Procédures légères

La lignée élevée dans ce projet porte un phénotype dommageable dont la nuisance déclarée est une anxiété accrue, compensée selon le porteur par des huttes en carton supplémentaires et un niveau sonore bas. 90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Chaque souriceau subit, entre son septième et son dixième jour de vie, une biopsie de la queue de quelques secondes, avec une douleur légère et un risque de saignement, le porteur situant l'intervention à un âge où les terminaisons nerveuses sont encore peu nombreuses. Toutes seront tuées, pour prélever des tissus cérébraux destinés à l'étude de la protéine Tau dans la maladie d'Alzheimer, ou parce que leur fertilité décline au-delà de six mois.

Objectifs

Les objectifs de sce projet sont : 1) méthode de génotypage invasive 2 ) maintien de la lignée Tau22 à phénotype dommageable sous forme respirante et de tirer profit des animaux générés par les accouplements d’élevage et par les animaux reproducteurs reformés pour effectuer un prélèvement de tissus à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seront 1) la caractérisation génétique de la lignée pour l'optimisation de la gestion de son élevage et pour la production pour fournir des animaux pour nos projets scientifiques (utilisation continue vers des DAP expérimentation) 2) maintenir notre lignée de souris à phénotype dommageable pour l’étude des mécanismes autophagiques impliqués dans la dégradation de la protéine Tau pathologique au cours du développement de la maladie d’Alzheimer, ce qui permettra à terme d’identifier des stratégies thérapeutiques dans les maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer

Procédures

Les animaux subiront une seule fois, une biopsie à la queue entre leur 7ieme et 10ieme jours lorsqu’ il y a encore peu de terminaisons nerveuses à ce niveau afin de limiter la douleur. Cette procédure durera que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent une biopsie avec comme nuisances une douleur légère de courte durée avec un risque de saignements. La nuisance liée au phénotype dommageable de ces souris sera une anxiété plus accrue.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement de tissus cérébraux et suite au déclin de la maturité sexuelle

Remplacement

Dans la maladie d'Alzheimer, une protéine anormale, Tau, s'agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau est le principal constituant des neurones en dégénérescence neurofibrillaire dans la maladie d'Alzheimer. Ces neurones sont envahis d'amas protéiques en forme de filaments qui bloquent le fonctionnement neuronal. Aujourd'hui, les mécanismes qui aboutissent à l'agrégation de Tau et à la formation de ces lésions demeurent inconnus et il est donc très difficile de reproduire ces changements de la protéine Tau in vitro. C’est pourquoi le prélèvement de tissus cérébraux de souris Alzheimer est important pour détecter cette forme pathologique de Tau et pour mieux comprendre comment favoriser la dégradation de cette protéine Tau en étudiant directement ses interacteurs in vivo (dans ce projet la protéine autophagique NDP52 sera étudiée). En fonction du génotypage les animaux seront utilisés pour les accouplements.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Le projet fournira aussi de façon régulière des tissus cérébraux servant de base pour les expériences réalisées au laboratoire, par conséquent aucune analyse statistique n’est prévue sur les animaux utilisés dans ce projet. Enfin, cette lignée transgénique sera cryoconservée, ce qui permettra de ne pas maintenir sous forme respirante la lignée lorsque nous aurons terminé nos analyses.

Raffinement

Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur par une routine d’élevage (toujours le même expérimentateur, toujours le même jour d’accouplement, à la même heure) ce qui permet de diminuer le stress des animaux. Une manipulation régulière, par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement) sera privilégiée comme méthode de manipulation des animaux. La taille de la biopsie, à l’extrémité de la queue, sera limitée à un millimètre. Pour pallier à l’anxiété possible des souris Tau22, les souris auront un enrichissement renforcé : ajout de plusieurs huttes ou tubes en carton en fonction du nombre d'animaux /cages ; elles seront maintenues en groupe et des niveaux sonores bas seront privilégiés au sein de la structure.

Choix des espèces

Le choix d’un modèle de souris est justifié car il s’agit d’une espèce dont l’architecture cérébrale est proche de l’architecture du cerveau humain (en particulier l’hippocampe). Par ailleurs la souris présente un développement embryonnaire rapide (21 jours). Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines chez les mâles, 7 semaines chez les femelles) et utilisés en reproduction préférentiellement jusqu’à l’âge de 6 mois, après quoi la fertilité diminue et les animaux seront réformés. En cas de besoin les animaux pourront être mis en reproduction après 6 mois, en l’absence de reproducteurs plus jeunes disponibles. Les tissus seront prélevés principalement sur des animaux à des âges adultes allant de 3 à 12 mois.

Produites par l'élevage du laboratoire pour alimenter d'autres protocoles en "utilisation continue", 2 614 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Toutes subissent, au sevrage à quatre semaines, une biopsie du bout de la queue sous anesthésie générale gazeuse pour vérifier leur génotype par PCR, avec une douleur de courte durée au réveil. 2 280 d'entre elles restent en vie, réparties entre le renouvellement des lignées et les expérimentations à venir, les 334 autres étant tuées. Ces lignées portent des gènes humains codant des anticorps pathogènes responsables de maladies de dépôt d'immunoglobulines, et le porteur justifie l'effectif par le fait qu'il couvre l'ensemble de ses lignées sur cinq ans, sans avancer de calcul.

Objectifs

Notre laboratoire développe depuis de nombreuses années des modèles murins transgéniques permettant l'étude d'un groupe de pathologies, les maladies de dépôt d'immunoglobulines monoclonales, qui viennent gravement compliquer certaines maladies hématologiques tel que le myélome multiple. Le pronostic vital des patients est souvent très péjoratif. En lien les médecins en milieu hospitalier, nous avons développé des modèles murins qui surexpriment tout ou parties des anticorps humains pathogènes responsables de ces maladies. Le but de ces modèles est d'étudier les mécanismes physiopathologiques de développement de ces maladies, d'étudier la toxicité de ces immunoglobulines pour les organes touchés et de développer et tester des thérapies innovantes lors d'essais pré-cliniques. La présence de modèles animaux permet de valider ou non le bénéfice de la molécule et de potentiellement la proposer à terme aux patients. Toutes ces études nécessitent donc l'utilisation de différents modèles murins dont le génotype doit être vérifié afin de s'assurer que les animaux présentent bien les caractéristiques attendues. La technique de génotypage décrite dans cet APAFIS consiste en la biopsie d'un bout de queue de la souris afin de contrôler le génotype de l'animal par PCR.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de maintenir les différentes lignées de souris génétiquement modifiées permettant de mener à bien les projets de recherche sur les maladies de dépôts d'immunoglobulines monoclonales. Ces modèles murins sont génétiquement modifié afin d'intègrer une modification génétique précise au sein d'un organisme complet. La modification génétique par l'apport d'un gène humain codant pour une protéine pathogène permet d'analyser et de comprendre la physiopathologie de ces maladies de depôts.

Procédures

Le prélèvement d'un bout de queue nécessaire pour le génotypage sera effectué sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de bout de queue sous anesthésie entrainent une douleur de courte durée aprés le reveil de l'animal. Aucune nuisance ou effet indésirable lié à leur génotype n'est attendu sur les animaux.

Devenir

Sur la totalité des animaux générés, nous attendons 100% de génotypes d'intérêts. Une partie de ces animaux sera maintenue dans la zone d'élevage pour le renouvellement et le maintien de nos lignées, et l'autre partie sera utilisée dans le cadre d'expérimentations (utilisation continue).

Remplacement

les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la physiopathogie des maladies de dépôts qui peut varier par le nombre et la localisation des atteintes d’organes, et ne permettent pas non plus de reproduire l’incidence d’une défaillance d’organe sur un autre organe ou l’organisme dans son entier. D’autre part, les approches thérapeutiques que nous souhaitons tester ont principalement pour objectif de cibler les dépôts d’immunoglobulines et de vérifier les réponses organes. Des modèles murins pour certaines maladies de dépôts ont déjà été développé et ont permis d’atteindre les objectifs précédemment évoqués.

Réduction

Notre laboratoire possède une grande expérience dans l’élevage des lignées murines destinées à la recherche ce qui permet d’anticiper le nombre d’animaux reproducteurs nécessaires au maintien de chaque lignée ainsi que le nombre de portées nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d’animaux pour effectuer les diverses expériences. Ce projet comprend un grand nombre d'animaux car il décrit l'ensemble des lignées de souris élevées par notre équipe pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux produits est réduit au minimum afin d'être suffisant pour maintenir la lignée et effectuer les expérimentations ultérieures tout en évitant de produire des animaux inutilement.

Raffinement

La procédure sera réalisée de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux : les prélèvements de tissus seront tous réalisés sous anesthésie générale gazeuse et par du personnel qualifié maitrisant ces gestes. Les animaux sont maintenus sous surveillance jusqu’à leur réveil. L'observation régulière des animaux et le suivi de leur comportement permettra d’avoir un contrôle sur leur état de santé et tout animal présentant des signes de souffrance sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Ce type de pathologie, avec en particulier une atteinte rénale, a déjà été reproduit de nombreuses fois avec succés chez la souris. Dans ce projet, les animaux seront mis en reproduction à partir de l’âge de 8 semaines, âge auquel mâles et femelles sont sexuellement matures et jusqu’à l’âge de 20 semaines car les animaux plus âgés (en particulier les femelles) commencent à présenter des difficultés à se reproduire. Le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage, c’est-à-dire à l’âge de 4 semaines.

Plongés cinq jours dans des cultures de cyanobactéries du genre Microcystis, 360 poissons médakas adultes ne subissent aucune autre intervention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Tous seront tués en fin d'exposition pour prélever leurs organes, seule voie d'accès selon le porteur aux compartiments biologiques étudiés. L'objectif porte sur l'effet des métabolites produits par ces bactéries sur le microbiote des poissons et, par ricochet, sur leur santé, un sujet que le porteur qualifie de "vierge". Il indique que les doses employées n'atteignent pas celles qui entraînent une souffrance "visible" au niveau morphologique ou du comportement, sans préciser ni les signes surveillés ni la fréquence des observations, alors qu'il attend par ailleurs un inconfort digestif et hépatique.

Objectifs

Les altérations des milieux aquatiques par les proliférations de cyanobactéries sont susceptibles de modifier le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Les préjudices associés à ces efflorescences comprennent : des perturbations de la chaîne trophique, une diminution de la pénétration de la lumière dans l’eau, une diminution de l’oxygène dissous disponible, mais également la production de métabolites secondaires potentiellement bio-actifs et parfois toxiques pour certains organismes qui y sont exposés. En effet, de nombreux genres de cyanobactéries sont susceptibles de produire et/ou de relarguer dans le milieu aquatique des molécules aux propriétés éminemment, ou potentiellement, bio-actives, délétères, voire toxiques. Si les effets toxicologiques (sensu stricto) de ces microorganismes et de leurs métabolites sont connus sur certaines cellules ou tissus de vertébrés, notamment chez certains poissons, on ignore leur impact sur la communauté microbienne associée et les répercussions sur la santé de l’organisme hôte. Des travaux menés ces dernières années ont montré que le microbiote, localisé à l’interface entre un organisme et le milieu extérieur, peut jouer un rôle important dans la physiologie de l’hôte, mais aussi dans de nombreux paramètres biologiques chez les Vertébrés, parmi lesquels la résistance aux pathogènes. Le présent projet propose d’étudier l’effet de l’exposition à des doses représentatives des conditions environnementales de divers efflorescences de cyanobactéries sur le poisson modèle en écotoxicologie aquatique, le médaka. A ce jour, peu d’études se sont ainsi efforcées de caractériser la réponse des poissons à différentes compositions d’efflorescences de cyanobactéries au niveau de l’holobionte (organisme hôte + microbiotes) et de tâcher ainsi de prendre en compte la réponse au niveau des différents compartiments biologiques et des différents organes.

Bénéfices attendus

Cette étude constituera un prérequis indispensable au développement de ce sujet encore vierge. La caractérisation du microbiote de poissons n’en est en effet qu’à ses débuts et dévoile déjà une large diversité microbienne inattendue. Les interactions entre hôte, son microbiote associé et l’environnement sont peu explorées, encore moins dans le cadre de stress écotoxicologiques, et pourraient s’avérer informatives de processus biologiques méconnus. A terme ces travaux permettront de mieux appréhender les conséquences (éco)toxicologiques des efflorescences de cyanobactéries et de la production de métabolites bio-actifs associés.

Procédures

Mis à part la balnéation avec les biomasses de cyanobactéries qui aura lieu pendant les 5 jours de l’expérimentation, aucune intervention ne sera réalisée sur les animaux.

Impact sur les animaux

Les poissons seront exposés 5 jours par balnéation à différentes doses environnementale de cultures de souches de cyanobactéries. Certains métabolites produits par les cyanobactéries pourraient induire des effets physiologiques occasionnant un inconfort alimentaire pour les poissons (digestif, hépatique). Les doses n’atteignent pas les doses toxicologiques entrainant de la souffrance visible au niveau morphologique ou du comportement.

Devenir

Les poissons seront euthanasiés en fin de procédures et leurs organes prélevés pour analyses. Seuls les prélèvements tissulaires post-mortem permettent d’avoir accès aux différents compartiments biologiques qui seront ici investigués.

Remplacement

Seul ce type d’analyse intégrée portant sur des organismes entiers permet de générer une compréhension fine des processus écotoxicologiques qui en oeuvre chez ces modèles biologiques complexes (organismes + microbiote associé).

Réduction

Notre expérience dans ce type de travaux nous a permis de raffiner le design expérimental au niveau du temps d’exposition qui passe ici de 28 jours à seulement 5 jours. Par ailleurs, nos travaux mettront en oeuvre une approche de comparaison de la variance des différents paramètres biologiques ici renseignés (composition bactérienne et métabolique) afin d’estimer à la fois les variabilités biologiques et expérimentales. Nos expérimentations seront réalisées à des concentrations environnementales (en teneurs en cyanobactéries) et avec des effectifs nécessaires et minimums pour être en mesure de démontrer l’occurrence d’effets moléculaires d’un nombre réduit d’organismes.

Raffinement

Nos travaux sont développés dans le contexte de la caractérisation de biomarqueurs précoces (et également plus sensibles) de stress au niveau du microbiome et du métabolome (ensemble des métabolites retrouvés dans un échantillon biologique, et sa concentration) des poissons Médaka. En en accord avec le principe de raffinement de la règle des 3R pour l’expérimentation animale, les expérimentations seront menées à des concentrations en cyanobactéries produisant des cocktails bio-actifs proches de la concentration minimale induisant les premiers effets détectables toxicologique, afin de limiter les potentiels effets toxicologiques. Durant toute l’expérimentation, les organismes seront maintenus en groupe dans des conditions d’élevages standards, correspondants aux critères de raffinement préconisés par l’Organismes de Coopération et de Développement Economique pour l’élevage et l’expérimentation sur cet organisme.

Choix des espèces

Oryzias latipes : Espèce modèle aquatique vertébrée couramment utilisée en expérimentation scientifique pour des travaux de développement, d’écologie ou d’écotoxicologie avec différents types de contaminants environnementaux Jeunes adultes (entre 3 et 5 mois), afin de pouvoir aisément les sexer et d’éviter qu’ils ne présentent les altérations cellulaires qui commencent à apparaître après l’âge de 6 mois chez cette espèce.

Les souris utilisées portent un gène humain pathogène prélevé chez un patient, et la moitié seulement développe les dépôts amyloïdes recherchés après induction. 334 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, toutes tuées à l'issue. Chacune peut recevoir jusqu'à quatre injections intraveineuses de fibrilles amyloïdes, des injections hebdomadaires pendant deux mois, cinq prélèvements sanguins, et passer tous les un à deux mois une échographie cardiaque après épilation ainsi qu'une imagerie SPECT-CT, un suivi qui peut durer vingt-quatre mois. L'effectif s'explique par ce rendement de 50 % et par l'absence d'outil validé pour détecter la maladie du vivant de l'animal, ce qui conduit à tuer les souris par séries pour vérifier après coup lesquelles étaient atteintes.

Objectifs

Nous avons développé un modèle murin transgénique d’amylose AL qui reproduit en partie la maladie humaine. Ce modèle est basé sur l'expression dans la souris d’une protéine humaine pathogène issue d'un patient. Les dépôts amyloïdes apparaissent principalement dans le coeur suite à une induction par l'injection de fibrilles amyloïdes, et dans des délais variables, allant d’une semaine à quelques mois, dans environ 50% des animaux. Nous ne maitrisons donc pas complètement l’apparition des dépôts d'amylose et nous ne disposons pas encore d’outils fiables nous permettant de les détecter de façon certaine avant la mise à mort de l'animal. Nous voulons donc mettre au point des techniques d'imagerie non-invasives pour détecter l’apparition de l’amylose dans nos souris. La première technique est par échographie cardiaque, déjà testé et qui a révélé un intérêt potentiel. La deuxième est par imagerie nucléaire in vivo (scintigraphie) en utilisant des protéines radiomarquées qui est à priori la méthode la plus sensible et qui est une méthode déjà utilisée chez l'homme et validée chez la souris. Ainsi, l’objectif de ce projet est donc d’une part d’améliorer la reproductibilité de l’induction de l’amylose AL dans notre modèle afin d’en faire un meilleur outil pour des tests pré-cliniques, et d’autre part de mettre au point des techniques de détection de l’amylose in vivo par imagerie afin de s’assurer de la présence de la maladie avant toute procédure supplémentaire (thérapeutique, exploratoire). Une fois que l’on sera en mesure de discriminer les souris positives, des tests thérapeutiques seront réalisés afin de tester leur efficacité.

Bénéfices attendus

L'amylose cardiaque est un problème clinique majeur à l'origine du décès des patients à très brève échéance. Aucun traitement éliminant les dépôts dans le myocarde n'est actuellement disponible. Bien qu’imparfait, notre modèle est le seul permettant de reproduire les phases précoces de la maladie. D'une part, il nous a déjà permis d’élucider une partie des mécanismes physiopathologiques d’apparition de l’amylose AL in vivo, et d’étudier la toxicité des fibrilles amyloïdes dans le cœur. D’autre part, nous avons aussi pu commencer à faire des tests thérapeutiques. Nos résultats ont obtenu un accueil très enthousiaste de la part de la communauté scientifique et nous avons été sollicités par de nombreuses équipes qui souhaitent travailler avec notre modèle. Ce projet vise à la fois à optimiser l’induction de l’amylose (procédure 1) et à développer des outils de détection précoce de la maladie (procédures 1 et 2) afin d'en faire un bon outil pour des tests thérapeutiques (procédure 3). Ces optimisations sont indispensables car une meilleure induction associée à un dépistage précoce de la maladie permettra de fait de diminuer la taille des cohortes nécessaires pour valider les tests thérapeutiques. Enfin, la démonstration de l'efficacité d'un traitement ciblant les dépôts amyloïdes cardiaques chez l'animal (procédure 3) pourrait permettre d'améliorer le pronostic vital des patients. Les résultats de cette étude seront publiés et accessibles à la communauté scientifique et médicale.

Procédures

Les souris de ce projet seront soumises aux procédures décrites précédemment : prises de sang par voie sous-mandibulaire, injections par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intrapéritonéale, ainsi que des techniques non-invasives d'imagerie. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter leur stress, à l'exception des injections par voie intraveineuse ou intrapéritonéale qui seront conduites sur animaux vigiles. Si plusieurs procédures sont réalisées sur un même animal, elles seront espacées dans le temps autant que possible. Chaque souris sera soumise à plusieurs interventions : le prélèvement de sang : 5 fois maximum espacé d'au moins 1 mois, les injections intra-veineuses pour induction : 4 fois maximum espacé de 2 semaines entre chaque injection ; les injections intra-péritonéale et sous-cutanées : une fois par semaine pendant 2 mois maximum ; imagerie par échocardiographie (épilation des souris avant imagerie sous anesthésie) : 1 fois tous les 1 à 2 mois ; imagerie par SPECT-CT : 1 fois tous les 1 à 2 mois.

Impact sur les animaux

Chez l’humain, les signes cliniques de la maladie sont la fatigue, l'essoufflement lors de l’effort physique et la perte de poids. Toutefois, à ce jour, nous n’avons pas constaté d’insuffisance cardiaque symptomatique et/ou de souffrance et/ou de mortalité chez nos animaux en dépit des dépôts amyloïdes, même sur des animaux suivis sur 18 mois après induction. Les dépôts amyloïdes, souvent légers, présents dans le cœur et la rate principalement, semblent asymptomatiques. Cependant, avec l'amérioration de l'induction de la maladie que nous espérons obtenir, un suivi régulier des animaux induits sera effectué (voir grille d'évaluations et points limites) et des mesures seront prises si des effets indésirables sont observés. Les injections intraveineuses et les prélèvements sanguins peuvent aussi entraîner des hématomes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour réaliser des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la physiopathologie des amyloses. D’autre part, les approches thérapeutiques que nous souhaitons tester ont pour objectif de cibler les dépôts amyloïdes et de stimuler la réponse immunitaire, elles nécessitent de cette façon la totalité de l’organisme dans sa complexité pour pouvoir en étudier l’efficacité.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé en tenant compte qu'en l'état actuel de nos connaissances, seulement 50% des animaux développent une amylose après induction, et d'autre part qu'il est nécessaire, en l'absence d'outil de suivi validé sur notre modèle, d'euthanasier de façon séquencielle les animaux pour réaliser des analyses anatomopathologiques. La valeur statistique de nos résultats sera analysée avec un test statistique dédié à de faibles nombre d'animaux. Ce test a été utilisé dans nos études précédentes ce qui nous a permis de valider de façon robuste nos résultats. Le meilleur protocole d'induction sera déterminé statistiquement et permettra de diminuer le nombre d'animaux utilisés par la suite. Le suivi longitudinal de nos animaux, grâce au développement de l'imagerie non-invasive, permettra aussi de maîtiser l'évolution de la maladie et de n'utiliser que des animaux réellement positifs pour les tests thérapeutiques.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être et la règlementation (contrôle de la température et de l’hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie et antalgique en cas de douleur). Les souris seront surveillées quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie.

Choix des espèces

Certaines amyloses ont déjà été reproduite avec succès chez la souris. Les études in-vivo chez la souris permettent de mieux évaluer le potentiel thérapeutique des molécules, même si elles ne préfigurent pas des résultats qui seront obtenus chez l'humain. Les animaux seront utilisés à partir de 4 mois et jusqu'à 24 mois en fonction de la vitesse d'apparition des dépôts et des lésions associées qui sont des mécanismes relativement long.

Six rémiges coupées au ras de la peau, quatre prélèvements sanguins à la veine alaire, une anesthésie par injection intramusculaire pour passer au scanner : 333 poulets de chair reproducteurs, mâles et femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. L'objectif déclaré est d'évaluer si la reproduction au sol, sans cage, améliore ou dégrade le bien-être et la santé des reproducteurs, sur trois lignées de vitesse de croissance différente. Les femelles destinées à la radiographie sont mises à jeun, enfermées en caisses, transportées en véhicule sur un kilomètre, pesées, puis anesthésiées, le porteur reconnaissant qu'un accident anesthésique reste possible, apnée prolongée ou arrêt cardiaque. Sur les 333 individus, 273 seront ensuite "disponibles à la vente" comme animaux vivants, les 60 autres étant tués.

Objectifs

En sélection, les lignées de volailles sont, pour une partie de leur vie, hébergées en cage. La reproduction en cage permet un suivi individuel de la ponte, mais surtout une reproduction par insémination artificielle qui limite la consanguinité en contrôlant les couples reproducteurs et de connaître le pedigree de la descendance à chaque génération. Aujourd’hui, nous cherchons à concevoir un élevage sans cage, plus en lien avec les demandes sociétales de bien-être animal. Si la reproduction au sol ouvre la possibilité d’exprimer des comportements naturels positifs (activité, bain de poussière,…), l’effet global sur le bien-être des animaux doit être mieux évalué. Des interactions sociales agressives entre adultes au sol peuvent s’accompagner d’une baisse du bien-être du troupeau, avec l’apparition de picage, de comportements violents voire de cannibalisme. D’autre part, ce mode d’élevage des reproducteurs pourrait avoir un effet sur la santé des mâles comme des femelles. Le but du projet est d’estimer les conséquences d’une reproduction au sol sur le comportement et la santé des reproducteurs, ainsi que sur la diversité génétique des descendants, en utilisant trois lignées génétiques de poulets de chair, variant sur la vitesse de croissance et les caractéristiques métaboliques. Ce projet, en collaboration avec deux unités expérimentales, évaluera comment une reproduction au sol impacte le bien-être et la santé des animaux reproducteurs, et si cet impact varie entre lignées aux caractéristiques distinctes. Le projet implique des prises de sang sur les animaux pour évaluer (i) le taux d’hormones indicatrices de comportements agressifs et du niveau de stress des animaux et (ii) la variation des paramètres immunitaires en fonction du milieu de vie ainsi que des prélèvements de plumes. Les femelles subiront également une anesthésie pour pouvoir évaluer leur santé osseuse de façon peu invasive (CT scan).

Bénéfices attendus

Ce projet est un approfondissement pour soutenir une modification de nos pratiques pour accompagner la transition vers un mode alternatif d’élevage en sélection. A court terme, il permettra l’évaluation des pratiques prenant en compte : les effets positifs ou négatifs d’un élevage au sol sur le bien-être et la santé des animaux reproducteurs. Au niveau scientifique, ce projet permettra une meilleure connaissance des interactions entre environnement d’élevage (cage vs sol) et génétique (croissance lente, intermédiaire ou rapide) sur les performances de reproduction et le comportement des animaux.

Procédures

Les animaux, d’élevage en cage ou d’expérimentation au sol, seront soumis à 4 prélèvements sanguins maximum à l’âge adulte, séparés d’au moins 3 semaines entre eux. La technique de prélèvement de sang à la veine alaire ne dure que quelques secondes. Les animaux subiront également un prélèvement de plumes par découpe des rémiges. Nous couperons les plumes une première fois, avant le début de la reproduction, pour s’assurer que les plumes prélevées ont bien poussé pendant la période d’intérêt. Nous préleverons ensuite, six semaines plus tard environ, en coupant 6 rémiges au ras de la peau. Les femelles subiront une anesthésie générale par injection musculaire à l’âge adulte (entre 35 et 41 semaines d’âge) pour une radiographie.

Impact sur les animaux

Les animaux d’élevage en cage ou d’expérimentation au sol, seront soumis à 4 prélèvements sanguins à l’âge adulte. Les prélèvements sanguins à l’âge adulte entrainent un risque de douleur légère de courte durée, un léger risque d’hématome et un potentiel stress de contention. La découpe des plumes peut également entrainer une douleur de courte durée. L’injection de l’anesthésique pour les poules peut être douloureuse (intramusculaire). Un accident anesthésique est également possible (apnée prolongée, arrêt cardiaque).

Devenir

Tous les animaux n’ayant subi qu’une procédure légère seront disponibles à la vente (animaux vivants).

Remplacement

Pour évaluer les possibilités de reproduction au sol des poulets de chair et connaître leur impact sur le bien-être, le modèle le plus adapté est le poulet de chair lui-même. Le comportement des individus ne peut être observé que sur un animal entier. Aucune méthode substitutive ne permet de reproduire la richesse des comportements reproducteurs et de leur impact sur la santé et la diversité génétique.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires pour ce projet a été évalué d'après (i) les résultats d’une première expérimentation (ii) des publications scientifiques, et (iii) des simulations de précision de l'estimation des paramètres physiologiques et génétiques, qui sont les éléments de base de la construction des schémas de sélection. Les effectifs les plus faibles sont pour les mâles. De nombreux caractères seront testés, dont plusieurs ont déjà montré des différences significatives à moins de 20 individus. D’autre part, des prélèvements multiples, permettront de renforcer la puissance des effets observés entre traitements en utilisant moins d’animaux. Les femelles seront, elles, au nombre de 20 par traitement, et des femelles non prélevées seront également présentes pour respecter un sexe ratio de 1 mâle pour 3 femelles en cages et 1 pour 4.4 femelles au sol pour garantir leur bien-être. Les animaux au sol permettront de tester trois traitements différents : au sol en sexes séparés (sans reproduction) et au sol en reproduction libre, pour réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Le calme et une contention soignée pendant la prise de sang seront mis en œuvre. Par ailleurs, les animaux voués à l’expérimentation de la reproduction au sol seront élevés sur copeaux, en groupe, et auront accès à l’aliment selon les schémas de rationnement. Un panel d’enrichissements du milieu sera disponible : plateformes de perchage, cachettes, nids, et distribution de nourriture aléatoire dans la litière. En plus des bienfaits habituels des enrichissements, ces derniers seront cruciaux pour limiter l’agressivité entre les animaux, que ce soit les comportements harceleurs des mâles envers les femelles (cachettes), l’agressivité entre mâles, ou la compétition pour la nourriture (distribution dans la litière favorisant le grattage). Le transport des animaux entre les deux plateformes, à 1km l’une de l’autre, sera organisé ainsi : - Avant le premier repas: mise en caisses des poules qui passeront au CT le matin, elles sont à jeun et sont mises dans des caisses numérotées et adaptées à leur taille et poids (maxi 3 ou 4 poules). - Elles sont transportées en véhicule agréé (transport d’animaux) puis déposées dans le local d’attente chauffé si besoin. - Elles sont pesées individuellement pour définir la dose d’anesthésiant à injecter. - Quatre heures après la mise à jeun les poules commencent à être anesthèsiées, passer au CT scan, et sont remises en caisses - Une heure après l’anesthésie, les poules sont retransportées et remises dans leur condition d’élevage habituelle. Si elles paraissent encore endormies, elles sont isolées jusqu’à réveil complet. - Si la procédure prend plusieurs jours, les poules scannées sont marquées individuellement pour être sur qu’elles ne sont pas manipulées deux jours de suite. Les animaux sont surveillés régulièrement tout au long de la journée et au retour au bâtiment afin de vérifier que tout va bien. Tous les animaux seront visités quotidiennement pendant quelques minutes. Si un animal est blessé ou malade (emplumement, picage) ou s’il est en souffrance (prostration permanente), il sera isolé en infirmerie jusqu’à récupération complète.

Choix des espèces

L’objectif étant l’étude de la reproduction au sol des poulets de chair, le modèle le plus adapté est le poulet de chair lui-même. Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux adultes, pour phénotyper des reproducteurs.

Pour fournir aux kits de diagnostic vendus dans le commerce un contrôle positif standardisé qui remplace le sérum humain, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, toutes tuées à l'issue. Chaque souris reçoit des injections intrapéritonéales d'antigènes puis subit des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, avant d'être tuée pour que sa rate serve à créer une lignée cellulaire productrice d'anticorps. Le porteur prévoit 200 antigènes différents. Il affirme qu'une réponse immunitaire spécifique reste "impossible" à reconstituer en culture cellulaire, qu'une immunisation animale est donc "nécessaire", et situe l'enjeu du côté de l'approvisionnement des "demandes du marché du Diagnostic".

Objectifs

Les kits de diagnostic immunologique clinique consistent en la recherche d’un anticorps donné spécifique d’une cible donnée (bactérie, virus, moisissure, allergène alimentaire, marqueur métabolique, marqueur tumoral, marqueur d’auto-immunité…). Ces kits nécessitent la présence d’un contrôle positif représenté actuellement par un sérum humain. Il est parfois difficile d’obtenir, de façon récurrente, ou à un coût raisonnable ou prévisible, un sérum humain ayant la spécificité souhaitée et ces problèmes de reproductibilité voire d’approvisionnement constituent souvent un frein à la commercialisation.

Bénéfices attendus

Cette production permettrait une production robuste industrielle, respectueuse des contraintes règlementaires, s’appuyant sur des procédés de bioproduction en culture cellulaire, une évolution dans la production d'anticorps car la législation va dans le sens de la suppression progressive de ces produits d’origine humaine, une standardisation des contrôles positifs proposés. Ceci est une garantie de reproductibilité des tests dans un souci de participer à l’amélioration du diagnostic médical. L’offre du développement « sur mesure » de l’anticorps, d'optimisation et de validation limitent au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour chaque développement. En parallèle, ce type de technologie permet la mise au point d’anticorps pouvant servir de médicaments contre le cancer, l’immunothérapie, ou servir aussi en diagnostic lorsqu’ils sont couplés à des radioisotopes.

Procédures

Tous les animaux vont être soumis à des prélèvements sanguins efféctués sous anesthésie gazeuse afin de réduire la douleur et le stress de l'animal ainsi qu'à des injections en intra-péritoneale.

Impact sur les animaux

L'anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant et après chaque procédure/prélèvement. Les animaux auront seulement le stress de la manipulationainsi qu'une douleur résiduelle de faible intensité et de courte durée dûe à l’introduction de l'aiguille.

Devenir

Tous les animaux immunisés sont sacrifiés afin de récupérer la rate pour la fusionner et créer une lignée cellulaire productrice d'anticorps

Remplacement

Le recours à des techniques totalement en culture cellulaire ou sur organes isolés est impossible car une réponse immunitaire spécifique pour un antigène donné doit être induite dans un environnement immunologique complet, impossible de reconstituer en culture cellulaire, car faisant appel à des mécanismes génétiques , moléculaires et cellulaires mimant une réponse immunitaire humaine. Une immunisation des animaux est nécessaire pour générer des anticorps spécifiques. La technique retenue permet de sélectionner des cellules productrices selon des critères majeurs de productivité, permettant de s'affranchir totalement de toute production en ascite chez la souris. Les animaux retenus permettent la génération de cellules productrices à hauts rendements de production. Les titres obtenus avec des modèles classiques de production en culture cellulaire permettent de répondre aux besoins et d’approvisionner largement les demandes du marché du Diagnostic.

Réduction

Le fait de ne pas avoir à modifier l’anticorps pour le tester dans l’application finale, notamment pour ces caractéristiques humaines permet de réduire le nombre de cohortes d’animaux nécessaires et de ne maintenir en expérimentation que les animaux qui répondent parfaitement aux caractéristiques attendues. Un simple test du sérum permet la validation rapide en immunoessai de ces aspects, limitant les temps d’expérimentation sur l’animal et le nombre d’animaux. L’anticorps produit pour l’utilisation finale est le même que celui sélectionné initialement chez l’animal, sans qu’aucune modification de structure n’y ait été apportée. Les candidats anticorps générés par notre approche sont directement humanisés, de sorte que seuls quelques candidats sont nécessaires initialement pour finalement choisir le meilleur candidat pour l’application visée. Cette approche permet ainsi de limiter le nombre de cohortes et d’animaux nécessaires pour le développement même dans le cas de cahiers des charges et d’exigences très complexes. Nous prévoyons d'utiliser 200 antigènes. En parallèle, tous les prélèvements sanguins ou de queues seront effectués par voie sous-mandibulaire, sous anesthésie gazeuse afin d'éviter le stress et la souffrance chez l'animal.

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux, une période minimale de 5 jours d'acclimation à la zone d'hébergement expérimentale sera effectuée. Ils seront également progressivement manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations.

Choix des espèces

L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court ainsi que pour un coût d’hébergement bas. Cette espèce est utilisée à des fins scientifiques internationalement reconnues et est facilement modifiable génétiquement. Sur des animaux adultes de 2 à 12 mois. A partir de 2 mois pour que les animaux aient un système immunitaire mature. Pas après 12 mois afin d'éviter des réactions auto-immunitaires.

Inflammation généralisée, prise de poids et excès de graisse dans le foie sont attendus, et les souris qui franchissent un point limite sont mises à mort. 1 782 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses après la mort, dans des procédures que le porteur classe au niveau de souffrance léger. Une partie reçoit pendant vingt-quatre semaines un régime riche en graisse à partir de l'âge de six semaines, puis toutes reçoivent des injections de dérivés du cholestérol deux jours de suite et deux prises de sang, à quatre puis douze jours. L'objet est de savoir si une protéine de l'immunité innée détecte ces dérivés comme un signal de danger, le porteur utilisant déjà des cocultures et des modèles informatiques mais affirmant avoir besoin de "l'organisme entier".

Objectifs

Des maladies chroniques telles que l’obésité ont énormément progressé depuis le début du siècle. L’obésité, définie comme l’indice de masse corporelle égal ou supérieur à 30 kg/m2 pour les adultes, est un facteur de risque pour d’autres types de maladies, tels que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Il est bien établi, par exemple, que l’obésité est la cause la plus commune de la résistance à l’insuline, ce qui déclenche le diabète de type 2. C’est pourquoi des stratégies biologiques fondamentales ainsi que cliniques sont essentielles pour empêcher la progression de ce type de complications. Au-delà des différences individuelles et comportementales, l’obésité et des maladies associées ont en commun un défaut dans le métabolisme des lipides, ainsi qu’une inflammation exacerbée. Cette inflammation est causée notamment par les cellules du système immunitaire qui migrent aux sites où il y a un excès de lipides, où elles libèrent des molécules solubles qui assurent la communication entre elles. Par conséquent, le système immunitaire joue un rôle essentiel dans les maladies associées aux excès de lipides. Grâce aux expériences de laboratoire dans des lignées cellulaires ainsi que dans des cellules issues de souris, nous avons découvert qu’une protéine du système immunitaire joue un rôle très important dans le déclenchement de l’inflammation causée par des lipides. L’objectif du projet est alors de comprendre si cette protéine du système immunitaire innée fonctionne comme un détecteur des lipides in vivo pour déclencher une réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Très récemment, il a été décrit que le système immunitaire joue un rôle dans l’inflammation déclenchée par des lipides. Néanmoins, notre étude est pionnière à montrer un lien direct entre une protéine précise du système immunitaire inné et une famille de lipides. C’est pourquoi, à court terme, notre premier objectif est de démontrer que cette protéine du système immunitaire inné est essentielle pour que la souris puisse détecter une famille de lipides comme un signal de danger. Cet objectif correspond à mieux comprendre le mécanisme intervenant entre le système immunitaire inné et le métabolisme des lipides. La compréhension de ce mécanisme pourra servir de base pour l’objectif à plus long terme de développer des agents thérapeutiques contre l’inflammation observée dans l’obésité morbide et /ou le diabète de type II. Enfin, étant donné qu’il y a une forte corrélation entre un excès de lipides et la progression des tumeurs à cause de leurs effets dans plusieurs voies de signalisation, et grâce à l’expertise de l’équipe à la fois dans le développement des agents pour l’immunothérapie du cancer et dans les connaissances fondamentales sur la protéine d’intérêt, notre autre objectif à long terme est d’optimiser les agents thérapeutiques contre le cancer en ciblant notre protéine d’intérêt et ainsi réguler le métabolisme des lipides.

Procédures

Dans un premier lot d’animaux, chaque souris vigile sera injectée avec des traitements, une fois par jour pendant deux jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Quatre jours après la première injection, les souris auront un prélèvement de sang. Huit jours plus tard, un autre prélèvement de sang sera réalisé (durée de chaque prélèvement inf à 20 sec). Dans un second lot d’animaux, des souris à l’âge de six semaines suivront un régime alimentaire normal ou un régime alimentaire riche en graisse pendant 24 semaines. Certains de ces animaux seront injectés avec des traitements une fois par jour pendant deux jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Quatre jours après la première injection, les souris auront un prélèvement de sang. Huit jours plus tard, un autre prélèvement de sang sera réalisé (durée de chaque prélèvement inf à 20 sec).

Impact sur les animaux

À la suite des injections avec les oxystérols (produits résiduels du cholestérol) : - une douleur liée à la piqûre elle-même est attendue (gêne de courte durée) - une inflammation est attendue au niveau systémique (= inflammation généralisée) - une augmentation du poids est attendue - une augmentation du pourcentage de graisse dans le foie. Des anomalies hépatiques pourraient être détectées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

À la suite des expériences in vitro, nous avons constaté que seulement certains types cellulaires sont l’objet de la régulation par la protéine d’intérêt. Une alternative que nous sommes déjà en train d’évaluer est l’utilisation de cocultures, où deux types cellulaires peuvent être analysés en détail in vitro en même temps. Une autre alternative est la modélisation in silico (modèles informatiques), que nous utilisons déjà pour mieux comprendre le fonctionnement de la voie décrite ici au niveau moléculaire. Néanmoins, pour bien caractériser les propriétés des cellules immunitaires qui sécrètent des molécules solubles assurant la communication entre elles, il reste nécessaire d’utiliser un modèle préservant la complexité des interactions entre tous les types cellulaires et au niveau de l’organisme entier.

Réduction

Pour toutes nos expériences, le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis deux ou trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et de surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer fréquemment le stress des souris et des points limites ont été définis. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort

Choix des espèces

L’étude du métabolisme des lipides et leur relation avec l’obésité, ainsi que le rôle de l’immunité innée ont été bien décrits chez la souris. Ces mécanismes sont similaires chez la souris et l’homme. En plus, des données de notre laboratoire montrent que le mécanisme de réponse aux lipides est conservé chez les cellules de souris ainsi que chez les cellules humaines. Nous allons utiliser des souris jeunes à partir de 8 semaines d’âge, quand le système immunitaire de la souris est bien développé, jusqu’à 32 semaines selon la procédure.

Immobilisés une à deux secondes par un courant électrique dans leur rivière, 65 vairons et chevaines sont pêchés, transportés au laboratoire et acclimatés à la température de l'eau. Avec 25 truites fournies par une pisciculture, ils sont sédatés, mesurés au millimètre, laissés au repos, puis lâchés dans un canal expérimental où ils dévalent une goulotte devant une caméra, jusqu'à cinq fois chacun, soit deux à deux heures et demie de manipulation par individu. Ces 90 poissons subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et tous sont relâchés, les vairons et chevaines sur leur site de capture, les truites sur un site déjà rempoissonné par le fournisseur. Les images doivent entraîner une intelligence artificielle à reconnaître et mesurer les truites qui descendent les rivières, avant d'investir dans une installation sur un ouvrage hydroélectrique, le porteur indiquant avoir préféré des poissons sauvages relâchés à des poissons d'élevage qu'il aurait fallu tuer.

Objectifs

La compréhension des besoins de déplacement des poissons est nécessaire pour proposer des mesures de restauration de la continuité écologique adaptées et efficaces. Contrairement aux espèces amphihalines (qui effectuent des migrations entre les milieux marins et les eaux douces), les besoins de déplacements des espèces résidentes en cours d’eau sont moins connus. Les adultes de truite fario (Salmo trutta fario) effectuent des migrations reproductives, en remontant dans des zones de frayères essentiellement situées en tête de bassin versant, mais les patrons de dispersion des juvéniles dans leurs premières années de vie sont beaucoup moins connus, à cause de la difficulté à étudier les déplacements des petits individus. Toutefois, un mouvement de ces juvéniles vers l’aval des cours d’eau (dévalaison) est attendu. De nombreux aménagements hydroélectriques sont implantés dans les zones de montagne ou de piémont, à peuplement majoritaire de truite. Ces aménagements fragmentent le milieu et peuvent avoir un impact fort puisque, lorsqu'ils dévalent, les poissons transitent bien souvent par les turbines, sources de mortalité élevée voire totale. L’installation d’un système de protection est possible mais souvent couteuse et techniquement complexe, et il est nécessaire d'améliorer nos connaissances sur le phénomène de dévalaison des truites pour concevoir et dimensionner au mieux les dispositifs de réduction d’impact, avec un rapport coût/efficacité optimisé (quelle temporalité ? pour quelles tailles de poissons ? ...). Pour y répondre, un suivi par vidéocomptage des flux d'individus dévalants est envisagé dans un dispositif de dévalaison installé sur un site de montagne. Compte tenu des conditions beaucoup plus contraignantes pour l’acquisition de l’image que ce qui est classiquement le cas pour des poissons comptés en montaison dans les dispositifs de franchissement (vitesse de passage plus élevée, présence de bulles et de feuilles), la présente étude vise à tester l’efficacité de l’intelligence artificielle (IA) pour reconnaitre les poissons dévalants et estimer leur taille en condition de laboratoire (canal expérimental permettant de reproduire les conditions d’écoulements de la goulotte réelle), avant d’engager l’investissement nécessaire à une installation in situ.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de tester la possibilité de suivre la dévalaison des truites par vidéocomptage dans un dispositif de dévalaison en exploitant les données par l’intelligence artificielle. C’est uniquement en cas de résultats positifs que l’installation du système de vidéocomptage sur le site envisagé pourrait intervenir au printemps - été 2025. Le système, si opérationnel, pourra être utilisé sur d’autres sites, ce qui contribuera à améliorer les connaissances des besoins en déplacement des poissons de rivière. Ces observations permettront de mieux concevoir et dimensionner les dispositifs de protection des poissons au niveau des ouvrages hydroélectriques, avec un rapport coût/efficacité optimisé, prenant notamment en compte les périodes de dévalaison et la taille des individus concernés.

Procédures

Les tests consistent à faire nager les poissons dans un canal expérimental, aménagé en dispositif de dévalaison, et filmer leur passage vers l’aval. Les tests seront conduits avec 3 espèces différentes : la truite en priorité (d’origine pisciculture), le vairon et/ou le chevaine (issus de milieu naturel) pour remplacer les tailles des truites cibles indisponibles en pisciculture au moment des tests. Les vairons et les chevaines nécessaires seront temporairement prélevés dans un cours d’eau et relâchés sur leur site d’origine après l’expérimentation. Utiliser des vairons et des chevaines sauvages (avec retour dans la nature) est apparu plus adapté qu’utiliser des vairons d’élevage avec l’obligation de mise à mort après l’expérimentation (impossibilité de placement ou de les relâcher dans la nature). Le prélèvement se fera par pêche à l’électricité, technique de capture la plus efficace compte tenu de la faible activité des poissons pendant la période d’expérimentation, tout en réduisant au maximum les dommages sur les individus et le dérangement du milieu. Les poissons seront transportés et mis en hébergement au laboratoire. Avant les tests, tous les poissons (90) seront sédatés, mesurés (au mm près) et laissés au repos 15-30 min avant le lancement des tests dans le canal expérimental pour récupérer complètement des effets de la sédation. Les poissons seront ensuite libérés, individuellement ou en groupe, directement dans la partie amont du canal expérimental, aménagée en goulotte de dévalaison. Après leur passage filmé vers l’aval, les poissons seront repêchés à l'épuisette, placés dans des viviers/seaux et laissés au repos env. 10 minutes avant le passage suivant. Chaque poisson sera utilisé au maximum 5 fois. Il est estimé qu’un individu sera manipulé en tout au maximum 2-2.5 heures (sédation, récupération, 5 passages filmés dans le canal, séparés par 10 min. de repos).

Impact sur les animaux

La réalisation de ce projet nécessite 1/ la capture de vairons et de chevaines (65 ind.) en milieux naturel par pêche à l’électricité (les truites (25 ind.) seront fournies par une pisciculture), 2/ le transport de tous les individus au laboratoire et leur manipulation dans les installations expérimentales. 1/ L’appareil utilisé pour la pêche est un engin portatif, capable de produire un courant continu, le moins impactant pour le poisson. La prospection des habitats sera partielle (prospection uniquement des habitats favorables aux espèces recherchées) afin de réduire l’impact de l’opération sur les populations du secteur pêché. L’immobilisation des individus à l’électricité sera de très courte durée (1-2 sec), la récupération de leur activité respiratoire est presque immédiate. Des effets indésirables plus graves (blessures) peuvent subvenir mais dépendent de l’intensité du champ électrique, de la durée d’exposition, des conditions environnementales et de l’opérateur. Tout le personnel participant à l’opération de pêche est formé et tout sera mis en œuvre pour éviter les dommages sur les poissons capturés : réglage de l’engin de pêche, retrait rapide des individus hors du champ électrique, stabulation en eau fraiche et oxygénée). 2/ L’unique nuisance attendue sur les animaux lors des diverses manipulations (transport, mise en hébergement, sélection des individus, réalisation des tests) est le stress et le risque de dommage en cas d'échappement. Pour réduire ces nuisances, la biométrie des poissons se fera sous sédation. Le transport des truites sera assuré par le fournisseur, équipé à cet effet. Les poissons prélevés dans la nature seront transportés par notre équipe dans un vivier (1*1m) adapté au transport, rempli d’eau constamment oxygénée à l’aide d’un bulleur pendant le trajet. A l’arrivée au laboratoire, les poissons seront acclimatés progressivement à la température de l’eau avant le transfert dans les bacs de stabulation. Les autres manipulations seront réalisées avec rapidité mais précaution pour éviter tous dommages des individus. Les conditions de stabulation seront surveillées à tout moment (circulation d’eau, oxygénation, obscurité pour tranquilliser les poissons). La sédation en soi pouvant être considérée comme une source de risque (si incorrectement réalisée), les doses d’anesthésiant les plus faibles seront appliquées (avec des délais d’exposition réduits), et progressivement augmentées si l’effet recherché n’est pas atteint.

Devenir

Toutes les truites en bonne santé seront relâchés en milieu naturel sur un des sites où l’espèce est déjà rempoissonnée par le fournisseur. Les vairons et les chevaines seront libérés sur leur site d’origine.

Remplacement

Les images acquises ont une double utilité. Elles serviront d’abord à l’entrainement de l’IA pour reconnaitre des poissons adoptant diverses positions sur l'image, puis à tester l’efficacité de cette reconnaissance (pourcentage d'individus détectés, évaluation de leur taille). Il est donc nécessaire de réaliser les tests avec des poissons vivants, qui adoptent des comportements de nage en réponse aux conditions d’écoulement dans la goulotte, tout en présentant une variabilité interindividuelle. En effet, le mouvement actif des poissons influence leur position dans la colonne d’eau (surface ou fond), la direction de leur corps lors du passage (tête ou queue en avant : certains individus empruntent la goulotte "en marche arrière", en nageant à contre-courant, de manière à freiner et contrôler leur descente), leur vitesse de déplacement dans la goulotte (vitesse potentiellement plus ou moins rapide que l'écoulement en fonction de leur positionnement en marche "avant" ou "arrière") et surtout la silhouette détectée par le système d'analyse d'image (les images de corps en mouvement ne sont pas comparables à celles prises sur des individus rigides). Cette variété de situations possibles doit être également prise en compte dans la calibration de l’acquisition d’une séquence, car il est prévu que l’enregistrement ne se lance que suite à une détection effective du passage d'un poisson. Il ne serait donc pas informatif de conduire des tests avec des maquettes de poissons ou des poissons morts, qui ne se positionneront et ne se déplaceront pas dans la goulotte comme des individus vivants.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, il a été décidé de travailler sur moins d’individus et de répéter les manipulations, sans toutefois dépasser 5 répétitions par individus. La méthodologie a été conçue de manière à pouvoir relier chaque individu à l’image enregistrée (pour mesurer l’efficacité à évaluer la taille) sans besoin d’un marquage individuel (par transpondeur ou marquage externe) qui engendrerait une nuisance supplémentaire aux animaux. De plus, seront testés uniquement des individus de taille entre 3 et 15 cm (maxi 20 cm selon la disponibilité des poissons auprès du fournisseur). Les tailles supérieures ne seront pas testées puisque nous partons de l’hypothèse que si des individus entre 10-15 cm sont détectés avec une bonne fiabilité, cela vaudra également pour les individus plus grands. L’expérimentation est de courte durée (quelques jours de captivité au maximum) et tous les poissons seront libérés après les tests : les truites sur un des sites déjà empoissonnés par le fournisseur, les vairons et les chevaines sur leur site d’origine.

Raffinement

Pêche - L’appareil utilisé est un engin portatif qui produit un courant continu, le moins impactant pour le poisson. La prospection des habitats sera partielle afin de réduire l’impact de l’opération sur les populations du secteur pêché. L’immobilisation des individus à l’électricité sera de très courte durée (1-2 secondes), la récupération de leur activité respiratoire est presque immédiate. Tout le personnel participant à l’opération de pêche à l’électricité est formé et tout sera mis en œuvre pour éviter les dommages sur les poissons capturés. - Biométrie sous sédation - Temps de calme de 10 minutes entre les différents passages dans le canal - Très bonnes conditions de stabulation (température, oxygène) et surveillées deux fois par jour - Bassins couverts pour réduire la luminosité et tranquilliser les poissons, éviter l’échappement. - Faible densité dans les bassins/seaux. - Manipulation rapide, remise en liberté des poissons après tests.

Choix des espèces

L’étude envisagée in situ vise uniquement la truite fario (cf. justification dans le paragraphe 5.5.1.). L’intelligence artificielle doit être paramétrée pour la reconnaissance de cette espèce et pour cela, il est nécessaire de rester, autant que possible, sur la même espèce. Cependant, en cas de l’impossibilité de se fournir en truite fario pour l’ensemble des tailles cibles, il a été décidé d’utiliser, pour les tailles manquantes, une autre espèce disponible avec une morphologie du corps proche : le vairon ou le chevaine . La reconnaissance d'individus de taille comprise entre 3 et 15 (20) cm est principalement visée. D’une part, il est nécessaire pour l’étude à venir de vérifier l'efficacité à suivre les individus de ces tailles, qui correspondent aux individus d’âge 0+ à 2+, supposés d’effectuer un déplacement vers l’aval dans les cours d’eau. Les tests sur des individus de tailles supérieures à 15 (20) cm n’apparaissent pas nécessaires puisque nous partons de l’hypothèse que si les individus entre 10-15 (20) cm sont détectés avec une bonne fiabilité, cela vaut également pour les individus plus grands.