Procédures légères

Issus d'un programme de croisements mené sur quatre générations, 2 250 médakas vont être utilisés pour établir des lignées mutantes, puis tués une fois ces lignées devenues inutiles. 950 d'entre eux relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 300 d'un niveau modéré. Chacun subit sous anesthésie le prélèvement d'un fragment de nageoire caudale de moins de deux millimètres carrés, geste que le porteur qualifie de bref et peu invasif tout en indiquant qu'il génère une douleur durant plusieurs heures, puis un isolement en aquarium individuel pouvant atteindre vingt-quatre heures. Les deux analyses de comportement prévues à quatorze semaines sur la troisième génération ne sont pas décrites, renvoyées à une demande d'autorisation ultérieure, et le porteur affirme qu'aucun autre modèle expérimental ne permet aujourd'hui de répondre à ce type de question.

Objectifs

L’histoire de vie des individus et les stress auxquels ils ont été soumis peuvent façonner le développement du cerveau et le comportement de leur descendance via des modifications non-génétiques de leur gamète, c’est-à-dire des modifications n’impactant pas la séquence d’ADN héritée par la descendance. Les mécanismes sous-jacents restent cependant encore peu connus chez les vertébrés, particulièrement côté maternel. En effet, de nombreuses études décrivant des effets intergénérationnels associent l’exposition à un stress parental à des modifications non-génétiques des gamètes et/ou à des modifications phénotypiques de la descendance, particulièrement côté paternel. Les études portant sur des effets maternels sont plus rares et concernent le plus souvent des stress post-conception (notamment durant la gestation chez les mammifères), ne rentrant pas dans la définition stricte d’effets intergénérationnels. Bien qu’informatives, ces études décrivent des effets corrélatifs mais sans démonstration de relation causative évidente entre modifications non-génétiques des gamètes et modifications phénotypiques chez la descendance. A l’inverse, ce projet vise à identifier de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle maternel non-génétique du neurodéveloppement et du comportement en tirant profit d’un modèle de poisson vertébré ayant déjà fait ses preuves dans une précédente étude du même type.

Bénéfices attendus

De nombreuses études décrivant des effets intergénérationnels associent l’exposition à un stress parental à des modifications non-génétiques des gamètes et/ou à des modifications phénotypiques de la descendance. Bien qu’informatives, ces études décrivent des effets corrélatifs mais sans démonstration de relation causative évidente entre modifications non-génétiques des gamètes et modifications phénotypiques chez la descendance. A l’inverse, l’approche utilisée dans ce projet permettra d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle maternel non-génétique du neurodéveloppement et du comportement. A plus long-terme, ces données pourraient être utilisés pour comprendre l’adaptation de certaines espèces animales, dont des espèces commerciales, aux stress environnementaux dans un contexte de changement climatique. Elles apporteront également des éléments de connaissance nouveaux dans le déterminisme non-génétique des troubles du neurodéveloppement.

Procédures

Il s’agit de la création de lignées mutantes, avec procédure de fin clip pour leur génotypage. Les animaux subiront, sous anesthésie, un prélèvement d’un petit fragment de nageoire caudale (moins de 2 mm²) afin de permettre leur génotypage et l’établissement des lignées mutantes. L’anesthésie est réalisée par balnéation dans une solution anesthésiante, assurant l’absence de réflexes et de douleur pendant la procédure. Cette manipulation dure moins de 3 minute temps d'induction en anesthésie compris avec un réveil très rapide. Les deux analyses de comportement qui seront réalisées à 14 semaines sur les animaux de 3ème génération ne sont pas décrits car elles feront l’objet d’une nouvelle DAP dans laquelle elles seront décrites précisément.

Impact sur les animaux

Les gènes ciblés dans ce projet jouent un rôle crucial dans le développement du cerveau et ont été impliqués dans des troubles du neurodéveloppement tels que le retard mental et les troubles du spectre autistique. Leur invalidation est susceptible d’entraîner des altérations comportementales, notamment une inhibition des comportements traduisant l’anxiété et une diminution des capacités d’apprentissage. Cependant, l’inactivation génique peut également provoquer des effets hors cible, c’est-à-dire des mutations involontaires en dehors des gènes ciblés. Ces effets sont difficilement prédictibles et peuvent avoir des conséquences variables sur d'autres fonctions physiologiques, allant d’effets bénins à des perturbations plus significatives. Bien que des stratégies de validation et de sélection des lignées soient mises en place pour limiter ces risques, il n’est pas possible de les exclure totalement. Par ailleurs, la procédure de génotypage nécessite une biopsie de la nageoire caudale pratiquée sous anesthésie. Cette intervention, très rapide (moins de 3 minutes/poisson), peut entraîner une douleur légère et transitoire, bien que des mesures de raffinement soient mises en œuvre pour en limiter l’impact. Après la biopsie, les animaux sont isolés temporairement (

Devenir

Les animaux sont euthanasiés après 4 générations (F0 à F3) car les lignées ne seront pas maintenues au-delà des tests de l’analyses préliminaires (et de comportement à 14 semaines le cas échéant).

Remplacement

L’objet du projet étant d’évaluer le rôle de certains gènes dans le contrôle maternel non-génétique du comportement, il nécessite par son essence l’utilisation de modèles expérimentaux animaux. Aucun autre modèle expérimental ne permet à l’heure actuelle de répondre à ce type de question scientifique.

Réduction

Dans ce projet, nous prévoyons de produire 450 poissons pour chaque lignée étudiée. Ces poissons proviennent d’un programme d’élevage en plusieurs étapes. D’abord, des poissons génétiquement modifiés sont croisés avec des poissons de génotype "sauvage" (c’est-à-dire sans modification génétique). Cela donne une première génération composée pour moitié d’individus porteurs d’une seule copie de la mutation étudiée. Ensuite, pour obtenir la deuxième génération, nous croisons ces individus hétérozygotes de la première génération avec d'autres poissons de génotype « sauvage ». Ce croisement permet d’obtenir, une moitié des animaux hétérozygotes, un quart d’animaux qui possèdent deux copies de la mutation (appelés homozygotes mutant) et un quart qui n’en portent aucune (animaux dits homozygotes de génotype "sauvage"). C’est parmi ces homozygotes mutants et ces homozygotes de génotype « sauvage » que seront sélectionnés les poissons géniteurs de la troisième génération qui sera utilisée pour les expériences. Tout au long du processus, le nombre d’animaux produits sera limité au strict nécessaire pour garantir des résultats fiables dans les différentes analyses comportementales prévues. Cela permet de respecter au mieux le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la qualité scientifique du projet.

Raffinement

Les mêmes animaux seront utilisés pour effectués les deux tests de prévus dans le projet. Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums contenant 9,5 litres avec la densité de 25 animaux maximum/aquarium. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte, le prélèvement d’œufs ou la mise en balnéation seront réalisées par du personnel compétent le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement par les zootechniciens. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à l’invalidation génique des gènes cibles) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier) et la Structure Bien etre de l'établissement sera immédiatement avertie. Pendant la procédure de biopsie pour le génotypage, les animaux sont anesthésiés par balnéation dans une solution d’anesthésiant. L'efficacité de l’anesthésie est confirmée par le ralentissement net des mouvements respiratoires et l’absence de réponse à un pincement de la nageoire caudale. Une biopsie d’environ 2 mm2 est prélevée à l’extrémité de la nageoire caudale à l’aide de ciseaux fins désinfectés. Cette procédure, brève et peu invasive, génère une douleur durant plusieurs heures. Afin de limiter la douleur, l’anesthésie est maintenue pendant toute la durée de la manipulation, et les animaux sont replacés en eau propre pour un réveil progressif. Après la biopsie, les animaux sont isolés individuellement pour une durée maximale de 24 heures, en attendant les résultats du génotypage. Bien qu’en aquarium individuel, le contact visuel avec leurs congénères est préservé afin de limiter le stress lié à l’isolement. Bien que cette méthode soit sans risque notable et maîtrisée, tout poisson montrant des signes de mal-être ou de comportement anormal dans les 24h suivant la biopsie est immédiatement retiré de l’expérimentation et euthanasié selon les procédures définies.

Choix des espèces

Les petits poissons téléostéens comme le médaka sont de plus en plus utilisés en laboratoire pour étudier la reproduction, le développement et certains troubles du développement du cerveau. Ils présentent plusieurs avantages : leur génome est connu, les mutations de gènes sont réalisables, et ils sont faciles à élever en milieu contrôlé. Ils ont un cycle de vie court (environ 3 mois), pondent beaucoup d’œufs chaque semaine, ce qui permet d’obtenir de nombreux descendants. Contrairement aux mammifères, leurs œufs se développent à l’extérieur du corps de la mère, ce qui simplifie l’étude des effets transmis d’une génération à l’autre. En effet, chez les mammifères, il est difficile de savoir si certains effets sur les descendants viennent de la gestation, de l’allaitement ou du comportement maternel. Avec les poissons comme le médaka, il est possible d’isoler les vrais effets intergénérationnels. Dans ce projet, les poissons de la deuxième génération seront utilisés comme parents à partir de 3 mois (leur maturité sexuelle). Les tests de comportement seront faits sur la troisième génération à 14 semaines, comme dans l’étude précédente. Les animaux F2 seront utilisés à l'âge adulte, soit à partir de 3 mois, au moment de leur maturité sexuelle comme géniteurs de la génération F3. Les analyses comportementales auront lieu sur la génération F3 âgée de 14 semaines comme pour notre précédente étude.

Un lot de souris est laissé vivre jusqu'à l'âge létal, pour caler la chronologie entre le remodelage moléculaire et l'apparition des phénotypes délétères. 917 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dont 872 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une injection de particules virales dans le sinus rétro-orbitaire, une injection sous-cutanée, une injection intrapéritonéale, et pour une partie d'entre elles un prélèvement de 200 microlitres de sang par incision de la queue juste avant la mise à mort, afin d'élucider le rôle des mitofusines dans les cellules cardiaques et nerveuses. Le porteur justifie le choix de la souris par la présence des mitofusines chez les seuls mammifères et par la possibilité de constituer de grands lots expérimentaux, et juge ce recours "indispensable" à la compréhension du rôle des mitochondries dans l'insuffisance cardiaque.

Objectifs

Les mitochondries sont les centrales énergétiques de nos cellules car elles consomment l’oxygène afin de produire l’énergie chimique nécessaire au fonctionnement cellulaire. Les mitochondries possèdent leur propre génome essentiel qui est essentiel à la production d’énergie. Du fait de leur rôle clé pour l’apport d’énergie, les mitochondries possèdent une machinerie enzymatique complexe contrôlant leur positionnement, leur mobilité et leur morphologie au sein des cellules. Bien qu’exprimées dans l’ensemble de nos cellules, les pertes de fonction des protéines médiant la fusion et la dynamique des mitochondries (comme les mitofusines) aboutissent à des altérations tissues spécifiques telles que l’atrophie optique ou des neuropathies périphériques telles que la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A). La CMT2A est une neuropathie héréditaire sensitivomotrice génétiquement associée à des mutations invalidant la fonction de la protéine mitofusine 2. L’absence de compréhension des mécanismes pathogènes impliqués dans les maladies neurodégénératives associés à la dynamique mitochondriale explique en grande partie les difficultés diagnostiques mais aussi l’absence de traitement pour ces pathologies invalidantes. Les travaux du laboratoire ont récemment mis en évidence que la perte de fonction de mitofusine 2 entrainait une perte du génome mitochondrial causant une crise énergétique cellulaire. La découverte de ce nouveau mécanisme pathogène pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des maladies neurodégénératives associées aux enzymes de la dynamique mitochondriale. Pour autant, bien qu’ayant démontré la validité des modèles transgéniques murins dans l’étude des mécanismes pathogènes des défauts des mitofusines, nos études étaient jusqu’alors concentrées sur des modèles animaux n’atteignant l’âge adulte et donc une maturation du métabolisme cellulaire comparable à celui de l’homme. Ainsi, cette saisine vise à encadrer la validation et l’établissement de nouvelles stratégies permettant de générer des modèles transgéniques chez la souris adulte visant à (i) élucider les différentes fonctions des mitofusines dans les cellules cardiaques et (ii) élucider les mécanismes pathogènes des neuropathies associées à mitofusine 2 à travers une étude se focalisant spécifiquement sur la physiologie des neurones.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment la dysfonction de la fusion mitochondriale peut perturber à la fois le mécanisme gérant la réplication de l’ADN mitochondrial et le métabolisme énergétique. Nos travaux s’inscrivent dans le contexte clinique de la neurodégénérescence périphérique et des cardiomyopathies. Les modèles transgéniques seront générés grâce à l’utilisation de particules virales de dernières générations ciblant spécifiquement soit les neurones soit les cellules cardiaques et deviendront à la suite du projet disponible pour les communautés scientifiques et cliniques. Les nouveaux mécanismes moléculaires découverts dans ce projet seront en partie transposables aux cellules humaines dysfonctionnelles secondairement à l’altération de la dynamique mitochondriale. De plus, nous utiliserons un système de particules virales équivalent à celui utilisé dans le contexte de la thérapie génique chez l’homme. Nous espérons faire avancer les connaissances sur les mécanismes biologiques fondamentaux responsables du développement des symptômes de la CMT2A. Notre objectif à long terme est de participer au développement d’une stratégie thérapeutique pour les patients diagnostiqués avec cette neuropathie périphérique qui à ce jour reste incurable. Nos travaux amèneront également un nouveau regard sur l’impact de la déficience du génome mitochondrial sur l’homéostasie métabolique et énergétique cardiaque avec des applications potentielles dans le domaine de l’insuffisance cardiaque.

Procédures

L'injection dans le sinus rétro-orbitaire des particules virales sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale. Elle prendra en moyenne 3 minutes de l'induction jusqu'au réveil. Les souris recevront une injection sous-cutanée d'anticoagulant puis une injection intrapéritonéale d'un anesthésiant et analgésiant. Le prélèvement sanguin (200µL), réalisé sur une partie seulement des animaux inclus dans le projet, sera effectué sur animal anesthésie et analgésié suite à l’incision au niveau de la queue juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Élevage et suivi des lignées présentant un phénotype délétère : Ces animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie avec feuille d’observation pour suivre la santé et le bien-être. Notamment, la motivation des souris pour (i) s’alimenter, (ii) explorer la cage, et (iii) interagir avec ses congénères seront surveillés. La réduction et/ou l’absence de toilettage seront également surveillés. La feuille d’observation permettra donc de suivre la santé et le bien-être des animaux à travers l’aspect extérieur (activité dans la cage, isolement de l’animale, posture normale ou voutée, aspect du pelage, respiration) et le poids des animaux. Un lot de souris sera suivi jusqu’à l’âge létal afin de définir la temporalité du remodelage moléculaire par rapport au développement des phénotypes délétères. L’atteinte d’un point limite sera communiqué par téléphone et par mail à l’expérimentateur qui prendra alors la décision de l’euthanasie, par dislocation cervicale ou asphyxie au dioxyde de carbone. Procédures expérimentales sur animale vivant : Ces procédures seront strictement restreintes à (i) l’injection dans le sinus rétro-orbitaire des particules virales adéno-associées. La procédure d’injection d’une durée totale de 3 min sera réalisées sous-anesthésie générale et secondairement à l’application d’une analgésie locale au niveau du site d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à l'issue de l'ensemble des procédures expérimentales.

Remplacement

Le premier objectif de ce projet est d’affiner notre compréhension des mécanismes biologiques responsables du développement de la neuropathie périphérique de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A). Le deuxième objectif vise à évaluer les conséquences d’une altération de la réplication du génome mitochondrial sur le fonctionnement et le métabolisme cardiaque. L’incidence fonctionnelle sur le myocarde sera étudiée à travers les modèles transgéniques cardiaques et les mécanismes pathogènes de la CMT2A seront étudiés grâce aux modèles transgéniques neurones spécifiques. Nos analyses requièrent l’utilisation de modèles animaux, qui expriment les protéines mitofusines 1 et 2. Notre projet comprend également la mise en place de nouveaux modèles cellulaires dans lesquels l'invalidation des mitofusines sera induite pendant la culture des cellules et non chez les animaux. Cette stratégie permettra l’établissement d'un modèle d'étude robuste, du point de vue des interprétations scientifiques, assurant ainsi la mise en place d’une stratégie de remplacement solide pour les futurs projets du laboratoire. En effet, la congélation d’ampoules de cellules permettra de réaliser de nombreuses expérimentations visant à caractériser les fonctions des protéines mitofusines sur de nombreux aspects sans avoir à sacrifier de nouvelles souris.

Réduction

La première phase du projet vise à étudier in vitro, sur un nouveau modèle cellulaire inductible, les effets de la perte des mitofusines ou de TFAM (une protéine indispensable pour la réplication de l’ADN mitochondrial) sur le métabolisme énergétique cellulaire. La validation de cette approche réduira de manière significative le nombre de souris nécessaire pour caractériser les effets de l’invalidation des mitofusines ou de TFAM. Les résultats générés par cette première approche guideront en partie le choix des paramètres biologiques à étudier sur animaux et permettra donc d’optimiser le nombre d’animaux à utiliser pour tester la solidité des hypothèses scientifiques du projet de recherche.

Raffinement

Tous les animaux sont utilisés soit pour l’expérimentation soit pour le renouvellement de géniteurs. Nos conditions d'élevage permettent aux phénotypes dommageables de ne pas s’exprimer : cages ventilées, change sous hotte à la pince, litière, eau et aliments stérilisés. Les enrichissements sont variés et adaptés au type d'animaux dans la cage. L’induction des KO via l’injection des AAVs s’exprimera de manière tissue spécifique limitant ainsi la sévérité et le nombre de phénotypes délétères. L’injection des AAVs dans le sinus rétro-orbitaire sera réalisée sous anesthésie en présence d’une analgésie. Les souris gestantes portant les embryons exprimant les KO inductibles ubiquitaires seront utilisées pour la mise en place d’un nouveau modèle de fibroblaste embryonnaire portant le KO d’intérêt qui sera induit in vitro uniquement. Dans notre projet une partie des animaux vivants subiront une injection dans le sinus rétro-orbitaire (réalisée sous anesthésie, durée procédure 3min), une injection sous-cutanée et une injection intrapéritonéale. Les animaux seront surveillés et en accord avec l’application de points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

La souris reste le modèle expérimental de référence pour la mise en place des modifications génétiques permettant l’étude de mécanismes biologiques impliqués dans le développement de maladies humaines. Notre projet vise à mieux comprendre les différentes fonctions des mitofusines, comme la mitofusine 2, dont le dysfonctionnement est responsable du développement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A. Les protéines mitofusines sont uniquement présentes chez les mammifères empêchant ainsi l’utilisation d’organismes modèles unicellulaire (bactéries, levures) ou d'invertébrés. De nombreuses études réalisées par différents laboratoires indépendants ont précédemment établit que le modèle souris transgénique est un modèle valide pour l’étude des maladies neurodégénératives. Le modèle souris permet la production de lots expérimentaux de taille importante offrant une flexibilité au projet de recherche mais également la possibilité de reproduire de nombreuses fois les expérimentations afin d’en évaluer la solidité du point de vue statistique. Finalement, la proximité des mécanismes physiologiques entre la souris et l’homme donne la possibilité de transférer une partie des connaissances développées vers le lit du patient. Notre projet, utilisant des souris adultes (8 semaines), permettra de faire un premier pas vers la clinique en étudiant les mécanismes biologiques de la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A dans un modèle murin adulte. Pour les mêmes raisons l'utilisation du modèle souris s'avère indispensable à la compréhension du rôle des mitochondries dans le développement de l’insuffisance cardiaque.

2 400 souris vont être utilisées pour que 264 d'entre elles portent le génotype recherché, les autres naissant, se faisant couper un bout d'oreille pour génotypage, puis étant tuées faute d'avoir hérité de la bonne combinaison génétique. Les 264 retenues subissent trois injections intrapéritonéales, trois semaines de croquettes additionnées d'un composé de marquage, puis un traitement oral de quinze à vingt jours qui perturbe volontairement leur fonction rénale. Le porteur indique interrompre ce traitement dès détection d'une protéinurie, et déclare un niveau de souffrance modéré pour ces 264 animaux, léger pour les 2 136 autres. L'élevage revient ainsi à huit souris tuées pour une souris étudiée.

Objectifs

Le rein est un organe jouant un rôle fondamental dans la filtration du sang et l’élimination des déchets via l’urine. Ce processus de filtration dépend essentiellement de la bonne santé de cellules du rein appelées podocytes, qui permettent de trier les toxines contenues dans le sang pour les éliminer tout en conservant les éléments sanguins bénéfiques pour le corps. Les podocytes sont endommagés dans 90% des cas de maladies rénales chroniques, et la faible capacité du rein à remplacer ces cellules blessées conduit à une défaillance rénale qui est actuellement incurable. Cependant, des recherches récentes montrent que la régénération des podocytes peut être stimulée de manière efficace. Le renouvellement des podocytes est assuré par des cellules souches adultes qui présentent un marqueur spécifique. Dans ce projet, nous allons utiliser ce marqueur afin de suivre les cellules souches au cours de la régénération des podocytes et d'identifier les facteurs permettant de contrôler l’activation de ces cellules. Ce travail permettra à terme de développer des approches thérapeutiques innovantes afin de traiter les patients souffrants de maladies rénales chroniques. Les effectifs ont été dimensionnés en utilisant G*Power. Pour réaliser l’étude, nous devons produire 264 souris issues de croisements où seul 12,5% des souriceaux présenteront le bon génotype (expérimentaux et témoins). Il faut donc produire 2112 souris pour obtenir les 264 souris nécessaires. En tenant compte des pertes liées à la mortalité juvénile et aux aléas de la génétique mendélienne nous appliquons une marge d’environ 15% amenant à 2400 souris.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les mécanismes régulant les cellules souches des podocytes dans le rein adulte. Ce travail ouvre la voie pour de nouvelles approches thérapeutiques visant à stimuler ou à restaurer la fonction de ces cellules souches des podocytes lorsque les reins sont endommagés.

Procédures

-Prélèvement à l'oreille (génotypage). Durée du prélèvement à l'oreille : 1 seconde. -Trois injections intrapéritonéales (marquage des cellules souches des podocytes). Durée des injections intrapéritonéales : environ 3 secondes. -Alimentation enrichie (croquettes) avec le composé pendant 3 semaines permettant de marquer les cellules souches associée à un supplément appétant dans l’eau de boisson. -Traitement oral (eau de boisson) de 15 à 20 jours pour stimuler la régénération. -Collectes d’urines (suivi de la fonction rénale) par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris.

Impact sur les animaux

Le traitement oral permettant de stimuler la régénération va entrainer une perturbation de la fonction rénale qui peut avoir des conséquences sur l’état de santé général des souris. Toutefois, ce traitement sera interrompu dès détection d’une protéinurie. Les trois injections intrapéritonéales peuvent occasionner une gêne et une inflammation au niveau du site d’injection. Les contentions pour injection et prélèvement d’urine peuvent occasionner un stress. Le prélèvement à l'oreille peut entrainer une nuissance légère.

Devenir

Etude 1 : élevage de souris pour la production des animaux nécessaires aux études 2/3 et génotypage, 12,5% des souris seront incluses en étude 2 ou 3 et le reste des animaux, ne comportant pas le génotype adéquat pour l’étude, sera euthanasié, directement après génotypage ou à la fin de la phase de reproduction. Etudes 2 et 3 : tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques et moléculaires de leurs reins.

Remplacement

La complexité des processus responsable de la régénération des podocytes rénaux ne peut être étudiée que dans un modèle in vivo intégrant tous ces facteurs. La réalisation de ce projet nécessite donc le recours à l’expérimentation animale afin de comprendre les dynamiques de régénération et ainsi de permettre d’envisager des stratégies thérapeutiques innovantes transposables sur l’être humain.

Réduction

Pour cette étude nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et ainsi de garantir l’obtention de résultats pertinents biologiquement tout en minimisant le nombre d’animaux.

Raffinement

Notre expérience sur le modèle nous a permis d’adapter la fréquence de suivi et de préciser les différents points d’observation clinique qui caractérisent de manière précoce et prédictive les points limites. Nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement des animaux. Les urines, collectées après miction spontanée lors de la préhension des souris pendant les examens cliniques, seront analysée afin de suivre l'évolution de la fonction rénale. Les animaux sont hébergés dans un milieu enrichi en portoirs ventilés avec un suivi journalier.

Choix des espèces

Le but de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes régulant la régénération des podocytes dans le rein adulte. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’être humain. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal associé à une régénération efficace des podocytes.

Les expérimentateurs provoquent une lésion musculaire sur une patte arrière des souris d'un lot, et posent chez celles d'un autre lot un plâtre laissé jusqu'à un mois sur ce même membre. 120 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune passant deux à trois examens d'IRM d'environ deux heures sous anesthésie générale. Le porteur qualifie cet examen de "totalement indolore et non invasif", et décrit par ailleurs une douleur de quatre à sept jours après la lésion, une atrophie musculaire sous le plâtre, des irritations cutanées et un stress lié à la restriction des mouvements. Toutes sont tuées à la fin du dernier examen pour que leurs muscles postérieurs soient prélevés.

Objectifs

Ce projet répond à un besoin critique en médecine : disposer de mesures objectives pour suivre la progression des maladies neuromusculaires (NMDs) et fournir des indicateurs fiables pour les essais cliniques. Bien que les biopsies musculaires soient largement utilisées pour la caractérisation des NMDs, elles sont invasives, non répétables en clinique et limitées par l’hétérogénéité de l’atteinte musculaire dans ces maladies. Dans ce contexte, l’imagerie par résonance magnétique (IRM) offre un moyen non invasif d’évaluer régulièrement l’état des muscles dans leur ensemble. Plus spécifiquement, pour les études cliniques, l’IRM de la fraction de graisse est devenue un biomarqueur incontournable pour caractériser l’évolution de la dégénérescence musculaire et son remplacement par du tissu graisseux. Cependant, il existe un besoin urgent de développer une mesure plus anticipative, capable d’évaluer les modifications tissulaires précoces précédant le remplacement graisseux.

Bénéfices attendus

Les maladies neuromusculaires (NMDs) et la sarcopénie sont des affections gravement débilitantes qui impactent profondément la qualité de vie des patients et de leurs proches, tout en imposant un lourd fardeau au système de santé publique. L'absence de mesures objectives permettant de suivre la progression naturelle de ces maladies et de fournir des indicateurs fiables pour les essais cliniques freine le développement thérapeutique. Le développement d'une méthode alternative à la biopsie musculaire, capable de caractériser les altérations microstructurales des muscles dans leur intégralité et de manière répétée, représenterait une avancée significative. Une telle approche améliorerait considérablement la compréhension de la progression des maladies et renforcerait notre capacité à évaluer l'efficacité des traitements. Cette innovation mènerait à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents au développement des maladies, à des stratégies thérapeutiques optimisées et, in fine, à une amélioration notable des soins et de la qualité de vie des patients.

Procédures

Trois lots de souris subiront plusieurs examens identiques d’IRM des membres postérieurs. Chaque examen a une durée maximale d’environ 2 heures. Au terme de leur dernier examen, chaque animal sera euthanasié afin de permettre des prélèvements histologiques musculaires sur les membres postérieurs. Le premier lot servira à établir les valeurs de référence et la précision des différentes métriques d’IRM et d’histologie. Les souris de ce lot subiront trois examens d’IRM espacés d’au moins une semaine. Pendant chaque examen, les souris seront anesthésiées avec un gaz afin d’éviter tout stress ou mouvement, et de garantir leur confort. Leur respiration sera surveillée en continu, et des soins seront apportés pour éviter tout dessèchement oculaire lié à l’anesthésie. Les animaux seront installés confortablement sur le dos, les pattes maintenues délicatement pour assurer des images de bonne qualité. L’examen est totalement indolore et non invasif. Il permet de collecter des données précises sur les muscles des pattes arrière, sans aucune chirurgie. Le deuxième lot de souris, réparties en six groupes, subira deux examens d’IRM. Après le premier examen, qui servira de valeur de référence (Baseline), une lésion musculaire localisée sera induite, sous anesthésie, sur l’un des membres postérieurs. Cette intervention dure moins de 15 minutes. Un analgésique prophylactique sera administré avant la lésion afin de minimiser la douleur et l’inconfort des animaux après l’intervention. Ensuite, chacun des six groupes subira le deuxième examen d’IRM à un intervalle différent après lésion (24 heures, 48 heures, 4 jours, 7 jours, 12 jours et 1 mois). Le troisième lot de souris, réparties en cinq groupes, subira également deux examens d’IRM. Après le premier examen de référence, un des membres postérieurs de chaque souris sera immobilisé à l’aide d’un plâtre, sous anesthésie. Cette intervention dure moins de 20 minutes. Ensuite, chacun des cinq groupes subira le deuxième examen d’IRM à un intervalle post-immobilisation différent (4 jours, 7 jours, 10 jours, 14 jours et 21 jours). Le plâtre sera retiré avant l’examen. De manière générale, pour les groupes soumis à une immobilisation prolongée, le plâtre sera retiré périodiquement, sous anesthésie, pour inspection, hygiène et, si nécessaire, soins du membre immobilisé, puis remis immédiatement. En cas de signes de douleur, un analgésique sera administré une fois par jour.

Impact sur les animaux

Un examen d’imagerie par resonance magnétique (IRM) in vivo nécessite l’immobilisation du sujet pendant la durée de l’examen. Dans ce projet, cela est accompli en réalisant les examens sous anesthésie générale. Cet examen est non-invasif, atraumatique et sans douleurs. La seule nuisance associée à cette procédure une légère diminution du rythme respiratoire, accompagnée d’une légère baisse de la température corporelle pendant la durée de l’examen (moins de 2 heures), attribuable à l’anesthésie. Dans un lot de souris, une lésion musculaire unilatérale sera induite sous anesthésie dans un des membres postérieurs des animaux. Cette lésion peut provoquer de la douleur et une légère réduction de la mobilité pendant les 4-7 jours suivant la lésion, avec un pic inflammatoire observé autour du 4ᵉ jour. Une régénération complète du muscle est prévue un mois après la lésion. Dans un autre lot de souris, l’immobilisation d’un des membres postérieurs à l’aide d’un plâtre entraînera une diminution modérée de la mobilité. Cette immobilisation sera réalisée sous anesthésie générale et induira un processus d’atrophie musculaire dans le membre concerné. Les souris pourraient également ressentir du stress en raison de l’inconfort causé par le plâtre et par la restriction de leurs mouvements naturels. De plus, une irritation cutanée sous le plâtre pourrait survenir.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale afin de permettre des prélèvements musculaires sur les membres postérieurs pour des analyses histologiques.

Remplacement

Les techniques développées dans ce projet ont pour objectif final l’imagerie quantitative in vivo. Des processus physiologiques tels que les échanges compartimentaux (intracellulaire, interstitiel, vasculaire) et la perfusion tissulaire influencent significativement le signal de RMN et, par conséquent, le modèle biophysique à établir. À ce jour, aucun substitut synthétique ne permet de reproduire fidèlement les caractéristiques du tissu musculaire vivant, ce qui nous contraint à recourir à l’expérimentation animale dans le cadre de ce projet.

Réduction

L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir de nombreuses informations différentes sur les muscles, à partir d’un seul examen. Comme cet examen est non invasif et sans douleur, il peut être répété plusieurs fois sur le même animal sans effet nocif. Cela permet de suivre l’évolution des tissus dans le temps tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Pour cette étude, un total de 120 animaux sera utilisé, répartis en 12 groupes de 10 souris. Ce nombre a été déterminé grâce à un calcul préalable (calcul de puissance) afin de garantir que les résultats obtenus soient fiables et statistiquement significatifs. En effet, il est important d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour pouvoir identifier clairement les effets étudiés, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Des analyses statistiques seront nécessaires pour interpréter correctement les résultats. Elles permettront notamment d’évaluer la fiabilité des mesures IRM, de déterminer si les changements observés dans les muscles sont significatifs, et de comparer les résultats obtenus par IRM avec ceux observés au microscope après prélèvement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, de fond plat avec de la litière de contact et bénéficiant d’un environnement enrichi avec du papier absorbant et des tubes en carton pour la construction de nids. Les animaux bénéficiéront également d’une période d’acclimatation d’au moins 10 jours. Les examens IRM se dérouleront sous anesthésie générale afin de garantir l’immobilité des animaux pendant les acquisitions et de minimiser leur stress. Afin de prévenir le dessèchement de la cornée et d’assurer le bien-être des animaux pendant les examens prolongés sous anesthésie, un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des souris dès l’induction de l’anesthésie. La température corporelle sera maintenue à environ 38 degrés Celsius à l’aide d’un tapis chauffant, et la fréquence respiratoire surveillée en continu. Pour le lot de souris subissant une lésion musculaire localisé, un analgésique prophylactique sera administré pour minimiser la douleur et l’inconfort post-lésion. Les animaux dont un membre postérieur est immobilisé par un plâtre seront surveillés quotidiennement. Le plâtre sera conçu de manière à laisser les orteils de la patte immobilisée visibles, permettant ainsi de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de complication. Une attention particulière sera portée aux signes tels qu’un grattage excessif du membre immobilisé, des irritations cutanées, des blessures dans la partie proximale du membre, ou une coloration anormale des orteils. Le plâtre sera retiré au moins une fois à chaque 7 jours, sous anesthésie, afin de garantir l’hygiène de la patte et d’évaluer son état. En cas de blessure superficielle, la zone sera désinfectée et un pansement appliqué. Si des signes de douleur sont observés, un analgésique sera administré. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Toute modification significative et persistante du comportement, qui puisse suggérer un signe de douleur excessive constituera un critère d’arrêt de l’expérimentation. Dans ce cas, l’euthanasie de l’animal sera réalisée conformément aux protocoles éthiques en vigueur.

Choix des espèces

En raison de leur petite taille et de la facilité avec laquelle elles peuvent être hébergées, les souris constituent un modèle animal pratique à manipuler. Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche biomédicale et a été développé pour étudier un large éventail de pathologies humaines, en particulier les maladies Neuromusculaires. Par ailleurs, notre laboratoire a développé de nombreux outils dédiés à l’imagerie et à la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, spécifiquement adaptés à l’étude du muscle squelettique chez les souris. Du point de vue technique, la petite taille des souris est aussi compatible à l’étude par RMN dans des machines d’IRM considérablement plus petites et moins couteuses, même si à haut champ magnétique. Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux adultes jeunes (12 à 16 semaines). Ce choix permet de s’affranchir des variations liées au développement/maturation tissulaire qui peuvent avoir un impact significatif sur les mesures. Cet intervalle d’âges inclut les différents points temporels décrits dans les procédures expérimentales.

1 836 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune peut recevoir jusqu'à 700 injections ou administrations de composés et subir jusqu'à 50 prélèvements de sang sur animal vigile, sans que le résumé explique d'où viennent ces plafonds. Les expérimentateurs leur provoquent une stéatose du foie par un agent chimique ou un régime gras, avec des douleurs inflammatoires que le porteur dit quantifier par un score quotidien, pour tester des candidats médicaments avant une éventuelle phase clinique. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ni aucune modélisation informatique n'est à même de remplacer "l'animal entier".

Objectifs

La NAFLD (stéatose hépatique non alcoolique) est une maladie chronique du foie qui est due à l’accumulation anormale de graisses dans les cellules du foie. Cette maladie survient chez des patients ayant un ou plusieurs facteurs de risque parmi les suivants : surpoids ou obésité, diabète de type 2, hypertension artérielle, dyslipidémie (augmentation du cholestérol ou triglycérides) ou syndrome d‘apnée du sommeil. Elle survient également en absence d’une consommation excessive d’alcool. D’abord silencieuse, la maladie évolue défavorablement en l’absence de mesures hygiéno-diététiques rectificatives. Quand l’accumulation de graisses est trop importante au niveau du foie, cela engendre une inflammation chronique et la destruction des cellules hépatiques : c’est la NASH (stéatohépatite non alcoolique). La destruction des cellules engendre, elle, la formation de tissus cicatriciels fibreux non fonctionnels : c’est la fibrose également appelée cirrhose, à son stade ultime. Les mécanismes impliqués dans cette évolution sévère sont encore mal clarifiés. En raison de sa prévalence mondiale croissante, divers modèles animaux reflétant à la fois la physiopathologie et l’histopathologie de chaque stade de la NAFLD/NASH sont disponibles. Ceci est essentiel pour déterminer la progression de la maladie et aide également à évaluer différentes approches thérapeutiques pour le traitement de stades spécifiques de la NAFLD. Ce projet a donc pour but de tester de nouveaux candidats médicaments anti-fibrotiques et anti-inflammatoires dans un modèle de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) induite par un agent chimique ou un régime alimentaire gras particulier. Nous nous attendons donc à une amélioration de la pathologie pour les groupes traités.

Bénéfices attendus

D’abord silencieuse, la maladie évolue défavorablement en l’absence de mesures hygiéno-diététiques rectificatives. Une caractéristique des maladies chroniques du foie est une inflammation persistante qui contribue à leur progression vers des stades plus sévères, et notamment l’évolution vers la fibrose et son stade ultime, la cirrhose. Le seul traitement est la transplantation de foie, le but est ici d'étudier d’autres pistes thérapeutiques. Nous nous attendons dans ce projet à une amélioration de la pathologie pour les groupes traités qui consiste à une diminution de l’inflammation ainsi que de la fibrose.

Procédures

Maximum 50 prélèvements de sang sur animaux vigiles durant l'étude et un prélèvement terminal sous anesthésie (30 secondes/prélèvement). Maximum 700 injections/administrations de composés par animal (30 secondes/injection).

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie. La douleur pourra générer une perte de poids et être quantifiée par des scores attribués quotidiennement (pesée quotidienne). L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques, ainsi de valider notre modèle et d’analyser l’effet des différentes molécules testées.

Remplacement

Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation, fibrose du foie chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie ou d’une combinaison thérapeutique. Ces nouvelles thérapies sont en premier lieu testées et validées sur des lignées cellulaires afin de sélectionner les doses à appliquer in vivo pour l'étude d'efficacité. Cependant, les méthodes substitutives à l’expérimentation animale ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament, test nécessaire avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré et des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. - Notre localisation nous donne de nombreux avantages en termes d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale, de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux - Animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, notamment dans les modèles de fibrose hépatique. Les animaux sont utilisés au stade adulte et âgés de 7 à 12 semaines à l'arrivée afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).

Anesthésiés pour une collecte de sperme ou une biopsie de la nageoire caudale, 950 poissons zèbres adultes servent à produire et identifier les lignées, puis sont tués à la fin de la période de reproduction. Leurs larves, âgées de cinq à sept jours, forment l'essentiel des 11 750 animaux du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 5 400 d'entre elles sont immobilisées dans un gel, parfois avec un agent paralysant, et restent vigiles pendant trente minutes d'imagerie du cerveau, sous des impulsions électriques que le porteur compare à une brève piqûre d'aiguille. 5 400 autres passent jusqu'à trois heures de tests de locomotion, sous variations de lumière et champ électrique. Toutes sont tuées à l'issue, puis fixées pour être observées au microscope.

Objectifs

Une bonne réponse aux situations stressantes est essentielle pour la survie. Face à des menaces, les animaux ont tendance à réagir de manière automatique : ils fuient ou se figent sur place, avant de revenir à une activité normale. Ces comportements ne peuvent pas être réalisés en même temps, mais se produisent successivement. Si ces réactions sont mal adaptées, cela peut entraîner des troubles comme la dépression, l'anxiété ou la dépendance chez l'homme. Bien que les scientifiques aient déjà repéré des zones du cerveau impliquées dans ces comportements, il reste difficile de comprendre précisément pourquoi certaines régions s'activent plutôt que d'autres. Une zone spécifique, appelée le noyau habénulointerpédonculaire (Hb-IPN), est particulièrement importante pour les réponses liées à la peur et au stress. Cette zone fonctionne grâce à deux circuits opposés qui se régulent mutuellement : quand l'un est activé par un stimulus négatif, l'autre est inhibé. En utilisant les larves de poisson zèbre, dont le cerveau est transparent et facile à observer, ce projet cherche à mieux comprendre comment une structure asymétrique du cerveau gère les informations provenant de l'extérieur et influence nos réactions face au stress.

Bénéfices attendus

Les troubles mentaux, comme la dépression, l’anxiété, le syndrome de stress post-traumatique ou la toxicomanie, représentent un problème de santé majeur. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), une personne sur cinq en France sera touchée par l'un de ces troubles au cours de sa vie. Pourtant, on comprend encore mal ce qui déclenche ces troubles et comment ils se développent. En outre, les traitements actuels sont souvent peu efficaces, surtout pour plus de la moitié des patients. Ces troubles mentaux sont liés à un dérèglement des comportements de réaction au stress, qui sont des réponses physiques et émotionnelles aux stimuli extérieurs. Avant de pouvoir trouver de meilleurs traitements, il est essentiel de comprendre comment ces réactions se mettent en place, au niveau biologique et moléculaire. Ce projet se concentre sur une zone particulière du cerveau, appelée la voie Hb-IPN, qui est impliquée dans les réactions à la peur et au stress. Bien qu'elle soit présente chez de nombreuses espèces, cette zone reste peu étudiée. Grâce à des techniques modernes, nous cherchons à comprendre comment les deux circuits principaux de cette voie fonctionnent et interagissent pour moduler les réponses physiques face à des situations stressantes. L’objectif est de mieux comprendre comment cette voie influence les comportements liés au stress, à l’anxiété ou à la dépendance, comme celle à la nicotine. Ce travail pourrait permettre de découvrir de nouvelles cibles pour des médicaments plus efficaces contre ces troubles. La voie Hb-IPN contient des récepteurs qui réagissent à certaines substances chimiques. En étudiant ces récepteurs, nous pourrions identifier de nouveaux composés capables de modifier leur activité. L’utilisation du poisson zèbre pour la recherche de médicaments a déjà montré son efficacité. À long terme, notre projet pourrait contribuer à trouver de nouvelles molécules qui aideraient à soulager les symptômes de troubles mentaux, tels que le stress post-traumatique ou l’anxiété.

Procédures

150 poissons zèbres seront soumis à une seule collecte de sperme par individu de manière non invasive et sous anesthésie pour préserver la lignée. L'ensemble de la procédure ne dépassera pas 3 minutes hors de l'eau. Pour identifier le génotype des 800 poissons adultes issus de la génération de nouvelles lignées, nous réaliserons une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie. La nageoire servira à extraire l'ADN utilisé pour le génotypage. C'est la méthode la moins invasive pour génotyper les poissons. Cette procédure ne dépasse pas 20 secondes par individu et n’est réalisée qu’une fois dans la vie de l’animal. Les procédures suivantes seront réalisées sur des larves âgées de 5 à 7 jours. Afin d'enregistrer l'activité neuronale, nous réaliserons une imagerie calcique de larves transgéniques. Nous mesurerons d'abord l'activité spontanée des larves puis elles seront soumises à des tests pharmacologiques ou à un faible potentiel de champ électrique. Il s'agit d'une approche à haut débit qui réduit le temps de manipulation des poissons : la procédure est limitée à 30 minutes par larve. Les 5400 larves seront vigiles durant l’imagerie calcique. Pour modifier l'activité neuronale dans le cerveau, nous réaliserons des expériences pharmacologiques, soit par une application aiguë (30 min) soit par une application chronique (3 jours). L'expérience pharmacologique sera réalisée lors d'imagerie calcique (aiguë) ou de tests comportementaux (aigus ou chroniques). L'activité locomotrice sera enregistrée lors d'une activité spontanée (pas de stimulus externe), de changements de lumière (présence ou absence de lumière) ou d'applications de potentiels de champ électrique doux (10 minutes de base, application d'un faible potentiel de champ électrique, d’une durée inférieure à 100 millisecondes, 10 fois à 1 minute d'intervalle, 10 minutes de récupération). Ces tests ne dépasseront pas 3 heures. Les 5400 larves utilisées dans cette procédure seront vigiles.

Impact sur les animaux

Nous immobiliserons les larves dans un gel avec ou sans ajout d’un agent paralysant. Il s'agit d'une procédure de routine dans le domaine qui est nécessaire pour réaliser une séance d’'imagerie à l'aide d'un microscope (30 minutes maximum). Nous administrerons un léger champ électrique aux larves immobilisées pour effectuer une imagerie afin d'analyser leur activité́ cérébrale et les mouvements de la queue. Les animaux peuvent ressentir un certain inconfort dû à l’immobilisation. Le champ électrique sera délivré́ pendant une durée inférieure à 100 millisecondes. Les animaux peuvent ressentir une douleur comparable ou inferieure à celle d'une brève piqûre d’aiguille. Concernant les poissons adultes nous devrons les génotyper afin de savoir s’ils ont ou non la mutation désirée. Pour ce faire nous réaliserons sous anesthésie une biopsie de la nageoire caudale. Les animaux peuvent ressentir une douleur inférieure ou égale à celle occasionnée par une brève piqûre d’aiguille au réveil de l’anesthésie qui n’affecte en rien leurs capacités motrices. Ils seront par la suite placés dans des bacs d’hébergement individuel, ce qui peut occasionner un stress si ce mode d’hébergement dure trop longtemps. Le stress disparait aussitôt que les animaux sont remis en groupe d’au moins 2 individus.

Devenir

Les animaux ayant été génotypés et/ou dont le sperme a été prélevé seront euthanasiés à la fin de la période de reproduction. Concernant les larves, elles sont euthanasiées à l’issue des procédures d’imagerie calcique et de comportement. Elles sont alors fixées pour une étude immunohistochimique

Remplacement

L’étude dynamique des processus de la morphogenèse (mise en place du système nerveux, dont la synaptogenèse) est essentielle pour comprendre de nombreuses étapes du développement embryonnaire normal et pathologique. La morphogenèse de tissus et d’organes complexes, comme le système nerveux central, ne peut être reproduite totalement in vitro et nécessite de recourir à des organismes modèles animaux.

Réduction

Afin d’appliquer le principe de réduction nous limitons le nombre d’animaux au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement fiables et significatifs. Nous utilisons une approche statistique pour déterminer le nombre d'indivudus nécessaire et obtenir des données valides. Par ailleurs, dès que cela est possible, nous partageons les poissons entre plusieurs projets et nous mutualisons toutes les lignées de poissons sauvages et certaines lignées transgéniques entre les différentes équipes utilisatrices. De même, lorsqu’il y a suffisamment d’œufs fécondés, nous partageons les pontes entre plusieurs expérimentateurs. Dans le but de réduire le nombre d’animaux présents dans l’animalerie, d’éviter de renouveler des lignées transitoirement inutilisées et de ne pas procéder à des expériences de génotypage, nous avons mis en place la congélation de sperme afin de conserver ces lignées. En tenant compte de tous ces paramètres nous estimons que nous aurons besoin de 11750 animaux âgés de plus de 5 jours afin de mener à bien ce projet.

Raffinement

Nous surveillons les conditions d’hébergement des animaux et leur état de santé (établissement de points limites). Les conditions salines (conductivité-pH) et de température de l’eau sont contrôlées en permanence et quotidiennement reportées sur un registre. En cas d’anomalie, les conditions sont modifiées pour revenir à la normale. Les teneurs en ammoniaque, nitrates et nitrites sont vérifiées hebdomadairement. Les poissons zèbres sont élevés en groupe dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure). Les poissons zèbres sont maintenus à une température de 26 degrés Celsius, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères (nourriture vivante), ce qui leur permet de chasser. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les utilisateurs. Des points limites ont été établis : maigreur, nage lente ou anormale, perte d’appétit. Une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout changement physique ou comportemental et de lui attribuer un score a été établie. Un animal est surveillé plus attentivement que d’habitude lorsque le score est de 1. Un score de 2 requiert, en plus d’une surveillance attentive, un hébergement individuel et des soins en cas de besoin sur une semaine puis réévaluation de l’état de l’animal. Un score de 3 est le point limite pour lequel il faut euthanasier l’animal. Par ailleurs dès que les procédures le permettent, nous anesthésions les animaux.

Choix des espèces

Le poisson zèbre (Danio rerio, zebrafish) est un modèle vertébré reconnu pour l'étude du développement embryonnaire. Il se développe rapidement et à l'extérieur de la mère, de sorte qu'il n'est pas nécessaire d'euthanasier la mère pour étudier son développement. Il pond un grand nombre d'œufs en même temps (jusqu'à 200 œufs) ce qui permet de réaliser de nombreuses expériences à la fois. Les embryons sont transparents permettant une visualisation aisée de l'activité neuronale et du développement cellulaire par l'expression de molécules fluorescentes spécifiques. Les embryons sont faciles à élever car ils se développent dans un incubateur à 28 degrés Celsius. Pour de nombreux projets, nous travaillons sur des embryons de moins de 5 jours, qui n'entrent pas dans le cadre de la réglementation sur l'expérimentation animale. Nous utilisons des embryons jusqu'à 7 jours, afin d'étudier la formation des synapses et l'activité neuronale dans une zone peu étudiée du cerveau appelée le système habénulo-interpédonculaire. Cette zone du cerveau est extrêmement difficile à étudier chez les rongeurs car elle est située en profondeur, alors que chez le poisson zèbre, elle se trouve à la surface même du cerveau.

Récupérées après l'annulation d'une étude ou issues d'un premier projet déjà autorisé, une partie des 4 115 souris de ce projet arrive avec un passé expérimental. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 330 réutilisées ensuite et les 3 785 autres tuées. Chaque animal peut recevoir une greffe de cellules tumorales, jusqu'à quatre administrations par jour pendant huit semaines et deux micro-prélèvements sanguins quotidiens, avant un prélèvement de sang terminal. Le projet ne produit pas de résultat propre, il fournit du sang, des tissus et des tumeurs à d'autres études. Sur le remplacement, le porteur écrit que l'objectif étant de fournir des échantillons d'origine murine, il est donc "nécessaire" d'utiliser des animaux.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. Dans ce cadre, un certain nombre d’études in vitro et ex vivo nécessite la mise à disposition d’échantillons biologiques d’origine animale (sang, tissus, organes, tumeurs,…) pour, notamment, permettre la mise au point de méthodes analytiques nécessaires aux futures études in vivo, comprendre les processus pathologiques, comprendre le mode d’action des composés testés, vérifier l’expression des cibles d’intérêt et contribuer à la sélection des meilleurs candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra la mise au point de méthodes analytiques nécessaires aux futures études in vivo, la compréhension des processus pathologiques, comprendre le mode d’action des composés testés, la vérification de l’expression des cibles d’intérêt et contribuera à la sélection des meilleurs candidats médicaments.

Procédures

• Sur animal vigile : Greffe de cellules tumorales (1 injection, 15 s) ; Administration de composé thérapeutique (jusqu’à 4 administrations maximum 1 fois /jour pendant 8 semaines maximum, 15 s) ; Administration de molécule déplétante, activatrice/stimulatrice, neutralisante (jusqu’à 4 administrations maximum 1 fois/jour pendant 8 semaines maximum, 15 s) ; Micro-prélèvement de sang (maximum 2 fois/jour, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang (maximum 4 fois, 30 s) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois /semaine pendant 8 semaines maximum, 15s) ; Administration de molécule déplétante, activatrice/stimulatrice, neutralisante (maximum 2 fois /semaine pendant 8 semaines maximum, 15s) ; Prélèvement de sang terminal (1 fois, 5 min).

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales. Stress et douleur légère lors de l’administration du(des) composé(s) thérapeutique(s) ou de(s) la molécule(s) déplétante, activatrice/stimulatrice et/ou neutralisante. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée). Possibilité d’effets indésirables liés aux composé thérapeutique ou molécule : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.

Devenir

A l’exception des animaux pouvant être réutilisés l’ensemble des animaux sont mis à mort lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de la procédure ; Prélèvement sanguin terminal ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort ; Fin de l’étude.

Remplacement

L’objectif du projet étant de fournir des échantillons biologiques d’origine murine, Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de celui-ci.

Réduction

Le nombre d’animaux est déterminé en fonction de la quantité minimale de sang et/ou d’autres prélèvements biologiques strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront des animaux devant faire l’objet de réaffectation de projet en cas d’annulation d’étude ou issus d’un premier projet autorisé. Dans le cas des procédures nécessitant l’administration de composés, ceux-ci sont préalablement testés in vitro et sélectionnés sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seuls ceux présentant la meilleure activité sont choisies pour être évalués chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. Un maximum de 95 études sera mené sur 5 ans.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, mise à mort de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. L’apparence/comportement de l’animal, l’aspect et le volume de la tumeur ainsi que la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de la procédure, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou la mise à mort de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé, la molécule (déplétante, activatrice/stimulatrice, neutralisante) et/ou les cellules tumorales greffées pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (jusqu’à 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Les analyses effectuées à partir des prélèvements biologiques étant directement liées aux études in vivo réalisées dans d’autres projet, il est donc indispensable d’utiliser la même espèce que dans celle-ci. Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans la procédure, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.

Seize séances d'imagerie sous anesthésie et treize mesures de tumeur au pied à coulisse pour un même animal : 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent aussi un rasage du ventre, jusqu'à deux injections et des transports entre deux établissements distincts. L'objectif déclaré est de modifier des cellules immunitaires pour qu'elles pénètrent mieux dans les tumeurs solides, contre lesquelles le porteur reconnaît que ces traitements restent peu efficaces. Il justifie le recours à la souris en affirmant que le développement tumoral et les infiltrats immunitaires y sont les mêmes que chez l'être humain.

Objectifs

Les traitements anticancéreux utilisant les propres cellules immunitaires du patient ont révolutionné le traitement des tumeurs. Cependant, une partie des patients ne répond toujours pas efficacement à ces thérapies. De plus ces traitements sont pour l'instant moins efficaces contre les tumeurs solides. Une des raisons peut être la faible capacité migratoire de ces cellules immunitaires. L’objectif de ce projet est de trouver les meilleures modifications à apporter à ces cellules pour leur permettre de mieux pénétrer dans les tumeurs et en limiter la croissance. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes responsables de l’efficacité de thérapies cellulaires anticancéreuses utilisant des cellules immunitaires. Des bénéfices thérapeutiques sont attendus concernant le traitement de certaines tumeurs solides.

Procédures

Les animaux de ce projet seront élevés dans l’établissement EU1 et les expériences se dérouleront dans les établissements EU1 et EU2. Les animaux auront une partie de peau ventrale rasée (1 à 2 minutes). Les animaux subiront des injections (1-2 minutes, 2 injections maximum par souris). Les animaux seront anesthésiés et soumis à des séances d’imagerie (15 minutes maximum; 16 séances maximum). La taille de la tumeur chez certains animaux sera mesurée avec un pied à coulisse (1 minute, 13 séances maximum).

Impact sur les animaux

Les souris subiront un stress léger consécutif à leur manipulation hebdomadaire et au transport. Elles subiront un stress et une douleur légère lors du rasage des poils et des injections. Elles pourront éprouver un stress lors des anesthésies. Elles pourront éprouver une gêne et une douleur lors du développement de la tumeur. Enfin, certains animaux pourraient subir un stress de voir disparaitre leurs congénères en particulier en fin d’expérience jusqu’au point de se retrouver eux-mêmes isolés dans la cage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure expérimentale (afin de prélever leurs tissus et organes à des fins d'analyses) ou si les points limites seront atteintes.

Remplacement

Un grand nombre d’expériences de culture cellulaire a été realisé, montrant une amélioration des fonctions antitumorales des cellules immunitaires humaines modifiées par plusieurs stratégies. En effet, ces stratégies améliorent les capacités de migration de ces cellules immunitaires. Le recours aux modèles animaux est maintenant incontournable car ils permettront de valider nos différentes observations dans des modèles précliniques de tumeur pertinents et reconnus par la communauté scientifique.

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d’animaux contrôles sont réduits au minimum nécessaire. Le nombre de souris utilisées a été estimé de façon à obtenir des résultats exploitables statistiquement.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe social avec de l’enrichissement. Les interventions pouvant susciter de la douleur seront effectuées sous anesthésie. Les animaux seront régulièrement surveillés. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place, leur atteinte éventuelle entrainera la mise à mort anticipée de l’animal souffrant. Lors du transfert entre les 2 établissements, les souris seront dans des boites de transport avec de la nourriture et de l’enrichissement.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix et de référence pour les études in vivo des réponses immunitaires antitumorales car le développement de la tumeur et les infiltrats immunitaires sont les mêmes chez la souris et chez l'homme. Les souris utilisées pour la reproduction seront mis en accouplement à partir de 8 semaines. Les souris utilisées pour les expériences d’étude de la réponse immunitaire contre la tumeur seront âgées de 7 à 12 semaines, une tranche d’âge correspondant au jeune adulte adapté pour ce genre d’études en vertu de l’absence de biais éventuels dûs aux changements physiques et hormonaux liés au développement autant qu’au vieillissement.