRCA1 (Breast Cancer 1), un gène connu pour être un suppresseur tumoral. Ces cancers appartiennent à un groupe des tumeurs pour lesquelles les thérapies ciblées utilisées dans le traitement d’autres types de cancers du sein (par exemple, les thérapies hormonales) se sont avérées inefficaces. Les intégrines sont des protéines présentes dans la surface des cellules qui permettent leur adhésion et régulent de nombreuses fonctions. Certaines intégrines sont indispensables à la multiplication et la différenciation des cellules souches nécessaires à une gestation et lactation normales. Nous souhaitons étudier le rôle de ces intégrines dans un modèle murin connu pour développer des tumeurs mammaires dont l’origine et les caractéristiques sont très similaires aux cancers du sein avec mutation en BRCA1 chez la femme. Nos premiers résultats indiquant que la perte des intégrines dans ce modèle diminue l’apparition des tumeurs mammaires, nous projetons d’analyser les mécanismes qui expliquent cette inhibition. On déterminera en particulier l’impact de la perte des intégrines dans la glande avant l’apparition des tumeurs (statut pre-néoplasique) et sur son contenu en cellules souches tumorales, connues pour leur implication dans les récidives et la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

L’interaction des intégrines avec la matrice extracellulaire qui entoure les cellules joue un rôle important au cours des différentes étapes de la progression tumorale mammaire, du carcinome in situ (tumeur en stage initiale, souvent bénin) à l’invasion tissulaire (tumeur invasif mais encore localisé à la glande mammaire) et la métastase (invasion d’autres tissues). De façon notable, certaines intégrines sont surexprimées dans les tumeurs du sein et leur expression est associée à un mauvais pronostic et à des taux de survie réduits. Notre étude permettra de déterminer la contribution des intégrines dans le développement tumoral de la glande mammaire et la régulation des cellules souches tumorales, responsables des récidives et de la dissémination métastatique. Notre approche permettra d’évaluer la contribution de ces intégrines dans les anomalies de croissance cellulaire, différenciation et invasion observées dans les carcinomes mammaires humains. A long terme, ces informations permettront de mieux appréhender les mécanismes impliqués dans la communication entre cellules épithéliales et matrice extracellulaire et notamment d’évaluer si des signaux anormalement émis par les intégrines dans le contexte tumoral peuvent constituer des cibles thérapeutiques efficaces pour le traitement de certains cancers du sein.

Procédures

Un suivi des animaux développant spontanément des tumeurs mammaires (observation et palpation) sera réalisé pendant toute la durée de l’expérience (au maximum 4 semaines après la détection des tumeurs). Des expériences de transplantation (greffe) de cellules tumorales dans le tissu adipeux mammaire de souris receveuses seront réalisées. Cette intervention chirurgicale est peu invasive, le péritoine (membrane entourant la cavité abdominale), restant intact. Elle est de courte durée (15-20 min par animal) et s’effectue sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nos souris transgéniques sont viables et ne présentent aucun problème sévère de santé à l’âge adulte. Le modèle de tumorigenèse que nous étudions n’entraînent pas de souffrance notable. Les nuisances liées au développement tumoral sont faibles et les souris portant des tumeurs seront analysées en moyenne 2 semaines après leur détection, avec un maximum de 4 semaines pour les tumeurs à croissance lente. Les tumeurs restent localisées à la glande mammaire et ne sont pas métastatiques dans notre fenêtre expérimentale. L’apparition de tumeurs sur d’autres organes reste extrêmement rare dans ce modèle. De possibles mais rares ulcérations peuvent se produire dans les tumeurs mammaires chez certains animaux. Les animaux opérés pourront éventuellement développer des tumeurs mammaires qui, d’après la littérature, reproduiront le phénotype de la tumeur originale avec, notamment, une absence de développement métastatique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

Notre projet repose sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées (souris transgéniques) pour définir les mécanismes qui régulent les cellules souches et leur contribution dans les cancers du sein. La glande mammaire est un tissu spécifique aux mammifères dont le fonctionnement normal est contrôlé par un ensemble complexe de régulateurs hormonaux et locaux. La souris reste à ce jour le modèle le plus pertinent pour étudier la biologie des cancers du sein. Les souris transgéniques sont reconnues comme des modèles incontournables pour explorer les mécanismes de tumorigénèse et développer des thérapies. Bien que nous utilisions des méthodes alternatives réduisant l’utilisation des animaux, en particulier des cultures pour modéliser le comportement des cellules tumorales in vitro, il est indispensable d’effectuer des expériences in vivo pour comprendre la formation et la progression des tumeurs dans leur environnement physiologique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible pour maintenir une signification statistique. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements de glande mammaire, on utilise chaque glande mammaire d’une même souris donneuse, celle-ci étant pourvue de 5 paires de glandes. Des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées.

Raffinement

Les animaux seront manipulés le moins possible. Les souris seront surveillées soigneusement pour détecter tout signe de détérioration des conditions cliniques. L’apparition de tumeurs sera surveillée à partir de l’âge de 4 mois (l’âge moyen d’apparition de tumeurs dans ces souris est de 7,5 mois). Des palpations seront effectuées trois fois par semaine. Un examen complet au moins hebdomadaire (fréquence adaptée à l’évolution) des souris développant des tumeurs permettra de détecter des signes précoces de détresse et de maladie. Les points limites sont soigneusement définis avec une surveillance attentive des signes cliniques. Des fiches d'évaluation clinique sont mises en place pour ce projet spécifique. Les expériences de transplantation se font sous anesthésie générale. Pour minimiser les risques d’infection, les instruments de chirurgie sont stérilisés et les surfaces et la loupe utilisées, soigneusement lavées et rincées à l’éthanol. Pendant l’opération un gel de protection oculaire est appliqué aux animaux pour éviter le desséchement. Des analgésiques, sont administrés 20 min avant l’anesthésie (buprenorphine, carprofen), puis relais 24h après l’opération (ibuprofène). Après l’intervention, nous utilisons du fil de suture stérile résorbable pour refermer la plaie. En post-opératoire, les souris encore anesthésiées sont réhydratées et placées sur une platine chauffante pour éviter l’hypothermie. Les souris greffées sont surveillées tous les jours afin de déceler tout signe de mal-être et pour détecter l’apparition de tumeurs (palpation trois fois par semaine). Si elles présentent des signes de mal-être (amaigrissement, prostration), elles sont mises à mort avant la fin programmée de l’expérience.

Choix des espèces

Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Par ailleurs, la connaissance du génome murin, sa forte homologie avec le génome humain et l’existence de divers modèles génétiques murins rendent ce modèle puissant. Enfin, c'est un animal facile à anesthésier, ce qui permet de réduire au maximum le stress qui pourrait être provoqué chez l'animal. Ainsi, ce modèle animal est le meilleur compromis entre l’étude d'un modèle animal mammifère et l’obtention de réponses pertinentes aux questions posées. Pour l’analyse des tumeurs, les souris avec un phénotype potentiellement dommageable sont euthanasiées à l’âge adulte (à partir de 5-6 mois d’âge lors de l’apparition des tumeurs ou avant, pour analyse de la glande pre-néoplasique). Les tumeurs sont analysées avant qu’elles ne génèrent de signes de souffrance chez les souris. Les souris receveuses utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles pré-pubertaires âgées de 3 semaines. A ce stade, l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du tissue adipeux resté intact.

30 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue et 2 500 réutilisées dans un autre projet. Le porteur leur greffe sous la peau des tumeurs dont il laisse le volume atteindre 1 000 à 2 000 mm³, teste des composés anticancéreux et mesure la tumeur au pied à coulisse, avec implantation chirurgicale de pompes et prélèvements sanguins répétés. Les souris incluses sont euthanasiées par dislocation cervicale ou au CO2, celles écartées à la randomisation pouvant être réutilisées. Il affirme que l'étape chez l'animal reste "indispensable" malgré les tests in silico et in vitro préalables.

Objectifs

En Europe comme aux Etats-Unis, le cancer est actuellement la seconde cause de mortalité après les maladies cardiovasculaires. En France, le cancer provoque environ 33% des décès chez les hommes et 23% chez les femmes. Il est donc primordial de s’intéresser à cette maladie et de trouver de nouvelles thérapies. Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales qui ont acquis, au cours du temps, un certain nombre de mutations faisant qu’elles ne répondent plus aux différents mécanismes de régulation et prolifèrent indéfiniment engendrant la formation d’une tumeur maligne et/ou de métastases. Un enjeu majeur pour la recherche consiste à trouver de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. L’objectif de ce projet consiste à tester de nouvelles thérapies, spécifiques des cellules cancéreuses, sur un modèle tumoral préalablement établi et parfaitement maitrisé chez la souris. Un moyen d’évaluer l’efficacité des molécules testées est de mesurer la régression tumorale en réponse au traitement de tumeurs greffées sous la peau, au moyen de mesures régulières de leur taille avec un pied à coulisse pendant une durée maximale de 4 mois. Ces études d’efficacité in vivo ont pour but premier de caractériser l’activité antitumorale des produits au sein d’un organisme vivant et complexe, l’objectif ultime étant le développement d’un candidat médicament pour le cancer. Les produits sélectionnés peuvent être évalués sur différents schémas de traitements (en modulant les doses, les voies d’administration, le nombre d’administration par jour, la récurrence ou une diffusion continue) afin d’escompter une régression partielle ou totale de la tumeur.

Bénéfices attendus

A travers l’investigation in vivo de potentiels candidats médicament, ce projet va permettre d’évaluer leur activité antitumorale, seuls ou en combinaison avec d’autres thérapies, et ainsi identifier des nouvelles stratégies dans la lutte contre le cancer. De plus, il rendra possible l’investigation de différentes modalités et schémas d’administration, de façon à trouver les conditions optimales pour maximiser l’efficacité contre les cellules tumorales et minimiser la toxicité pour les cellules saines, véritable enjeu pour le bien être des patients. Les produits sélectionnés peuvent être évalués sur différents schémas de traitements (en modulant les doses, les voies d’administration, le nombre d’administration par jour, la récurrence ou une diffusion continue ) afin d’escompter une régression partielle ou totale de la tumeur. A travers les deux procédures décrites, les objectifs du projet vont être plus précisément les suivants : - démontrer l’efficacité antitumorale in vivo de nos composés et ainsi soutenir l’intérêt thérapeutique de la cible en question, ce qui est primordial au développement d’un candidat médicament - rechercher les indications thérapeutiques et les combinaisons qui permettent au candidat d’exprimer au mieux son potentiel curatif - établir une relation PK/efficacité et ainsi mieux comprendre et exploiter les données générées - déterminer le profil d’exposition optimal pour avoir une activité antitumorale (via l’utilisation de pompes implantées en sous-cutanée chez la souris) - investiguer la persistance d’efficacité du traitement sur la réponse immunitaire grâce à la réimplantation en contra-latéral de la même lignée tumorale après observation d’une régression tumorale complète de la greffe initiale (« rechallenge ») - étudier la formation de métastases suite à une greffe en sous-cutanée, en intradermique ou intra-mammaire et leur sensibilité au traitement.

Procédures

- Ponction à la veine jugulaire (durée 5 minutes) : 1 prélèvement de sang au dernier jour de traitement (ou en cours de traitement), sous anesthésie gazeuse, à raison de 10% du volume total de sang en 1 fois (pour les analyses de pharmacocinétique, pharmacodynamie ou biomarqueurs). Ex : 158µL pour une souris de 25g - Ponction cardiaque ou veine cave (durée 5 minutes): 1 prélèvement de sang en procédure terminale, sous anesthésie gazeuse et suivie par l’euthanasie de l’animal (pour les analyses de pharmacocinétique, pharmacodynamie ou biomarqueurs). Ex : 500µL/souris « Microsampling » (durée environ 1 minute) : prélèvements de sang, en cinétique (Ex 1 : 6 temps/ prélèvements de 40µl sur une semaine), à la veine marginale latérale du membre inférieur sur animal vigile, au maximum 1 fois par semaine, en ne dépassant pas la limite totale cumulée de 15% du volume total de sang circulant sur 28 jours (pour les analyses de pharmacocinétique, pharmacodynamie ou biomarqueurs) -Eventuellement, prélèvement de la tumeur primaire (durée 15-20 minutes) (sous anesthésie gazeuse et analgésie pré et post opératoire) dans le cas de lignées métastatiques greffées en sous-cutanée, en intradermique ou en intramammaire pour évaluer l’efficacité anti-métastatique du composé -Dans le cadre de l’implantation d’une pompe (durée 15 minutes si implantation en SC , et 1 heure si cathéter en IV), les animaux seront sujets à une intervention chirurgicale. Les conditions adaptées d’anesthésie et analgésie seront appliquées de façon à réduire autant que possible la douleur.

Impact sur les animaux

Le but du projet étant d’étudier l’activité antitumorale de nos candidats médicament dans des modèles relevant de la pathologie, les souris reçoivent une greffe de cellules cancéreuses ou de fragments tumoraux sous la peau qui vont développer une tumeur de taille limitée à 1000 ou 2000 mm3 selon la procédure mise en œuvre. Concernant les traitements pharmacologiques, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet). Cependant, selon la cible du candidat médicament, même à des doses tolérées dans l’absolu, il peut y avoir une toxicité allant de faible à modérée. En effet, même si les efforts pour identifier des thérapies ciblées sont nombreux, les cellules tumorales sont à l’origine des cellules normales du soi : il est donc très difficile de trouver des traitements qui affectent uniquement les cellules cancéreuses en épargnant complétement les tissus sains. L’administration des candidats traitements pourra être effectuée via une pompe implantée sous chirurgicalement sous la peau du dos. Enfin, ce projet peut nécessiter l’utilisation de souches de souris transgéniques ou mutantes leur conférant un statut immunodéprimé. Ce statut peut être considéré comme un phénotype dommageable mais non exprimé dans des conditions d’hébergement protégées de l’environnement extérieur strictes.

Devenir

A l’issue de toutes les procédures décrites dans ce projet, les animaux inclus dans l’étude seront euthanasiés, soit par dislocation cervicale, soit par inhalation de CO2. Eventuellement, un prélèvement de sang via une ponction cardiaque, à la veine jugulaire ou à la veine abdominale (sous anesthésie gazeuse) pourra être effectué au préalable. Les animaux ne rentrant pas dans les critères d’inclusion le jour de la randomisation pourront être réutilisés dans un autre projet, dans la mesure du possible et à la suite d’une validation par SBEA et/ou vétérinaire de leur bon état général. Il se peut que quelques souris supplémentaires (non incluses dans la randomisation) soient traitées avec le composé à tester pour faire une caractérisation biochimique et/ou moléculaire des tumeurs en ex vivo.

Remplacement

Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse, son comportement dans un système complexe et plus relevant d’un point de vue physiologique, ses potentiels effets secondaires.

Réduction

Avant la mise en oeuvre de ce projet, des tests in vitro et in vivo sont systématiquement effectués afin de sélectionner les meilleurs composés à investiguer. des screenings biochimiques et cellulaires vont permettre d’identifier les molécules inhibant la cible de manière spécifique et ayant une puissance cellulaire satisfaisante. Des tests ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme et Elimination) sont ensuite effectués in vitro puis in vivo pour identifier et sélectionner les produits circulants avec une exposition suffisante dans l’organisme. Enfin, on s’assure qu’ils atteignent bien leur cible d’intérêt et induisent l’effet escompté via des études de pharmacodynamie. C’est seulement après ces étapes que l’on peut évaluer leur efficacité antitumorale. Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de définir au préalable les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires. C’est seulement sur la base de ces données que les études d’efficacité antitumorale sont ensuite réalisées : uniquement les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Les doses de produits à administrer à l’animal sont également sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. La progression tumorale (volume tumoral) est mesurée via le pied à coulisse et permet un suivi dans le temps sur les mêmes animaux. Des prises de sang en « microsampling » (c’est-à-dire sur des petits volumes) peuvent aussi être effectuées au cours de l’étude afin d’analyser des biomarqueurs ou le profil d’exposition du composé (évitant aussi de faire des études de pharmacocinétique complémentaires) et ainsi optimiser les données d’activité antitumorale. Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires par groupe avant le début de l’expérimentation avec le support de l’équipe biostatistique. Ce nombre d’animaux nécessaires par groupe pour évaluer l’efficacité d’un candidat sera estimé par simulation avec un modèle statistique longitudinal.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les souris sont hébergées avec un enrichissement de milieu adapté de manière à favoriser leur instinct de nidification. il va également permettre de surveiller l’état général des animaux par observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci. La croissance tumorale, mesurée au moyen d’un pied à coulisse non invasif et indolore pour l’animal permet une caractérisation et un suivi de l’évolution de la tumeur dans le temps pour un même animal et ainsi une réduction de nombre d’animaux nécessaires à la conduite d’une étude. L’état général des souris est surveillé régulièrement et les volumes tumoraux sont mesurés au minimum 2 à 3 fois/semaine, pour l’objectif de l’étude et pour identifier les éventuels signes de souffrance et appliquer les points limites prédéfinis dès que nécessaire. Ces mesures sont effectuées sous anesthésie gazeuse en cas de pompe pré-implantée (procédure 2) pour éviter l’inconfort de l’animal lors de la contention. Au-delà de 1500 mm3, pour les tumeurs sous cutanées et 1000 mm3, pour les tumeurs intra-mammaires, une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures est mise en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite lié au volume tumoral. L’exérèse de la tumeur lorsqu’elle a lieu (procédure 1) et l’implantation de la pompe (procédure 2) sont effectuées selon les bonnes pratiques chirurgicales avec un protocole anesthésique et analgésique pré et post opératoire adapté, et une observation spécifique sur plusieurs jours jusqu’au rétablissement total. Le point limite de croissance tumorale est fixé à 1000mm3 afin de limiter la charge liée au dispositif cumulée à une tumeur. Au-delà de 600mm3, une surveillance spécifique avec une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures est mise en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite. Les prélèvements de sang en « microsampling » sont privilégiés dès que possible (très petits volumes sanguins) et ne dépassent pas le volume maximal respectant le bien etre animal (maximum 15% du TBV (Total Volume Blood) sur 28 jours).

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche préclinique. Le choix du modèle est dicté par le type d’anti-cancéreux étudié (souris immunocompétentes et/ou immunodéprimées) et le choix de la souche par les études de prise tumorale qui permettent de déterminer, en amont, tous les paramètres in vivo (taux de prise, temps de doublement, caractère éventuellement cachectique de la tumeur sur la souche, etc…) et ainsi définir les conditions optimales de greffe. La souche est conservée pour l’ensemble des études in vivo pour une tumeur donnée (DMA/DMT, pharmacocinétique, pharmacodynamie, efficacité). En effet, des différences importantes en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit en fonction de la souche murine peuvent exister, ce qui pourrait impacter le bien-être des animaux ainsi que l’interprétation des résultats. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Pour la procédure 2, compte tenu du volume de la pompe, les animaux sont utilisés le jour de la chirurgie à un poids > à 25 g.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur provoque une inflammation du côlon par le dextran sulfate de sodium, administre par gavage un antagoniste des récepteurs cannabinoïdes pendant sept jours et prélève du sang par voie submandibulaire à plusieurs reprises. Toutes sont mises à mort par ponction intracardiaque terminale pour prélever côlon, rate et foie. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser cette inflammation in vitro et s'appuie sur une lignée transgénique fat-1.

Objectifs

L’inflammation colique correspond à une inflammation de la muqueuse du côlon se traduisant par différents troubles intestinaux. Elle est particulièrement associée à la présence de diarrhée et de douleurs abdominales. Les médicaments actuels permettent la plupart du temps leur contrôle durable. Cependant, plusieurs pistes de recherche sont actuellement explorées afin d’améliorer la prise en charge des patients. En particulier, un rééquilibrage alimentaire permettant d’améliorer le ratio acides gras oméga6/oméga3 est à l’étude. La souris transgénique fat-1 (le gène fat-1 code pour une désaturase permettant de convertir les oméga6 en oméga3) présente de fait un enrichissement tissulaire en oméga3 aux dépens des oméga6, conduisant à une diminution drastique du rapport tissulaire oméga6/oméga3 comparativement aux souris sauvages (WT) ce qui en fait un modèle d’étude tout particulièrement intéressant pour l’étude des effets bénéfiques des oméga3. Ces souris fat-1 sont protégées d’une colite induite par le Dextran Sodium Sulfate (DSS), contrairement aux WT. Ainsi, un enrichissement tissulaire en oméga3 pourrait représenter une cible potentielle dans la prévention de l’inflammation colique. Par ailleurs, le système endocannabinoïde et plus particulièrement le récepteur CB1R est impliqué dans de nombreuses pathologies présentant une composante inflammatoire comme l’obésité, le diabète, ou encore le syndrome du côlon irritable . Il a été récemment suggéré que la modulation des composants du système endocannabinoïde et de CB1R en particulier pourrait présenter certains bénéfices pour la prise en charge du syndrome du côlon irritable. Ce syndrome du côlon irritable étant associé à une inflammation colique, nous pensons que le blocage des récepteurs CB1R à l’aide d’un antagoniste pourrait avoir un effet bénéfique sur l’inflammation colique. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la contribution relative et/ou synergique des acides gras polyinsaturés en n-3 (oméga3) et des récepteurs aux endocannabinoïdes sur la prévention de l’inflammation colique dans un modèle de colite chimiquement induite par le DSS.

Bénéfices attendus

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, maladie de Crohn et rectocolite hémorragique, se caractérisent par l’inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire. S’il n’existe pas de traitement pour guérir ces maladies, les médicaments actuels permettent la plupart du temps leur contrôle durable et une qualité de vie satisfaisante en dehors des poussées. Ce projet a pour but de déterminer une éventuelle contribution relative et/ou synergique des acides gras polyinsaturés en n-3 (oméga3) et du blocage pharmacologique des CB1R sur la prévention de l’inflammation colique dans un modèle de colite chimiquement induite. Cela permettrait de mettre en évidence le potentiel d’un rééquilibrage alimentaire (supplémentation en oméga3) couplé à une nouvelle classe de composé pharmaceutique (antagonistes CB1R) en cours d’évaluation clinique pour de nombreuses pathologies présentant un profil pro-inflammatoire comme l’obésité, le diabète ou encore la néphropathie diabétique.

Procédures

Les animaux seront manipulés quotidiennement pendant toute la durée des traitements (7 jours) afin d’évaluer leur masse corporelle et leur prise alimentaire. De plus, • un prélèvement sanguin de 50 μl sera réalisé au niveau de la région submandibulaire à J0, J4 et J6 pour chaque souris. Durée 1minute • L’antagoniste aux récepteurs CB1, sera administré quotidiennement pendant une durée de 7 jours par gavage à raison de 10mg/kg de poids corporel. Durée 30 secondes un prélèvement terminal sera effectué à J7 via ponction intracardiaque. Aucune durée, procédure entraînant le décès de l’animal. Aucune procédure chirurgicale n’est prévue.

Impact sur les animaux

Les conditions expérimentales utilisées peuvent entraîner de la douleur chez l’animal. Pour cela, un scoring sera établi et pour quantifier cette douleur/souffrance une observation générale quotidienne des animaux et de leurs excréments sera réalisée. Ainsi, si une souris est en souffrance nous pourrons agir rapidement. Pour le prélèvement de sang en région submandibulaire et les gavages orogastriques, le personnel maitrise très bien ces gestes techniques et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements de différents tissus (colon, iléon, rate, foie....).

Remplacement

Le protocole vise à étudier les mécanismes impliqués au cours de l’inflammation colique. Cette pathologie faisant intervenir une interaction complexe entre le côlon et les cellules du système immunitaire, il est impossible de complètement modéliser ce processus à travers d’approches in vitro. De même, compte-tenu de la complexité de cette pathologie, l’utilisation de modèles animaux dont le système immunitaire est trop éloigné de celui des mammifères est exclus. C’est pourquoi nous utiliserons la souris, pour des raisons de facilité d’élevage et surtout de l’existence du modèle transgénique fat-1.

Réduction

Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature et les différences attendues entre les différents groupes pour les paramètres clés-de l’étude. Lors de la conception du protocole expérimental nous avons déterminé le nombre de 10 animaux par groupes nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables.

Raffinement

La souris est un animal vivant en groupe, elles seront donc plusieurs par cage pour éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher

Choix des espèces

La détermination de l’impact du DSS couplé ou non à l’administration d’un antagoniste CB1R est primordiale à notre étude. Cet aspect ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux afin de mimer au mieux un contexte d’inflammation intestinale. Bien que relativement éloignée de l’Homme, l’espèce murine est l’espèce animale de référence dans ce domaine de recherche et la plus utilisée en recherche préclinique avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le modèle de souris transgénique fat-1 est un modèle précieux qui rend cette étude unique dans l’approche de l’impact des oméga3 sur la prévention de l’inflammation colique. Stade adulte (8 semaines d’âge). La réponse inflammatoire chez la souris est affectée par l’âge ce qui se traduit par une certaine tolérance aux endotoxines, l’installation d’une inflammation chronique et une diminution de la sécrétion de cytokines proinflammatoires d’où la nécessité d’utiliser des animaux plutôt jeunes et d’âge homogène

5 070 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur greffe sous la peau des cellules de cancer du sein, puis leur administre chaque jour une à trois molécules inhibitrices, les souris étant mises à mort dès que la tumeur dépasse 2 000 mm³ ou en cas de perte de poids supérieure à 20 %. Les prélèvements sont réalisés post-mortem. Il affirme que les essais in vitro déjà menés ne suffisent pas et que l'étape chez l'animal reste "indispensable" au développement des médicaments.

Objectifs

Nous avons identifié un onco-métabolite qui stimule la prolifération des cellules mammaires expriment le récepteur des estrogènes (RE+) ou ne l’exprimant pas (triple négatif ou TN) in vitro et in vivo. In vitro, nous avons récemment caractérisé les voies de signalisation qui participent au développement tumoral induit par cet onco-métabolite et les voies métaboliques qui induisent la production de cet onco-métabolite. Nous avons caractérisé différents acteurs impliqués dans les voies de signalisation et de production cet onco-métabolite dont le ciblage par des inhibiteurs bloque la prolifération tumorale des cellules tumorales mammaires RE+ ou TN. Nous avons caractérisé un analogue phytostérol cet onco-métabolite qui cible les mêmes voies de signalisation mais qui a une activité anti-mitogène in vitro. Nous avons caractérisé une nouvelle cible thérapeutique (C1) qui médie les effets pro- et anti-prolifératifs de ces deux molécules in vitro. Les objectifs du projet consisteront i) à valider in vivo l’implication de la cible C1 dans les effets mitogènes de cet onco-métabolite et anti-mitogène de l'analogue phytostérol de cet onco-métabolite en utilisant des modèles de cellules KO pour la cible C1 (KOC1) en comparaison avec des cellules non KO (WT et mock), ii) à étudier l’effet des différents inhibiteurs ciblant différents acteurs des voies de signalisation ou production de cet onco-métabolite, seul ou en association, sur le développement de différents modèles de cancers mammaires RE+ et TN, implantées chez la souris, traités ou non par cet onco-métabolite. Nous utiliserons différentes lignées tumorales commerciales exprimant les cibles d’intérêts (WT et mock) ou déficientes pour le gène d’intérêt (KOC1).

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de valider, in vivo, le ciblage thérapeutique de deux nouvelles voies impliquées dans la signalisation et la production d’un onco-métabolite induisant la prolifération des cancers du sein RE+ et TN ainsi que l’efficacité de différents inhibiteurs ciblant différents acteurs de ces deux voies, seul ou en association, sur le développement de différents modèles de cancers mammaires RE+ et TN. Les bénéfices seront de pouvoir publier dans un article scientifique les résultats de ce projet et d’en faire bénéficier la communauté scientifique. A terme, ce projet permettra de proposer des traitements ou combinaison de traitements pour ces cancers qui représentent la première cause de mortalité chez la femme.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront : l'injection en sous cutanée des cellules tumorales pour établir une tumeur : 1 injection / expérience (Exp 1 à Exp 3), avec une durée de 1 min/ souris; Traitement avec une molécule: 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 1 min/souris. Traitement avec deux molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 2 min/souris. Traitement avec trois molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 3 min/souris. Les prélèvements se feront post-mortem.

Impact sur les animaux

L'onco-métabolite, à la dose qui sera utilisée, a été testé in vivo sur plusieurs modèles de cancers mammaires RE+ et TN et aucun effet indésirable n'a été observé. Les inhibiteurs inhS1 à inhS5 et inhP1 ont déjà été utilisés in vivo sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées. Les autres inhibiteurs n’ont pas encore été testés in vivo. Dans tous les cas, pour chaque traitement ou combinaison de traitements, nous serons vigilants et nous surveillerons de façon quotidienne les animaux afin de s’assurer que les inhibiteurs n’auront pas d’effets indésirables et ne provoquerons pas de souffrance.

Devenir

Procédure 1: garder en vie 5070 souris. Procédure 2: mise à mort à la fin des expériences

Remplacement

Des expériences in vitro sur les cellules utilisées dans ce projet ont été préalablement réalisées avec l'ONCO seul ou en association avec les inhibiteurs, qui seront testés in vivo, pour s'assurer de la pertinence d'étudier ces inhibiteurs sur la croissance tumorale chez la souris. Cependant ces expériences ne sont pas suffisantes et nous devons avoir recours à l’utilisation de souris afin de montrer l’efficacité des molécules testées dans un modèle animal. Les études précliniques chez l’animal sont des étapes indispensables dans le développement des médicaments pour démontrer leur efficacité.

Réduction

Le nombre de souris utilisées sera le nombre d’animaux qui permettra de mener à bien ce projet et d’avoir des résultats significativement exploitables pour permettre d'avoir un suivi de la réponse anti-tumorale au cours du temps et de pouvoir être publié dans un article scientifique.

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général, pesée) afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur. Si une souffrance est observée, un traitement mis dans l’eau de boisson pour éliminer la douleur sera mis en place sous prescription du vétérinaire de l’animalerie. Si des symptômes correspondants à des critères d’arrêt de l’expérience (voir ci-dessous) sont observés, Les souris seront anesthésiées en injectant un mélange de kétamine plus xylazine (50 mg + 5 mg /kg, i.p.) puis mises à mort en injectant une solution de pentobarbital (150 mg/kg, i.p.). De même, les animaux seront mis à mort si la tumeur atteint un volume supérieur à 2000 mm3. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance et procédure d’urgence en cas de dégradation rapide de l’état d’un animal : Les critères d’arrêt de l’expérimentation établis afin de minimiser la souffrance et/ou la détresse des animaux sont les suivants : Perte de poids > 20 % du poids initial ; en particulier, une maigreur extrême des animaux sera définie comme critère d’arrêt.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et permet de comparer les effets obtenus à d’autres molécules développées dans d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude de cette espèce comme les anticorps ou les microarrays. Les souris sont achetées à l’âge de 5-6 semaines et greffées après la période d’acclimatation. Les souris sont adultes lorsqu’elles sont traitées.

640 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur greffe sous la peau une membrane synoviale humaine inflammatoire, puis teste des molécules contre les rhumatismes, une déchirure du tissu cutané pouvant provoquer douleur, prostration et isolement dans les jours suivant la chirurgie. Toutes sont euthanasiées pour prélever les tissus. Il affirme que la culture de membrane synoviale ne suffit pas et que la souris Nude est un "modèle de choix" pour accepter le greffon humain.

Objectifs

Les maladies rhumatismales restent parmi les premières causes d’incapacité au rang mondial. A l’échelle de la France, la Polyarthrite Rhumatoïde est par exemple, le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques. L’arthrose quant à elle, est la maladie articulaire la plus répandue et concerne plus de 10 millions de français. Les mécanismes de ces maladies sont encore mal connus et malgré l’existence de traitements qui sont en grande partie symptomatiques, la recherche reste très importante afin d’atténuer ce fléau. C’est dans ce cadre que le projet porte sur l’étude de molécules capables d’inhiber le développement, l’infiltrat de cellules immunitaires et l’inflammation d’un des tissus cibles dans les rhumatismes inflammatoires, qui est la membrane synoviale. En effet, la prise en charge des patients atteints de Polyarthrite Rhumatoïde (PR), Arthrose (OA) ou Synovite VilloNodulaire (SVN) est insuffisante avec de nombreux patients non répondeurs aux thérapeutiques actuelles. Il s’agit ici, de tester l’efficacité de molécules ou d’améliorer les effets de molécules déjà utilisées en clinique, via des modes d’administration différents, chez un modèle de souris immunodéficiente recevant un greffon humain de membrane synoviale inflammatoire, en sous-cutané. En fonction des molécules testées, les voies d’administration recommandées par le fournisseur seront suivies, ou de nouvelles voies seront explorées, afin d’augmenter l’efficacité des traitements tout en diminuant les effets secondaires, pour être proposées dans des essais cliniques humains.

Bénéfices attendus

La prise en charge des patients atteints de Polyarthrite Rhumatoïde, Arthrose ou Synovite VilloNodulaire est insuffisante avec de nombreux patients non répondeurs aux thérapeutiques actuelles. Ce projet permettra de mettre en évidence l’efficacité de nouveaux traitements contre ces maladies rhumatismales mais également d’explorer de nouvelles voies d’administration de composés déjà connus, permettant un effet similaire sur la résolution de l’inflammation synoviale tout en diminuant les effets secondaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique chirurgie consistant en une greffe de membrane synoviale humaine sous la peau effectuée dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et traitement anti-douleur pré et post-opératoire. Puis 2 semaines après cette chirurgie, un composé unique sera testé pour un groupe donné de souris. La voie d’administration variera en fonction de la voie de référence fournie par le fournisseur ou pourra être modifiée afin d’évaluer son efficacité par rapport à celle originelle. La fréquence d’administration pourra elle aussi varier et s’effectuera toujours chez des animaux vigiles. Ces traitements seront effectués sur une période de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Dans les trois premiers jours suivant la chirurgie, si de la douleur est ressentie par l’animal celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Cette douleur pourrait être notamment causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant la chirurgie lors de l’introduction du greffon dans la cavité. Cependant, une surveillance quotidienne des animaux pourra permettre de repérer ces comportements et de prolonger le traitement analgésique si nécessaire. De plus, une infection pourrait intervenir au niveau des sutures post-chirurgicales. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué, réponse comportementale aux stimuli et évaluation du site chirurgical/injection) seront attentivement pointés.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter des tissus et procéder à des analyses.

Remplacement

Les maladies rhumatismales sont des maladies complexes impliquant différents tissus au sein des articulations concernées à savoir, le tissu osseux, le tissu cartilagineux, la membrane synoviale. Le tissu qui nous intéresse particulièrement ici concerne la membrane synoviale. Bien que celle-ci peut être utilisée en culture afin de tester quelques molécules d’intérêt thérapeutique par diffusion passive, cela ne permet pas de l’intégrer dans un système biologique afin de mesurer son effet selon différentes voies d’administration. Le recours au souris Nude ayant une immunité réduite, est un modèle de choix pour l’acceptation du greffon humain sans souci de rejet.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà effectuées, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum (8 par groupe) mais suffisant pour démontrer des différences statistiquement significatives entre les groupes. Les molécules candidates sont préalablement testées in vitro sur des modèles de cellules en culture afin de limiter leur nombre et donc le nombre de groupes de souris.

Raffinement

La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de quelques minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les souris seront ensuite transférées dans une cage également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, au maximum 5 souris seront hébergées par cage afin de leur fournir un espace suffisant pour cohabiter sans encombrement et le milieu sera enrichi de litière mais également de dômes et de papier afin d’y construire un nid. Le suivi de l’évolution de la taille du greffon se fera avec un pied à coulisse et par échographie, de façon précise et reproductible, non invasive pour l’animal. De plus, les administrations orales des composés se feront au maximum par prise spontanée à l’aide de composés appétants afin de limiter le traumatisme éventuel lié au gavage.

Choix des espèces

Les souris NMRI Nude permettent la greffe de tissu humain en évitant les phénomènes de rejet et constituent un modèle reconnu en tant que modèle de xénogreffe (= greffon provenant d’une espèce biologique différente de celle du receveur). De plus, l’utilisation de cette espèce est décrite dans la littérature et a déjà été utilisée et validée au sein de cet établissement utilisateur. Des souris âgées de 8 semaines seront réceptionnées à l’animalerie, considérées comme adultes afin de mimer au mieux les rhumatismes qui se développent chez l’adulte. Après réception, les souris sont utilisées après une semaine d’acclimatation (9 semaines).

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur implante par chirurgie un capteur d'électrocardiogramme, leur administre par gavage des molécules anticancéreuses connues pour leur cardiotoxicité et suit leur cœur par échocardiographie sous sédation. Toutes sont ensuite euthanasiées pour prélever le cœur. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne remplace l'étude du cœur dans un organisme "entier", tout en menant en parallèle des travaux sur cardiomyocytes issus de cellules humaines.

Objectifs

Le projet consistera à évaluer de nouvelles options thérapeutiques pour traiter le cancer. Il concerne le développement d’approches basées sur la nanotechnologie, en particulier l’incorporation des molécules dans des formulations nanostructurées. Il s’agira d’étudier les effets bénéfiques espérés de deux nouveaux systèmes de vectorisation pour une molécule déjà utilisée dans la maladie de Chagas et repositionnée pour traiter le cancer, et pour une autre molécule de référence très efficace mais cardiotoxique. Nous évaluerons les effets bénéfiques des deux formulations chez la souris.

Bénéfices attendus

La nanomédecine est une stratégie innovante émergente. Elle vise à mieux contrôler le niveau plasmatique de médicaments et à réduire leur toxicité tout en préservant leur efficacité. Par exemple, des molécules incorporées dans des nanostructures séjournent plus longtemps dans l´organisme ; ce qui améliore leur efficacité à dose plus faible et leur tolérance. L’un des deux médicaments testés est déjà utilisé pour traiter la maladie de Chagas. Il est actuellement évalué dans une stratégie de repositionnement comme traitement d'appoint anticancéreux. Son incorporation dans dans une formulation nanostructurée est prometteuse. Nous comparerons les effets de ce médicament nanoformulé avec ceux d’une molécule de référence, qui sera elle aussi nanoformulée pour supprimer ou atténuer sa cardiotoxicité latente. Nous déterminerons la meilleure option thérapeutique possible pour traiter le cancer. A notre connaissance, il n'y a aucune étude équivalente à l'heure actuelle.

Procédures

Les animaux auront deux à trois échocardiographies (de 15 à 20 minutes chacune) au cours des traitements et, si nécessité de suivre une évolution de leur statut cardiaque, entre une et trois échocardiographies en post-traitement. Les enregistrements se font sous anesthésie légère et sont non-invasifs. L’acquisition d’ECG se fera en ambulatoire (animal vigile, libre de mouvement, dans son environnement) avant et au cours du traitement. Il n’y a aucun intervention particulière (enregistrement neutre pour l’animal). Une chirurgie préalable est réalisée en amont (10 jours avant le premier enregistrement) pour l’implantation du capteur-émetteur de l'ECG.

Impact sur les animaux

Les traitements administrés sont une source potentielle d’effets indésirables chez les animaux. Nous limiterons ces nuisances par un traitement à une dose moyenne et de durée minimale permettant toutefois d’avoir un effet détectable, quantifiable, et actionnable avec des points limites bien définis. L’une des molécules testée est utilisée chez l’homme pour traiter la maladie de Chagas, elle-même source d’insuffisance cardiaque et d’arythmies. Sa cardiotoxicité est donc difficile à apprécier et donc peu documentée. Nous avons montré des effets cellulaires qui pourraient, possiblement, affecter la contraction cardiaque et induire des troubles du rythme. La cardiotoxicité subclinique de l’autre molécule testée, mieux connue chez l'homme, est définie par échocardiographie cardiaque. Elle est donc plus ou moins attendue chez la souris et devra être surveillée. Il est à noter que les deux formulations avec ces deux molécules sont censées diminuer toute toxicité éventuelle. Le gavage peut également une cause de stress qui peut cependant être limité (brièveté de l’acte, expertise de l’expérimentateur). L’échocardiographie est une méthode de choix pour l’exploration indolore de la morphologie et de la fonction cardiaque in-vivo. Elle est non-invasive. Elle permettra de caractériser la fonction cardiaque in-vivo et rend possible un suivi des animaux au cours du temps. Le stress subi par les animaux se limite à la manipulation (période courte, 10 min/animal). Une sédation légère permet l’obtention d’images échocardiographiques de qualité (rythme cardiaque proche de la physiologie). Concernant l'enregistrement des ECG par télémétrie, l’animal est vigile et maintenu dans son environnement habituel, sans stress. Cette approche permet de gérer de façon optimale la période post-opératoire après implantation des capteurs de télémétrie. La nuisance que représente l'étape chirurgicale au cours et après l'implantation sous-cutanée des capteurs est prise en charge par sédation/analgésie. Le bénéfice expérimental inclut l’absence d’interférence liée à une anesthésie pratiquée au cours de l’étude, sans limitation de la durée d’observation, avec un accès aux périodes diurnes et nocturnes, une qualité supérieure du signal, et une diminution des artéfacts.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin des procédures pour prélever le coeur à des fins d'études in vitro (électrophysiologie, biochimie, histologie).

Remplacement

L'une des deux molécules testées est un médicament anticancéreux de référence, mais entaché d’effets cardiotoxiques. Des approches in-vitro et in-vivo ont permis d’envisager l’utilisation d'une autre molécule déjà utilisée pour traiter la maladie de Chagas. L’évaluation d’éventuels effets cardiotoxiques est fondamentale pour poursuivre cette piste. Des études antérieures, réalisées dans notre laboratoire, ont montré des effets cellulaires pouvant être source d'arythmies cardiaques in vivo. Il n'existe actuellement aucune méthode (in-vitro ou in-silico) de substitution idéale pour l’évaluation des effets cardiaques dans un organisme « entier ». Le cœur est un organe complexe, en interaction avec de nombreux autres systèmes (systèmes nerveux autonome, neuroendocrines, etc…). L'approche in vivo est donc nécessaire pour étudier des molécules libérées à partir de nanostructures comme cela est notre cas. Nous comparerons les effets potentiels de notre molécule d'intérêt repositionnée avec ceux de notre molécule anticancéreuse de référence, après incorporation dans des nanostructures censées diminuer leur cardiotoxicité. En parallèle, nous mènerons des études mécanistiques sur des cardiomyocytes dérivés de cellules iPS humaines pour limiter les investigations chez l’animal. Les données seront replacées dans leur contexte d'utilisation et des connaissances acquises in-vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des informations fiables et robustes, nous utiliserons deux techniques de choix utilisées chez l’homme en clinique : l’électrocardiograhie (ECG) et l’échocardiographie. Elles permettent un suivi de la fonction cardiaque au cours du temps. Cela permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés pour des mesures répétées et peu, voire non-invasives, au cours du temps. Les animaux ne sont pas sacrifiés après chaque examen (étape) nécessaire à l’étude. Chaque animal est son propre témoin. Le protocole expérimental a été conçu à partir d'études précédentes similaires. Pour limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, nous étudierons aussi les effets électrocardiographiques avec une méthode d’enregistrement simplifiée de l’ECG. Cette approche a de nombreux avantages : elle est techniquement simple, peu coûteuse, avec un court temps de mesure et facile à mettre en œuvre pour un dépistage d’altérations évidentes. En cas d’altérations significatives, et seulement si, une mesure d'ECG en ambulatoire (sur des animaux vigiles) serait alors mise en œuvre pour approfondir les effets. Notre expérience et une analyse statistique a permis de définir le nombre minimum mais suffisant d'animaux nécessaire dans chaque groupe expérimental pour les deux procédures. Chaque animal étudié sera utilisé en fin de protocole après sacrifice pour mesurer des caractéristiques histologiques, biochimiques et moléculaires. Les données numériques seront moyennées +/- l'écart-type. Nous exécuterons un test normalité de D'Agostino-Pearson (symétrie et distribution Gaussienne) pour chaque ensemble de données indépendantes avec une analyse des variances pour les comparaisons par one-way ANOVA et un test post-hoc (Bonferroni or Tukey) pour comparer les paires de données.

Raffinement

Nous réaliserons des approches in-vivo non invasives et performantes (échocardiographie, électrocardiographie) utilisées chez l’homme afin de transférer les résultats et les connaissances acquises vers la clinique. Nous veillerons à maintenir les meilleures conditions de vie possibles pour les animaux tout au long du protocole, ce qui garantira aussi la qualité et la pertinence des résultats scientifiques acquis. Notre objectif est également de réduire au strict minimum la quantité de détresse imposée aux animaux. Cela inclut la réduction des contraintes pour les animaux, à savoir en matière de stress (ex : période de « repos » après le transport), douleurs éventuelles (soins adéquats avant, pendant et après l’implantation des capteurs de télémétrie ; anesthésie/analgésie), enrichissement du milieu (jouets, tunnel, cell nest; carrés de coton pré-découpés, etc…) pour répondre à leurs besoins physiques et comportementaux, détresse éventuelle, points limites et arrêt anticipé de la procédure en particulier si des effets indésirables intervenaient durant le protocole.

Choix des espèces

Les modèles murins sont utilisés en laboratoire pour des études pré-cliniques, et en particulier pour des investigations pharmacologiques. D’une manière générale, le modèle souris est de très loin le plus utilisé de tous les modèles animaux. Les paramètres cardiaques morphologiques et fonctionnels chez la souris normale sont parfaitement connus, à la fois au laboratoire et via une bibliographie abondante; ce qui élargit les possibilités de comparaison et d’interprétation des résultats avec les études déjà effectuées dans le domaine. Nous utiliserons des souris Swiss, une souche hétérogène avec un pourcentage élevé d'hétérozygotie au niveau des allèles, car elles imitent le mieux la variabilité génétique de la population humaine typique. Les animaux seront réceptionnés au stade adulte, à 2 mois. Ils seront utilisés après la phase d'adaptation dans l'animalerie. Le stade choisi rend plus précises les investigations échocardiographiques et l'implantation des capteurs de télémétrie pour l'ECG (taille de l'animal).