Maintien des lignées génétiquement modifiées

Nées de huit lignées de souris génétiquement modifiées, dont des lignées immunodéprimées, maintenues en élevage pour alimenter des projets sur la réponse immunitaire aux thérapies géniques, 32 580 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 22 230 d'entre elles seront tuées faute de porter le bon génotype ou d'être du bon sexe, 8 400 partiront vers des projets scientifiques et 1 950 resteront en vie comme reproductrices. La seule procédure déclarée est une biopsie d'oreille de moins de 2 mm au ciseau fin, sur souris éveillée, pour le génotypage. Le porteur affirme qu'"aucune méthode substitutive" n'existe pour reproduire la réponse immunitaire et que les croisements retenus imposent des génotypages auxquels il ne peut se soustraire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de produire et génotyper des animaux transgéniques (dont des modèles immunocompromis), amenés à être utilisés comme animaux d’étude dans des projets visant à mieux comprendre les réponses immunitaires induites après traitement par thérapie génique via des vecteurs viraux et à développer des approches permettant de réduire ces réponses. C’est ainsi que 8 lignées génétiquement modifiées pour différents éléments du système immunitaire sont maintenues en zone d’élevage dans cet objectif.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de fournir des animaux de génotype conforme de manière à satisfaire les besoins expérimentaux des projets d’étude de la réponse immunitaire, assurer le maintien des colonies d’élevage et de prendre à charge le phénotype dommageable des lignées concernées en conditions d’hébergement protégé. Cette demande s’inscrit plus largement dans l’étude des mécanismes de la réponse immunitaire dirigée contre des vecteurs viraux et dans le développement d’approches thérapeutiques permettant de réduire ces réponses immunitaires.

Procédures

Intervention du prélèvement pour identifier des animaux porteurs de la mutation génétique : les animaux subiront une biopsie de moins de 2 mm de diamètre à l'oreille pour le génotypage. Une paire de ciseaux fins sera utilisée à cet effet qui sera désinfectée à l'alcool et rincée à l'eau stérile entre chaque prélèvement. Cet acte est exécuté par du personnel zootechnique entraîné et ne nécessite que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La principale nuisance de ce projet est le prélèvement d’un fragment d’oreille de moins de 2mm de diamètre à des fins de génotypage. La douleur générée est considérée comme légère et passagère. Le phénotype dommageable des lignées concernées, lié au statut immunologique n’est pas exprimé dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation et ne présente de ce fait qu’une gravité légère.

Devenir

Sur 5 ans et pour l'ensemble des 8 lignées, 8400 animaux seront inclus dans des projets scientifiques d’étude de la réponse immune aux produits de thérapie génique. 1950 animaux seront gardés en vie pour les besoins de la reproduction et la gestion des élevages. 22 230 animaux seront euthanasiés car ne présentant pas un génotype d'intérêt ou le bon sexe pour l'expérimentation ou la reproduction.

Remplacement

Chaque projet applicatif fait l'objet d'études préalables in vitro dans le cadre d'évaluation de produits thérapeutiques candidats et de molécules immunosuppressives permettant de réduire la réponse immunitaire . Les réponses immunes, entre autres à l’encontre de produits de thérapie cellulaire et génique, sont la résultante de complexes interactions, impliquant de multiples partenaires cellulaires (lymphocytes, cellules présentant l’antigène…), se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Le système immunitaire, à travers les organes du système immunitaire, mais également le sang et la lymphe, se trouve imbriqué dans tout l’organisme, ce qui lui permet d’en contrôler l’intégrité. Si certaines expériences in vitro permettent d’analyser certains processus et paramètres de ces réponses immunes, seul le modèle animal est à même de mimer la complexité de la réponse immune humorale (production d'anticorps) et cellulaire résultante. Ainsi, il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive aux modèles animaux, en particulier aux mammifères tels que rongeurs, chiens ou primates pour mimer ce qui pourrait advenir chez les patients. De plus, la production de certains animaux nécessite la réalisation de croisements entre non homozygotes, donc la réalisation de génotypages auxquels nous ne pouvons nous soustraire.

Réduction

La production de toutes les lignées de cette demande d'autorisation de projet repose sur des croisements spécifiques et des stratégies d’accouplement qui permettent d’adapter au mieux la production en fonction des besoins expérimentaux des projets scientifiques. En particulier, le nombre de reproducteurs et le nombre de nouveau-nés sevrés sont réévalués toutes les semaines afin de ne produire/conserver que des animaux utilisés dans les projets. Par ailleurs, quand cela est possible, nous mettons en place un schéma d’accouplement optimisé afin de produire un maximum d’animaux présentant les caractères d’intérêt.

Raffinement

D’après la littérature, aucune des modifications apportées aux animaux n’entraine d’effets négatifs ou de maladies dans nos conditions d’élevage et d’expérimentation. En effet, les animaux sont élevés dans un environnement propre et contrôlé, et manipulés dans des conditions protégées. Des seuils d'alerte ont été définis pour détecter rapidement tout signe de malaise, de blessure, ou d'infection chez les animaux dont le système immunitaire est affaibli. Une surveillance quotidienne, assurée 7 jour sur 7, permet d'anticiper ces situations. Pour les génotypages, qui constituent la seule procédure de ce projet, le prélèvement d’un petit fragment d'oreille est réalisé sur des souris éveillées sans provoquer de saignement. Les animaux sont maintenus calmement le temps de la procédure et sont remis dans leur cage. Une surveillance pendant 5 minutes permet de contrôler leur réaction/comportement suite à cette intervention.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain, faisant du modèle murin le modèle de référence pour les analyses des complexes réponses immunes, se déroulant via de nombreux types de cellules et dans divers organes. Il bénéficie en outre de l’existence de nombreuses souches modifiées pour des éléments du système immunitaire, permettant d’en analyser le rôle. Les animaux sont prélevés à 7 jours.

Deux millimètres de queue coupés en dix secondes sur des souriceaux vigiles, sans anesthésie : 300 souris subissent ce prélèvement dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Celles dont le génotype ne correspond pas à celui recherché sont tuées, les autres partant vers un projet autorisé ou vers le maintien de la lignée, quand elles ne sont pas tuées elles aussi. Le porteur écrit que les méthodes non invasives testées n'ont pas donné de résultats exploitables et qualifie ce projet de "nécessaire". Aucune connaissance n'est produite ici, le prélèvement sert à trier un élevage et à fournir aux laboratoires des lots d'animaux homogènes.

Objectifs

Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale. Dans le cadre de certains projets scientifiques, des lignées d’animaux sont développées et élevées. Pour maintenir ces lignées et fournir des animaux adaptés à ces projets, il est donc important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer des lots expérimentaux homogènes et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des prélèvements de tissus selon des méthodes non invasives. L’objectif de ce projet est de présenter la méthode de prélèvement utilisée par notre équipe pour caractériser les souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre une sélection des animaux d’intérêt et ainsi une optimisation de la gestion et de l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des utilisateurs pour les projets scientifiques autorisés.

Procédures

Prélèvement unique de 2mm de l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sous contention - Durée: 10 secondes par animal

Impact sur les animaux

Les nuisances engendrées sont le stress inhérent à la préhension et à la contention des animaux et la douleur lors du prélèvement du tissu.

Devenir

Les animaux au génotype non recherché seront mis à mort. Les animaux au génotype recherché seront : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé ; b/ Utilisés pour le maintien de la lignée ; c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.

Remplacement

A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas donné de résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés utilisés dans le cadre d’une utilisation dans les projets scientifiques autorisés.

Réduction

L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consiste à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire pour leur utilisation dans des projets scientifiques autorisés ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - Seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues. Les autres sont conservées congelées. - Les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence. - Les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (croisement entre individus de même génotype).

Raffinement

La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée ce qui permet de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.

Choix des espèces

La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent de poser de nombreuses questions scientifiques en biologie fondamentale, environnementale, santé humaine et animale avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèces, dont l’être humain. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives…). Les prélèvements de l’extrémité de la queue seront réalisés entre 10 et 21 jours après la naissance. En effet, durant cette période, l’extrémité distale de la queue est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douloureux et avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.

Les souris élevées ici sont immunodéprimées et portent une altération du foie qui les tue peu après la naissance, à moins qu'elles ne reçoivent en continu un médicament spécifique. 6 100 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune subissant une biopsie sur animal éveillé pour son génotypage. L'élevage fournit des souris dont le foie peut être humanisé, livrées à des clients académiques et industriels pour leurs essais précliniques. Celles qui portent le génotype attendu partent vers le laboratoire demandeur, les autres sont tuées, faute d'autre usage.

Objectifs

Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules humaines afin d’obtenir des souris humanisées car elles sont particulièrement tolérantes à l’implantation de cellules ou tissus. Les souris sont dites « humanisées » lorsqu’elles sont greffées avec des cellules humaines. Il existe plusieurs types de souris humanisées en fonction des cellules humaines qui sont utilisées et des pathologies étudiées, par exemple, l’utilisation de cellules humaines de foie (hépatocytes humains) permet de générer des souris dont le foie est humanisé, l’utilisation de cellules immunitaires humaines permet de générer des souris dont le système immunitaire est humanisé. Le développement et la production de souris humanisées permet de proposer des modèles expérimentaux pertinents et adaptées en recherche biomédicale aux utilisateurs finaux (académiques et industriels). Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles de souris dont le foie est humanisable sont pertinents, robustes et fiables. Ils permettent d’effectuer les tests précliniques de composés candidats médicaments pour le traitement de pathologies hépatiques mais également d’étudier la toxicologie de composés candidats médicaments pour d’autres pathologies.

Procédures

Les souris au foie humanisable sont immunodéficientes donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé qui sont exempts de microrganismes pathogènes ou opportunistes listés dans un référentiel afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Certaines souris au foie humanisable peuvent aussi un phénotype dommageable de trouble hépatique, inhibé par l’apport de médicament spécifique. Une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre EU1 (prestation de Sciences de la Reproduction : réception d’animaux, prélèvement gamètes…) et sur notre EU2 (Elevage).

Impact sur les animaux

Sans l’apport d’un médicament spécifique, les animaux ayant un foie défaillant dû à une modification génétique meurent très rapidement après leur naissance de lésions hépatiques majeures. Les animaux immunodéficients sont particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état. Par ailleurs, une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies en vue du génotypage.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés pour une utilisation continue vers le laboratoire demandeur, soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (avant l'atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes). Les animaux ne présentant pas de génotype d’intérêt pour la poursuite du projet seront mis à mort (pas d’autre utilisation possible).

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permet une sélection des propriétés pharmacologiques et qui permet de valider certaines hypothèses et d’obtenir de données préliminaires et complémentaires. Ce type de modèle n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe permettant de mimer le foie humain. Il permet de réaliser des études précliniques in vivo de toxicité avant de réaliser des tests chez l’Homme. Les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine en limitant le recours aux modèles de primates non-humains.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Ces animaux au foie humanisable étant immunodéficients (système immunitaire affaibli ou rendu non fonctionnel via différentes modifications génétiques), un hébergement standard (litière, enrichissement et congénères) dans un milieu biologiquement sécurisé pour les protéger de la survenue d’infections est réalisé. Le maintien de conditions d’hygiènes strictes exemptes de pathogènes et d’opportunistes étant la clé pour éviter l’expression du phénotype dommageable des animaux immunodéficients et limiter les nuisances associées. Ces animaux seront surveillés quotidiennement. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Les souris au foie humanisable présentant une invalidation génétique particulière ont un foie dysfonctionnel. Cette modification génétique est léthal. Un médicament spécifique permettant le maintien d’un fonctionnement normal de leur foie leur sera administré afin d’assurer leur survie y compris pendant le transport. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux. Une période d’acclimatation sera appliquée après réception des animaux. Le médicament spécifique permettant de contrecarrer le phénotype des animaux au foie humanisable leur sera fourni tout au long du transport soit dans l’aliment soit dans le gel servant d’eau de boisson.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les souris sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elles constituent un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des informations pertinentes pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins de nos clients. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de leur gestation.

Des souriceaux de sept jours subissent l'ablation de moins d'un millimètre du bout de leur queue, sous pommade anesthésiante, pour que leur génotype soit déterminé. 1 050 souris sont utilisées dans cet élevage de lignées reproduisant le syndrome de Prader-Willi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le titre du projet met le mot "invasifs" entre guillemets, quand le texte reconnaît par ailleurs que jusqu'à 15 % des souriceaux porteurs de la maladie meurent le jour de leur naissance, sans signe avant-coureur. Les animaux dont le génotype intéresse les expériences à venir sont maintenus en vie, les autres tués, sans que la proportion soit indiquée.

Objectifs

Le syndrome de Prader Willi (SPW) est une maladie génétique rare sans traitement curatif. Cette maladie est caractérisé par un manque de tonus à la naissance suivi d'un retard de crosisance dans le jeune âge et, en parallèle, vers l'âge de deux ou trois ans, l'installation d'une faim permanente et incontrôlable qui peut conduire au fil des années à une obésité extrême et fatale. Nos travaux préliminaires ont permis de développer une molécule de thérapie génique capable de corriger l’absence d’expression de certains de ces gènes en lignée cellulaire, néanmoins ces modèles ne permettent pas de savoir si le traitement serait efficace sur un organisme. Plusieurs modèles de la maladie existent chez la souris. Ainsi, l’objectif général du projet scientifique est d’analyser le potentiel thérapeutique de ce traitement sur plusieurs modèles de souris et à différents stades de développement, y compris à un stade précoce nécessitant de caractériser génétiquement les animaux par une méthode invasive (prélèvement de bout de queue). Ainsi, l'objectif précis de ce projet est de mettre en place les conditions et les gestes associés à la production de souris dans le contexte d'essais de thérapie de la maladie de Prader Willi.

Bénéfices attendus

Les différents projets que nous souhaitons réaliser permettrons de tester la capacité de la thérapie à soigner des individus traités dès la naissance ou traités à des stades plus tardifs, afin de tester la possibilité de soigner des patients déjà adultes. Concernant un traitement précoce après la naissance des animaux, le prélèvement de tissu une semaine après la naissance va permettre de caractériser génétiquement les nouveau-nés malades ou sains, et ainsi optimiser leur intégration dans les différents groupes expérimentaux.

Procédures

Il s'agit d'un seul prélèvement de bout de queue (

Impact sur les animaux

Une douleur et un stress pourraient être associés au prélevement d'un bout de queue (

Devenir

Les animaux utiles pour constituer les groupes expérimentaux (animaux porteurs de la maladie ou contrôles, traités avec le médicament ou avec un traitement contrôle) seront maintenus en vie en utilisation continue, les autres seront mis à mort.

Remplacement

le syndrome de Prader Willi (SPW) est une maladie spécifique des mammifères et ne peut être modélisée par des animaux non-mammifères. Des études préalables sur cultures cellulaires mammifères ont permis de développer un traitement contre le SPW. Il convient maintenant de l’administrer sur un modèle animal chez qui l’efficacité du traitement sera évaluée en mesurant plusieurs paramètres biologiques qui ne sont pas évaluables sur modèle non-animal.

Réduction

Uniquement le nombre d'animaux requis pour les projets scientifiques autorisés seront produits et, si nécessaire, subiront un prélèvement de tissu. Des schémas d'accouplements visant à limiter le nombre d'animaux générés seront scrupuleusement suivis.

Raffinement

Le prélèvement d'un bout de queue sera réalisé par du personnel expérimenté selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée en vue de limiter le stress et la douleur. Auparavant, l'anesthésie locale du bout de queue sera obtenue par l'application d'une pommade. Une surveillance et un suivi de la cicatrisation seront réalisés dans les jours suivant le prélèvement. Les animaux seront surveillés tous les jours pour vérifier l'absences de points limites. Le change des cages sera décalé de trois jours après la mise bas afin de ne pas nuire à la relation mère-petits. Pour limiter le stress, le nid maternel sera conservé pendant le change.

Choix des espèces

Les lignées de souris SPW sont les seuls modèles mammifères permettant d'étudier le développement de la maladie humaine. Le prélèvement d'un bout de queue se fera au 7ième jour après la naissance. Les animaux porteurs de la maladie seront utilisés entre leur jour de niassance et le stade adulte, selon les projets sceintifiques autorisés.

Tuées lorsque leur profil génétique ne sert plus à la reproduction, versées à d'autres projets autorisés dans le cas contraire, 3 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Au sevrage, entre trois et cinq semaines, chacune se fait découper un bout d'oreille sous anesthésie brève et implanter une puce électronique sous la peau, et jusqu'à 5 % d'entre elles repassent une seconde fois par ce prélèvement. Le projet ne sert qu'à entretenir deux lignées transgéniques liées au récepteur de l'urotensine II, élevées depuis cinq ans dans l'établissement pour alimenter des travaux sur les hémorragies cérébrales. Le porteur qualifie ces lignées d'"indispensables" à ces travaux et conclut que "l'animal entier est donc nécessaire", les cerveaux devant être étudiés en entier.

Objectifs

Ce projet vise à identifier et à réaliser des prélèvements de tissus (petit bout d'oreille) permettant de réaliser la caractérisation génétique de souriceaux issus de la reproduction de souris de 2 lignées transgéniques, des souris n'exprimant pas le récepteur d'un peptide vasoactif (urotensine II) et des souris exprimant le gène du récepteur de l'urotensine humain. Les biopsies permettront de maintenir l’élevage de ces 2 lignées de souris, en cours dans l'établissement depuis 5 ans, et permettra de fournir les animaux nécessaires aux projets scientifiques autorisés. Ces souris sont actuellement utilisées dans différents projets scientifiques du laboratoire cherchant à caractériser le rôle de l'urotensine dans divers processus pathologiques, notamment les hémorragies cérébrales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la caractérisation génétique et l'identification des souris issues des reproductions nécessaires aux élevages et utilisées pour les différents projets scientifiques de l'équipe. Ce projet permettra de produire et d'entretenir des lignées de souris transgéniques qui sont indispensables aux projets scientifiques actuellement en cours (projets autorisés) visant à élucider les mécanismes impliquant le système urotensinergique et à rechercher des thérapies potentielles dans le cadre de modèles d'hémorragies cérébrales.

Procédures

Les souriceaux issus de la reproduction au sein de chacune des 2 lignées de souris transgéniques feront l'objet d'une biopsie au moment du sevrage (entre 3 et 5 semaines post-natal) afin de permettre leur caractérisation génétique. Pour cela un petit bout d’oreille sera prélevé grâce à des micro-ciseaux chirurgicaux, désinfectés avant chaque utilisation. Les animaux seront anesthésiés (moins de 2 minutes) afin de limiter le stress éventuel lié à leur manipulation nécessaire pour le prélèvement de tissu et pour l'injection sous-cutanée d'une puce électronique permettant leur identification à long-terme. En cas de problème techniques rencontrés parfois au moment des expériences de caractérisation génétique, il pourrait être nécessaire de réaliser à nouveau, quelques jours après le sevrage, un prélèvement de tissu à l'oreille sur les animaux anesthésiés brièvement, et ceci pour moins de 5 % des souris.

Impact sur les animaux

Une possible douleur au niveau de la zone de la biopsie et un stress de courte durée pourraient apparaitre.

Devenir

Les animaux anciens reproducteurs ou dont le profil génétique n'est pas utile pour la reproduction, et qui ne seront pas utilisables pour d’autres projets ayant reçu une autorisation du ministère, seront mis à mort. Les autres animaux seront utilisés pour des projets scientifiques spécifiques (ayant fait l'objet d'autres demandes d'autorisation de projet).

Remplacement

Des souris sont nécessaires pour assurer la reproduction des animaux des 2 lignées transgéniques et ainsi fournir les souris utilisées dans les projets de recherche faisant l’objet ou ayant fait l’objet d’autres demandes d’autorisation au Ministère et portant notamment sur des modèles murins d'hémorragie cérébrale qui sont évalués dans des tests comportementaux et dont le cerveau entier est indispensable pour des études neurobiologiques. L'animal entier est donc nécessaire.

Réduction

Les prélèvements nécessaires à la caractérisation génétique des animaux ne concerneront que les souris servant au maintien de l'élevage. Le nombre d'animaux de ce projet est un nombre maximal car il ne tient pas compte de la variabilité de l'effectif de nouveau-nés d'une portée à l'autre (variant de 0 à 15). Afin de réduire le nombre d'animaux qui feront l'objet de prélèvements pour le génotypage, des schémas de reproduction pourraient être mis en place (entre homozygotes) pour obtenir des souris en plus grand nombre en cas de besoin dans des procédures décrites dans d'autres projets autorisés.

Raffinement

Les prélèvements seront réalisés par du personnel expérimenté. Afin de réduire le stress des animaux soumis à une contention pour le prélèvement de tissus au moment de leur identification, les souris seront anesthésiées brièvement. Le tissu prélevé sera le plus petit possible. Les outils nécessaires à la biopsie seront désinfectés avant chaque utilisation. Des points limites sont mis en place afin de limiter la douleur au minimum. Un suivi des animaux est réalisé quotidiennement et permet de déceler un éventuel signe de souffrance. Un suivi particulier sera fait au niveau des zones de la biopsie au cours de la semaine qui suit les gestes. Parmi ces signes, des plaies, des vocalisations anormales, une agressivité anormale, une posture « dos voûté », une lenteur des mouvements, une prostration indiquent une souffrance de l’animal. Si l’un de ces signes ou une combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé dans les heures qui suivent son apparition, des soins seront apportés, par exemple désinfection des plaies. Et si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 48h, il sera considéré que le niveau de souffrance atteint nécessite une mise à mort anticipée.

Choix des espèces

La souris est très couramment utilisée comme modèle transgénique et c’est une espèce classiquement utilisée le cas des études sur l'hémorragie cérébrale car leur anatomie et physiologie sont bien connues. Ce projet utilise des souris n’exprimant pas le gène du récepteur de l'urotensine ou exprimant le gène codant le récepteur humain. Ces 2 lignées de souris sont déjà utilisées dans notre établissement et permettront de poursuivre les projets scientifiques en cours ou prochainement mis en place. Le prélèvement de tissu pour permettre la caractérisation génétique des individus sera fait sur des souris âgées de 3 à 5 semaines.

Tuées au sevrage pour les femelles et les génotypes jugés non pertinents, à sept mois pour les mâles malades, la moitié des géniteurs pouvant retourner à l'élevage, 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes les souris de chaque portée subissent à sept ou dix jours le prélèvement d'un morceau de tissu destiné à lire leur génotype, y compris celles dont le génotype ne servira à rien. Les souris porteuses de la modification développent une maladie rénale chronique que le porteur décrit comme silencieuse jusqu'à la mise à mort, une perte de poids supérieure à 15 % déclenchant celle-ci plus tôt. Il indique que des mini-organes cultivés en laboratoire existent désormais, tout en concluant que l'étude du rein "nécessite" des animaux parce que la fonction rénale suppose un organe entier.

Objectifs

Ce projet porte sur la gestion de souris génétiquement modifiées pour étudier la maladie rénale qui se développent chez les patients atteints de glycogénose de type 1. L’absence de cette enzyme provoque de fortes baisses de sucre dans le sang (hypoglycémies) et des problèmes au foie et aux reins. La glycogénose est une maladie génétique rare qui touche environ 150 personnes en France. Jusqu’à ce jour, il n’existe pas de modèles cellulaires reproduisant la maladie rénale de la glycogénose. En effet, son développement implique différents types cellulaires constituant le néphron et les tubules rénaux, ainsi que des cellules immunitaires recrutées de la circulation sanguine. Le modèle de souris utilisé dans ce projet reproduit toute la maladie rénale de la glycogénose et est viable car la transgenèse est ciblée dans les reins. L’obtention de ces souris transgéniques nécessitent la réalisation d’un prélèvement de tissu (biopsie) pour caractériser leur gène et sélectionner uniquement les souris d’intérêt. Contrairement aux souris totalement dépourvues de l’enzyme clé de la production de sucre et qui meurent très tôt d’hypoglycémie (chute des taux de sucre dans le sang), ces souris particulières restent en vie car leur foie peut encore produire du glucose. Elles développent cependant progressivement une maladie des reins, avec apparition de kystes et perte de la fonction rénale, ce qui en fait un bon modèle pour étudier cette complication. Ces souris sont donc un outil unique pour comprendre les mécanismes de la maladie rénale dans la GSD1a et pour tester de nouveaux traitements. Le projet a pour but de conserver de jeunes mâles capables de se reproduire pour produire rapidement un nombre suffisant de souris destinées à ces recherches.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seront l’identification génétique de la lignée à partir d’une biopsie de tissu pour optimiser la gestion de l’élevage. Ce projet permet aussi d’organiser au mieux la production de cohortes d’animaux pour nos projets scientifiques (utilisation continue vers des projets liés à l’étude de la maladie rénale ou le test d’efficacité d’approches thérapeutique), en conservant un nombre de souris d’intérêt jeunes reproducteurs sans atteindre le développement le développement d’un mal -être lié à l’apparition d’une insuffisance rénale.

Procédures

Pour sélectionner les souris génétiquement modifiées nécessaires à l’étude, un morceau de tissu sera prélevé à l’âge de 7-10j sur toutes les souris de la portée (souris d’intérêt pour ce projet, mais aussi les souris de génotype non pertinent ou ne présentant pas phénotype dommageable) pour analyser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Les souris atteintes de glycogénose peuvent développer une maladie chronique rénale, mais qui restera silencieuse puisqu’aucun signe de mal-être liée à une insuffisance rénale ne devrait apparaitre avant la mise à mort à l’âge de 7 mois des animaux.

Impact sur les animaux

A l’âge de 7 jours, on prélève un morceau de tissu pour analyser l’ADN des souris génétiquement modifiée. Ceci peut entrainer une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés mais le geste est rapide (quelques secondes). Le risque de saignement est très faible. La nuisance liée au phénotype dommageable est principalement induite par la perte de la fonction rénale à long terme. Cette maladie silencieuse peut se révéler par une perte de poids importantes et des signes communs de mal-être (prostration de l’animal, absence de toilettage, yeux fermés, respiration accélérée).

Devenir

Toutes les souris génétiquement modifiées qui présentent les caractéristiques de la glycogénose seront mis à mort à l’âge de 7 mois afin d’éviter d’atteindre les stades avancés de la maladie rénale. Les animaux de génotype non pertinent ou femelles non utilisées seront mis à mort au sevrage ; cependant une partie des animaux géniteurs (50%) pourra être replacée, si besoin, dans le système d’élevage en vue du maintien de lignées.

Remplacement

Même s’il est maintenant possible de bio-construire des mini-organes à partir de cellules en laboratoire, l’étude de la maladie rénale nécessite l’utilisation d’animaux ; en effet, le rein est un organe complexe dont l’organisation en néphrons est requise pour assurer la fonction rénale. Ainsi, conserver la physiologie de l’organisme est nécessaire pour comprendre les mécanismes impliqués dans cette maladie et tester l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en connaissant le schéma d’accouplement et le nombre de lots de souris nécessaires pour chaque projet d’expérimentation. Les lignées transgéniques nécessaires à la création de ce modèle animal sont cryoconservées, ce qui permettra d’arrêter la production des animaux dès la fin des projets nécessitant ces animaux

Raffinement

L’obtention d’un modèle de la glycogénose ne touchant que les reins permet d’éviter le développement d’hypoglycémies sévères caractéristiques de la glycogénose et qui sont fatales chez les souris génétiquement modifiées dans tous les tissus. Ce raffinement a permis d’obtenir un modèle unique reproduisant la maladie rénale chronique qui apparait chez les patients atteints de glycogénose plutôt âgés. Pour vérifier la modification génique, la biopsie sera réalisée sur une zone peu innervée à l’âge de 7-10 jours pour limiter la douleur liée à la petite incision. Lors de la contention des nouveau-nés, le zootechnicien se frottera les mains dans la litière pour limiter le stress des animaux. La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. L’âge de la mise à mort des animaux a été fixé à 7 mois pour les mâles afin de s’affranchir du développement du phénotype dommageable. Les femelles seront mises à mort au sevrage car elles ne peuvent pas être utilisées pour la reproduction. Une perte de poids au-delà des 15%, ainsi que l’observation d’une souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels les souris seront mises à morts.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations de la production de glucose par l’organisme ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. De plus, le modèle de souris transgéniques utilisé n’a été réalisé que dans cette espèce grâce à la transgenèse ciblée. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. Seule une biopsie de tissu sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. Les animaux d’intérêt seront ensuite utilisés à l’âge de la maturité sexuelle (6-8 semaines) pour être mis en reproduction.

Produites sur place pour alimenter des projets sur le néocortex, 11 340 souris de lignées génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souriceau âgé de sept à dix jours subit un prélèvement du bout de la queue sur animal vigile, ou de l'oreille en cas de nouvel essai, avec un risque de saignement. Le porteur affirme piloter l'élevage "de manière raisonnée" et envisager la cryopréservation, sans dire combien d'animaux naîtront sans porter les mutations recherchées. Ceux-là sont tués faute de pouvoir être replacés, les 5 860 autres passant en utilisation continue dans les projets de l'équipe.

Objectifs

Le néocortex des mammifères est une zone spécifique du cerveau responsable de nombreuses fonctions cognitives essentielles, telles que la perception sensorielle, le contrôle moteur et la mémoire de travail. Il est organisé en différentes aires, ou zones, hiérarchisées. Cette hiérarchie influence la circulation et le traitement de l'information dans le cerveau. L’objectif de nos recherches est de démontrer que ces différentes aires présentent des organisations de circuits neuronaux distinctes et de les caractériser en détail. Ces recherches nécessiteront de travailler avec des modèles de souris génétiquement modifiées. Ainsi l’objectif de ce projet sera le maintien de lignées murines d’intérêt avec un prélèvement invasif pour connaitre leur patrimoine génétique.

Bénéfices attendus

Les maladies du cerveau ont un impact important sur la vie des personnes, affectant leur santé, leur indépendance et leur capacité à travailler. C'est pourquoi il est crucial de comprendre comment fonctionnent les connexions entre les différents types de neurones dans le cerveau. Nos recherches visent à étudier ces connexions en détail, à la fois dans un cerveau sain et dans des situations de maladie. Nous pensons que certains problèmes du cerveau, comme la schizophrénie ou l'autisme, pourraient être liés à un mauvais fonctionnement d'une partie du cerveau appelée néocortex. Ce projet nous permettra de produire des animaux de lignées génétiquement modifiées d’intérêt pour nos projets de recherches. Les bénéfices attendus sont donc liés à ces projets de recherche et concerneront toutes les informations que nous pourrons obtenir pour identifier le fonctionnement du néocortex et l’origine de ses dysfonctionnements. A long terme cela pourrait donc amener à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients impactés par un dysfonctionnement du néocortex.

Procédures

Un petit prélèvement du bout de la queue sera fait sur une partie des jeunes animaux vigiles (1 fois, moins d’1minute). En cas de problème technique (rare) il pourrait arriver que certains animaux aient un autre prélèvement mais cette fois au niveau de l’oreille (1 fois, moins d’1 minute).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage (ou de l’oreille en cas de re-prélèvement). Il existe un risque de saignement suite au prélèvement.

Devenir

Les animaux non porteurs des mutations génétiques d’intérêt seront euthanasiés car ils ne pourront pas être réutilisés ou replacés du fait de leur modification génétique spécifique. La majorité des animaux produits (5860) sera en utilisation continue dans nos projets de recherche.

Remplacement

Nos recherches portent sur l’étude du fonctionnement de zones spécifiques du cerveau et les différentes interactions entre ces zones. A l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de modéliser la complexité de ces connexions. Ainsi il nous est nécessaire de recourir à l’utilisation d’animaux pour nos projets de recherche.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (11340) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaire pour nos projets de recherche et en limitant au maximum le nombre d’animaux produits non porteurs des modifications génétiques d’intérêt. La production des lignées non utilisées en expérimentation est strictement limitée au minimum nécessaire, et la possibilité de recourir à la cryopréservation sera envisagée afin de réduire davantage le nombre d’animaux élevés. S’agissant d’un projet d’élevage il n’y aura pas de tests statistiques. Pour les projets dans lesquels les animaux produits seront transférés, les effectifs par groupe auront été définis sur la base d’études précédentes et à l’aide de tests statistiques si cela est possible. Les données générées seront ensuite analysées à l’aide des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé dans une pièce dédiée, au calme, à l’aide de matériel désinfecté entre chaque animal afin de prévenir tout risque d’infection ou de contamination croisée. Les petits sont replacés rapidement avec leur mère et le reste de la portée pour leur redonner un environnement réconfortant. L’état du souriceau est vérifié immédiatement après le prélèvement puis environ 30 minutes après pour s’assurer qu’il soit bien repris en charge par sa mère. Si un re-prélèvement était nécessaire sur un animal, il n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. La taille des prélèvements est limité au strict nécessaire et est donc la plus petite possible. Les animaux sont observés quotidiennement. En cas d’anomalie un suivi est mis en place par la structure chargée du bien-être animal et des conseils sont donnés à l’équipe de recherche pour assurer une prise en charge rapide et optimale de l’animal. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

La souris permet de modéliser de nombreuses pathologies humaines, en effet sa forte homologie génétique avec l’humain et les nombreux outils disponibles pour générer des modifications génétiques chez cette espèce en font un modèle de choix. Nos projets de recherche portent sur l’étude du fonctionnement de zones spécifiques du cerveau et les différentes interactions entre ces zones. En utilisant différentes lignées de souris génétiquement modifiées nous pourrons étudier l’effet et le rôle de cellules spécifiques pour comprendre le fonctionnement et identifier les interactions entre ces différentes zones du cerveau. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de connaitre le plus tôt possible les mutations génétiques d’intérêt, nous permettant ensuite de réaliser nos procédures à différents stades de développement pour répondre à nos questions scientifiques.

Toutes issues de lignées génétiquement modifiées dont il faut vérifier le patrimoine, 268 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune est immobilisée quelques secondes à une minute, se voit poser une micropuce sous la peau et amputer moins d'un millimètre du bout de la queue ou de l'oreille. Le porteur mentionne comme nuisances le stress de la manipulation et, en cas de manquement à l'asepsie, une infection et un saignement. Les souris porteuses des gènes recherchés partent vers d'autres projets ou retournent en accouplement, les autres sont tuées, et l'effectif de 268 000 individus sur cinq ans n'est justifié nulle part.

Objectifs

Le projet a pour but de réaliser le suivi des animaux d'élevage afin d'assurer la traçabilité des lignées via les registres obligatoires et de suivre les lignées par la réalisation de biopsies de queue ou d'oreille, nécessaires au génotypage des lignées transgéniques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet consistent à assurer une traçabilité optimale des animaux grâce à une identification unique avec une micropuce RFID, permettant ainsi la sélection des animaux porteurs des gènes d'intérêt pour l'élevage des lignées transgéniques et la production des lots expérimentaux nécessaires aux expérimentations.

Procédures

Les animaux, au cours du projet et de leur vie, seront soumis à une contention d'immobilisation et à un prélèvement d'un bout de l’extrémité de la queue ou d'oreille, inférieur à 1 mm. Le geste a une durée d'environ quelques secondes à 1 minute par animal.

Impact sur les animaux

Les potentielles nuisances attendues pour les animaux sont le stress lors de la manipulation et, éventuellement, en cas de non-respect de l'asepsie, une infection et un saignement de la queue ou du bout d'oreille prélevé est possible.

Devenir

À la fin de la procédure expérimentale, les animaux sont soit utilisés dans le cadre d'une autre autorisation de projet, soit remis en accouplement pour la génération de nouvelles portées dans le cadre du maintien et du développement des colonies. Les animaux non porteurs des gènes d’intérêt sont mis à mort et peuvent également être utilisés pour le prélèvement d’organes après mise à mort.

Remplacement

Pour le génotypage, l'utilisation des poils ne permet pas d’identifier correctement les animaux porteurs des gènes d’intérêt. De plus, pour la réalisation de ce type de prélèvement, il est nécessaire de prélever le bulbe avec le poil, et ce, en quantité suffisante. Ce geste technique est également plus long que la coupe de l’extrémité de la queue ou d’un bout d'oreille et conduirait à générer davantage de stress pour l’animal (du fait de l’allongement du geste technique, mais aussi du fait de la nécessité de réaliser des prélèvements complémentaires en cas d’impossibilité de lire les résultats de génotypage). Il n'existe pas actuellement de méthode de remplacement de l'implantation de micropuce RFID en sous-cutané chez la souris.

Réduction

Pour la réduction du nombre d'animaux, nous incitons fortement les équipes de recherche à réaliser la cryopréservation d’embryons ou de sperme de leurs lignées, afin de maintenir uniquement les colonies de souris nécessaires à la production des lots expérimentaux. Actuellement, un logiciel de gestion est en place, permettant de faire un suivi au plus près des élevages.

Raffinement

Concernant le raffinement, nous accordons une grande importance à la formation des zootechniciens pour la réalisation des identifications et des biopsies. Une attention particulière est portée aux règles d'asepsie pour l'implantation de la micropuce ainsi qu'au nettoyage et à la désinfection systématique des ciseaux entre chaque animal. Le raffinement des biopsies consiste également à ne prélever que le strict nécessaire en échantillon, à un bout de tissu inférieur à 1 mm du bout de la queue de l'animal ou de l’oreille afin de limiter l’impact potentiel. Pour le raffinement au niveau de l'hébergement des animaux, nous mettons dans chaque cage trois types d'enrichissements : du papier kraft, des carrés de coton et une maison en cellulose pour le confort des animaux, afin qu’ils puissent exprimer leurs besoins naturels de nidification

Choix des espèces

La souris est l'animal principalement utilisé pour les travaux de recherche du centre, car elle se reproduit facilement, a un cycle de développement court et est facilement manipulable d'un point de vue génétique. C'est également un animal de petite taille pouvant être hébergé en groupe dans des infrastructures dédiées. Cela en fait un modèle de choix pour répondre aux besoins des différentes thématiques de notre établissement : les neurosciences, la psychiatrie, la physiopathologie des maladies cardiovasculaires et respiratoires, le développement et la sénescence, les virus, l'immunité et le cancer.

Élevés sur place pour alimenter les projets de neurobiologie de l'institut, 68 750 poissons zèbres et 7 500 Danionella cerebrum vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Les Danio rerio génotypés subissent une biopsie de la nageoire caudale à vif, un prélèvement par individu, qui peut provoquer un déséquilibre de nage dans les premières secondes. Une partie de ces poissons est tuée, une autre sert de reproducteurs dans les projets pour lesquels les lignées ont été créées. Le porteur reconnaît que les effets des mutations ne sont pas connus au moment où les lignées sont générées, estime à moins de 1 % la part de lignées qui développeront des caractéristiques dommageables, et fonde l'effectif de 76 250 poissons sur son expérience de l'élevage.

Objectifs

Les projets scientifiques des équipes de recherche de notre institut visent à comprendre l’organisation anatomique et fonctionnelle des circuits neuronaux et visuels ainsi que leurs mécanismes moléculaires sous-jacents. Danio rerio et Danionella cerebrum sont deux espèces de poisson adaptés à la modélisation de maladies humaines du système nerveux et visuel via des techniques de mutagénèse. La création, le maintien des lignées et l’étude des caractéristiques génétiques des lignées créées sont nécessaires à la réalisation des différents projets de recherche de l’Institut. Le Danio a environ trois-quarts de son génome en commun avec l’Homme, il est transparent durant les premiers jours de vie ce qui facilite les études par imagerie sur ces lignées. L’utilisation de l’espèce Danionella, permettra quant à elle, de réaliser des études in-vivo à long terme, en prenant avantage de la transparence de l’espèce tout au long de sa vie

Bénéfices attendus

Les lignées génétiquement modifiées crées dans le cadre de cette demande seront des outils précieux pour les différents projets de recherche du laboratoire. Elles permettront de mieux comprendre les mécanismes de développement et fonctionnement du système visuel et nerveux central du Danio et du Danionella. La forte homologie structurelle et fonctionnelle avec celui des mammifères, dont l’Homme, aidera à la compréhension des mécanismes fondamentaux impliqués dans le développement et permettra de mieux comprendre sa mise en place afin d’apporter des pistes de recherche pour certaines maladies humaines et ainsi faire progresser les traitements.

Procédures

La biopsie de la nageoire caudale est réalisée sur des animaux vigiles. Un seul prélèvement sera réalisé par individu et ce geste est pratiqué en moins d’une minute par du personnel habilité.

Impact sur les animaux

Les effets des mutations crées ne sont pas clairement connus au moment de la génération de la lignée. Certaines des lignées (moins de 1 pour cent) peuvent développer des caractéristiques ayant un impact négatif. La biopsie de la nageoire caudale peut provoquer un léger déséquilibre de nage lors des premières secondes

Devenir

Les animaux sont soit euthanasiés, soit utilisés comme reproducteurs dans des projets pour lesquels ils ont été générés.

Remplacement

Les projets scientifiques des équipes de recherche consistent à comprendre l’organisation anatomique et fonctionnelle des circuits neuronaux et visuel ainsi que leurs mécanismes moléculaires sous-jacents. Les techniques alternatives in-vitro, ne peuvent pas remplacer la complexité d’un organisme vivant avec ses interactions cellulaires. Dans les projets de recherche de nos équipes, l’utilisation de certaines espèces de poissons est particulièrement adaptée à leurs études du fait de leurs caractéristiques ( fécondation et développement externe, transparence des œufs et leur grande capacité proliférative).

Réduction

Au cours du projet, nous élèverons 76 250 animaux. Ce nombre d’individus élevé est basé sur notre expérience de l’élevage et de la création de nouvelles lignées chez les espèces utilisées. Nous élèverons le nombre minimum d’individus pour générer les lignées de poissons avec les caractéristiques génétiques voulues et nécessaires aux études des chercheurs afin d’obtenir des résultats significatifs et scientifiquement interprétables. Pour le zebrafish : Nous estimons à 20 le nombre de lignées qui seront nouvellement créées par année. Nous possédons également à l’heure actuelle 50 lignées, ce qui représente 68750 zebrafish au total. Pour le danionella : Nous estimons à 5 le nombre de lignées qui seront nouvellement créées par année pour cette espèce. Pour cette espèce nous élèverons 7500 animaux au cours du projet.

Raffinement

Les animaux concernés par les procédures décrites ici feront l’objet d’une surveillance accrue. En cas de signe de mal-être d’un poisson, des actions sont menés afin de réduire le stress ou la douleur des individus concernés soit par un hébergement individuel avec présence d’analgésiant temporaire, soit par l’euthanasie par surdose d’anesthésiant de ce dernier. Nous évaluons notamment les paramètres suivants : nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, modification de la pigmentation. Pour éviter la détérioration de l’eau lors du co hébergement, l’eau des aquariums, sera renouvelé toutes les 48 heures. Pour les nouvelles lignées, l’évaluation de l’apparition de caractéristiques avec un impact négatif sur l’individu sera réalisée sur la seconde génération au stade larvaire et à 12 mois. L’évaluation du bien-être des animaux sera réalisé avec la structure du bien-être animal de l’établissement.

Choix des espèces

Le génome du zebrafish présente soixante-dix pour cent d’homologie avec celui de l’Homme, et près des quatre-vingt-dix pour cent des gènes impliqués dans une maladie humaine y sont présents. L’espèce présente également l’avantage de se reproduire facilement avec une maturation sexuelle rapide. La fécondation, le développement externe et la transparence des œufs sont également des atouts majeurs de ce modèle pour l’étude de la neurobiologie par le développement et la création de lignées transgéniques Le Danionella cerebrum a de nombreux points communs avec le zebrafish. Leur proximité phylogénétique permet une transposition facile des techniques scientifiques. Il est moins prolifique mais à l’avantage d’être dépourvu de pigment tout au long de sa vie. Son crâne étant cartilagineux, permet un accès direct pour l’imagerie in-vivo chez l’adulte Le maintien des lignées génétiquement modifiées de zebrafish ou de danionella nécessite des animaux en âge de se reproduire soit entre 3 et 24 ou 36 mois. La création de lignées est réalisée au stade 1 cellule (entre 15 et 45 min après la ponte). La biopsie caudale nécessaire au génotypage sera réalisée dès que les animaux auront atteint une taille suffisante pour limiter l’impact de celle-ci sur la nage des poissons, soit entre 3 et 6 mois