Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 09/07/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-975316)
1 064 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 322 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La création de la lignée passe par deux générations d’accouplements, une biopsie d’identification sur chaque animal, une chirurgie de trente minutes sur quatorze femelles gestantes, et une chirurgie sans réveil sur jusqu’à 140 souriceaux pour préparer des tissus. Le porteur reconnaît ne pas savoir quelles atteintes attendre puisque la lignée n’existe pas encore, et avance comme hypothèses la mortalité embryonnaire ou périnatale, le retard de croissance et l’hydrocéphalie, l’électroporation des embryons pouvant à elle seule en tuer un dixième. Aucun calcul de puissance n’était possible pour la même raison, et le porteur conclut qu’un modèle murin est « nécessaire » pour compléter des expériences déjà menées en culture cellulaire et in silico.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les troubles du neurodéveloppement (TND) concernent près d’une naissance sur 10 dans les pays développés. Ils constituent un groupe hétérogène d’atteintes du développement du système nerveux qui regroupe des maladies souvent invalidantes et avec peu de perspectives thérapeutiques, tels que des syndromes de retard mental, ou des déficits musculo-squelettiques. Les TNDs sont très fortement influencées par la génétique, mais plusieurs centaines de gènes de prédisposition ont été identifiés, ce qui rend indispensable la compréhension de la fonction de ces gènes pour trouver les dénominateurs communs expliquant la symptomatologie et les pistes thérapeutiques potentielles. Ce projet a pour finalité de créer des modèles de souris pour étudier une maladie causée par la mutation d’un gène qui a jusqu’à présent quasi exclusivement été étudié dans le contexte de son rôle dans la progression tumorale. Les fonctions de ce gène dans le développement du système nerveux et musculaire sont pour l’heure quasiment inconnues. L’objectif est de caractériser les fonctions de ce gène dans les neurones et les muscles pour comprendre la pathologie humaine. Pour cela, en collaboration avec une équipe américaine, nous allons générer une lignée de souris dite KO spécifique (uniquement dans les neurones) et caractériser cette lignée. Nous utiliserons également des souris pour des études cellulaires et pour des procédures chirurgicales pour étudier la connectivité cérébrale. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU) où auront lieu respectivement l’élevage et la production des animaux, et le prélèvement de tissus.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra de mieux comprendre les causes du syndrome de retard mental en identifiant les fonctions du gène d’intérêt de l’étude, fonctions qui sont pour l’instant inconnues. Ces données permettront de mieux comprendre l’évolution de la maladie et d’améliorer le conseil génétique fourni aux familles de patients. Grâce au contact avec une association de patients, les connaissances issues de ce projet bénéficieront directement aux patients. De façon plus large, ce projet permettra de mieux comprendre les bases du développement cérébral et fournira des hypothèses pour d’autres maladies (retard mental etc…) causées par des mutations dans des gènes proches du gène d’intérêt.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Le projet comprend la création d’une nouvelle lignée qui implique des accouplements pour créer les animaux (2 générations), puis des accouplements réguliers pour produire les animaux (nombre variable, étalé sur la durée du projet). Les animaux seront manipulés quotidiennement pour des observations non invasives et pesées. Des animaux seront mis à mort pour du prélèvement de tissus. Des animaux (14 femelles au maximum) subiront une procédure chirurgicale, d’une durée de 30 minutes, une fois pendant le projet. Des animaux (140 souriceaux au maximum) subiront une procédure chirurgicale sans réveil pour la préparation de tissus pour l’histologie.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
S’agissant de la création d’une nouvelle lignée, les nuisances sont inconnues. Sur la base de ce qui est connu du syndrome de retard mental chez l’homme, nous pouvons émettre l’hypothèse que les nuisances ci-après peuvent survenir : mortalité embryonnaire ou périnatale, retard de croissance, hydrocéphalie. Ces nuisances peuvent entraîner du stress lié à la compétition avec le reste de la portée pour l’accès à la nourriture. Les animaux subiront une biopsie dans le but de leur identification, qui entraîne une douleur temporaire. Les animaux seront manipulés régulièrement pour le suivi de la lignée et les accouplements, entraînant un stress léger. Des femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale avec réveil, sous anesthésie, une seule fois, d’une durée de 30 minutes. Dans de rares cas, nous pouvons observer une dystocie. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. La chirurgie peut entraîner une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons électroporés). Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU). Dans l’EU1, les animaux seront produits et manipulés. Au moment de la mise à mort, les animaux seront transférés dans l’EU2, dont les locaux sont situés à un autre étage du même bâtiment (durée de transport 2 minutes).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées et nous prédisons un phénotype dommageable. Nous ne pouvons donc pas replacer les animaux à l’issue de l’étude.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet est consécutif à des expériences in vitro du gène d’intérêt qui ont démontré son importance pour le développement des neurones. Les données in silico (études transcriptomiques) et les données de la littérature ont été croisées avec les données de patients. Il est à présent nécessaire de confirmer les fonctions de ce gène dans le développement cérébral en générant un modèle animal, qui permettra de reproduire les atteintes retrouvées chez les patients souffrant du syndrome. Ce modèle permettra à terme de réaliser des expériences qui ne peuvent pas être reproduites in vitro telles que des tests des fonctions cognitives ou du comportement social. Par ailleurs, l’architecture cérébrale (développement et connectivité des neurones corticaux) ne peut pas être complètement reproduite à l’aide des cultures d’organoides, qui ne permettent notamment pas d’étudier la connectivité cérébrale. Par conséquent, la création d’un modèle murin est nécessaire pour compléter les études in vitro déjà réalisées.
2. Réduction
Ce projet vise à créer une nouvelle lignée, par conséquent il n’est pas possible de savoir à quoi s’attendre et de faire un test de puissance statistique préalable. Pour calculer un nombre d’animaux à inclure dans le projet, des hypothèses réalistes ont été émises sur la base notamment de l’expérience préalable avec d’autres lignées. Les calculs ont été optimisés pour utiliser le moins d’animaux possibles et maximiser les informations revueillies. Selon les données collectées, nous comparerons des proportions (génotypes), ou nous comparerons des valeurs moyennes (poids en fonction de l’âge), à l’aide de tests statistiques adaptés. Concernant la génération d’animaux en vue du prélèvement de tissus, le nombre d’animaux a été calculé afin d’avoir une quantité suffisante de tissus pour conduire les expériences tout au long du projet, sans avoir d’animaux surnuméraires. Pour certaines expériences, les souriceaux seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental et de ne pas réaliser de procédure inutilement sur un souriceau qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
3. Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. Les points limites sont basés sur les phénotypes attendus d’après la pathologie chez les patients, afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, l’équipe de recherche utilise des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information concernant les patterns de connectivité corticale. Le transport des souriceaux entre établissements utilisateurs est rapide puisque les deux sont situés dans le même bâtiment. Les animaux seront placés dans une cage de transport et mis dans un sac opaque, amenés dans l’EU2 (transport 2 minutes), où la mise à mort sera réalisée immédiatement afin de limiter le stress lié à un nouvel environnement. Les animaux seront traités individuellement, pendant que le reste de la portée sera isolée dans un portoir ventilé qui procure une isolation visuelle, acoustique et olfactive.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris présente les avantages suivants : – un cerveau comparable au cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation du cortex cérébral, – un développement embryonnaire rapide (21 jours) et un développement postnatal court (21 jours pour des circuits neuronaux « matures »), – Une petite taille adaptée à des préparations histologiques, – la possibilité de modifier l’expression de gènes par croisement de lignées transgéniques déjà existantes. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines chez les mâles, 7 semaines chez les femelles) et utilisés en reproduction préférentiellement jusqu’à l’âge de 6 mois, après quoi la fertilité diminue et les animaux seront réformés. En cas de besoin les animaux pourront être mis en reproduction après 6 mois, en l’absence de reproducteurs plus jeunes disponibles. Les tissus seront prélevés à des âges standards dans la communauté scientifique, et selon les phénotypes exprimés : jour embryonnaire E15.5 , jour postnatal P1, jour postnatal P10-P12, au moment du sevrage , et au jour P45 ou au-delà. Pour les expériences de culture de cellules musculaires, les animaux seront utilisés entre le jour postnatal P4 et P7.