Procédures légères

440 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés, et 165 d'entre elles subiront dix gavages étalés sur douze jours quand d'autres n'en subiront qu'un seul. Chaque gavage dure moins d'une minute et peut irriter l'œsophage au point de faire perdre du poids à l'animal. L'objet est de savoir où va le resvératrol une fois ingéré et comment l'organisme le transforme, le porteur affirmant devoir travailler sur un "organisme entier". Le bénéfice qu'il annonce reste méthodologique et conditionnel, la technique de marquage "pourrait être appliquée à d'autres composés".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de savoir dans quels organes se retrouve un composé dont les propriétés de neuroprotection ont déjà été démontrées une fois qu’il a été ingéré par l’animal. Ce projet nous permettra aussi de comprendre comment ce composé est dégradé, transformé par l’organisme et comment il agit ce qui, à ce jour, n’est pas complètement identifié.

Bénéfices attendus

Le développement de la nouvelle méthode de marquage associée à l’imagerie que nous proposons permettrait de déterminer la nature et la localisation du resvératrol et de ses métabolites. Cette méthode pourrait être appliqué à d’autres composés.

Procédures

Gavage sur animal vigile : 165 souris, 1 fois. Gavage sur animal vigile : 55 souris, 1 fois par jour sur 2 jours. Gavage sur animal vigile : 55 souris, 1 fois par jour sur 5 jours, pause de 2 jours, puis 1 nouveau gavage. Gavage sur animal vigile : 165 souris, 1 fois par jour sur 5 jours, pause de 2 jours, puis 1 fois par jour sur 5 jours. Un gavage dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée à une irritation de l’œsophage à cause du gavage. Stress lié à la contention au moment du gavage.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car nous souhaitons ensuite analyser les organes prélevés.

Remplacement

Les composés seront vérifiés et validés avant d’être administrés aux animaux. Cependant nous souhaitons connaitre le comportement des composés une fois ingéré par l'animal (où va-t-il ? dégradation ?), pour cela nous devons travailler sur un organisme entier.

Réduction

Seuls les composés validés in vitro seront testés. Si les résultats obtenus avec les premiers composés testés ne sont pas concluants, nous n'irons pas plus loin. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de faire des analyses qui nous permettront de mieux comprendre le mécanisme d’action des molécules.

Raffinement

Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs en suivant des critères bien définis. En cas de souffrance des mesures conservatoires seront mises en place pour soulager l'animal. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors il sera euthanasié. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant.

Choix des espèces

Des travaux précédents ont déjà été réalisés avec ce composé. Afin d’avoir un point de comparaison et positionner la méthode que nous avons développer nous travaillerons dans les mêmes conditions que nos prédécesseurs. Pour cela nous utiliserons la souris à l’âge adulte de 8 semaines. A cet âge les souris ont une taille raisonnable qui facilite leur manipulation diminuant ainsi le stress lié à leur manipulation.

Trois à quatre séances d'IRM de deux heures chacune, sous anesthésie gazeuse, avec injection d'un produit de contraste : 50 souris et 50 rats en bonne santé passent par ce protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le projet ne porte sur aucune maladie, il sert à mettre au point des séquences d'imagerie, et le porteur annonce comme retombée de "faire progresser les recherches de nos partenaires et de nos clients". Il décrit cette imagerie comme non invasive, indolore et sans nuisance attendue, tout en programmant la mise à mort de chaque animal. Le seuil qui la déclenche n'a rien de médical : les rats sont tués quand ils atteignent 500 grammes et les souris 45 grammes, poids au-delà desquels ils ne rentrent plus dans l'appareil disponible en routine.

Objectifs

Un modèle animal permet d’étudier dans des conditions contrôlées de laboratoire les causes, les processus et les traitements éventuels d’une pathologie. Il doit présenter des similitudes avec la pathologie humaine correspondante en termes de symptômes et de mécanismes physiopathologiques. Une grande partie des connaissances en biochimie, physiologie ou pharmacologie ont été acquises grâce à l’étude des modèles animaux. Dans ce contexte, l’imagerie et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) sont des techniques d’investigation non irradiantes, non invasives, n’entrainant pas de douleur ou de souffrance chez l’animal anesthésié. L’application de ces méthodes in vivo chez le petit animal permet la caractérisation et la compréhension de modèles de pathologies, tant d’un point de vue anatomique que fonctionnel. Elle permet également la validation préclinique de nouvelles molécules à visée thérapeutique et l’étude des mécanismes d’action de médicaments actuellement utilisés. Le premier avantage de l’imagerie RMN in vivo est la possibilité de suivre des phénomènes biologiques complexes chez un animal au décours de sa pathologie et donc d’utiliser moins d’animaux que lors d’approches in vivo invasives. Le second avantage de l’imagerie RMN in vivo tient au fait que les technologies utilisées (aimants RMN, produits de contraste) sont identiques à celles utilisées chez l’Homme, permettant ainsi une recherche biomédicale translationnelle. Or la mise au point de cette approche nécessite régulièrement de nouvelles séquences d’acquisition et méthodologies qui doivent être développées, évaluées et optimisées sur des animaux avant d’être applicables dans des projets de recherche. Ainsi les objectifs principaux du projet mené sur des rongeurs sont : • d’optimiser les paramètres d’acquisition de séquences existantes afin de les adapter au mieux au modèle biologique et à ses spécificités ; • de développer et mettre au point de nouvelles techniques d’imagerie et de spectroscopie RMN.

Bénéfices attendus

Le développement et la validation de nouvelles méthodes en imagerie et spectroscopie RMN contribuent à faire progresser les recherches de nos partenaires et de nos clients

Procédures

L’examen RMN est effectué sur un équipement dédié aux investigations chez le rongeurs sous anesthésie . Les animaux sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Nous estimons que 3-4 examens RMN sous anesthésie seront réalisés sur un animal au cours du projet, avec un intervalle minimum d'une semaine entre 2 anesthésies.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles liées à l'injection d'un produit de contraste (réduites car l'injection est effectuée sous anesthésie). Aucune nuisance liée à l'imagerie in vivo n'est attendue.

Devenir

Les animaux seront utilisés pour plusieurs examens IRM, ils seront mis à mort lorsqu'ils auront atteint un poids de 500 G pour les rats et 45 G pour les souris (poids limite compatible avec nos équipements RMN disponibles en routine).

Remplacement

Avant d’être appliqués dans le cadre de pathologies d’intérêt, les développements méthodologiques et instrumentaux dédiés à l’imagerie in vivo du petit animal doivent être validés in vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux: - dans la mesure du possible, un maximum d’étapes nécessaires au développement méthodologique et instrumental sera réalisé sur fantôme ; - les animaux ayant subi une anesthésie gazeuse seront utilisés pour plusieurs examens RMN. Chaque examen sera espacé d’au moins 1 semaine. Un animal pourra être évalué plusieurs fois jusqu’à ce qu’il ait atteint un poids de 500g pour les rats et 45g pour les souris, poids limites compatibles avec les équipements RMN disponibles en routine. Aucune analyse statistique n’est envisagée en routine pour les validations des développements méthodologiques. Cette validation sera appréciée par la capacité à répondre à la question posée et la reproductibilité de la méthode sera évaluée chez 3-5 animaux.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une période suffisante lors de leur arrivée. Ils seront hébergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress, dans une pièce thermorégulée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois par semaine. Il faut considérer que les animaux seront habitués à être manipulés par l’expérimentateur et observés quotidiennement, ce qui permet de déceler des signaux de stress, de douleur ou d'inconfort. L’IRM est non invasive et effectuée sous anesthésie et suivi physiologique continu : installation de l'animal dans un berceau dédié avec suivi en continu de la température corporelle (utilisation d’un système de chauffage intégré dans le berceau dont la température est contrôlée et adaptée en fonction de la température de l’animal) ; monitoring de la fréquence respiratoire pendant toute la procédure (ce qui permet d'adapter la profondeur d'anesthésie). Ce monitoring permet de déceler un problème (fréquence respiratoire irrégulière et en baisse, température en baisse malgré le chauffage), ainsi l'acquisition peut être interrompue avant l'atteinte des points limites définis pour l'imagerie, l'anesthésie arrêtée et l'animal réveillé sous surveillance de l'expérimentateur.

Choix des espèces

Un modèle animal permet d’étudier dans des conditions contrôlées de laboratoire les causes, les processus et les traitements éventuels d’une pathologie. Il doit présenter des similitudes avec la pathologie humaine correspondante en termes de symptômes, de mécanismes physiopathologiques et/ou de traitements. Le rat et la souris sont très souvent utilisés comme modèle. Les modèles rongeur de pathologies sont obtenus par des méthodes physiques, chimiques et pharmacologiques ou par sélection de lignées spécifiques. De nombreux modèles génétiquement modifiés ont également été obtenus par ajout ou retrait de gènes (souris knock-in ou knock-out). Finaliser le développement et/ou la mise au point les méthodes RMN in vivo chez l’animal permettra de réaliser les expérimentations dans des conditions similaires aux futures études. Travailler chez le rat ou la souris offre la possibilité de confronter nos résultats avec une littérature abondante. Au début des expérimentations, les rats et les souris sont utilisés au stade de jeune adulte avec des poids de 200-250 g et 16-20g, respectivement. Au vu du caractère non invasif de la RMN, les animaux anesthésiés pourront être utilisés plusieurs fois et serviront à la validation de plusieurs procédures. Cependant, pour des contraintes matérielles (optimisées pour des rats d’un poids < 500 g et des souris d’un poids < 45 g) et pour nous affranchir des biais dus à des changements dans le métabolisme qui se développeraient plus tard dans la vie de l’animal, les rats seront utilisés jusqu’à ce qu’ils atteignent un poids de 500g et les souris un poids de 40-45g. Avant l'atteinte de ces poids limites, nous estimons à 3-4 anesthésies à l’isoflurane par animal avec un intervalle d’au moins 1 semaine entre chaque évaluation.

Gardées vivantes pour le renouvellement du troupeau et réutilisables dans d'autres essais, 24 vaches laitières Prim'Holstein sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'intervention se limite à trois prises de sang à la veine, une par période expérimentale, le reste des mesures relevant de la routine d'élevage : quantités ingérées, production laitière, pesées. La plupart seront en gestation pendant l'essai. Le projet mesure l'ingestion et l'efficience alimentaire de rations mêlant ensilage de maïs et de légumineuses, avec l'autonomie protéique des élevages laitiers pour horizon, et le porteur affirme qu'il est "impossible de se passer" des vaches puisque ce sont elles qui ingèrent la ration et produisent le lait.

Objectifs

L’élevage laitier se trouve de plus en plus confronté à la problématique du changement climatique, sous contraintes environnementales, avec le souci d’accroître l’efficience d’utilisation des ressources. Dans ce contexte en mutation, il est reconnu que les légumineuses ont une place de choix, comme fixatrices d’azote atmosphérique, et pour leur capacité à apporter des protéines produites de façon durable dans l’alimentation des ruminants. Si le trèfle blanc est bien connu, et très utilisé au pâturage, les grandes légumineuses, plus adaptées à un contexte de sécheresse potentielle, sont moins bien connues. La luzerne est surtout déshydratée en usine, alors qu’elle pourrait être valorisée aussi sous forme d’ensilage, participant aussi à l’économie d’eau. Une meilleure utilisation des grandes légumineuses sous forme d’ensilage ou d’enrubannage (conservation humide anaérobie) pourrait être une réponse adaptée au contexte changeant actuel, si les conditions de leur utilisation sont mieux définies, notamment en termes de valorisation par l’animal. En effet, les niveaux d’ingestion et l’encombrement induit par ce type de ration sont encore très mal connus. Or, la valeur nutritive de la ration ainsi que son efficience d’utilisation dépendent directement des quantités ingérées par l’animal. L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de la proportion croissante d’ensilage de grandes légumineuses (luzerne et trèfle violet) dans une ration d’ensilage de maïs sur l’ingestion volontaire, l’efficience alimentaire, la production et la composition du lait, ainsi que sur la production de méthane des vaches laitières.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous aideront à mieux connaitre l’effet associatif de différentes proportions d’ensilage de grandes légumineuses (luzerne et trèfle violet) mélangé avec l’ensilage de maïs sur l’ingestion et l’efficience alimentaire chez les vaches en lactation. Cela nous aidera à mieux valoriser ces fourrages pour nourrir les vaches laitières de façon plus durable en augmentant la diversité fourragère et l’autonomie protéique des élevages laitiers, et en réduisant les apports de type tourteau de soja extérieurs à ces élevages, l’ensilage de luzerne fournissant les protéines nécessaires à l’animal et dont l’ensilage de maïs est déficitaire.

Procédures

Cette expérimentation concerne des animaux vigiles, élevés conformément aux règles d’élevage et de bonnes pratiques. La majorité des mesures ne demande pas plus d’intervention que celles réalisées en routine sur les vaches laitières (mesure de l’ingestion et de la production laitière). Les vaches laitières auront une prise de sang en semaine 4 de chaque période, soit 3 prises de sang au total pour toute l’expérimentation.

Impact sur les animaux

La prise de sang est peu douloureuse et dure peu de temps (quelques secondes). Toutefois, la peau peut être légèrement sensible lorsque l'aiguille la traverse. Le volume du prélèvement de sang est très faible.

Devenir

Les animaux n’ayant subi aucune intervention invasive, ni traitement susceptible d’avoir des effets importants sur leur santé et/ou survie, ils seront conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable des installations expérimentales. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci est possible.

Remplacement

L’expérimentation concerne directement les réponses zootechniques de capacité d’ingestion et de production de lait des vaches laitières. Il est donc impossible de se passer des vaches laitières qui ingèrent la ration et qui produisent du lait. Par ailleurs, les modèles de prévision disponibles ne permettent pas de prévoir les réponses sur ce type de ration, car les associations d’ensilages pauvres ou riches en protéines en mélange n’ont quasiment pas été étudiés.

Réduction

Le nombre de vaches laitières de chaque lot a été calculé pour permettre de mettre en évidence par analyses statistiques des différences significatives entre les traitements. Ces analyses statistiques permettent de tester l'influence des rations sur les variables de production (ingestion, production laitière, poids...) tout en corrigeant des effets "vache". Compte tenu du schéma expérimental, il est difficile de diminuer le nombre d’animaux sans risquer de perdre trop en puissance statistique.

Raffinement

Les seuls actes invasifs seront des prises de sang, à raison de 3 prélèvements au total par animal pour toute la durée de l’essai. Les vaches seront maintenues dans leur environnement d’élevage habituel qui est parfaitement adapté à leurs besoins comportementaux, environnementaux, sanitaires. Elles ne seront jamais en isolement social. Les prélèvements et la surveillance des animaux se feront par des personnes compétentes et habilitées.

Choix des espèces

La problématique de l’étude, spécifique aux vaches laitières, nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue en France et dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Au démarrage les vaches laitières seront en milieu de lactation (après le pic de lactation). Comme l’insémination artificielle (pour la future lactation) intervient environ deux mois après le vêlage (de la lactation en cours) selon la pratique habituelle en élevages commerciaux et en particulier dans notre élevage, la plupart des vaches seront également en gestation. Au cours de l’expérimentation, les vaches seront toutes dans les deux premiers tiers de gestation.

60 poulets et poulettes de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 50 d'entre eux vaccinés deux fois et 10 formant un groupe témoin, avec quatre prises de sang. Les cinq formulations testées associent une bactérie inactivée à des adjuvants huileux, qui peuvent laisser au point d'injection un granulome inflammatoire de quelques millimètres. La bactérie visée, Enterococcus cecorum, cause dans les élevages des boiteries, des retards de croissance et de la mortalité, et le porteur met en avant des "pertes économiques importantes". Il s'agit d'une première preuve de concept, d'autres études devant suivre si les résultats sont positifs. Tous les oiseaux sont tués à la fin, le porteur expliquant que ces poulets viennent d'une souche sélectionnée pour grossir très vite et pour un élevage à court terme, et que "leur morphologie rend l'adoption inenvisageable".

Objectifs

Etudier la réponse sérologique de poulet(te)s suite à la vaccination par un vaccin inactivé contre Enterococcus cecorum pour confirmer son efficacité à induire une réponse immunitaire satisfaisante pour les utilisateurs. L'interrogation réside dans l'absence de données bibliographiques sur la production d'anticorps à partir de bactérines (bactéries inactivées) du genre Enterococcus, bactéries à Gram positif connues pour être mauvais imunogènes. Il n'existe pas à l'heure actuelle de vaccin sous Autorisation de Mise sur le Marché contre cette bactérie, problématique émergente et devenant majeure en élevage de poulet(te)s de chair en France. Cette bactérie entraîne des troubles locomoteurs allant jusqu'à des poulet(te)s assis, des boîteries, des retards de croissance, de la mortalité, entraînant des pertes économiques importantes. Il y a une forte augmentation des troubles dûs aux enterocoques entre 2006 et 2020 (0,4% portage à 12,9%, dont 53% E. cecorum, déclaration Reseau National Observations Epidémiologiques Aviculture ). Différentes formulations de vaccins seront testées: titres antigéniques et adjuvants différents. Ce sont tous des adjuvants huileux déjà utilisés couramment en Europe dans des autovaccins et/ou vaccins ayant des autorisations de mise sur le marché.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'une preuve de concept, permettant de démontrer la production d'anticorps contre Enterococcus cecorum après vaccination des oiseaux et de comparer les différentes formulations testées. Si les résultats sont positifs, d'autres études seront engagées afin de développer un vaccin contre cette pathologie.

Procédures

les 2 piqûres pour les injections de vaccin (5 secondes par piqûres) _ les 4 piqûres pour les prises de sang (20 secondes par prise de sang)

Impact sur les animaux

Les nuisances sont : _ le maintien en animalerie _ les 2 piqûres pour les injections de vaccin (5 secondes par piqûre) _ les 4 piqûres pour les prises de sang (20 secondes par prise de sang) _ les réactions locales de type granulome inflammatoire de quelques mm dûes aux adjuvants (réactions classiques aux adjuvants huileux couramment utilisés en médecine vétérinaire)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. Cette décision est prise considérant le type de souche de poulet(te)s concerné qui est à croissance très rapide (animaux très lourds). Ce sont des animaux sélectionnés pour un élevage à court terme et leur morphologie rend l'adoption inenvisageable.

Remplacement

Il s'agit ici d'étudier la réponse sérologique des poulet(te)s suite à l'injection du vaccin. Il n'y a pas de méthode alternative permettant d'évaluer la réponse sérologique in vitro.

Réduction

Dans les monographies de la pharmacopée européenne pour les vaccins poulet(te)s, le test d'activité d'un lot se fait par suivi sérologique sur au moins 10 animaux vaccinés et 3 animaux témoins. Dans cette DAP nous souhaitons tester 5 formulations, avec 10 animaux vaccinés par formulation correspondant au minimum de la pharmacopée pour ce type de test, et avoir un groupe témoin de 10 animaux pour assurer d'avoir un effectif suffisant à une bonne évaluation du niveau sérologique initial des animaux non vaccinés (car animaux venant d'un élevage conventionnel pouvant avoir des anticorps contre Enterococcus avant vaccination).

Raffinement

Les poulet(te)s sont logés par groupe ce qui leur permet d'exprimer leur comportement grégaire. Mise à disposition de perchoirs dans chaque logement. Surveillance accrue en cas de détection de souffrance avant l'atteinte de points limites. De la musique est également diffusée (habituation aux voix humaines et aux bruits). Les animaux sont élevés au sol, sur une litière végétale permettant le comportement naturel de grattage et leur permettant également de s'y rouler pour nettoyer leur plumage.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible du vaccin, pertinente afin d'obtenir les données sérologiques recherchées. Les animaux seront vaccinés à partir de 3 semaines d'âge, correspondant à un âge de maturité suffisante pour la production d'anticorps.

Ralentir la croissance de jeunes truites pour disposer de poissons de 5 à 25 grammes sur une plus grande partie de l'année : telle est la raison déclarée de ce projet, qui répond à une contrainte de calendrier du laboratoire. 2 500 truites arc-en-ciel y sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées. Elles sont nourries deux jours par semaine, le lundi et le jeudi, ce que le porteur traduit par une "sensation modérée de faim" pendant au maximum cinq jours par semaine. Cinq cents poissons par an permettent dix extractions de cellules musculaires, soit cinquante truites par extraction, sans que ce rapport soit justifié autrement dans le résumé.

Objectifs

Les cellules souches musculaires qui sont des précurseurs myogéniques, sont indispensables à la croissance du muscle. Pour déterminer précisément la régulation de l'activité de ces cellules souches, nous utilisons un modèle d'étude in vitro de la myogénèse basé sur la culture primaire de ces cellules. La quantité de ce ces cellules dans le muscle diminue rapidement avec la croissance, ce qui nous conduit à devoir utiliser des poissons d'un poids compris entre 5 et 25 g. Néanmoins, la croissance des truites est très rapide à ces stades là et les animaux passent de 5 g à 25g en 2 mois ce qui limite considérablement nos capacités d'expérimentation puisque la truite est une espèce saisonnière qui pond une fois par an. Le projet a pour objectif de ralentir la croissance des animaux pour obtenir des poissons de 5-25 g en décalé et ainsi pouvoir réaliser des expérimentations sur une plus grande partie de l'année. Une fois réalimentés pour être en pleine croissance, ces animaux seront euthanasiés et le muscle sera prélevé pour étudier les modalités de croissance.

Bénéfices attendus

Grâce à ce modèle in vitro de myogénèse, nous cherchons à élucider les mécanismes moléculaires qui régulent l'activité des cellules du muscle. A termes, ces recherches devraient permettre une meilleure maîtrise de la croissance des poissons, et de la qualité de la chair des poissons.

Procédures

Les animaux seront soumis à une restriction alimentaire légère afin de ralentir leur croissance, puis ils seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements. Nous prélèverons 500 animaux de 5-25g par an.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être nourris 2 jours par semaine (lundi et jeudi) ce qui va potentiellement engendrer une sensation modérée de faim pendant au maximum 5 jours par semaine.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet. En effet, l'extraction des cellules du muscle nécessite l'euthanasie des animaux. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés.

Remplacement

Il n'existe pas de lignée cellulaire de muscle de truite capable de proliférer et de se différencier in vitro. Il est donc nécessaire de prélever les cellules couches musculaires à partir de muscle de truite.

Réduction

Nous limiterons le nombre de poissons restreints à 500 poissons par an, ce qui nous permet de faire 10 extractions de cellules par an.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement optimal pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, enrichissement). Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisées en pisciculture. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (>50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance. Cette espèce n'est pas incluse dans la liste des espèces identifiées comme devant provenir d’élevage ou de fournisseurs agréés. Les poissons utilisés auront un poids compris entre 5 et 25g, car c'est à ce poids qu'il y a le plus de cellules souches musculaires dans le muscle de truite.

Pour vérifier que des candidats vaccins déclenchent bien une réponse immunitaire avant tout essai d'efficacité, 160 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Ils reçoivent jusqu'à trois injections, par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen ou dans le muscle sous anesthésie, et subissent un prélèvement de sang sous anesthésie jusqu'à une fois par semaine. Le porteur indique que leur système immunitaire peut s'affaiblir, avec perte de poids, prostration, rougeurs et lésions au point d'injection, et justifie la mise à mort par le fait que seuls des animaux naïfs peuvent servir à ce type d'essai. Une perte de poids égale ou supérieure à 15 % déclenche une pesée quotidienne, et aucun groupe témoin n'est systématiquement prévu, le prélèvement de sang réalisé avant les administrations en tenant lieu.

Objectifs

Selon l'OMS, les maladies infectieuses sont responsables dans le monde de 17 millions de décès par an, soit un tiers de la mortalité et 43 % des décès dans les pays en voie de développement (contre 1 % dans les pays industrialisés). Les maladies infectieuses recouvrent un large spectre de pathologies bénignes comme le rhume ou l’angine, mais également très graves comme l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine, les hépatites, le paludisme, la tuberculose, etc. Si la recherche a permis l’éradication de certaines d’entre elles grâce à la mise au point de vaccins spécifiques et des antibiotiques, il reste encore beaucoup de chemin à parcourir pour que toutes ces pathologies soient traitées. Dans le cas du développement d'un vaccin, il convient de s'assurer que le candidat vaccinal permet d'induire une réaction immunitaire spécifique chez l'animal sain après injection, permettant le développement d'anticorps spécifiques contre la pathologie visée, avant la réalisation d'études d'efficacité (challenge vaccinal). Ce projet a donc pour objectif de caractériser l'immunogénicité de candidats vaccins après administration chez le cobaye.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner de nouveaux candidats vaccins pour des études d'efficacité, et ainsi contribuer au développement de nouveaux vaccins contre de nouvelles cibles ou plus performants que ceux actuellement disponible sur le marché.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection unique ou répétée (maximum 3 injections durant l’étude) par voie per-os, sous-cutanée, intrapéritonéale (vigiles) ou intramusculaire (sous anesthésie) des produits tests en respectant les volumes d’injection recommandés. Sur animaux vigiles, ces administrations seront réalisées en environ 1 minute, pour les administrations IM réalisées sous anesthésie la durée est d’environ 5 minutes. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine (et avant euthanasie) jusqu’à la fin de l’étude en respectant les volumes éthiques recommandés. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 5 minutes (anesthésie comprise).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter des réactions immunitaires différentes selon les produits testés. Il est possible que leur système immunitaire soit affaibli entrainant l’apparition de signes cliniques (général : perte de poids, prostration, réduction de la mobilité ou local : rougeur, gonflements, lésions au site d’injection). Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes (pesées, administration des produits, prélèvements de sang) et pourront subir plusieurs anesthésies au cours des études susceptibles d’induire un stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole car seul des animaux naïfs peuvent être utilisés, ils ne pourront donc pas être inclus dans d’autres protocoles. De plus dans certains cas, des organes pertinents (tels que la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse) seront prélevés pour déterminer l’immunogénicité des produits testés.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser l'immunogénicité d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la réaction immunitaire induite d’un produit dans un organisme vivant.

Réduction

Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur un réel pouvoir immunogène du traitement testé, des groupes d’au moins 5 animaux seront constitués. Un groupe contrôle ne sera pas systèmatiquement prévu car un prélèvement de sang "baseline" sera réalisée en amont des administrations sur tout les animaux et servira de contrôle pour l'ensemble des anaylses de l'étude (dosage des anticorps spécifiques et/ou analyses biochimiques).

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée pour les cobayes. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux en parcs ou en cages (hors isolement des animaux pour agressivité ou blessure qui pourra être jugé nécessaire par le vétérinaire) avec les enrichissements appropriés (bâtonnets de bois, galets de foin ainsi qu’une plateforme et une cachette). Les animaux seront observés quotidiennement afin de déceler précocement tout signe clinique anormal et de mettre en place des mesures de prise en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien de type désinfection de plaies, hydratation, isolement etc. ou mise à mort si nécessaire). Des pesées régulières seront réalisées : minimum 1 fois par semaine et entre 24 et 72h post-administration des candidats vaccinaux. La fréquence des pesées pourra être augmentée en fonction de l’état clinique des animaux : une pesée quotidienne sera réalisée si l’animal est en perte de poids égale ou supérieure à 15% de son poids maximal atteint durant l’étude. Dans les 24 à 72h post-administration des candidats vaccinaux, une observation du site d’injection sera réalisée pour s’assurer qu’aucune anomalie n’est visible. Les administrations des produits en intramusculaire seront réalisés sous anesthésie. Lors des anesthésies, du gel oculaire sera appliqué sur la cornée des animaux pour éviter une déshydratation et une attention particulière sera portée pour éviter l’hypothermie : mise en place de tapis chauffant et/ou réveil des animaux sous lampe chauffante.

Choix des espèces

Le cobaye a été choisi pour ce projet car le système immunitaire de cette espèce est très bien caractérisé et la réponse immunitaire est robuste. De plus, le cobaye présente une similarité immunologique plus proche de celle de l’homme comparé à d’autres modèles animaux tels que la souris, permettant ainsi de mieux prédire la réponse immunitaire chez l’homme. Les animaux seront inclus dans les études entre 250 et 500g correspondant à environ entre 3 et 6 semaines pour les mâles et entre 4 et 7 semaines pour les femelles. A ce stade de développement les animaux sont adultes et ont un système immunitaire mature. Leur poids permet le prélèvement de volume de sang suffisant et répété pour réaliser les analyses du taux d’immunogénicité mais également d’autres tests biochimiques.

Une perfusion intracardiaque de trois minutes sous anesthésie profonde, précédée d'une ouverture du thorax : c'est le seul acte que la rubrique des procédures décrit pour les 96 souris de ce projet, classées en souffrance légère et toutes tuées. Leur cerveau est prélevé pour être découpé en tranches et imagé au microscope, afin de caractériser la forme et la mobilité des cellules microgliales de l'hypothalamus. La moitié des animaux passe à huit semaines à un régime riche en graisses, élément qui n'apparaît pas dans la description des procédures mais dans la justification du choix de l'espèce. Le porteur mentionne aussi l'usage d'un appareil de stéréotaxie et un stress lié à l'injection, sans préciser quelle injection est pratiquée ni à quel moment.

Objectifs

Afin d'envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l'obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux comprendre les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Les neurones du groupe de l'hypothalamus (partie assurant un double rôle de contrôle des sécrétions hormonales et de contrôle de l'activité du système nerveux végétatif tel que les organes viscéraux) sont sensibles aux signaux de la périphérie qui les informent du statut énergétique de l'organisme. La consommation d'un régime riche en graisses et en calories (HFD: High Fat Diet) entraîne une neuroinflammation (inflammation des neurones) dans l'hypothalamus. La microglie, une population de cellules immunitaires dans le cerveau, est également connue pour être impliquée dans la régulation du poids corporel. En effet, elles participent à la neuroinflammation dans l'hypothalamus suite à un régime HFD. Leur activation varie en fonction de la période d'exposition au régime HFD (entre les premiers jours et plusieurs semaines). Des publications récentes ont montré que la limitation de l'activation de la microglie en réponse à l'HFD limite la neuroinflammation. Cependant, les recherches sur la dynamique morphologique microgliale (vitesse des processus, etc.) à l'état de base chez des souris exposées au HFD pendant une période aiguë sont encore insuffisantes. Dans ce projet, nous visons à clarifier le rôle de la microglie dans le développement de l'inflammation hypothalamique en réponse à un régime alimentaire riche en calories et à caractériser les changements dans la microglie ainsi que son effet sur la dynamique de l'interaction microglie-neurone. Pour cette étude, nous utiliserons une approche génétique (utilisation d'animaux transgéniques), une technique de microscopie récemment développée et l'emploierons sur des tranches de cerveau frais de l'hypothalamus dérivées de souris nourries au HFD pour quantifier la morphologie microgliale, les vaisseaux sanguins, etc.

Bénéfices attendus

Les informations obtenues grâce à ce projet nous permettront de mieux comprendre le rôle de la microglie de l'hypothalamus dans le développement de l'obésité et les caractéristiques morphologiques de la microglie.

Procédures

La réalisation d'une perfusion intarcardiaque sur animal anesthésié sera induite durant 3 minutes

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu sur les animaux est le stress durant l'injection. Après l'induction la souris sera anesthésiée et endormie (en vérifiant la profondeur d'anesthésie sur l'animal grâce à l'abscence de réflexe, vérifié par pression sur les pattes arrières).

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées afin de récupérer le cerveau et réaliser des tranches pour être imagées au microscope

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour l'étude du système nerveux des vertébrés, qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. L'objectif de ce projet étant de caractériser la réponse microgliale à l'HFD par microscope dans les conditions les plus naturelles possibles. Cette étude ne peut être réalisée de manière pertinente avec des modèles informatiques (in silico) ou sur des micro-organismes, organes ou cellules hors de leur contexte naturel (in vitro). Le microscope sera dans un premier temps validé par l'imagerie de très petites particules fluorescentes (nanoparticules) afin d'avoir les bons réglages au niveau du microscope et ainsi utiliser moins de souris. Cependant, ces échantillons ne permettent pas réellement de reproduire tous les paramètres optiques observés dans les échantillons biologiques.

Réduction

La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes et la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé grâce à des outils statistiques par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naîtront dans notre animalerie dans un haut niveau sanitaire, logés dans des cages collectives, garnis de litière leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouille et d'enrichissement avec une régulation de la température et de l'humidité. Leur prise en charge est confiée à un personnel qualifié et expert. Ils surveillent tous les animaux quotidiennement et l'expérimentateur dispose d'une solide expérience pour la procédure proposée. Nous avons défini différents points permettant de meilleurs conditions tout au long de l'étude : 1) Les animaux arriveront dans la salle d'hébergement à l'âge de 3 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d'accoutumance réduira le stress des animaux en réponse à l'expérimentateur. 2) Pour supprimer le stress et la douleur liés à la thoracotomie pendant la perfusion intracardiaque, les souris recevront une dose profonde d’anesthésiques par injection intrapéritonéale. Ces doses induisent une perte de conscience rapide et une anesthésie profonde. Nous vérifierons l’efficacité de l’anesthésie par la méthode du pincement du coussinet plantaire avant de commencer l’incision des tissus. Cette procédure sera effectuée par un personnel formé et compétent, ce qui garantira la précision et limitera le stress de l’animal avant la perte de conscience.. 3) L'enrichissement des cages consiste en des carrés de cellulose pour la nidification, un tunnel en carton pour la cachette et des bâtons de bois pour le rongement. 4) Des critères d'évaluation précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères concernent l'apparence, le changement de poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect des plaies (le cas échéant). Des mesures conservatrices sont prévues pour chaque critère, afin de gérer rapidement tout changement dans l'état de l'animal comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Lorsqu'un critère précoce est atteint, nous demanderons l'avis d'un vétérinaire afin d'envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec la poursuite de la participation de l'animal à l'étude. En cas d'échec ou d'atteinte d'un critère terminal, l'animal sera retiré de l'étude et sacrifié, afin d'éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le metabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. La souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Toutes les souris de cette étude seront adultes A l'âge de 8 semaines, la moitié des souris sera nourrie au HFD, tandis que l'autre moitié sera nourrie au régime standard. Cet âge est celui où la croissance du crâne est considérée comme achevée, ce qui nous permet d'utiliser l'appareil de stéréotaxie et d'utiliser les coordonnées stéréotaxiques des atlas de référence habituels. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le controle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modele prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l'inflammation des neurones de l'hypothalamus induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme.