Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/06/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-656714)
Pour comprendre comment la température fait basculer le sexe des poissons, 920 poissons zèbres sont élevés à des températures modifiées puis tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur ne décrit ni chirurgie ni prélèvement sur animal vigile : les atteintes tiennent à l’enrichissement limité, à la vie en milieu contraint et aux variations de température imposées. Les individus sont analysés à cinq stades, de l’œuf fécondé au poisson adulte de 135 jours, pour établir le sex-ratio de chaque groupe. La mise à mort sert à cette détermination et à constituer une banque d’échantillons, dans un projet rattaché à la protection de l’environnement naturel.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Bien que le sex-ratio représente un paramètre démographique simple et basique, il fournit une information essentielle sur le futur potentiel reproducteur d’une population et donc, sur sa viabilité. Chez la plupart des espèces, le sex-ratio est approximativement de 1:1 (ie autant de mâles que de femelles). Cependant, ce dernier peut être biaisé sous l’effet de facteurs environnementaux. Depuis plusieurs décennies les scientifiques alarment sur le fait que le changement global entraine des biais dans les sex-ratios des populations. L’exemple le plus frappant est celui de la température chez les tortues. Chez la plupart des tortues, la détermination sexuelle (le fait de devenir mâle ou femelle) est dépendante de la température d’incubation des œufs. En-dessous d’un certaine température d’incubation, des bébés mâles sortent de leurs œufs ; au-delà, ce sont des bébés femelles. Ainsi, avec le réchauffement climatique, on observe une féminisation progressive des populations de tortues et on estime que d’ici 2100, le sex-ratio de certaines populations atteindra 93 % de femelles, ce qui risque de mener à l’extinction de l’espèce. Si l’on suspecte que beaucoup de facteurs peuvent agir sur la détermination sexuelle et biaiser les sex-ratios des populations chez les reptiles, amphibiens et poissons, les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Comprendre ces mécanismes revêt une importance cruciale et constitue un défi de longue date en biologie avec des implications importantes pour les populations et la biodiversité. Nous avons récemment mis en évidence chez le poisson zèbre (Danio rerio) que la température, les radionucléides ou le cadmium (un métal non essentiel issu de l’extraction minière) peut entrainer de manière directe ou à la génération suivante des biais importants dans le sex-ratio des populations. Le présent projet a pour objectif d’apporter des données nouvelles sur le déterminisme sexuel sous influence environnementale chez cette espèce en étudiant plus particulièrement les effets d’une hausse des températures et en étudiant à la fois les effets directs et transgénérationnels. L’objectif à terme sera de développer un outil moléculaire (basé sur des modifications épigénétiques) permettant d’apprécier l’effet de divers facteurs en lien avec l’activité humaine (réchauffement, pollution chimique, lumineuse ou sonore, …) sur la détermination sexuelle et le sex-ratio des populations en utilisant le danio comme modèle de poisson.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les preuves s’accumulent pour démontrer que le changement global affecte le sex-ratio des populations sauvages de poissons, reptiles et amphibiens, fragilisant et menaçant ainsi le futur des espèces. Si de nombreux facteurs environnementaux ont été identifiés comme affectant le processus de différentiation sexuelle (ie le fait de devenir mâle ou femelle), les mécanismes biologiques sous-jacents demeurent largement inconnus. Les résultats obtenus permettront d’acquérir des données nouvelles et originales sur (i) l’impact de l’environnement dans le processus de différentiation sexuelle chez les poissons (ie le fait qu’un poisson devienne mâle ou femelle au cours de son développement précoce), (ii) l’évolution des mécanismes impliqués dans la différentiation sexuelle et (iii) sur comment l’expérience environnementale vécue par les parents peut affecter le sex-ratio de leur descendance (appelé sex-ratio à la naissance et qui correspond à la proportion de mâles et de femelles dans une ponte). In fine, la compréhension des mécanismes impliqués dans le sex-ratio à la naissance permettra le développement d’outils moléculaires permettant d’évaluer et prédire l’impact des facteurs environnementaux, notamment une hausse des températures et des contaminants, sur le sex-ratio des populations (effet reprotoxique et perturbateur endocrinien). Alors que la majorité des outils utilisés à l’heure actuelle pour évaluer l’impact des activités humaines sur l’environnement ne donnent que peu d’indications sur l’état de santé des animaux et reflètent une exposition/effet à un instant donné, un tel outil permettrait (i) de relier un évènement moléculaire à un effet à l’échelle de l’individu (sexe) et de la population (sex-ratio), un défi de longue date en biologie et (ii) d’évaluer de potentiels effets transgénérationnels, ie effets à long terme sur les populations (en rupture par rapport aux approches classiques).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de procédure chirurgicale
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Enrichissement limité, Vie en milieu contraint, Variation de la température
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des individus seront euthanasiés à l’issue de l’expérience pour analyse, détermination du sex-ratio des populations et création d’un banque d’échantillons.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le présent projet a pour objectif majeur de développer des outils permettant d’évaluer et prédire l’effet de divers facteurs environnementaux (une hausse de la température étant étudié comme facteur masculinisant) sur le processus de détermination sexuelle chez le poisson et conjointement sur le sex-ratio des populations ainsi que de comprendre et décrire les mécanismes moléculaires sous-jacents. Un tel projet ne peut s’effectuer sur des modèles in vitro.
2. Réduction
Le sex-ratio pouvant fortement varier d’une famille à une autre (effet génétique) et d’un aquarium à un autre (effet environnemental), notre étude nécessite de recourir à au moins 3 aquariums et 3 familles par condition expérimentale pour obtenir des résultats scientifiquement pertinents et statiquement exploitables. Par ailleurs, une augmentation de la température entrainant une masculinisation de la population (90 % des poissons élevés à la plus forte température seront des mâles), le nombre de poissons utilisé correspond au minimum d’individus nécessaires pour obtenir un nombre suffisant de femelles matures pour assurer les analyses ( n = 6 par condition) et la reproduction.
3. Raffinement
La qualité de l’eau est un point fondamental pour assurer le bien-être des poissons. Les conditions d’élevage seront optimales. Chaque aquarium sera équipé d’une pompe assurant la filtration mécanique et biologique. La température et le pH seront suivis quotidiennement. Le bullage dans les unités sera contrôlé visuellement et quotidiennement. Les individus seront nourris 3 fois par jour afin de nourrir les poissons ad libitum tout en conservant une bonne qualité de l’eau (en évitant l’accumulation de nourriture non consommée dans les aquariums). En accord avec les préconisations et les études réalisées chez le poisson zèbre, l’enrichissement reposera sur (i) le maintien des individus en groupe (le danio étant un poisson grégaire), (ii) l’utilisation de photos de graviers placés sous les aquariums afin de créer un substrat et (iii) l’utilisation d’aliments vivants (les animaux seront nourris quotidiennement avec des artémies vivantes). Pendant toute la durée de l’expérimentation, des observations quotidiennes permettront de suivre l’état de santé des individus. Les potentielles atteintes au bien-être des animaux seront évaluées par des modifications comportementales et physiques en utilisant une grille de score. Dans le cas où les animaux présenteraient des signes de stress, la fréquence des observations serait augmentée. Dans le cas où plusieurs individus seraient affectés en même temps, un vétérinaire serait immédiatement contacté. En cas de signe de souffrance ou de prolongement de comportements anormaux, les individus seront euthanasiés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le poisson zèbre (Danio rerio) est utilisé comme modèle biologique en recherche depuis de très nombreuses années. Ainsi, il existe beaucoup de littérature et de protocoles disponibles pour assurer son élevage et le maintien du bien-être des animaux. Dans le cas particulier de notre projet, les avantages du Danio sont : (i) il présente une fécondité élevée, un temps de génération rapide (3,5 mois) et une petite taille (3.5 cm à l’âge adulte), ce qui en fait un modèle idéal pour des études transgénérationnelles ; (ii) il possède un génome complètement séquencé et de haute qualité, ce qui en fait un modèle idéal pour des études de génétique et d’épigénétique et (iii) il est facile d’identifier le sexe des individus par des caractères sexuels externes à l’âge adulte ce qui en fait un modèle idéal pour des études sur la détermination du sexe. Pour répondre à nos objectifs de recherche, des individus adultes mâles et femelles ainsi que des juvéniles (sexe encore non établi) seront étudiés. En effet, chez le danio, l’ensemble des individus sont initialement femelles et présentent des ovocytes non matures de l’âge de 11 à 21 jours (post fertilisation). Entre les jours 21 et 50, en fonction de la génétique, de l’environnement ou de l’expérience environnementale vécue par les parents, ces ovocytes vont, soit se maintenir, soit dégénérer, permettant le développement de spermatozoïdes et donc de mâles. Après le 50ème jour de vie, le sexe est fixé et tout inversion est impossible. Afin de balayer la période de détermination sexuelle (appelée fenêtre critique), les individus seront analysés à J0 (œufs fécondés, pour analyser la relation parents-enfants), J18 (juvéniles femelles), J25 (début de la différentiation sexuelle), J40 (juvéniles mâles ou femelles) et J135 (adultes matures mâles et femelles).