Procédures légères

Un poinçon dans l'oreille au quinzième jour de vie, deux minutes de contention comprises : 312 souris nées hémophiles A ou B en passent par là. 270 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 42 un niveau modéré, 270 sont tuées et 42 réutilisées, les reproducteurs des trios renouvelés tous les quatre mois finissant en banque de tissus. L'objet est l'entretien de l'élevage lui-même, pour alimenter en souris hémophiles A et B d'autres expériences sur la destruction des articulations. Le porteur précise que la souris hémophile, contrairement à la forme humaine de la maladie, ne saigne pas spontanément et ne saigne qu'après un traumatisme, et que les souris de génotype non hémophile sont mises à mort.

Objectifs

L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Ce projet nous permet donc d’obtenir des souris hémophile A et hémophile B en bonne santé et sans manifestations hémorragiques pour assurer la continuité de la lignée. Ce projet nous permet également d’acquérir des informations d’élevage spécifique aux modèles employés afin de mieux répondre aux critères des 3R.

Procédures

Durant la phase de maintien de la lignée, les souris ne subissent aucunes procédures, lors du bacrossing et génotypage, un prélèvement à l’oreille est réalisé au 15ème jour de vie, durée éstimée à 2min : contention + prélèvement.

Impact sur les animaux

Au cours du maintien, le modèle est maintenu sous la forme hémophile homozygote KO pour les modèles d’hémophilies A et B et ne fait attendre aucune nuisance de type saignement, mortalité foetale ou post-natal, seul les portées des souris hémophiles A sont réduites (4-6 animaux par portée) par rapport aux souris hémophiles B (8-10 animaux par portée). Le poiçon réalisé à l'oreille à 15jours de vie des animaux, selon les bonnes pratiques vétérinaires, se superpose avec l'opération d'identification et ne nous fait attendre aucune douleur. Seule la contention des animaux peut engendrer un léger stress chez les animaux, stress compatible avec la survie des animaux.

Devenir

Au cours de la procédure 1 : les souris sont mise en reproduction et tous les 4 mois les trios sont renouvelés. Les souris issus des anciens trios sont mis à disposition pour la réalisation de prélèvement post mortem et ainsi constituer une banque de tissus contrôle. A la fin de la procédure 2, les animaux sont mis en reproduction et les animaux de génotype non hémophiles sont mis à mort.

Remplacement

Le recours aux modèles in vitro ou in silico est impossbile dans l'étude de l'arthropathie hémophilique, en effet, le modèle d'étude nécessite un système vasculaire et locomoteur fonctionnel et en lien direct.

Réduction

Les animaux nécessaires au maintien de la lignée sous forme respirante sont limités à 3 trios reproducteurs maximum par modèle d’hémophilie soit 6 trios au total la première année. A la fin de cette première année, les données acquises nous permettrons de réviser le nombre de souris.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal par l'application des points limites stricts et spécifiques du projet et l'utilisation d'anesthésie et d'antalgie lors des gestes expérimentaux.

Choix des espèces

La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, les souris sont maintenues en élevage jusqu’à leur puberté avant d’être mises en reproduction.

Comprendre comment se forment les cellules ciliées qui tapissent les cavités du cerveau, et l'origine de certaines maladies neurologiques : 2 037 souris vont y être utilisées. 1 987 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 un niveau léger, et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Des femelles gestantes sont gavées ou reçoivent un traceur sous la peau, leurs petits sont biopsiés à la queue le jour de la naissance, puis certains reçoivent une injection dans le cerveau suivie d'impulsions électriques, deux minutes par animal. Le porteur indique que le gavage peut léser l'œsophage et provoquer des mises bas prématurées ou difficiles, et que l'électroporation peut entraîner des microlésions du cerveau ou le rejet du souriceau par sa mère, tout en estimant à cinq ou dix animaux la taille optimale par stade d'analyse, pour un total de 2 037 souris.

Objectifs

Les objectifs de notre projet de recherche sont d'une part de comprendre comment les cellules souches se développent le long des parois des ventricules du cerveau pour former différents types de cellules gliales. D'autre part, nous cherchons à comprendre l'origine de pathologies humaines telles que les ciliopathies et les maladies psychiatriques. Nous souhaitons donc utiliser des souris génétiquement modifiées afin de mimer ces pathologies humaines et ainsi identifier l'origine développementale de ces pathologies. A plus long terme, ce projet permettra de mieux identifier l'origine des dysfonctionnements dans certaines pathologies neurologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier les cascades moléculaires complètes du développement des cellule multiciliées du cerveau, les épendymaires qui tapissent les murs ventriculaires et les cellules du plexus choroïde. Nous pourrons ainsi mieux comprendre les étapes qui dysfonctionnent dans des conditions pathologiques telles que les tumeurs cérébrales et les maladies neurologiques (220 000 nouveaux cas chaque année en France). A plus long terme, nous pouvons envisager de nouveaux traitements thérapeutiques pour améliorer les conditions de vie des patients.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques: 1- prélèvement caudal unique sur des souris vigiles le jour de la naissance de quelques secondes pour génotypage, 2- injection sous cutanée unique en quelques secondes de femelles gestantes et vigiles d'un traceur afin de réaliser un marquage des cellules d’intérêt chez les embryons puis euthanasie réglementaire des animaux sous analgésie et anesthésie en quelques minutes à différents stades, 3- gavage unique en quelques secondes de femelles gestantes et vigiles avec une solution permettant d’induire le modèle expérimental puis euthanasie des animaux par une méthode réglementaire en quelque secondes à différents stades, 4- injection unique au niveau cérébral sous analgésie et anesthésie, application d’impulsions électriques permettant l’introduction du traceur génétique chez les nouveaux-nés (environ 2 minutes par animal) puis euthanasie des animaux par une méthode réglementaire à différents stades.

Impact sur les animaux

Les injections effectuées afin de procéder à un marquage cellulaire, une analgésie ou une anesthésie seront réalisées par voie sous-cutanée et pourront induire un stress pendant la contention ainsi qu’une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille. La molécule administrée par gavage aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire des lésions de l’œsophage ou de l’inflammation. L’électroporation à la naissance (injection au niveau du cerveau suivi de l’application de quelques impulsions électriques) peut entraîner des microlésions du cerveau et pourrait dans de rare cas entraîner un rejet par la mère ou un défaut de prise de poids. Concernant les anesthésies, les effets secondaires peuvent être les suivants : détresse respiratoire, réveil de l’animal et stress thermique. Dans le cadre de l'identification génétique des animaux, une biopsie caudale sera réalisée à la naissance. Les effets indésirables peuvent être le stress engendré par la contention/manipulation, la douleur légère et locale ainsi que la possibilité de saignement à la suite de la biopsie.

Devenir

L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Aucune technique ou outil biologique n'est actuellement disponible pour mimer correctement le développement des cellules multiciliées de cerveau de mammifères que nous étudions. En effet, nos résultats expérimentaux de cultures primaires démontrent que seuls certains aspects du développement épendymaire peuvent être étudiés in vitro. Certains mécanismes moléculaires semblent mal récapitulés dus, en partie, à la non-conservation de la structure tridimensionnelle de l'épithélium ventriculaire. De façon similaire, les résultats préliminaires obtenus sur des cultures d'organoïdes démontrent l'absence de cellules épendymaires dans ces modèles.

Réduction

Un total de 2037 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous utiliserons des mâles ou des femelles indifféremment pour réduire le nombre d'animaux et la taille de chaque stade d'analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Nous estimons à 5 ou 10 animaux la taille optimale par stade d'analyse en fonction de la procédure.

Raffinement

Trois catégories de mesures de raffinement seront mises en œuvre et concerneront les aspects liés aux procédures, l'établissement de points limites ainsi que l'hébergement et l'enrichissement de l'environnement des souris. Nous réduirons au maximum l'inconfort des souris car les procédures que nous mettrons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l'angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Nous examinerons en parallèle le comportement et l'apparence des souris ayant subi une procédure pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez les souris consécutivement, ou non, à la réalisation d'un acte et non conduiront à l'arrêt de la procédure en cours. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la règlementation en vigueur à savoir : l’hébergement en surpression, les portoirs avec des cages ventilées individuellement, le nombre d’animaux par cage), eau et nourriture à volonté, change litière et biberon hebdomadaire, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu (papier kraft, coton et maison en carton). L'ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

Le projet a pour objectif d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement des cellules multiciliées des mammifères. Nous utiliserons le modèle murin car la souris présente un développement proche de celui de l’homme. De plus la durée de gestation courte ainsi que la taille des portées permettent de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences et à partir de peu de parents. La disponibilité d’un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiées, qui permettent d'induire ou inhiber l'expression de certains gènes d'intérêt, fait du modèle murin un modèle de choix pour répondre aux questions scientifiques. Nous utiliserons des femelles adultes matures sexuellement qui seront rendues gestantes par accouplement contrôlé afin de connaître précisément le stade de gestation afin d’induire les modèles expérimentaux. Par la suite les animaux seront étudiés au cours du développement cérébral (entre le jour de la naissance et 20 jours postnatal) parce que nous avons établi que les cellules d’intérêt sont spécifiées avant le stade embryonnaire et entièrement différenciées et matures au 15ème jour postnatal et constitue donc notre fourchette d’analyses dans ce projet.

Quatre injections dans la même journée pour une rate, dont trois sous contention, avant une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes. 500 souris et 500 rats vont être utilisés ainsi, 700 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 300 un niveau modéré, 900 tués à l'issue et 100 remis "dans le stock" pour être réutilisés. Ces gestes servent à former des techniciens, ingénieurs, chercheurs et étudiants aux techniques de transgenèse et de cryoconservation, à raison de cinq sessions par an pendant cinq ans. Les femelles donneuses d'ovocytes sont prépubères, trois à quatre semaines pour les souris et cinq à six pour les rates, parce qu'elles "répondent mieux aux traitements hormonaux", et les femelles opérées sont tuées faute de pouvoir être réutilisées.

Objectifs

Notre institut a pour mission de créer des lignées de rats et de souris génétiquement modifiées et de les cryoconserver pour permettre leur pérennité et leur distribution aux chercheurs. Ces lignées génétiquement modifiées peuvent devenir des modèles de maladies humaines et vont permettre de mieux comprendre leurs processus de développement. Ces modèles peuvent également répondre à d’autres intérêts scientifiques tout aussi importants (comme par exemple devenir des modèles de choix pour la recherche fondamentale). Ces rongeurs, en tant que modèle de maladies humaines, vont également permettre de tester des médicaments et de valider (ou d’invalider) des cibles thérapeutiques. Notre objectif ici, est de former les gens de la communauté scientifiques aux activités expérimentales de transgénèses et de cryoconservation sur les rats et les souris, dans les conditions optimales. Ces formations pratiques sont destinées aux techniciens, ingénieurs, chercheurs et étudiants de l'institut ou d'un centre partenaire. Notre établissement envisage de réaliser 5 formations maximum par an, soit environ 100 rats et 100 souris par an sur 5 ans. Le nombre d'animaux utilisés dépend directement du type de formation souhaitée. Pour certaines techniques, une vingtaine d'animaux seront nécessaires et pour d'autres seulement 5. Ces formations pratiques auront lieu sur demande directe des collaborateurs pour la technique souhaitée parmi celles proposées.

Bénéfices attendus

Etant un institut pilote et certifié pour nos activités, nous souhaitons transmettre nos savoir-faire et connaissances en transgénèse et cryoconservation sur nos modèles animaux, partager nos expériences et aussi permettre par la formation d'améliorer le bien-être animal et le raffinement des techniques qui seront mise en œuvre par d'autres membres de la communauté scientifique sur ce sujet. Ces formations sont destinées aux techniciens, ingénieurs, chercheurs et étudiants.

Procédures

1) Dans la première procédure, il s'agit de 2 injections d'hormones réalisées à 48h d'intervalle. Les injections sont réalisées sous simple contention rapide de 5 secondes, puis l'animal est relaché dans sa cage avec ses congénères. 2) Dans la seconde procédure, les rates seulement recevront une injection, sous simple contention rapide de 5 secondes, afin de synchroniser leur cycle pour devenir mères porteuses. 4 jours plus tard, les animaux recevrons une injection d'antidouleur sous simple contention rapide de 5 secondes, puis 40 minutes plus tard, ils seront anesthésiés par une autre injection, là encore sous simple contention rapide de 5 secondes. Une fois endormis, les animaux vont subir une petite chirugie de transfert d'embryons ou de sperme. La chirurgie dure environ 5 minutes. Juste après la chirugie, pendant que les animaux dorment encore, afin de limiter le stress, elles recevront un réhydratant et un anti-infammatoire en injectable. Ainsi, une rate recevra un total de 3 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie et 4 injections au total. Pour la souris, elle recevra 2 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie au total. Les injections et chirurgies sont pratiquées ou encadrées par du personnel compétent et donc présentent un risque très limité pour l'animal.

Impact sur les animaux

Les injections (hormones diverses, anesthésique ou antalgique) sont réalisées sous contention rapide qui peut engendrer une légère douleur et un stress de courte durée. La chirurgie, d'une durée de 10 minutes maximum va engendrer une plaie chirurgicale qui pourra être à l'origine d'une douleur ou un inconfort temporaire pour l'animal. La prise en charge de la douleur va fortement limiter ces nuisances.

Devenir

Dans le première partie, il s'agit de femelles donneuses d'ovocytes ou d'embryons. Nous avons besoin de les mettre à mort pour collecter les ovocytes / embryons pour réaliser nos expérimentations dans le cadre de la formation. Les souris n'ayant pas été accouplées peuvent être réutilisées. Ceci vise à réduire le nombre d'animaux utilisés. De même, dans la seconde procédure, les animaux non utilisés en chirurgie sont remis dans le stock pour être réutilisés. Les femelles opérées seront mises à mort car nous ne pouvons pas les réutiliser.

Remplacement

Les rongeurs, principalement les rats et les souris représentent près de 90% des animaux utilisées en expérimentation animale. Ce sont de très bons modèles expérimentaux puisqu'ils possèdent une très forte homologie avec les gènes Humains et ont un taux de reproduction rapide . Il n'y a pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour la formation à la création de lignées transgéniques et leur cryoconservation.

Réduction

L'objectif de cette saisine est de nous permettre de former les personnes désireuses de le faire aux techniques expérimentales de transgénèses et de cryoconservations chez le rat et la souris. Dans ce projet, ne seront commandés dans des établissements éleveurs que les animaux que nous n'avons pas en stock pour les besoins de la formation. Il ne sera pas acheté de mâles spécifiquement pour les besoins de formation, nous nous servirons des animaux utilisés pour nos activités de service. Les femelles seront au maximum des animaux recyclés au sein de notre animalerie. Il n'y aura que peu de commandes spécialement dédiées aux formations. Notre établissement envisage de réaliser 3 formations par an, soit environ 100 rats et 100 souris par an (soit au maximum 1.000 animaux sur la durée du projet). Le nombre d'animaux utilisés dépend directement du type de formation souhaitée (de 5 à 20 animaux). Nous n'aurons pas d'approche statistique dans cette étude car c'est un projet à visé de formation.

Raffinement

Nous souhaitons transmettre nos savoir-faire et connaissances, partager nos expériences et aussi permettre par la formation d'améliorer le bien-être animal et le raffinement des techniques qui seront mise en oeuvre par d'autres membres de la communauté scientifique sur ce sujet. La petite chirurgie s'effectue sous anesthésie et analgésie avec une compensation de la potentielle perte hydrique pour les aider à récupérer au mieux. Du gel oculaire sera placé sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée. Nous serons particulièrement vigilants sur la surveillance des points d'injections, l'aseptie pour la partie chirurgicale et la surveillance post opératoire des animaux pour déceler tout signe d'inconfort (prostration, dos voûté, difficultés locomotrices, expressions faciales) ou d'infection (rougeur, gonflement, supuration). Puisqu'il s'agit de formation, les animaux inconfortables seront mis à mort immédiatement pour éviter toute souffrance inutile. Les animaux sont surveillés quotidiennement à l'animalerie. De l'enrichissment sera placé dans les cages pour leur bien-être.

Choix des espèces

Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ce sont de très bons modèles expérimentaux puisqu'ils possèdent une très forte homologie avec les gènes Humains. Les rats et les souris sont utilisés dans notre laboratoire en routine pour la création et l'archivage de lignées. Les mâles proviendront tous de nos activité de service, et ne seront pas achetés spécialement pour les formations. - Les mâles vasectomisés sont utilisés à l’âge de jeunes adultes à adultes(10 semaines à 1 an) et renouvelés tous les 9 mois (souris) et 12 mois (rats). - Les mâles fertiles sont de jeunes adultes en âge de procréer (10 semaines à 1 an) pour fournir du sperme ou être mis en accouplement pour fournir des embryons à différents stades. - Les femelles utilisées pour produire les embryons/ovocytes sont prépubères (3-4 semaines pour les souris et 5-6 semaines pour les rats) car elles répondent mieux aux traitement hormonaux. (réduit le nombre de femelles donneuses utilisées) - Les mères-porteuses utilisées sont de jeunes adultes à adultes (10 semaines à 8 mois), elles doivent être en âge de procréer.

Tuées à l'issue de chaque procédure pour que leurs poumons soient prélevés, 1 156 souris vont être utilisées, 804 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 352 un niveau léger. Elles reçoivent des injections deux fois par semaine, une injection dans la trachée sous anesthésie générale et une instillation nasale, et une partie d'entre elles est irradiée pendant cinq minutes ou privée de macrophages pulmonaires. Infectées par la grippe, elles perdent du poids et voient leur température baisser, et développent une fibrose des poumons que le porteur qualifie de non létale et réversible. Sur le remplacement, il affirme que l'environnement des alvéoles pulmonaires "ne peut être reproduit in vitro", tout en annonçant développer en parallèle une culture de macrophages alvéolaires pour étudier les mêmes mécanismes.

Objectifs

La réponse immunitaire est généralement de plus forte amplitude chez les femmes comparées aux hommes. Cela les protège vis-à-vis des infections virales ou bactériennes, mais augmente également le risque de développer des pathologies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique (LES). Le récepteur toll like 7 (TLR7), codé sur le chromosome X, reconnait des ARN simple brin dérivés du soi ou de virus. Des études d’association génétiques ont identifié une mutation pour TLR7 associée à une perte de fonction conférant des formes sévères de COVID-19. L’inflammation et les réponses immunitaires sont régulées par des facteurs liés au sexe comme les hormones et les facteurs génétiques portés sur le chromosome X comme le gène TLR7. Nous avons mis en évidence que le gène TLR7 peut être exprimé en deux copies dans les cellules immunitaires femelles, ce qui leur confère un avantage fonctionnelle comparées aux cellules immunitaires de mâles. Nous avons développé des modèles génétiques rapporteur/délétère pour l’expression du gène Tlr7 chez la souris. Ces modèles nous permettent de suivre les cellules exprimant Tlr7 à partir des deux chromosomes X, et également de les éliminer de manière constitutive ou inductible. Nos objectifs scientifiques sont d’identifier précisément les cellules immunitaires exprimant Tlr7 à partir des deux chromosomes X, de caractériser leurs fonctions immunitaires à l’état basal et durant une infection par le virus influenza.

Bénéfices attendus

Les infections respiratoires par influenza ou coronavirus (comme le MERS ou SARS-CoV-2) sont plus sévères dans les individus âgés de plus de 65 ans. Il a été suggéré que les monocytes et macrophages pulmonaires ont un rôle dans la dysrégulation de la réponse immunitaire. Il existe des différences liées au sexe dans la susceptibilité au COVID-19 avec un risque de mortalité presque deux fois supérieur pour les hommes comparé aux femmes après 50 ans. Cette différence est maintenue à tous les âges. Les différences liées au sexe dans le remplacement des macrophages pulmonaires, promu par des infections récurrentes, le vieillissement ou des facteurs environnementaux peut être un mécanisme contribuant aux observations épidémiologiques. Ce biais de sexe n’ayant jamais été documenté, ce projet permettra de mettre en avant l’importance d’un double dosage des gènes codés sur le chromosome X dans la biologie des macrophages alvéolaires, en utilisant les modèles murins uniques que nous avons développés. Le double dosage des gènes codés sur le chromosome X pourrait contribuer au biais de sexe en permettant l’activation plus efficace des cellules immunitaires mais aussi en promouvant la maintenance et les fonctions d’homéostasie des macrophages alvéolaires chez les femmes.

Procédures

Les animaux recevront des injections plusieurs fois (2 /semaine sur une semaine maximum) pendant 1 minute. Une injection par voie intratrachéale sous anesthésie générale une seule fois pendant 3 minutes. L’irradiation sera faite une fois pendant 5 minutes. L’instillation nasale se fera une seule fois pendant une minute.

Impact sur les animaux

Dans le modèle de reconstitution les animaux seront irradiés ou déficients en macrophages alvéolaires. Dans le modèle d’infection à l’influenza, les souris présentent une baisse de température et une perte de poids. La fibrose pulmonaire n’est pas létale et est réversible.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour analyser leurs tissus, en particulier les poumons.

Remplacement

L’environnement des alvéoles pulmonaires ne peut être reproduit in vitro. La physiologie de l’infection, le recrutement des cellules ne peut s’étudier que dans un modèle in vivo. Nous nous attacherons à développer un modèle d’expansion de « macrophages alvéolaires like » in vitro afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans le maintien de l’inactivation de l’X ou son échappement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'expériences effectuées nous utilisons un nombre d'animaux suffisant par expérience afin d'obtenir des résultats statistiquement interprétables et de faire des analyses différentes. Le nombre de lots et d’animaux par lot sont détaillés dans chaque procédure. De manière générale, nous avons estimé que 2 à 3 lots expérimentaux devront être produits afin de reproduire les expériences de façon indépendante. Nous allons comparer 2 conditions.

Raffinement

Les souris sont hébergées en portoirs ventilés. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par quinzaine. Les cages seront systématiquement enrichies (coton, igloo, tunnel) pour leur permettre de faire un nid. L'angoisse des animaux sera réduite par une période d'acclimatation à l'hébergement (1semaine) mais également par une habituation à la manipulation. Un protocole est mis en place avec la structure du bien-être animal (SBEA) pour prévenir toute douleur, souffrance ou angoisse de l'animal. De plus, les procédures et le suivi de l'animal seront effectués par des personnes compétentes et formées à l'expérimentation animale. Les animaux sont surveillés tous les jours par les zootechniciens du service, en accord avec la réglementation.

Choix des espèces

Ces expérimentations ne peuvent être conduites que chez la souris car nous avons développés de nombreux modèles génétiques sur le fond C57BL/6 pour suivre et éliminer les cellules exprimant le gène Tlr7 à partir du X inactif chez les femelles. Résumé des modèles génétiques de souris reporter/deleter utilisés : lignée#1 : XmXistKOTlr7WT XpXistWTTlr7MCH modèle biaisé dans lequel le X actif est fixé. Permet de suivre l’échappement de Tlr7. lignée#2 : XTlr7mCh XTlr7YFPCre Rosa26LSL-DTA rapporteur mCherry maternel/délétion cellules YFP paternelles ou rapporteur mCherry paternel/ délétion cellules YFP maternelles. lignée#3 : XmXistKO Tlr7WT XpXistWT Tlr7tdTomato DTR (human diphteria toxin receptor): rapporteur tdTomato et expression du récepteur à la toxine diphtérique de manière à éliminer les cellules exprimant Tlr7 sur le chr X porteur de cette construction. lignée #4 : Csf2rb-/- déficiente pour la chaine béta du récepteur au GM-CSF. Ces souris n’ont pas de macrophages alvéolaires. lignée #5 : Tlr7 fate-mapping model= Femelle R26LoxStopLox-tdTomato+/- Xm = XXistKO Tlr7WT Xp = XistWT Tlr7YFPCre. Les cellules exprimant Tlr7 à partir du Xp = Xi seront marquées de manière irréversible par la tdTomato suite à l’élimination du Stop par la YFPCre.

Une injection dans le cerveau au cours d'une opération pouvant durer deux heures, une canule fixée au crâne, une fibre optique branchée sur la tête pendant des séances d'une heure : 696 rats passent par là, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 624 d'entre eux, tous tués pour que leur cerveau soit prélevé. La majorité subit en plus un rationnement alimentaire pouvant durer douze semaines. Le projet cherche à cartographier les circuits cérébraux des apprentissages complexes, avec la schizophrénie et les addictions citées comme horizon translationnel. Le porteur écrit que maintenir les rats entre 90 et 95 % de leur poids "impacte très peu leur bien-être", tout en présentant cette faim comme ce qui garantit leur motivation à travailler pour la nourriture.

Objectifs

Ce projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent les apprentissages de haut niveau chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de plusieurs régions connues pour être impliquées dans ces apprentissages mais dont le rôle précis n’est pas connu. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre les différentes régions impliquées en utilisant des produits permettant de les visualiser (traceurs). Ensuite nous inactiverons certaines structures pendant les tests d’apprentissage afin de mieux comprendre leur rôle.

Bénéfices attendus

Ce projet de Neurosciences permettra de comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux dans les processus d’apprentissage. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où des dysfonctionnements dans ces circuits ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions)

Procédures

Dans ce projet, les rats subiront une seule intervention chirurgicale pour une injection intracérébrale et certains seront implantés avec une petite canule fixée au crâne. Cette intervention durera maximum 2h. Pour certains de ces rats, une source lumineuse (fibre optique) sera attachée à leur tête pendant la tâche comportementale, ce geste durera quelques secondes et le rat restera connecté tout le long de la séance qui dure 1h. La majorité des rats recevront également un entraînement comportemental, qui nécessite une restriction alimentaire légère pour une durée maximale de 12 semaines.

Impact sur les animaux

Deux points de vigilance sont à noter. Le premier concerne la chirurgie. Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Le second concerne les procédures comportementales. Le stress de manipulation, lorsque l’on place les rats dans les cages opérantes ainsi que celui de contention pour les injections i.p. (juste avant la tâche) est faible puisqu’il est limité par l’habituation et par le côté appétitif de la tâche. Durant la tâche comportementale, les animaux seront mis en rationnement alimentaire léger pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial, ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours des tâches comportementales (environ 5g par jour).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le cerveau pour les études tissulaires

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives complexes ne peuvent, par définition, s’étudier que chez les organismes entiers. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables lors de l'utilisation des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les rats sont hébergés dans des cages collectives avec un milieu enrichi (un tunnel, matériel de nidation, et un bâton à ronger), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière. Pour les procédures chirurgicales, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites généraux et des points limites gradés spécifiques aux procédures ont été déterminés, associés à des actions conservatoires de prise en charge de la douleur et de l’inconfort. Les animaux seront inspectés une fois par jour par l’expérimentateur durant 5 jours consécutifs à l’opération chirurgicale. Une grille de scorage a été mise en place pour adapter le suivi post opératoire et prendre en charge tout inconfort ou douleur des animaux. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.

Choix des espèces

D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une constance dans les coordonnées stéréotaxiques.

3 791 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 1 380 d'entre elles et modéré pour 2 411. Elles reçoivent une ou plusieurs instillations directes dans la trachée, sous anesthésie par inhalation, et un tiers subit en plus l'administration de suspensions bactériennes ou virales par le nez ou la trachée. Le porteur décrit une perte de poids transitoire de deux à trois jours après l'infection puis un retour à la normale, et prévoit des injections de morphinique selon les scores obtenus. Les traitements sans antibiotiques qu'il espère en tirer restent au stade du souhait, tandis qu'il qualifie les modèles animaux d'"indispensables" à la compréhension des interactions entre flore pulmonaire et immunité.

Objectifs

La pneumonie est une infection des poumons qui peut être très grave et causer de nombreuses complications, voire la mort, si elle n'est pas traitée. Nous ne savons pas encore comment les bactéries présentes naturellement dans les poumons [flore bactérienne saine], et les substances qu'elles produisent, peuvent influencer la santé pulmonaire. Ce projet vise donc à : 1. Créer un modèle de souris dont les poumons sont colonisés par des bactéries bénéfiques (cocktail thérapeutique), similaires à celles que l'on trouve dans des poumons sains, et à étudier comment ces bactéries agissent. 2. Comprendre comment ce groupe de bactéries ou les substances qu'elles produisent affectent l'équilibre des autres bactéries dans les poumons et renforcent les défenses immunitaires de l'organisme.

Bénéfices attendus

Notre recherche essaye de montrer que les résultats de la pneumonie ne dépendent pas seulement des bactéries dangereuses mais aussi d'une flore bactérienne saine affaiblie dans les poumons. Nous voulons mieux comprendre quelles bonnes bactéries aident les poumons à rester en bonne santé. Avec cette étude, nous espérons découvrir des bactéries bénéfiques, des protéines et des substances utiles qui pourraient être utilisées ensemble pour prévenir ou traiter la pneumonie. L’idée est de créer des traitements qui n’utilisent pas d’antibiotiques, ce qui pourrait aider à soigner les infections respiratoires de façon plus durable et efficace.

Procédures

Tous les animaux (mis à part les naïfs) seront soumis à une ou plusieurs administrations intra-trachéales d’un cocktail bactérien ou d’un milieu de dilution sous anesthésie générale par inhalation en continu d’anesthésique volatile. Le geste de l’injection intratrachéale, en tant que tel, dure au maximum 1 minute et le réveil est presque instantané. Un tiers des animaux reçoivent également une administration de suspensions bactériennes, virales ou d’eau physiologique (PBS) par voie intranasale ou intra-trachéale sous anesthésie. En fonction de l’état général des souris et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous cutanée de morphinique pourraient être réalisées. Le geste de l’injection sous cutanée ne dure au maximum que 30 secondes.

Impact sur les animaux

Modèles d’infection : Les modèles d’inflammation respiratoires aigües sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Pour les autres parties du projet, suite à la colonisation bactérienne en IT, les animaux pourraient présenter, au cours des 24 premières heures du protocole, une légère perte de poids. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendre pas de douleurs résiduelles ainsi que de stress supplémentaire. L’injection intratrachéale peut générer une potentielle gène consécutive au geste.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre la colonisation microbienne et la réponse immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=8) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Pour les tests pour lesquels une analyse statistique n’est pas prévue ainsi que pour certains groupes témoins, le nombre d’animaux sera réduit à 3 ou 5 animaux par groupe. Le nombre indiqué est un nombre maximum de souris et toutes ne seront pas forcément utilisées. Une partie des analyses sera conditionnelle aux résultats obtenus sur l’étape d’avant.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. L’état général des souris est évalué quotidiennement afin de s’assurer du bien-être de nos animaux. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la zone sera anesthésiée localement. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle.

Choix des espèces

Le modèle murin de pneumonie est un modèle bien caractérisé, reproductible, et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. Les souris ont entre 6 semaines et 14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature.

1 052 rats vont être utilisés, tous tués pour prélèvement du cerveau, 908 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacun passant par une chirurgie crânienne d'environ une heure trente et jusqu'à douze semaines de restriction alimentaire. Une canule est fixée sur le crâne pour injecter dans le cerveau, et une fibre optique est attachée à la tête de certains pendant la tâche comportementale. Le rationnement les maintient à 90 ou 95 % de leur poids, ce que le porteur décrit comme une "légère sensation de faim garantissant la motivation" à obtenir la récompense. Ce que le projet promet en retour reste indirect, comprendre des réseaux de la prise de décision, avec des indications jugées précieuses pour la schizophrénie et les addictions, sans qu'aucune application soit avancée.

Objectifs

Ce projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent une prise de décision adaptée chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de plusieurs régions connues pour être impliquées dans la prise de décision mais dont le rôle précis n’est pas connu. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre les différentes régions impliquées en utilisant des produits permettant de les visualiser (traceurs). Ensuite nous inactiverons certaines structures pendant le comportement de prise de décision afin de mieux comprendre leur rôle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre le fonctionnement de certains réseaux neuronaux de la prise de décision. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où ces dysfonctionnements ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions)

Procédures

Dans ce projet, les rats subiront une intervention chirurgicale pour une injection intracérébrale et seront implantés avec une petite canule fixée au crâne. Cette chirurgie durera environ 1h30. Pour certains de ces rats, une source lumineuse (fibre optique) sera attachée à leur tête pendant la tâche comportementale. La majorité des rats recevront également un entraînement comportemental, qui nécessite une restriction alimentaire légère pour une durée maximale de 12 semaines.

Impact sur les animaux

Deux points de vigilance sont à noter. Le premier concerne la chirurgie. Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Le second concerne les procédures comportementales. Durant la tâche comportementale, les animaux seront mis en rationnement alimentaire léger pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial, ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours des tâches comportementales (environ 5g par jour).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le cerveau pour les études tissulaires.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives complexes ne peuvent, par définition, s’étudier que chez les organismes entiers. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables lors de l'utilisation des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les rats sont hébergés dans des cages collectives avec un milieu enrichi (un tunnel, matériel de nidation, et un bâton à ronger), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière. Pour les procédures chirurgicales, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites généraux et des points limites gradés spécifiques aux procédures ont été déterminés, associés à des actions conservatoires de prise en charge de la douleur et de l’inconfort. Les animaux seront inspectés une fois par jour par l’expérimentateur durant 5 jours consécutifs à l’opération chirurgicale. Une grille de scorage a été mise en place pour adapter le suivi post opératoire et prendre en charge tout inconfort ou douleur des animaux. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.

Choix des espèces

D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une constance dans les coordonnées stéréotaxiques. Pour la procédure 5 les animaux seront plus jeunes : 45 jours