Procédures légères

1 940 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 100 finissent morts, 500 sont réutilisés dans un second essai et 1 340 sont renvoyés à l'élevage ou vendus à d'autres éleveurs. Chaque animal peut être piqué jusqu'à quatre fois entre 21 et 180 jours d'âge, à la jugulaire ou à l'oreille, immobilisé au trépied ou au lasso, une contention qui exerce une pression sur le groin et empêche toute fuite pendant deux à cinq minutes. La finalité est de mettre au point des aliments pour porcs d'élevage conventionnel destinés à la consommation humaine, avec des enjeux que le porteur décrit comme économiques, écologiques et sociétaux. Il écrit que les animaux concernés "ne sont pas des animaux de laboratoire mais sont élevés comme en élevage porcin conventionnel", tout en les déclarant au registre européen de l'expérimentation animale.

Objectifs

La mission de notre centre de recherche est de mettre au point des aliments destinés à l’alimentation des porcs, élevés dans des élevages conventionnels à destination de l’alimentation humaine. Au cours de nos essais, nos principales mesures sont les suivantes : consommation d’aliments, évolution de la croissance, suivi de la santé des porcs. Afin d’approfondir certaines thématiques d’essais, nous sommes parfois amenés à réaliser des prélèvements sanguins pour évaluer l’impact de la nutrition sur plusieurs mécanismes de l’organisme animal (reproduction, stress, immunité, etc.). Certains de nos essais s’inscrivent dans la poursuite d’études au niveau cellulaire ayant déjà permis de réduire et cibler le nombre de paramètres à étudier sur les animaux. Le projet consiste donc à réaliser des prélèvements sanguins pour mesurer des paramètres sanguins d’intérêt pour la compréhension des mécanismes de l’organisme (marqueur d’inflammation, marqueur du stress, glycémie, enzymes hépatiques, etc.). L’objectif est d’évaluer les besoins nutritionnels des porcs à plusieurs stades physiologiques pour adapter au mieux les niveaux nutritionnels des aliments. La nutrition des animaux, comme de l’homme, a des effets simultanés sur de nombreux mécanismes biologiques dans l’organisme. Les formules alimentaires pourraient, dans certaines conditions d’élevage, avoir des effets différents sur la santé, la reproduction, le bien-être des animaux et/ou sur la qualité de leurs produits. Avant de généraliser une solution nutritionnelle à un grand nombre d’animaux en élevage, il est nécessaire d’évaluer les impacts sur l’organisme sur un nombre limité d’animaux. Les enjeux sont non seulement économiques (coût de formulation des aliments, performances des animaux), mais aussi écologiques (émissions de gaz à effet de serre), et sociétaux puisque l’alimentation participe au bien-être des animaux. Dans un contexte actuel de réduction de l’impact environnemental des pratiques d’élevages, les formulations des aliments sont particulièrement retravaillées pour incorporer de nouvelles matières premières ou ingrédients (nouvelles sources par ex) répondant à cet enjeu. Cela nécessite de réévaluer l’impact de ces nouveaux aliments sur l’organisme, la croissance et la santé des porcs.

Bénéfices attendus

L’intérêt est d’évaluer les besoins nutritionnels des porcs à plusieurs stades physiologiques pour adapter au mieux les niveaux nutritionnels des aliments. La nutrition des animaux, comme de l’homme, a des effets simultanés sur de nombreux métabolismes. Les aliments testés, bien que répondant aux besoins nutritionnels des animaux, peuvent avoir des impacts métaboliques non décelables macroscopiquement par la seule observation des animaux. Les formules alimentaires pourraient, dans d’autres conditions d’élevage, avoir des effets différents sur la santé, la reproduction, le bien-être des animaux et/ou sur la qualité de leurs produits. Avant de généraliser une solution nutritionnelle à un grand nombre d’animaux en élevage, il est nécessaire d’évaluer les impacts métaboliques sur un nombre limité d’animaux. Pour cela, il est fait appel à des marqueurs tissulaires permettant d’évaluer le statut nutritionnel, l’état de santé, l’état immunitaire ou de stress de l’animal avant et après application d’une stratégie alimentaire. Les enjeux sont non seulement économiques (coût de formulation, performances des porcs), mais aussi écologiques (émissions de gaz à effet de serre), et sociétaux puisque l’alimentation participe au bien-être des animaux. Dans un contexte actuel de décarbonation des pratiques d’élevages, les formulations des aliments sont particulièrement retravaillées pour incorporer de nouvelles matières premières (nouvelles sources, process, variétés) répondant à cet enjeu. Cela nécessite de réévaluer l’impact de ces nouvelles pratiques nutritionnelles sur les métabolismes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins par ponction jugulaire ou cutanée. Les prises de sang sont des actes reconnus d’élevage et sont réalisées par un personnel qualifié et préalablement formé. Ces prélèvements sont réalisés sous contention d’animaux vigiles. La procédure se déroule en 3 phases successives : mise en place de la contention, ponction jugulaire ou cutanée et prélèvement, retrait de la contention et distribution d’une récompense sous forme d’eau sucrée par exemple. La méthode de contention est adaptée en fonction du stade physiologique de l’animal : utilisation d’un trépied ou d’un lasso. Pour la ponction jugulaire, la zone de prélèvement est située à la base du cou. Le sang est récupéré dans des tubes : le volume de sang prélevé peut aller de 5 à 12 ml maximum. Dans le cadre d’une ponction cutanée, la zone peut être l’oreille ou bien la queue. La zone est percée à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette stérile. Les gouttes de sang sont récupérées via la lancette ou un buvard par ex pour être analysées immédiatement. Au global, la phase de contention + prélèvement peut durer entre 2 et 5 min par animal. Un animal âgé de 21 j à 180 j d’âge pourra être prélevé au maximum 4 fois sur cette période d’âge en respectant un intervalle de 2 semaines pour les jeunes animaux (âgés de 21 à 35 j) puis un intervalle d’une semaine pour les animaux âgés de plus de 35 j.

Impact sur les animaux

La réalisation de la contention avec le lasso peut entrainer une douleur légère pendant la durée du prélèvement (entre 2 et 5 min maximum), à cause de la pression exercée par le lasso sur le groin de l’animal. Cette étape peut également entrainer de la peur et du stress puisque cela contraint l’animal et l’empêche temporairement d’accéder à une zone de fuite. Pour réaliser la ponction, la piqure d’aiguille entraine une douleur légère de courte durée, équivalente à la durée du prélèvement et peut induire également du stress et de la peur.

Devenir

En fonction de l’état général des animaux (application des mêmes signes que ceux listés dans les points limites), les animaux poursuivent leur croissance/vie dans nos locaux d’élevage ou sont vendus à d’autres éléveurs. Certains animaux prélevés par exemple en post-sevrage peuvent être réutilisés dans un essai engraissement avec procédure de prélèvement sanguins. Dans ce cas, dans un objectif de prise en compte du bien-être de nos animaux, si il est souhaité de prélever des animaux à la fois en stade post-sevrage et engraissement alors le nombre maximum de prélèvements sur les 19 semaines (7 + 12 semaines) est plafonné à 4 prélèvements, en respectant toujours les 2 semaines d’intervalles minimum entre 21 et 35 j d’âge.

Remplacement

Les méthodes actuelles cellulaires menées en laboratoire ne sont malheureusement pas toujours suffisantes pour comprendre les relations complexes entre les différents mécanismes de l’organisme, entre les individus ou encore avec l’environnement. C’est pourquoi, pour certaines thématiques d’essais, il n’existe pas de méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux. Lorsque d’autres indicateurs (autres que sanguins) sont possibles alors le prélèvement de sang est remplacé par une autre méthode moins invasive (collecte d’urine et/ou de déjection au moment de la défécation). Cette stratégie a d’ailleurs été appliquée dans le passé pour le dosage du cortisol (hormone du stress). Des études récentes montrent que le cortisol contenu dans les poils des porcs est un indicateur de stress chronique car il s’y accumule au cours du temps. Dans ce cas, les prélèvements sanguins peuvent être remplacés par la récolte des poils des porcs. Les animaux placés en essais et concernés par ces procédures ne sont pas des animaux de laboratoire mais sont élevés comme en dans un élevage porcin conventionnel. Nos essais s’inscrivent dans le cadre de la recherche agricole et pour certains dans la poursuite d’études cellulaire ayant déjà permis de réduire et cibler le nombre de paramètres à étudier sur un nombre réduit d’animaux. Lorsque d’autres mesures via des prélèvements moins invasifs tels que la récolte de déjection ou de poils ne sont pas possibles, la prise de sang devient le seul moyen d’obtenir les informations sur les effets des aliments testés.

Réduction

Le nombre de porcs entrant dans cette procédure est étudié pour limiter le nombre d’animaux tout en se donnant suffisamment de chance de montrer une différence de résultat si celle-ci existe (c’est ce qu’on nomme également la puissance statistique). Pour définir ce nombre, nous utilisons un logiciel de statistiques. Par ailleurs, en plus de cette méthode, nous nous appuyons sur notre expérience (traitements statistiques des précédents résultats d’essais depuis 20 ans) ainsi que sur les résultats d’autres études réalisées dans d’autres centres de recherche (nombres d’animaux/groupe dans les études avec résultats significatifs) pour affiner le nombre d’animaux concernés par les prélèvements. En outre, certains animaux concernés par cette procédure entrent également dans le cadre d’essais ayant déjà intégré une phase de recherche au niveau cellulaire permettant de réduire le nombre de paramètres à tester et le nombre d’animaux.

Raffinement

Plusieurs mesures sont intégrées dans la mise en place de la procédure afin de réduire les nuisances sur le bien-être. D’abord, si il est constaté que des animaux à prélever présentent un état de santé affaibli ou s’ils semblent apeurés alors ils sont retirés de la procédure et ne sont pas prélevés. Ensuite, la méthode de contention est réfléchie en fonction de l’âge de l’animal afin que cette dernière soit la plus adaptée à son âge et à son gabarit pour faciliter le prélèvement et donc en limiter sa durée. Une fois le prélèvement réalisé, une récompense sous forme d’eau sucrée est proposée à l’animal. Nos animaux sont entrainés à sortir de leur case et à découvrir leur environnement d’élevage lors des pesées hebdomadaires. Ainsi, ils connaissent cet environnement ce qui réduit leur stress. Par ailleurs, le nombre de tentatives sans réussite du prélèvement est réduit à 2 afin de limiter la durée de contention. Une surveillance particulière des animaux est réalisée durant les 3 jours qui suivent les prélèvements et des soins sont définis en cas d’apparition de signes d’atteinte de la santé des animaux. De plus, l’intervalle entre 2 sessions de prélèvements est allongé à 2 semaines lorsqu’il s’agit de prélever des animaux de 21 à 35 j d’âge.

Choix des espèces

C’est l’espèce cible de notre activité de recherche. Les résultats de nos essais sont valorisés pour améliorer l’alimentation des porcs dans les élevages conventionnels. Les animaux placés en essais et concernés par ces procédures ne sont pas des animaux de laboratoire mais sont élevés comme en élevage porcins conventionnels. Les animaux utilisés sont des porcelets de 3 stades physiologiques différents : Porcelets sevrés âgés de 21 à 42 j et pesant entre 6 et 15 kg (c’est la phase appelée « 1er âge », stade physiologique Post-Sevrage), Porcelets sevrés âgés de 42 à 69 j et pesant entre 15 et 40 kg (c’est la phase appelée « 2ème âge », stade physiologique Post-Sevrage), Porcs sevrés âgés de 69 à 180 j pensant entre 25 et 130 kg (c’est la phase appelée « croissance », stade physiologique Engraissement). C’est sur ces stades physiologiques que nous souhaitons faire avancer nos connaissances.

Injectés en sous-cutané avec un produit de comblement dermatologique, puis passés au scanner à rayons X jusqu'à trois fois le premier jour, une fois par jour les quinze jours suivants, une fois par semaine pendant deux mois, puis une fois par mois jusqu'à la fin de l'étude. 266 rats sont ainsi utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chaque passage d'imagerie se faisant sous anesthésie gazeuse. Le porteur signale des pertes de poids liées aux anesthésies répétées, et une inflammation voire une nécrose possible du site d'injection. 252 rats sont tués pour prélever le site d'injection ou des organes, 10 sont réutilisés pour de la formation continue du personnel et 4 sont adoptés, l'objet réel du projet étant d'améliorer la persistance de produits de comblement du visage.

Objectifs

Les dermal fillers (remplisseurs cutanés) sont généralement utilisés pour des traitements peu invasifs, tels que la restauration du volume du visage dans des cas de dégradations physiques sévères (lésions post-accidentelles, restauration et correction des signes de perte de graisse faciale (lipoatrophie) chez les personnes atteintes du VIH, ... ). Certains produits de comblement se résorbent naturellement avec le temps nécessitant pour les patients de répéter les injections, il est donc nécessaire d'améliorer la persistance de ces produits. La recherche de nouveaux produits, performants et sains pour le patient, est donc un enjeux de santé publique. Ce projet a pour objectif de tester et d’évaluer des dispositifs médicaux injectables de comblement sur le modèle rat. Il comporte plusieurs protocoles visant à évaluer leur comportement (persistance) et la tolérance locale (potentielles réactions locales de type inflammatoire) après injections en sous-cutanée. Lors de ce projet, l'imagerie médicale sera utilisée afin de suivre l'évolution (volume, hauteur, étalement et forme) des produits injectés au cours du temps. Un effet inflammatoire des produits pourra également être mis en évidence par analyse histologique.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera aux développements de nouveaux produits dermatologiques de comblements et éventuellement à leur mise sur le marché dans le but de proposer des produits plus performants et persistants.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 ou maximum 2 injections en sous-cutanée des produits tests en respectant les volumes d’injections recommandés. Ces injections seront réalisées en environ 4 minutes pour les animaux vigiles et en maximum 10 minutes (anesthésie comprise) pour les animaux anesthésiés. Des examens scanners à rayons X seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Un examen scanner dure jusqu’à 20 minutes (anesthésie comprise). La fréquence des examens scanners sera de maximum 3 acquisitions par jour le premier jour, puis maximum 1 acquisition par jour pendant les 15 jours suivants, puis maximum 1 acquisition par semaine pendant les 2 premiers mois puis maximum 1 acquisition par mois jusqu’à la fin de l’étude.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress (pesées, injection de produits et réalisation des acquisitions d’imagerie scanner à rayons X). Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées et/ou inflammation voire nécrose du(des) site(s) d’injection - probablité faible avec des produits de comblement classique).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole car des prélèvements du site d’injection ou d’organe(s) doivent être réalisés pour analyse histologique. Dans la mesure du possible, les animaux réserves qui n’auront finalement pas été inclus dans les études pourront être réutilisés pour de la formation continue du personnel ou adoptés en fin d’étude selon la procédure d’adoption de l’EU.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet ainsi qu’à des exigences réglementaires, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant de manière fiable. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal, etc.

Réduction

Le suivi du comportement des produits injectés réalisé par imagerie médicale scanner à rayons X permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisé par projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la performance du produit au cours du temps, des groupes de minimum 6 sites d’injection par éléments d’essai seront constitués.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux en cages sur portoirs ventilés (hors cas d’isolement des animaux pour agressivité ou blessure sur avis vétérinaire) avec les enrichissements appropriés (bâtonnets de bois, cell-sizzle et tube en bois). Les animaux seront observés quotidiennement afin de déceler précocement tout signe clinique anormal et ainsi mettre en place des mesures de prise en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien ou bien mise à mort en cas d’état de santé considérablement dégradé et irréversible). Des pesées régulières seront réalisées : minimum 1 fois par semaine et entre 24 et 72h post-administration des produits de comblement. La fréquence des pesées pourra être augmentée en fonction de l’état clinique des animaux : une pesée quotidienne sera réalisée si l’animal est en perte de poids égale ou supérieure à 15% de son poids maximal atteint durant l’étude (soit une perte de poids de 52.5g pour un animal de 350g). Dans les 24 à 72h post-administration des produits de comblement, une observation du(des) site(s) d’injection sera réalisée pour s’assurer qu’aucune anomalie (rougeur, plaie, nécrose, nécrose ulcérante) n’est visible. L’état général de l’animal sera également observé. Lors des anesthésies, du gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement cornéen et une attention particulière sera apportée à la lutte contre l’hypothermie (tapis chauffant et/ou lampe chauffante).

Choix des espèces

Le rat est l’espèce privilégiée pour les injections sous-cutanées de produit de comblement. Un volume plus important que chez la souris peut-être administré permettant un suivi par imagerie scanner à rayons X au cours du temps. De plus, le rat est très bien caractérisé et présente une similitude avec l’homme concernant sa réactivité au niveau de la peau et des tissus sous-cutanés permettant d’évaluer la biocompatibilité et l'efficacité des produits de comblement. Les rats seront utilisés entre 6 et 10 semaines lors des administrations. Pour ce type d’étude, il n’y a pas de contrainte spécifique lié à l’âge. A partir de 6 semaines, les rats ont un système immunitaire suffisamment développé pour répondre efficacement aux stimuli immunitaires, ce qui les rend appropriés pour ce type d’études.

Déjà utilisés dans un projet de trois ans qui vient de s'achever, 45 prosimiens sont repris pour un suivi prolongé jusqu'à leur mort naturelle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent l'un de deux régimes, l'un à base de matière grasse laitière, l'autre de matière grasse végétale, avec un prélèvement sanguin tous les six mois et quatre à cinq jours de tests cognitifs à la même fréquence. Le porteur écrit que ces tests ne constituent pas une nuisance et qu'ils sont "même considérés comme un enrichissement" chez les primates. Douze animaux sont comptés comme réutilisés, et ceux qui ne meurent pas d'eux-mêmes retournent à l'élevage. La finalité affichée est d'aboutir à des recommandations nutritionnelles pour le grand public, et le porteur affirme que ces expériences ne sauraient être remplacées puisqu'elles exposent "l'organisme entier" au régime.

Objectifs

La matière grasse laitière, du fait de son impact sur le métabolisme des acides gras oméga-3 et de la présence d’acides gras facilement métabolisables, pourrait avoir un impact favorable sur les fonctions cérébrales, et en particulier sur les fonctions cognitives, à plusieurs moments de la vie. Toutefois, l’apport en lipide des laits maternisés utilisés en nutrition humaine est assuré par des huiles végétales (ne contenant que des acides gras à chaîne courte), ce qui ne mime donc que très partiellement le lait maternel, qui apporte par définition, du gras animal. La matière grasse laitière présente des teneurs en acides gras oméga-3 plus favorables que la matière grasse végétale, notamment parce qu’elle procure des acides gras oméga-3 à longue chaîne, essentiels au bon fonctionnement cardiovasculaire et cérébral. Nous souhaitons donc mettre en place un protocole pour évaluer l’impact de la matière grasse laitière comparativement à des matières grasses végétales, sur le statut cognitif de primates adultes (âgés de plus de 24 mois). Nous allons réaliser un suivi à long-terme des fonctions cognitives et psychomotrices, à l’aide de tâches comportementales simples et utilisées en routine, pour évaluer les effets à long-terme de la matière grasse laitière (jusqu'à la mort naturelle des animaux). Ce projet est la continuité d’un projet de 3 ans terminé, qu’il est nécessaire de le prolonger pour étudier de façon longitudinale l’impact de ces régimes sur ces animaux au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Le projet vise à évaluer les impacts à long-terme de la supplémentation en matière grasse laitière sur les fonctions cognitives. Nous avons déjà démontré que ces nutriments ont un impact positif au cours du développement et de la croissance. En effet, les animaux du groupe Matière grasse laitière présentent des facultés cognitives supérieures à celles des animaux du groupe Matière grasse végétale dans tous les tests cognitifs au cours de la croissance. Le présent projet nous permettra de déterminer si cet impact peut se prolonger dans le temps. De plus, la mise en place des régimes croisés, c'est à dire des animaux adultes qui reçoivent un régime différent de celui de leur mère après le sevrage, nous a permis de mettre en évidence une importante empreinte maternelle (ce qui signifie que les mères apportent des nutriments essentiels aux petits dont les bénéfices durent même lorsque les petits changent de régime). La poursuite des régimes à très long terme nous permettra d'évaluer combien de temps cette empreinte maternelle perdure à l’âge adulte. C'est une question particulièrement importante dans le domaine de la nutrition qui pourra permettre à terme d'aboutir à la rédaction de recommandations nutritionnelles à destination du grand public.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à l'un des deux régimes expérimentaux, ce qui n'a aucune conséquence sur le bien-être animal puisque les deux régimes sont équilibrés d'un point de vue des macro-nutriments. Les animaux seront également soumis à un prélèvement sanguin tous les 6 mois (prélèvement qui dure quelques secondes) et réalisé selon un protocole strict, par du personnel formé. Enfin, les animaux passeront des tests cognitifs pendant 4 ou 5 jours tous les 6 mois également, pour évaluer leur niveau de performances cognitives.

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effet indésirable des différents régimes alimentaires sur les animaux puisque les deux régimes sont équilibrés d'un point de vue de l'apport en macronutriments. La seule nuisance attendue est celle qui pourrait être provoquée par les prélèvements sanguins, mais tout est mis en oeuvre pour en minimiser l'impact, et ces prélèvements sont effectués conformément à la réglementation, par du personnel formé, tout en respectant le cadre fixé par la règle des 3R. Enfin, les tests cognitifs, qui ne durent que quelques heures, tous les 6 mois, ne constituent pas une nuisance et sont même considérés comme un enrichissement chez les primates.

Devenir

Tous les animaux seront maintenus en vie jusqu'à leur mort naturelle à la fin de la procédure. Les animaux qui ne seront pas morts naturellement retourneront dans l'élevage.

Remplacement

Ces expériences ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives puisqu’elles nécessitent l’exposition de l’ensemble de l’organisme au régime. Les interventions nutritionnelles ayant par définition des effets sur l’organisme entier (de la digestion à l’utilisation des micronutriments et de leurs métabolites par les différents organes), ces expériences ne sauraient être remplacées par des expériences in vitro par exemple.

Réduction

Ces expériences seront réalisées sur un nombre maximal de 45 animaux, nombre suffisant pour évaluer les effets sur les fonctions cognitives notamment. Les effectifs, déterminés à partir d’un test de puissance, prennent en compte la variabilité interindividuelle attendue au sein des groupes expérimentaux pour les mesures de cognition (paramètres qui présentent la plus grande variabilité) et permettront de réaliser des tests statistiques avec assez de puissance (au minimum 85%). Etant donnés le nombre relativement faible d’animaux par groupe (N=6 par sexe), l’analyse statistique sera basée sur des tests non-paramétriques et des analyses statistiques descriptives sont prévues.

Raffinement

Les actes techniques appliqués seront organisés de sorte à laisser des temps de récupération longs entre deux actes. Toute procédure entraîne un suivi attentif de chaque individu afin de s’assurer du bien-être des animaux utilisés. Pour cela, des indicateurs comme le poids de l’animal, la prostration, l’absence d’alimentation, des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, surléchage) sont particulièrement suivis. Le raffinement sera notamment assuré grâce à une bonne maîtrise des procédures réalisées par du personnel qualifié. Les dispositions habituelles de l'animalerie seront conservées pour les animaux inclus dans le projet (enrichissement par branchage et feuillage, nichoirs, cache d'aliments, groupe sociaux…).

Choix des espèces

L'espèce choisie a la particularité d'être omnivore, se nourrissant aussi bien de végétaux (feuilles et fruits) que d'animaux (petits mammifères ou reptiles, insectes) dans le milieu naturel. En tant que mammifère, cette espèce se nourrit naturellement de lait maternel (contenant donc naturellement de la matière grasse animale) pendant les 2 premiers mois de sa vie. Chez cette espèce, les périodes de gestation et de lactation durent chacune 2 mois. Les altérations liées à l'âge, comparables à celles observées chez l'humain, apparaissent dès l'âge de 5 ans. De nombreuses études ont montré les similarités des changements cérébraux liés à l’âge avec l'humain, avec notamment des altérations de la balance énergétique des paramètres endocriniens et des performances cognitives ainsi que l’apparition d’une atrophie cérébrale. Ce modèle représente donc un parfait compromis entre une longévité relativement longue, des facilités d'élevage dues à sa taille et une bonne proximité phylogénétique et physiologique avec l'humain. Les animaux seront donc utilisés à l'âge adulte.

Les prises de sang sont réalisées à la veine alaire ou au sinus occipital, ce dernier geste comportant un risque de lésions cérébrales que le porteur dit chercher à réduire. 2 450 poules et coqs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour maintenir deux lignées consanguines dont l'une porte peu de salmonelles et l'autre beaucoup. L'élevage en groupe entraîne du picage et des blessures cutanées de gravités diverses, ainsi qu'une détérioration de l'état général de certains individus dont la cause n'est parfois établie qu'à l'autopsie. Le porteur écrit pourtant que ces animaux n'ont pas subi d'intervention majeure, ce qui le conduit à envisager de les replacer chez des particuliers ou de les valoriser pour leur viande, 1 940 étant renvoyés à l'élevage et 510 réutilisés.

Objectifs

Les lignées consanguines N et 6 ont la particularité de présenter des niveaux de portage intestinal de salmonelles différents après infection. Du fait de cette particularité et de leur consanguinité, elles constituent un modèle unique d’étude du contrôle génétique de la résistance au portage de salmonelles. Le contrôle du portage de salmonelles est un enjeu de sécurité sanitaire dans une optique « Une santé pour tous » (« One Health »), qui contribue à la durabilité des élevages dans le cadre de la transition agro-écologique Les lignées N et 6 ont la particularité de posséder un taux d’homozygotie supérieur à la normale, obtenu via des croisements consanguins frères-sœurs initiaux effectués lors de leur création et à présents achevés. Depuis qu’elles sont hébergées, elles sont simplement maintenues de façon à éviter autant que possible d’augmenter leur consanguinité pour éviter d’accentuer d’éventuels problèmes physiologiques associés (notamment problèmes de fertilité). Cette consanguinité facilite les études de génétique classique comparant les deux lignées ou exploitant les croisements entre ces deux lignées pour étudier le contrôle génétique du portage intestinal de salmonelles. En outre, nous avons pu récemment démontrer que ces deux lignées possèdent des microbiotes intestinaux de compositions très différentes, si bien que nous formulons l’hypothèse que le niveau de portage intestinal est en partie déterminé par la composition du microbiote, peut être sous influence génétique. Ces lignées ont donc pour vocation d’être utilisées dans les projets de recherche visant à comprendre le rôle de la génétique et/ ou du microbiote intestinal sur le portage de salmonelles. Le présent projet vise à maintenir un pool d’animaux de ces lignées suffisant pour servir les projets à venir visant à les étudier dans cet objectif, en prenant en compte leur faible niveau de fertilité.

Bénéfices attendus

L’étude de ces lignées permettra à terme de mieux comprendre (court/moyen terme) l’origine du niveau de portage (génétique et/ou microbiote) et de faciliter la mise au point d’approches efficaces de lutte se basant sur la modulation du microbiote et/ou la sélection génétique (long terme), en complément des méthodes prophylactiques déjà existantes, en identifiant des marqueurs génétiques ou microbiens qui pourront être utilisés en sélection ou bien pour mettre au point une modulation du microbiote intestinal par l’alimentation ou les pratiqeus d’élevage. Ces approches permettront de limiter la propagation des salmonelles en élevage et donc de limiter de nombre de troupeaux abattus en cas de détection de salmonelles, et de réduire la contamination humaine via l’ingestion de produits aviaires contaminés (viande, œufs).

Procédures

Une prise de sang, à la veine alaire ou au sinus occipital sera effectuée entre 2 et 18 semaines d'âge pour pouvoir génotyper les animaux et ainsi déterminer leur pedigree. Une seconde prise de sang sera réalisée en fin de cycle de reproduction pour évaluer la réponse vaccinale. L’intervention a une durée inférieure à une minute.

Impact sur les animaux

Les prises de sang alaires pourront être une source de stress, en raison de la contention nécessaire et de la piqûre. Les prises de sang peuvent éventuellement engendrer des hématomes. L’élevage en groupe peut entraîner des comportements agressifs. Ces comportements présentent des risques inhérents de picage entre les animaux, ce qui peut causer des blessures cutanées de diverses gravités. Les comportements de domination sont généralement plus fréquents jusqu'à ce que l'ordre social soit rétabli. Dans les élevages de longue durée comme celui-ci, une détérioration de l'état général de certains individus peut également être observée, les causes n'étant parfois déterminées qu'après une autopsie.

Devenir

Nous utilisons ici nos individus pour permettre la production d'une descendance. Arrivés à l'âge de réforme, les animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de les replacer vivants chez des particuliers ou de les valoriser pour leur viande qui est tout à fait consommable.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de maintenir deux lignées dont l’étude permet la compréhension des rôles combinés du microbiote intestinal et de la génétique de l’hôte dans la réduction du portage de salmonelles. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle alternatif permettant de remplir ces objectifs.

Réduction

Les effectifs de reproducteurs utilisés permettent en théorie de gérer la consanguinité déjà très élevées de nos populations. Par calcul, les tailles éfficaces des populations devraient être plus importantes, cependant la variabilité génétique de notre caractère est peu renseignée. L'objectif des maintiens des populations est de disposer d'animaux

Raffinement

Les poules et les coqs hébergées en groupe bénéficient d’un milieu enrichi, notamment par des perchoirs et de la proximité avec leurs congénères permettant des échanges visuels, olfactifs et auditifs. Les animaux seront l’objet de surveillance classique et toute manifestation de détresse ou de maladie prise en considération pour envisager le retrait des animaux (mise à l'infirmerie) ou leur euthanasie si besoin. Dès l'éclosion, les animaux sont élevés en groupe au sol puis en cages collectives à partir de 18 semaines. Les cages collectives hébergeant les poules seront équipées de divers enrichissements, tels que des perchoirs, des blocs à picorer, des chaînettes métalliques et des bandelettes de tissu pour stimuler le jeu. Les coqs, hébergés également dans des cages collectives, bénéficieront eux aussi de divers enrichissements. Pour prévenir le picage, des répulsifs antipicage pourront être appliqués sur les animaux concernés. Une surveillance soutenue sera assurée plusieurs fois par jour pour détecter précocement toute détérioration du bien-être. Un arbre de décision , destiné à faciliter la gestion quotidienne des animaux (en cas d'atteinte ou non du point limite), a été développé et sera fourni aux animaliers en charge du suivi des animaux.Lorsque un ou des points limites sont identifiés , une action avec un suivi de celle-ci est mise en œuvre.Raffinement de la procédure : Cas de la prise de sang au sinus occipital : afin de réduire le risque de lésions cérébrales pouvant être associé à la réalisation d'un prélèvement de sang au sinus occipital, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur son aiguille afin d'éviter tout possibilité d'enfoncer l'aiguille trop profondément. La facilité de visualisation de ce site d'injection évite l'arrachage de plumes douloureux pour les animaux. Un point de compression de 30-60s sera effectué pour limiter également la formation d'un hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour une prise de sang afin de permettre la réalisation d'une contention appropriée par l'un pendant que l'autre réalisera la prise de sang. Les personnes en charge du prélèvement de sang au sinus occipital auront reçu une formation spécifique à ce geste et seront des personnes le réalisant régulièrement afin de maximiser la fluidité des gestes. Cas de la prise de sang effectué à la veine alaire : un point de compression sera effectué et deux expérimentateurs seront mobilisés.

Choix des espèces

Les poulets sont porteurs asymptomatiques de salmonelles en élevage. Pour réduire le portage il faut en étudier les mécanismes sur cet animal, ce qui justifie notre choix. Les animaux seront utilisés depuis la naissance jusqu'à l'âge adulte d'environ 42 semaines pour produire les poussins destinés au renouvellement des lignées, mais aussi répondre aux besoins en individus demandés par les projets de recherche reposant sur ces lignées.

Soumises à une ou deux injections intraveineuses de nanoparticules lipidiques ou de vecteurs de thérapie génique sous anesthésie gazeuse, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, toutes tuées à l'issue. Une partie d'entre elles passe un test de force où la queue est reliée à un capteur qui enregistre leurs réponses d'échappement pendant cinq minutes. Le projet vise à valider l'effet de ces nanoparticules contre la fibrose musculaire dans des myopathies génétiques comme la dystrophie de Duchenne, et le porteur écrit qu'un essai clinique concluant "devrait" alors permettre de stopper la progression de la maladie chez les patients. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe "pas de modèle in vitro de fibrose musculaire" et que l'élimination des cellules fibrotiques par les lymphocytes T exige un milieu physiologique complet.

Objectifs

Notre laboratoire cherche à traiter un certain type de myopathies (maladie des muscles) qui comprennent en particulier la dystrophie musculaire de Duchenne et les dystrophies musculaires des ceintures. Ces myopathies sont des maladies génétiques rares, progressivement invalidantes et conduisent à la perte de la marche. Le muscle sans ses protéines structurales finit par se détruire puis l’apparition de la fibrose rigidifie le tissu et entraîne de sévères complications. Dans la myopathie de Duchenne, la protéine déficiente s'appelle la dystrophine. Cette protéine joue un rôle d'amortisseur au cours des cycles de contraction/relaxation du muscle et un rôle fonctionnel dans la membrane musculaire. Aucun traitement curatif n'est actuellement disponible. Les stratégies visant à ajouter une copie fonctionnelle du gène et/ou à réduire la fibrose constituent l’approche la plus prometteuse pour le traitement de ces myopathies. Des approches de thérapie génique sont en cours d’étude et consistent à introduire un gène médicament dans l’organisme du patient à l’aide d’un vecteur viral inoffensif pour remplacer le gène malade et rétablir le fonctionnement de la protéine. Néanmoins, les tests cliniques utilisant l'administration de versions courtes de la protéine dystrophine (micro-Dystrophine) via un virus adéno-associé (AAV), ont mis en évidence seulement une efficacité partielle du traitement et ont révélé des risques pour la sécurité des patients, tels qu'une réponse immunitaire associée à la dose élevée d'AAV utilisée. C’est pourquoi, dans ce projet, nous souhaitons explorer la technologie des nanoparticules, utilisées dans la formulation de certains vaccins, pour délivrer les ARN messagers de gènes thérapeutiques et réduire la fibrose dans le tissu musculaire. Ces nanoparticules sont le plus souvent lipidiques et permettent un transfert efficace et ciblé de protéine ou d’acide nucléique dans les cellules d’intérêts. Nous souhaitons donc tester dans un premier temps l’immunogénicité de ces particules chez la souris et dans un second temps, tester l'efficacité des nanoparticules pour le transfert de gènes et pour la reprogrammation de cellules T en cellules T anti-fibrose. L'étude permettra en outre de tester l'efficacité thérapeutique de grandes versions de dystrophine ou de dystrophine complète pouvant être logées dans les nanoparticules, ce qui ne pourrait pas être possible dans les AAV étant donné leur capacité de cargo limitée.

Bénéfices attendus

Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Il vise à valider l’effet thérapeutique de nanoparticules lipidiques pour un groupe de maladies humaines sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique pourrait permettre d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie, et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse d'une durée maximum de 5 minutes pour vérifier la présence des nanoparticules lipidiques et analyser la réponse immunitaire. Ils seront aussi soumis à l'injection de nanoparticules lipidiques et ou de vecteurs de thérapie génique en intraveineux sous anesthésie gazeuse. Pour la PE1, il y aura 2 prélévements de sangs et une seule injection de nanoparticules lipdiques. Pour la PE2, les souris auront un prélévements de sang et deux injections en intraveineux, soit deux injections de nanoparticules lipidiques à deux semaines d'intervalle, soit une injection de nanoparticules lipidiques et 15 jours après une injection de vecteurs de thérapie génique. La durée d'anesthésie et le temps de d'injection durent moins de 5 minutes par souris. Pour le test de force musculaire, la queue des animaux est reliée à un capteur de force qui va enregistrer les réponses d’échappements des animaux. Ce test est limité à 5 min et ne peut être réalisé qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés. Les nuisances de classe légères sont liées à l’acte d’anesthésie lors de l’injection : du traitement et des prélèvements de sang. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. Les nuisances attendues pour le test de force sont de classe legère. Cet acte ne sera fait qu’une fois. En ce qui concerne le modèle utilisé, même s’ils portent une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients.

Devenir

Les animaux de chaque procédure seront tous euthanasiés pour collecter les muscles squelettiques, la rate et les ganglions pour analyser au laboratoire les effets de nos traitements.

Remplacement

Nous réalisons systématiquement des tests préalables in vitro pour exclure les nanoparticules de mauvaise qualité. Nous vérifions la présence de l’ARN messager du gène d’intérêt après infection cellulaire en mesurant l’expression des protéines d’intérêts. Afin de valider l’effet des nanoparticules anti-fibrose sur la fibrose in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro n’est capable de développer cet aspect de la pathologie. En effet, il n’existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et l’interaction et l’élimination des cellules fibrotiques par les lymphocytes T nécessite un milieu physiologique où la réponse immunitaire peut avoir lieu.

Réduction

Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 160 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôle pour les différents modèles évalués. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Nous administrerons les nanoparticules lipidiques par voie sanguine car c’est le moyen le plus efficace et le moins invasif pour cibler tous les muscles de l’organisme. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi. Aucun animal n’est seul dans une cage, sauf si problème d’agressivité. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Les prélèvements de sang à la veine submandibulaire se font sous anesthésie de courte durée. Les doses de nanoparticules injectées sont faibles par injection et d'après les données de la littérature scientifique aucune toxicité n’est attendue. Néanmoins une surveillance de l’état général des animaux sera effectuée régulièrement. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées.

Choix des espèces

Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Les modèles murins inclus dans ce projet portent des anomalies génétiques ciblant le gène de la pathologie chez l’homme qui va entraîner le plus souvent des désordres musculaires sans impact sur l’activité naturelle de la souris. Ces modèles permettent d’analyser les perturbations de la fonction musculaire et sont donc pertinents pour nos études. Nous utiliserons pour ce projet des souris jeunes d’environ 2 mois- 3 mois car c’est à cet âge que les muscles sont les plus permissifs au traitement de thérapie génique. Le développement de la fibrose qui est un frein majeur au transfert de gène musculaire est progressif et la cinétique de dépôts de collagène varie d’un muscle à l’autre. Nous avons vu également dans nos précédents résultats que pour réduire la fibrose de manière significative dans le muscle via des cellules T anti-fibrose, il faut cibler et éliminer le plus tôt possible les cellules fibroblastiques sécrétrices de collagène, soit environ à l’âge de 2 mois.