Procédures légères
Caractérisation d’un modèle murin de trouble bipolaire par injection chronique de roténone à faible dose
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une souris placée sous surveillance dont l'état ne s'améliore pas en 48 heures est mise à mort. 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, pour reproduire chez elles des comportements proches des phases du trouble bipolaire. Elles reçoivent une injection sous la peau chaque jour pendant huit semaines, de roténone pour les souris traitées, un inhibiteur de la chaîne mitochondriale, et passent trois fois chaque test comportemental, à quatre semaines d'intervalle, sans que le porteur nomme ces tests. Il décrit une "légère douleur" au point d'injection, un "stress modéré" lié aux manipulations, à la contention et parfois à l'isolement, et des effets de la roténone sur l'anxiété, alors que le projet déclare aussi un niveau de souffrance sévère.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété, mais aussi des troubles somatiques telles que les maladies cardiovasculaires). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. L’objectif de ce projet est à d’établir des méthodes d’étude des phases maniaques et dépressives du trouble bipolaire au niveau comportemental, puis de se focaliser sur les transitions entre phase, un aspect méconnu de la maladie qui pourrait amener à une meilleure compréhension de sa biologie et à de nouvelles pistes thérapeutiques. Pour cela, nous avons besoin d’un modèle de la maladie récapitulant les deux phases à l’échelle individuelle. Notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, et nous sommes en train de mettre au point des tests pour évaluer les phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir et de caractériser un modèle récent de trouble bipolaire basé sur une des hypothèses majeures du domaine, à savoir l’hypothèse mitochondriale. Celle-ci se base sur un ensemble de données suggérant qu’une dysfonction mitochondriale légère serait au centre de cette pathologie. La première phase de caractérisation est de reproduire et d’étendre les résultats comportementaux suite à un traitement chronique de roténone, un inhibiteur de la chaîne mitochondriale.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude permettra d’évaluer la reproductibilité d’un modèle murin prometteur de la pathologie, et de développer de nouvelles pistes de compréhension de la maladie avec un suivi longitudinal et individuel des animaux.
Procédures
Une injection sous-cutanée est réalisée quotidiennement pendant 8 semaines. Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test comportemental a lieu 3 fois (une fois pendant la phase sans symptômes, une fois en phase maniaque et une fois en phase dépressive) à 4 semaines d'intervalle. Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanée (7 fois par semaine sur 8 semaines), sont espacées de 24h. Les doses de roténone sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. La roténone en elle-même ne semble pas induire de phénotypes comportementaux à court terme (au moins jusqu’à deux semaines) d’après la littérature. A un mois, la roténone semble induire une hypoanxiété, puis de l’anxiété à 2 mois.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). La stratégie des 8 groupes avec deux groupes (contrôles et traités) se base sur un effet attendu relativement important. Nous faisons le choix de travailler chez les animaux des deux sexes en accord avec les directives d'intégrer le sexe comme variable biologique dans les recherches : en effet, les troubles psychiatriques dont le trouble bipolaire sont un facteur majeur d'invalidité dans le monde et peuvent s'exprimer différemment chez les hommes et les femmes. Il est donc essentiel de s'intéresser aux deux sexes pour une meilleure compréhension du trouble et développer des approches thérapeutiques adaptées.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En complément, une friandise (sous la forme d'un morceau de gâteau) sera distribuée après chaque injection et après les tests comportementaux afin de diminuer le stress en faisant associer les manipulations à un événement positif. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur . En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout de 48h. Dans ce cas, une euthanasie sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 7 semaines ou plus. Le modèle roténone ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Modèles rongeurs de fragilisation de la barrière intestinale et de translocation bactérienne appliqués à l’évaluation d’efficacité de composés innovants dans des modèles de défaillance hépatique chroniques (ACLF)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 3850
Barrière intestinale fragilisée par des agents chimiques, absorptions chroniques ou massives d'alcool, fonction du foie altérée: 4 150 souris et 3 850 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 5 900 d'entre eux en gravité sévère. Les animaux peuvent présenter des diarrhées parfois hémorragiques, une perte de poids, un état de choc et une détresse cardio-respiratoire avec des troubles de la régulation de leur température. Le porteur décrit des gestes "peu invasifs ou traumatisants" et affirme écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important, tout en indiquant que dans les études de survie la mort constitue le point final expérimental et qu'aucun point limite anticipé ne pourra alors s'appliquer. Il ajoute que les moyens de lutte contre la douleur peuvent introduire un biais expérimental, et vise une gravité "sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique".
Objectifs
Notre laboratoire est engagé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la décompensation aigue de la cirrhose hépatique et dans le développement de solutions thérapeutiques visant à protéger les patients qui la subissent. La cirrhose du foie est le stade terminal courant des maladies chroniques du foie provenant de différentes étiologies. L’aggravation de la maladie hépatique déclenche une cascade d’événements avec une prolifération bactérienne intestinale et une dysbiose comme événements centraux. Les toxines bactériennes peuvent directement provoquer la mort des hépatocytes, tandis que la dysbiose affecte également la fonction de barrière intestinale et augmente la translocation bactérienne, ce qui entraîne des épisodes inflammatoires, des infections systémiques, une vasodilatation et contribue à une décompensation aiguë accompagnée de défaillances de plusieurs organes. Les patients qui montrent des signes similairesou qui sont atteints de ces symptômes présentent une inflammation systémique élevée, qui est principalement précipitée par une infection bactérienne avérée et/ou une hépatite alcoolique sévère. Au cours de l’évolution de la cirrhose, les modifications du microbiote (dysbiose) sont aggravées par des modifications de la motilité intestinale, de la perméabilité, de la fonction de barrière envers le compartiment lymphatique et sanguin, de l'hypertension portale et du système immunitaire. Le rôle du microbiote semble crucial chez les patients atteints de cirrhose décompensée, car de nombreux événements déclencheurs sont liés aux microbes ou à leur interaction avec l’hôte. Ce projet de recherche sur cette maladie hépatique met l’accent sur les mécanismes associés au microbiote qui sont impliqués, de manière à pouvoir les cibler ou pour identifier des paramètres permettant d’évaluer les propriétés de composés en développement. Nous mettrons en place des modèles expérimentaux conçus pour fragiliser la barrière intestinale et induire une translocation bactérienne, ces modèles induits par des actions directes d’agents chimiques ou par des absorptions chroniques ou massives d’alcool pourront également être combinés à des modèles pathologiques où la fonction hépatique est altérée de manière à reproduire les caractéristiques de la pathologie.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes de défaillance hépatique et par voie de conséquence d'autres organes, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible pour préserver le capital hépatocytaire qui subsiste, et qui peut se révéler être vital lors de la survenue d’un second évènement aigu. Aujourd’hui les traitements employés agissent sur les symptômes tels que la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent aussi à agir sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, et immunité). L’action régulatrice de composés sur la translocation bactérienne par une action directe sur la barrière ou indirecte sur le microbiote pourrait avoir un impact important sur la réduction des effets déclencheurs de la défaillance aigue du fonctionnement du foie.
Procédures
Au cours des procédures expérimentales qui constituent ce projet conduit sur des rats ou des souris, nous serons amenés à effectuer des gestes peu invasifs ou traumatisants, il s’agit d’administrer aux animaux par des moyens classiques d’injection des agents qui vont conduire à l’apparition de la pathologie souhaitée ou à contrario des produits destinés à en limiter ou réduire les symptômes. Ces administrations seront dans certains cas répétées de manière quotidienne sur des périodes courtes (une semaine) , ou de manière bi-hebdomadaire au cours de période plus longues ( 10 semaines max) Dans les cas ou une immobilisation est plus confortable, pour l’opérateur et pour l’animal, et de manière systématique pour les prélèvements, une légère anesthésie de quelques minutes (3min) sera pratiquée par exposition des voies respiratoires à un agent anesthésiant.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet dont la finalité est le développement de modèles permettant de mener des évaluations de propriétés thérapeutiques de composés dans le traitement des patients dans un état ACLF dont la survie est engagée. La relation entre le foie et l’intestin joue un rôle primordial lors des phases qui précèdent le déclenchement de l’ACLF, l’altération de la fonction barrière et la translocation bactérienne sont des éléments que nous avons considérés et que nous devons reproduire dans nos modèles. Les modèles développés chez les rongeurs pourront présenter des troubles de la fonction digestive, associés à des diarrhées parfois hémorragiques et une perte de poids. Au cours de l’épisode ACLF, nous pourrons observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé lorsqu’il sera possible de les appliquer par exemple lors de la mise à mort à un temps fixe précoce prédéterminé. En revanche, dans les situations d’études de survie où la mort est le point final expérimental, il ne pourra pas y avoir recours à des points limites anticipés. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l'aide du test statistique de Welsh qui associe variance et probabilité d'atteinte d'un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d'affiner les effectifs et de réduire donc les nombres d'animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l'obtention d'un résultat biologique relevant. Les administrations par voie veineuse de manière répétées peuvent présenter des difficultés techniques qui obligent parfois à augmenter les effectifs des groupes (échec des injections à combler), la possibilité des injections multiples ou continues sur es des animaux cathétérisées est de ce point un avantage car cela permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paire , les souris par trio , l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
La littérature scientifique, est riche sur la cirrhose du foie, les rongeurs sont de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, (condition importante dans ce projet.), mais il faut noter que la réponse du rat à l’induction de la fibrose (composant nécessaire à l’apparition de la cirrhose) est meilleure que celle de la souris. Dans le cas où il n’y a pas de différences majeures entre les espèces, le choix de l’espèce peut être strictement économique. L’hébergement des souris de petite taille est plus aisé. La souris nécessite 10 fois moins de réactifs ou médicaments parfois rare et précieux ou onéreux que le rat. La contrainte de la souris de petite taille est que les volumes d’échantillons biologiques obtenus sont limités, et on obtient moins d’informations scientifique à partir d’un seuil animal. Le recours dans ce cas au rat peut présenter des avantages.
Rôle des circuits thalamo-corticaux dans les déficits d’attention dans l’autisme
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Maintenues à 90 ou 95 % de leur poids initial par un rationnement alimentaire pouvant durer deux mois, les souris doivent rester assez affamées pour travailler contre une récompense. 560 souris porteuses d'une mutation modélisant l'autisme vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure pour l'injection d'un virus et l'implantation de fibres, avec inconfort, fatigue et parfois douleur dans les jours qui suivent. Ce rationnement, dont le porteur juge l'impact très faible, accompagne une "claire perspective translationnelle" annoncée pour le trouble du spectre autistique, quand l'expérience consiste à faire exécuter une tâche d'attention une heure par jour pendant deux mois.
Objectifs
Les déficits attentionnels affectent une large proportion des autistes (jusqu’à 80%). De récentes études suggèrent que les difficultés sensorielles et attentionnelles des autistes seraient étroitement liées. Ainsi, les autistes auraient des difficultés à sélectionner les stimuli sensoriels appropriés, ce qui entrainerait une surcharge cognitive. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle que joue l’attention dans le trouble du spectre de l’autisme. Plus précisément, ce projet examinera l’implication de différentes régions du cerveau et leur interaction lors d’une tâche comportementale permettant d’évaluer la capacité de transition attentionnelle dans un modèle transgénique d’autisme chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure connaissance des structures et circuits impliqués dans l’attention ainsi qu’une meilleure compréhension de l’implication des déficits attentionnels dans un modèle animal d’autisme. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle, en particulier pour le trouble du spectre autistique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une tâche comportementale d'environ 1h/jour pendant 2 mois maximum ainsi qu'à un rationnement alimentaire léger qui n'exédera pas deux mois. Les animaux de la procdure 2 subiront une chirurgie cérébrale qui dure en moyenne 1h.
Impact sur les animaux
Les chirurgies d’injection intra cérébrale de virus et d’implantation de fibres présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en rationnement alimentaire léger (pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.
Remplacement
Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’humain n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour que nos tests conservent assez de puissance en tenant compte des pertes inévitables. Le recours à des méthodes réversibles (inactivation transitoire de certaines voies anatomiques par la technique d’optogénétique) permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables dans notre recherche, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, maisonnette) et seront hébergés en cage collective. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pendant 7 jours pour s’assurer de la récupération complète des souris. Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez la souris des aptitudes cognitives complexes que l’on retrouve chez l’humain. Enfin, la souris permet l’utilisation de modèles transgéniques, dans notre cas un modèle induisant un phénotype autistique. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes âgés de 6-8 semaines au début des expérimentations. Ils atteindront 10-12 semaines avant le début des chirurgies et des protocoles comportementaux afin de limiter la variabilité de taille. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les données de la littérature.
Formation à la protection des animaux de la FAUNE SAUVAGE NON-HEBERGEE terrestre (Mammifères, Oiseaux, Reptiles) utilisés à des fins scientifiques
- Formation professionnelle
Rats : 5
Autres rongeurs : 50
Autres mammifères : 60
Autres oiseaux : 120
Reptiles : 50
Cinq plumes arrachées sur le corps des petits oiseaux, une brûlure superficielle des écailles ventrales pour marquer les couleuvres, jusqu'à quarante-huit heures de détention pour les serpents: 290 individus, dont 120 oiseaux, 60 sangliers, 50 rongeurs sauvages et 50 reptiles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal capturé subit en moyenne six actes parmi capture, contention, prise de sang, anesthésie, écouvillonnage cloacal ou buccal et pose d'un dispositif de biotélémétrie. Ces actes alimentent des démonstrations pratiques pour la formation réglementaire de personnes qui travailleront sur la faune sauvage, sans produire de connaissances, le porteur retenant des espèces communes et abondantes connues pour ne pas entrer rapidement en stress pathologique et estimant le recours à des animaux vivants "inévitable". 286 individus sont relâchés sur leur lieu de capture ou réintégrés dans leur élevage, les quatre rongeurs d'origine captive étant tués puis donnés en nourriture aux serpents élevés sur le site, faute d'être repris par le fournisseur.
Objectifs
Tout personnel scientifique utilisant des animaux à des fins scientifiques doit avoir validé une formation spécifique à l’expérimentation animale, laquelle inclue obligatoirement un module complémentaire spécialisé sur un groupe d’espèces au plus proche de ses modèles d’étude. Le présent projet concerne les démonstrations pratiques d'un module complémentaire spécifique obligatoire de formation règlementaire à la protection des animaux de la faune sauvage non-hébergée utilisés à des fins scientifiques. La présente formation est la première et seule formation en France offrant des modèles d’étude adaptés aux personnes travaillant sur la FAUNE SAUVAGE NON-HEBERGEE. Une telle formation doit comporter des démonstrations pratiques pour transmettre les bonnes pratiques à acquérir, mais réduites au minimum nécessaire en termes de nombre d’individus et de degré de contrainte des procédures appliquées. La finalité de ce projet est donc la formation en vue de l’acquisition des compétences professionnelles requises réglementairement pour utiliser des animaux des fins scientifiques. Les objectifs des démonstrations pratiques sont de transmettre par l’exemple, les bonnes pratiques en termes de capture, contention, prélèvements biologiques, sédation/ anesthésie, suivi des signes du stress et d’évaluation du statut sanitaire. Au préalable, ces pratiques sont enseignées lors d’enseignements en salle lors du module de base (3 à 6 mois avant le module complémentaire), puis la veille de chaque démonstration pratique lors du module complémentaire. Les démonstrations sont réalisées par des expert-e-s des actes à pratiquer sur chacun des groupes d’espèces proposées. De l’ordre de 20 pour cent du temps des démonstrations pratiques correspond à des actes sur des animaux vivants (maximum de 2 par démo et par groupe d’espèces), le reste du temps étant dédié à des apprentissages à l’aide de diverses méthodes de remplacement (photos, vidéos, mannequins).
Bénéfices attendus
Le bénéfice est de promouvoir la préservation du bien-être des animaux sauvages utilisés dans des projets de recherche par la formation des concepteur-rice-s et applicateur-rice-s aux bonnes pratiques, adaptées à leurs modèles d’étude. Tant le bon sens que la réglementation imposent que les personnes soient formées aux actes à pratiquer. Cette acquisition de compétences se fait en 3 temps : conceptualiser (enseignements théoriques), assimiler (démonstrations pratiques), puis acquérir la maitrise technique des actes (tutorat). Le présent projet, par la démonstration pratique des actes les plus courants, promeut les bonnes pratiques en vigueur à ce jour, et ainsi assure un meilleur traitement des animaux par le raffinement des actes. Certaines recherches empiriques en écologie et biologie de la conservation animale imposent de capturer des animaux sauvages, les contenir temporairement captifs, et leur appliquer des actes techniques. Ce faisant, les animaux sont inévitablement en situation de stress. Tout l'enjeu de la protection des animaux sauvages utilisés à fins scientifiques est de savoir gérer simultanément ce stress et l’application des actes techniques. Ces deux compétences (suivi du stress et dextérité) ne peuvent pas être enseignées (i) sans pratique: le recours à des démonstrations sur des animaux vivants est inévitable, (ii) sur des animaux d'origine captive : ces derniers ne stressent pas comme les animaux sauvages car ils sont acclimatés (voir adaptés) à l'humain, avec un stress en réponse à la capture et la manipulation très atténué.
Procédures
Quel que soit le groupe d'espèces, les animaux utilisés sont exposés en moyenne à une combinaison de 6 actes (4 à 9 suivant les espèces et les démos), parmi : 1) stress léger pendant la capture, les contentions, et la détention (5 min à 48 heures suivant les espèces et les démonstrations pratiques) ; 2) douleur légère et transitoire lors d’un prélèvement sanguin (quelques minutes); 3) inconfort pendant l’induction et le réveil d’une courte anesthésie (5 min à 2h), l’équipement avec un dispositif électronique de biotélémétrie (15 à 45 min), et/ou l’écouvillonnage cloacal et/ou buccal. En sus, les nuisances spécifiques à des actes démontrés que sur certains groupes (si et uniquement si des apprenants le sollicitent) sont: sur sanglier, douleur légère à modérée et [transitoire] (quelques minutes) lors du marquage pour identification individuelle (boucle auriculaire et transpondeur, réduit par cryoanalgésie locale); pour les serpents, douleur ponctuelle légère sur quelques secondes à minutes lors du marquage pour identification individuelle (brûlure superficielle d’écailles ventrales), le stress de contention pendant une échographie (1 à 3 minutes) illustrant les possibilités d’exploration fonctionnelle (activité cardiaque, reproductrice, alimentaire), ponction veineuse intracardiaque ; sur les oiseaux, inconfort lors d’un prélèvement de liquide uropygien par palpation ou d’un écouvillonnage buccal ou du jabot chez les pigeons et l’arrachage de 5 plumes du corps (petites plumes). Ces actes peuvent être stressant ou douloureux mais très temporairement, ils n’induisent pas de détresse ou souffrance durable: ce sont les actes utilisés en routine pour étudier ces espèces dans la nature, sans indication d'impact durable. Chaque acte de prélèvements biologiques n’est pratiquée qu’une seule fois par individu au cours d’une session de formation (et deux sessions de formation par an, avec évitement de la réutilisation entre sessions).
Impact sur les animaux
Les actes induisant une légère douleur transitoire sont: les prélèvements sanguins (tous groupes d'espèces), l'écouvillonnage cloacal ou rectal (tous groupes d'espèces), l’implantation d'un nano-transpondeur sous-cutané (sangliers), marquage à l’aide de boucles auriculaires (rongeurs, sangliers), marquage par cautérisation superficielle d'écailles ventrales (couleuvres), l'injection d'anesthésique (intra-musculaire sur sanglier et tortues, intra-péritonéal sur rongeur), l'arrachage de plumes de corps (petits oiseaux). Les actes induisant un stress transitoire sont: la capture, la contention/détention/hébergement temporaire, la manipulation (tous groupes d'espèces), l'équipement avec un dispositif électronique biotélémétrique (sur collier pour rongeurs, sur harnais pour oiseaux, collé sur tortues). Les actes induisant un inconfort transitoire sont: l'anesthésie (tous groupes d'espèces), l'écouvillonnage buccal (tous groupes d'espèces sauf tortues), la pose d'une bague à la patte (oiseaux).
Devenir
Tous les animaux capturés à l'issue de la formation seront replacés = relâchés sur le lieu de capture ou réintégrés dans leur groupe d'élevage, car aucune des procédures prévues n’est susceptible d’induire une douleur prolongée. En cas de complications irréversibles (blessure, épuisement), le vétérinaire référent décidera du devenir de l’animal (soin ou euthanasie). Nous rappelons qu'aucune mise à mort ne sera réalisée à fins pédagogiques. Pour les animaux captifs utilisés, lorsque qu'il n'a pas été possible de capturer des individus sauvages, ils seront tous réintégrés dans l'élevage dont ils sont issus (à l'exception des rongeurs d'origine captive, le fournisseur ne les reprenant pas et l’Etablissement Utilisateur n’ayant pas d’animalerie rongueur pour les maintenir en élevage, ces rongeurs sont mis à mort puis donnés comme alimentation aux serpents élevés à fins scientifiques sur site).
Remplacement
Chaque année, nous accroissons les médias de remplacement à disposition des formateurs: recours à des cadavres (obtenus de manière opportuniste avec dérogations idoines; p. ex. mortalité routière, accident lors de projet nécessitant la capture, animaux euthanasiés en centre de sauvegarde de faune sauvage) ou achat de mannequins pour la démonstration d’actes potentiellement douloureux ou de mise à mort (mannequin de rat pour contention et ponction veineuse caudale ; mannequin de cerf et phoque pour (télé)anesthésie, prélèvement sanguin) ; constitution d’une banque d’’images et vidéos dédiées (collectées lors des démonstrations pratiques, ainsi que lors de leurs projets par les formateurs). Néanmoins, le but pédagogique de démonstration de l’intérêt de méthodes alternatives aux pratiques communes (Raffinement) nécessite le recours à quelques animaux vivants par session de la formation. Les démonstrations pratiques, dans des conditions réalistes, sur de très petits nombres d’animaux sauvages en nature, nous semblent donc indispensables pour atteindre cet objectif pédagogique.
Réduction
Le nombre d’individus utilisés a été réduit le plus possible : maximum N = 2 par démonstratin pratique et par groupe d’espèces (1 utilisé par le formateur pour démontrer les actes, 1 utilisé par un apprenant sous tutorat du formateur pour appréhension des actes) ; avec réutilisation des individus de la Démo2 dans la Démo3 dans la majorité des procédures. Ainsi, pour une session de formation sur un groupe d’espèces, maximum 6 individus sont utilisés (sauf pour les tortues : maximum 4, du fait de la disponibilité limitée en individus pour ce groupe d’espèces). Nous faisons deux sessions de formation par an: 6 groupes en Juin (2 x grands mammifères, petits mammifères, grands oiseaux, petits oiseaux et reptiles - serpents), 4 groupes en Septembre (petits mammifères, grands oiseaux, petits oiseaux, reptiles - tortues). Ce sont donc au total max. 58 individus qui sont utilisés par an, soit max. 290 individus sur la durée du projet (5 ans). Autres leviers de réduction: 1) la majorité des individus utilisés en Démo font simultanément partie de projets de recherche en cours sur site, et sont donc mutualisés entre projets (entre finalité scientifique et pédagogique ; cas des sangliers, oiseaux, serpents) ; 2) en cas d’absence de volontaire pour pratiquer ou de demande de la part des apprenants, le formateur peut décider de ne pas faire la 2ème démonstration prévue (ainsi, ~ 1 fois sur 2, dans les démos d’anesthésie, 1 seul individu est anesthésié au lieu de 2) ; 3) les manipulations sont filmées, réduisant ainsi la nécessité ultérieure de recourir à des démonstrations d’actes, et augmentant la diversité des situations auxquelles les apprenants sont exposés ; 4) l’offre de formation sur un groupe d’espèces donné et une session donnée n’est proposée que si il y a au moins 4 inscrits demandant à être formé sur ce groupe (et maximum 5 inscrits par groupe). Si la demande est inférieure, le groupe d’espèces concerné n’est pas proposé = il n’y a pas d’utilisation d’animaux pour ce groupe à cette session.
Raffinement
L’enjeu pédagogique majeur est la démonstration de pratiques de raffinement : évaluer et minimiser le stress des animaux sauvages pendant les contentions tout en démontrant le degré de dextérité requis pour une mise en œuvre sûre des actes. C’est la trame transversale à toutes les démonstrations pratiques. Les formateurs ont été choisis parmi les personnes les plus expérimentées en France pour chaque groupe d’espèces, offrant des démonstration sûres et rapides des actes techniques courants, ajustés en fonction de la condition de stress de l’animal manipulé. Les anesthésies ne sont pratiquées que par des vétérinaires, pratiquant sur faune sauvage (et formés à l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques). Des équipements de capture et contention minimisant le stress ont été acquis (pièges pour petites mammifères, sabot de contention pour sanglier). L’hébergement temporaire (max. 48h pour les serpents, 1h à 27h pour les autres groupes) est accompagné de mesures de préservation des 5 libertés (calme auditif et olfactif, obstruction visuelle, abris et supports adaptés, alimentation et boisson ad libitum). Les animaux sauvages sont systématiquement relâchés sur leur lieu exact de capture. Les animaux captifs sont réintégrés dans leur lot d’origine. Chez les petits et grands mammifères, la douleur ponctuelle induite par le marquage d’identification (boucle auriculaire, transpondeur) est réduite par analgésie locale. Les surmulots sont sédatés pour réduire le stress lors de la contention. La démonstration de l’anesthésie par inhalation est privilégiée (plus rapide, moins risquée ; seule méthode sur oiseaux, petits mammifères et serpents). Pour les oiseaux, démonstration d’un point de ponction veineuse (veine cutanée jugulaire ou veine tibiale) avec moins de risque d’impact sur les performances de vol que le point usuel (veine brachiale ou ulnaire). Un dispositif d’imagerie par ultra-sons (doppler) a été acquis pour mieux localiser les points de ponction veineuse (reptiles). En cas d’animal risquant d’atteindre un état de stress pathologique (points limites et grille d’évaluation spécifiques à chaque groupe d’espèces), il est immédiatement mis au calme sous surveillance (quelques minutes à 1h), puis relâché au plus vite sur son lieu de capture. A défaut d’une récupération rapide, le responsable vétérinaire référent décide du traitement à apporter (idem en cas de blessure accidentelle ; 2 cas en 5 ans).
Choix des espèces
Les critères de choix des espèces sont: (1) espèces et individus d'origine sauvage, pour que les animaux présentent des comportements similaires aux espèces sur lesquelles les apprenants opèreront; (2) groupes taxonomiques d'animaux terrestres couramment utilisés en utilisation d'animaux de faune sauvage non-hébergée à des fins scientifiques et disponibles sur site de formation; (3) des espèces communes et abondantes, assurant une capture aisée en nombre suffisant dans les temps impartis, sans impact sur les populations et les espèces. (4) des espèces connues pour NE PAS entrer rapidement en phase de stress pathologique lors des manipulations (p. ex. sensibilité cardiaque, épuisement, apathie, hyper-activité). (5) en cas de défaut de capture le jour de la Démo, espèces disponibles en nombre suffisant dans les élevages de l'EU ou de son partenaire scientifique local, un parc zoologique à proximité. Les espèces pouvant être utilisées sont: Petits mammifères: Souris grise (Mus musculus), Rat noir (Rattus rattus), Rat surmulot (Rattus norvegicus), Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus), Campagnol roussâtre (Myodes glareolus), Campagnol des champs (Microtus arvalis) Grands mammifères: Sanglier (Sus scrofa) Grands oiseaux: Canard domestique (Anas platyrhynchos), Oie domestique (Anser anser domesticus) Petits oiseaux: Mésange charbonnière (Parus major), Mésange bleue (Cyanistes caeruleus), Moineau domestique (Passer domesticus), Merle noir (Turdus merula), Pigeon biset domestique (Columbia livia), Diamant mandarin (Taeniopygia guttata) Reptiles – Serpents: Couleuvre verte-et-jaune (Coluber viridiflavus), Couleuvre d’Esculape (Zamenis longissimus), Couleuvre à collier (Natrix natrix) Reptiles – Tortues: Tortue d’Hermann (Testudo hermanni), Tortue grecque (Testudo graeca), Cistude d’Europe (Emys orbicularis), Emyde lépreuse (Mauremys leprosa) Stade: uniquement des animaux ayant atteint la taille adulte. Les individus juvéniles, n'ayant pas fini leur croissance, ne seront pas utilisés. Les femelles gravides/gestantes (dans la limite des capacité à détecter leur statut reproducteur) ne seront pas utilisées.
Utilisation de vecteurs dérivés de phages pour modifier génétiquement des bactéries toxigéniques responsables d’infections intestinales sévères
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Toutes tuées à l'issue parce qu'aucune ne peut sortir de l'animalerie pour raisons de sécurité biologique, 3 697 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 1 455 d'entre elles en gravité sévère. Leur microbiote est d'abord détruit par cinq jours d'antibiotiques dans l'eau de boisson et une injection intrapéritonéale, avant le gavage de bactéries toxinogènes puis des candidats médicaments, avec jusqu'à six prélèvements de fèces par jour pendant deux jours. Les diarrhées décrites, la déshydratation et les douleurs intestinales peuvent durer plusieurs jours, jusqu'à guérison ou atteinte d'un point limite. Le hamster, modèle historique de cette infection, a été écarté parce qu'il est "extrêmement sensible" et présente une forte mortalité, la souris offrant une colonisation intestinale stable et des données déjà accumulées au laboratoire.
Objectifs
Certains agents pathogènes bactériens ont la capacité de coloniser l’intestin humain et de s’y reproduire très efficacement, entraînant des symptômes sévères (diarrhées violentes, perforation de la paroi intestinale…) pouvant engager le pronostic vital du patient. La sévérité de ces infections tient à la production par ces bactéries pathogènes de toxines qui ciblent et détruisent les cellules de la paroi intestinale et du côlon. Pathogènes opportunistes, ces bactéries intestinales entraînent rarement des infections chez les personnes en bonne santé car leur développement est inhibé par les nombreuses bactéries qui colonisent naturellement l’intestin et constituent le microbiote (encore appelé flore intestinale). En revanche, ces pathogènes prospèrent dans l’intestin de personnes affaiblies et/ou dont le microbiote a été perturbé par un traitement antibiotique, les rendant ainsi particulièrement sensibles à l’infection. Malgré la pression considérable que ces bactéries pathogènes exercent sur les systèmes de santé, avec des coûts globaux annuels estimés à plusieurs milliards de dollars, il n’existe à ce jour aucune approche pleinement satisfaisante pour les traiter. En effet, les antibiotiques restent le standard thérapeutique contre ces infections, or ils participent à la perturbation du microbiote intestinal favorisant le développement même de ces pathogènes et sont responsables de l’augmentation continue de l'antibiorésistance, deux facteurs clés favorisant le risque de récurrence des infections. Dans ce contexte, nous développons 2 approches thérapeutiques inédites permettant, après administration par voie orale, de cibler les bactéries pathogènes dans l’intestin et de les éliminer de manière spécifique sur la base de leur séquence génétique, ou bien de les modifier génétiquement afin d’abolir leur production de toxines, les rendant ainsi inoffensives. Ces deux approches ont l'avantage unique d’être extrêmement spécifiques : contrairement aux antibiotiques elles ne ciblent que les bactéries pathogènes et préservent ainsi le reste du microbiote, limitant ainsi le risque de récurrence des infections. L'objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité de ces deux approches thérapeutiques dans des modèles murins d’infection par ces pathogènes bactériens intestinaux afin de sélectionner la plus prometteuse en vue d’en faire un médicament et d’organiser des essais cliniques chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Il n'existe à ce jour aucune approche thérapeutique pleinement satisfaisante pour soigner les infections causées par les bactéries pathogènes intestinales productrices de toxines. En effet, si les antibiotiques demeurent le standard thérapeutique contre ces infections, ils perturbent grandement le microbiote intestinal, un point clé favorisant le développement de ces pathogènes intestinaux. De plus, ils sont responsables de l’augmentation continue du phénomène d’antibiorésistance. De ce fait, les antibiotiques peuvent paradoxalement être contre productifs et favoriser le risque de récurrence des infections chez les patients. Dans ce contexte, ce projet vise à tester l'efficacité de 2 modalités thérapeutiques inédites et permettant de combler les lacunes des antibiotiques. La première modalité consiste en un antimicrobien extrêmement spécifique capable de reconnaître et d’éliminer les bactéries pathogènes dans l’intestin sur la base de leur séquence génétique. La seconde fonctionne à la manière d’un produit de thérapie génique et permet de cibler les bactéries pathogènes dans l’intestin et de le modifier génétiquement afin d’inactiver les gènes responsables de la production de toxines, les rendant ainsi inoffensives. Ces deux approches ont en commun leur spécificité sans précédent: elles ne ciblent que les bactéries pathogènes et n’engendrent aucune perturbation du microbiote intestinal. Elles se démarquent donc très nettement des antibiotiques et réduisent le risque de récurrence des infections à ces pathogènes intestinaux. En utilisant des modèles murins de colonisation et d’infection intestinale, ce projet vise à démontrer la capacité de ces 2 approches à éliminer les bactéries pathogènes ou à les rendre inoffensives tout en préservant le reste du microbiote intestinal. Le principal bénéfice en découlant sera le développement d’une stratégie thérapeutique alternative plus performante, plus sûre et plus adaptée au traitement clinique des infections intestinales aux bactéries productrices de toxines que les antibiotiques.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont les suivantes : - Une administration d’antibiotiques via l’eau de boisson (biberon) pendant 5 jours - Une administration d’antibiotique par injection intrapéritonéale (quelques secondes par animal) - Une administration orale par gavage de bactéries puis des candidats médicaments que nous testons (quelques secondes par animal) - Prélèvements de fèces: ils seront effectués au maximum une fois par jour (sauf procédure spécifique: 6 fois par jour pendant 2 jours), en récoltant les fèces excrétées naturellement par les animaux, en les plaçant dans une boite pendant quelques minutes. Il est également attendu que certains animaux infectés présentent une diarrhée et une perte de poids associées à la maladie que nous étudions.
Impact sur les animaux
La piqûre d’aiguille pour l’injection d’un antibiotique entraîne une douleur légère de courte durée. Le gavage oral avec les bactéries ou avec le traitement à tester entraîne une gêne et un stress légers et de courte durée. Les prélèvements de fèces entraînent un stress physique léger et un isolement de courte durée (5 minutes maximum). La maladie étudiée entraîne des symptômes tels que de la diarrhée, et donc une déshydratation légère à modérée, ainsi que des douleurs intestinales légères à modérées pouvant durer plusieurs jours (jusqu’à guérison ou atteinte d’un point limite, tel que décrit dans la section dédiée).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, la quasi-totalité de ces animaux seront infectés par des bactéries pathogènes, empêchant toute sortie de l’animalerie pour des raisons de sécurité biologique. Les quelques animaux qui ne seront pas infectés seront tout de même hébergés dans l’enceinte de la même animalerie, et doivent donc aussi être considérés comme potentiellement contaminés.
Remplacement
Les bactéries cibles colonisent l’intestin, où elles produisent des toxines qui entraînent notamment des diarrhées. Un traitement efficace doit donc être capable d’atteindre l’intestin afin d’agir sur ces bactéries. Bien que des modèles in vitro permettent de simuler les conditions gastrique et intestinale et seront utilisés en première intention au laboratoire, seule l’utilisation d’animaux permet de récapituler à la fois les obstacles physico-chimique qui seront rencontrés par notre traitement chez l’homme, mais aussi les conditions physiologiques dans lesquelles ces bactéries cibles seront retrouvées chez l’homme. De plus, bien que la réduction/abrogation de la production des toxines sera montrée préalablement in vitro au laboratoire, un modèle récapitulant les symptômes causées par l’infection avec ces bactéries est nécessaire pour évaluer l'efficacité de notre traitement dans la réduction/abrogation de ces symptômes chez l’homme.
Réduction
Nous effectuerons un grand nombre de tests préliminaires in vitro au laboratoire avant de passer chez l’animal. Ainsi, la diminution et l’abrogation de la production de toxines par les bactéries confrontées à notre traitement seront mesurées in vitro; la stabilité de notre traitement en conditions physico-chimiques physiologiques (acidité de l’estomac, présence d’enzymes digestives) sera mesurée in vitro; la capacité de notre traitement à tuer les bactéries ciblées sera évaluée par culture microbienne au laboratoire. Ces tests préliminaires permettront de réduire au strict minimum les tests devant absolument être effectués sur animaux en les effectuant que sur les candidats médicaments les plus prometteurs. De plus, toutes nos procédures sont construites autour de calculs de puissance statistique, afin de garantir au maximum que les résultats produits puissent répondre aux questions scientifiques, tout en utilisant le juste nombre d’animaux. Nous allons vérifier la colonisation bactérienne (un des indicateurs principaux) dans l’intestin des animaux au cours de l’expérience à partir du matériel fécal; cette stratégie non invasive, que nous avons déjà mis en place précédemment, nous permettra de procéder ) des études longitudinales sur un même individu, réduisant ainsi le nombre d’animaux à euthanasier sans perdre des informations essentielles pour le développement et l'interprétation de nos expérimentations.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux seront celles classiquement admises, notamment en termes de socialisation (jamais moins de 3 animaux par cage) et d’enrichissement (stick de coton pour nidification); la nourriture et l’eau seront fournies ad libitum (sauf exception la veille au soir d’une administration de traitement oral). Il n’est pas prévu d’isoler des animaux ou de restreindre leur environnement au cours du projet. L’infection par nos bactéries toxinogènes cibles entraînera sous quelques jours des diarrhées dont la sévérité peut évoluer rapidement. C’est pourquoi dans toutes les procédures impliquant des animaux infectés par des bactéries produisant des toxines, nous prévoyons une surveillance accrue des animaux (au minimum 1 fois par jour; voire 2 fois par jour dans les cas des animaux ayant perdu du poids ou peu mobiles), afin d’anticiper l’aggravation des symptômes et le cas échéant de procéder à la mise à mort des animaux pour éviter toute souffrance inutile. Des blocs d’hydrogel et des morceaux de nourriture pourront être fournis au fond de la cage pour les souris pouvant présenter des symptômes les empêchant d’accéder aussi librement que possible à l’eau et la nourriture présents dans le capot de la cage. Un autre moyen de limiter la souffrance animale est d’effectuer les tests de notre traitement en 2 jours maximum (sauf exception). Ainsi, l’expérimentation pourra être terminée avant que les symptômes n’atteignent des niveaux trop élevés. Enfin, nous avons prévu d’utiliser pour la plupart de nos procédures une souche ne produisant pas la toxine majeure de cette bactérie cible; des telles bactéries possèdent encore une toxine mineure avec le même mécanisme d’action, mais dont la dose toxique est 1000 fois moindre que la première. La majorité de nos procédures utiliserons cette souche comme alternative, moyennant certains changements dans la nature de notre traitement, à l’exception des procédures évaluant l’effet du traitement sur les symptômes eux-mêmes, par définition, où l'efficacité devra être démontrée contre les souches sauvages impliquées dans la maladie chez l’homme.
Choix des espèces
De nombreux animaux ont été infectés expérimentalement par la bactérie pathogène que nous étudions tels que hamsters, souris, rats, lapin et cailles, mais aussi des cochons et des singes. Le modèle historiquement utilisé pour étudier la pathologie est le hamster, cependant ce modèle est extrêmement sensible et présente une forte mortalité. Dans ce projet, nous limitons au maximum les souffrances éprouvées par les animaux, en travaillant majoritairement avec des versions fortement atténuées de ces bactéries. Ainsi, la souris devient le modèle le plus simple pour lequel il existe des données de littérature confirmant une colonisation intestinale stable. Nous disposons également de nombreuses données antérieures générées dans notre laboratoire chez la souris sur des candidats médicaments similaires, ce qui bénéficiera au projet. Le modèle souris récapitule également certains des symptômes clés de ces infections bactériennes chez l'Homme; cela nous permettra d'évaluer l'impact de notre traitement sur l'évolution de la maladie. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, typiquement âgés de 6 à 9 semaines en début d’expérimentation. L’âge des animaux en fin d’expérimentation ne dépassera pas 12 semaines, du fait de la durée maximum des expériences prévues dans les différentes procédures. Il faut noter que cet âge maximum n’est pas une limite scientifique, mais simplement un fait lié à la durée de nos expériences. Les individus plus jeunes ou beaucoup plus âgés pourraient être plus sensibles aux toxines produites par nos bactéries cibles, et ainsi développer des symptômes plus sévères, ce qui n’est pas nécessaire pour notre projet, et serait même contre-productif en termes d’obtention de colonisation intestinale stable avec ces bactéries.
Rôle des changements épigénétiques liés à l’âge sur les fonctions remyélinisantes et cognitives des cellules oligodendrogliales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour décrire comment le vieillissement de certaines cellules du cerveau limite la mémorisation et la réparation, 450 souris d'une lignée transgénique conçue pour modéliser ce vieillissement vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un punch d'oreille qui les marque à vie, cinq semaines d'alimentation supplémentée par une substance qui altère la myélinisation du cerveau, puis une injection avant leur mise à mort. Les essais comportementaux dont le porteur tire son effectif de dix souris par groupe, par âge et par génotype, n'apparaissent pas dans la description des procédures. La pesée hebdomadaire tient lieu de seuil: si l'état général se dégrade ou si la perte de poids est jugée importante, les souris sont tuées.
Objectifs
Nos capacités de mémorisation et réparation du cerveau diminuent avec l’âge. Si les neurones sont à la base de l'organisation du cerveau, des études récentes ont aussi mis en évidence le rôle des cellules non-neuronales. Tout particulièrement, les cellules oligodendrogliales (qui myélinisent les neurones) semblent jouer un rôle essentiel dans le cerveau. Notre équipe a récemment développé une lignée de souris transgénique, qui modélise le vieillissement des cellules oligodendrogliales du cerveau. Dans ce projet, nous allons 1/ Décrire comment le vieillissement de cellules du cerveau limitent les capacités de réparation ; 2/ Décrire comment le vieillissement de cellules du cerveau limitent les capacités de mémorisation. Notre projet pourrait ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques intéressantes pour la maladie d’Alzheimer et les démences associées au vieillissement.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle des cellules oligodendrogliales dans le vieillissement, en particulier dans les capacités de mémorisation et réparation. À long terme : développer des stratégies pour rajeunir les cellules oligodendrogliales, pour favoriser les fonctions cognitives dans le vieillissement et les maladies liées à l'âge, comme dans la maladie d’Alzheimer. Le déclin de la cognition cérébrale représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.
Procédures
Les souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille. Les souris seront nourries avec de l’alimentation supplémentée (en continu, à volonté, pendant 5 semaines). Les souris seront injectées avec un analgésique et anesthétique, avant mises à mort (1 minute, une fois).
Impact sur les animaux
Le punch à l’oreille entrainera une douleur légère de courte durée et marquage permanent. L’administration de l’analgésique et de l’anesthésie entraînera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les cohortes expérimentales seront euthanasiées à la fin de l'étude, afin de corréler l'analyse comportementale par une analyse au niveau moléculaire et/ou cellulaire.
Remplacement
Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans les cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions et dysfonctionnements cognitifs au niveau de l'organisme. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, quand possible, nous exploitons des modèles cultures cellulaires, dont des lignées ou des cellules souches pluripotentes.
Réduction
Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 10 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux, chaque âge et génotype. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos cohortes seront donc composées de souris des deux sexes, à parité.
Raffinement
Sous le traitement alimentaire supplémenté, les animaux seront nourris avec des croquettes alimentaires complémentées avec une substance qui affecte la myélinisation du cerveau. L’alimentation, à volonté, sera changée tous les 2 jours. Les animaux seront pesés une fois par semaine. Nous avons défini des points limites et nous appliquerons une grille de score. Si l'état général de l’animal se dégrade ou si la perte de poids est importante, les souris seront mises à mort.
Choix des espèces
Les modèles de souris sont pertinents car ils nous permettent de faire des études comportementales, et d’adresser les changements de mémorisation et d’apprentissage. Les souris adultes seront utilisées à l'âge de 2 mois, 9 mois et 12 mois. Les différents âges nous permettent de comparer les souris jeunes, adultes, et âgées.
Etude du rôle de d’une protéine d’intérêt dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à quatre tests comportementaux d'une semaine chacun, entrecoupés d'une semaine de repos, 804 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent aussi une biopsie pour le génotypage et développent, à partir de quatre mois, les troubles cognitifs de leur lignée. Les tests censés mesurer leurs capacités mémorielles ne sont pas nommés, et l'objet du projet se limite à une "protéine d'intérêt" qui n'est pas davantage identifiée, dans un modèle de la maladie d'Alzheimer réparti sur deux établissements. Les souris qui ne portent pas le génotype recherché sont tuées faute d'usage, les autres avant huit mois, pour éviter les souffrances liées à un phénotype dommageable qui apparaît à douze mois et que la lignée a été construite pour porter.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle d'une protéine d'intérêt dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs notés EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux adultes seront soumis à quatres tests comportementaux qui durent chacun environ 1 semaines. Les animaux seront mis au repos pendant une semaine entre chaque test. Ces tests permettent de mesurer les capacités mémorielles des animaux et seront réalisés dans l'EU2. Les élevages se dérouleront dans l'EU1.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront développer une légère douleur lors des biopsies pour le génotypage et des effets indésirables au cours des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indésirables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Des effets indésirables liés aux troubles cognitifs se développant à partir de 4 mois peuvent aussi apparaitre.
Devenir
Les animaux sans génotypes d’intérêt pour le projet sont mis à mort. Les animaux ayant les bons génotypes seront mis à mort après les tests comportementaux, à l'age de 8 mois au plus tard, pour éviter les souffrances liées à leur phénotype dommageable exprimé à partir de 12 mois.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle d'une protéine inhibitrice de protéase dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Des tests statistiques précis permettront de s'assurer de la significativité des résultats et un calcul de puissance a permis de dimensionner les groupes expérimentaux.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Durant le transfert des animaux entre les deux EU, les animaux seront transportés dans des boites de transports du type safebox contenant litière et enrichissement, elles-mêmes placées dans des sacs opaques à la lumière pour limiter le stress des animaux.
Choix des espèces
Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie, tests comportementaux). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 mois seront utilisées. A cet âge, les souris ont des défauts cognitifs détectables par des tests comportementaux et qui seront eventuellement modulés par l'absence ou la surexpression de notre protéine d'intérêt.
Études thérapeutiques contre l’infection par Aspergillus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
9 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales et deux instillations intranasales sous anesthésie, par lesquelles Aspergillus fumigatus leur est inoculé après un traitement qui affaiblit leurs défenses immunitaires, l'infection provoquant poil hérissé, mobilité réduite et perte de poids. Dans la majorité des expériences, les souris sont tuées avant l'apparition des signes d'infection, et celles qui atteignent le score limite sont mises à mort. Le porteur justifie ce recours par le fait que l'effet des molécules à l'étude reste inconnu "à l'intérieur, dans la vie réelle", et qualifie l'expérimentation animale d'"indispensable".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont d'identifier les molécules (endogènes ou exogènes) qui peuvent améliorer l'issue de l'infection à Aspergillus. Il a été démontré que les facteurs humoraux de l'immunité innée sont importants dans l’élimination d'Aspergillus dans les poumons, et certains de ces facteurs disparaissent des poumons chez les patients infectés. L’un de ces facteurs, la protéine surfactante SP-D, a montré un potentiel thérapeutique dans le modèle pré-clinique d’aspergillose invasive pulmonaire (IPA) chez la souris, améliorant l’issue fatale sans toutefois offrir une protection totale. Dans ce projet nous allons combiner différentes approches incluant des molécules ayant un effet antifongique direct et des molécules importantes pour la réponse immunitaire mais qui sont absentes chez les patients immunodéprimés infectés, afin d’obtenir un maximum de protection. Le premier objectif de ce projet est de déterminer si les traitements à effet immunodépresseur pris par les personnes à risque d’Aspergillose affectent les molécules de l'hôte essentielles au contrôle des premiers stades de l'infection. En l’absence d’infection, nous comparerons donc les facteurs présents dans les poumons de souris recevant le traitement à effet immunodépresseurs à ceux de souris recevant la solution véhicule. Le deuxième objectif est d'évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle d'infection d'aspergillose invasive. La résistance à l’infection sera surveillée, et les marqueurs de résistance à l’infection (charge fongique, dommage des tissus, marqueurs immunologiques) seront mesurés dans les poumons. Toutes ces études ne peuvent être remplacées par des techniques in vitro et sont essentielles pour le développement de toute nouvelle thérapie ou application médicale.
Bénéfices attendus
Le projet identifiera les facteurs humoraux de l'immunité de l'hôte susceptibles d'être régulés différemment sous traitement à effet immunodépresseur, ce qui pourrait fournir des informations cruciales sur la reconstitution possible de ces facteurs humoraux en tant que stratégies thérapeutiques pour l'aspergillose pulmonaire. Le projet fournira également des résultats pré-cliniques de molécules antifongiques dans l'aspergillose pulmonaire.
Procédures
Certains animaux auront, selon les procédures : 2 injections intrapéritonéales par animal (moins de 10 secondes) 2 instillations intranasales par animal sous anesthésie (de 20 à 30 secondes)
Impact sur les animaux
Une nuisance légère de courte durée sans incidence significative sur le bien-être ou l’état général des animaux sera associée aux injections intrapéritonéales. Les dommages escomptés dans ces expériences sont liés à l’objectif visant à identifier les molécules (endogènes ou exogènes) qui peuvent améliorer l'issue de l'infection à Aspergillus. Aspergillus fumigatus sera inoculé aux souris et induira des signes cliniques d’infections (poil hérissé, mobilité réduite, perte de poids). Dans la majorité des expériences, les animaux seront mis à mort avant que les signes d’infections apparaissent.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous devrons prélever en fin de procédures certains organes vitaux pour analyse.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est indispensable, car bien que nous ayons étudié in vitro l’effet des molécules à potentiel thérapeutique chez l’homme, nous ne connaissons toujours pas comment elles fonctionnent « à l’intérieur », dans la vie réelle, ce qui est essentiel pour envisager des traitements thérapeutiques contre l’infection d’aspergillose invasive du poumon (IPA). De plus, comprendre les mécanismes « in vivo » nécessite l’utilisation de mammifères possédant un système immunitaire, une anatomie et une pathogenèse similaire à l’homme, excluant l’utilisation des invertébrés. En effet, ces derniers peuvent être utilisés dans certaines études d’infections systémiques, mais notre étude nécessite la présence de poumons et d’un système respiratoire, couplé au système vasculaire circulatoire, ainsi qu’un système immunitaire complexe. Enfin, le modèle mammifère pré-clinique d’IPA développé par la communauté scientifique mime l’IPA humaine, n’affectant les souris qu’après traitement à effet immunodépresseur . D’importance, les défenses immunitaires de la souris lors de l’Aspergillose sont proches de celles de l’homme et la maladie est très similaire à l’aspergillose invasive humaine. Ce modèle a d’ailleurs été utilisé pour les études de traitement contre l’IPA et nos résultats seront donc conformes et comparables aux autres études.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires à ce projet est évalué à 9680 sur 5 ans. Ce nombre a été déterminé après analyses statistiques préalables permettant de déterminer à partir de combien de sujets une mesure est exploitable scientifiquement, et ce dans le souci de n’utiliser que le strict nécessaire d’individus tout en récupérant le maximum d’information par animal. Lorsque la technique d’analyse des tissus le permet, nous combinons un même animal pour plusieurs analyses inflammatoires et infectieuses (l’analyse protéomique des réponses inflammatoires et de la charge fongique peuvent être effectue sur les mêmes poumons).
Raffinement
Le suivi des animaux, selon une liste de signes cliniques, permettra d’attribuer un score quantitatif du bien-être des animaux tel que décrit par la structure du bien-être animal. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort.
Choix des espèces
L’aspergillose expérimentale chez la souris reproduit la pathologie observée chez l’homme, avec un développement pulmonaire qui se produit exclusivement lorsque l’animal est immunodéprimé, comme c’est le cas après un traitement par un immunodépresseur transitoire. Ce modèle développé par la communauté scientifique et clinique étudiant A. fumigatus permets l’étude de traitement thérapeutique en phase pré-clinique. Les souris utilisées seront adultes, âgées de 7 à 11 semaines. Le choix de ce stade de développement permet d'avoir des souris dont le système immunitaire est complètement développé et dont les poumons ont atteint leur taille définitive.
Etude de l’effet de l’hypoxie intermittente sur un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
3 360 souris vont être utilisées, chacune passant cinq jours en hyperoxie puis quatre à dix jours en hypoxie intermittente, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certains souriceaux reçoivent dès huit jours de vie une injection dans l'œil sous anesthésie, et subissent jusqu'à cinq examens d'imagerie rétinienne également sous anesthésie, un régime alimentaire particulier pouvant durer quatre mois. Les bénéfices annoncés se limitent à mettre en évidence de "potentielles" cibles thérapeutiques contre la rétinopathie du prématuré, quand le porteur reconnaît que le retour à l'air ambiant est mal supporté et peut provoquer une détresse respiratoire. Les mères sont tuées dès la sortie du caisson pour cette raison, les souriceaux étant confiés à des femelles Swiss présentées comme de bonnes mères adoptantes avant d'être tués à leur tour pour les prélèvements.
Objectifs
La rétinopathie du prématuré (ROP) est un trouble oculaire potentiellement cécitant qui affecte les prématurés. Elle survient lorsque les vaisseaux sanguins de la rétine se développent anormalement. Chez les prématurés, les vaisseaux sanguins de la rétine ne sont pas complètement formés à la naissance et, par conséquent, ils peuvent être perturbés par des facteurs tels que l'oxygénothérapie et d'autres traitements médicaux L'hyperoxie fait référence à un état d'augmentation des niveaux d'oxygène ou à une concentration d'oxygène supérieure à la normale. L'hypoxie se caractérise par des niveaux d'oxygène réduits ou une concentration d'oxygène inférieure à la normale. La concentration normale d’oxygène dans l’air ambiant (normoxie) est de 20.9 pourcent. La rétinopathie désigne toute lésion de la rétine des yeux pouvant entraîner une déficience visuelle. La rétinopathie fait souvent référence à une maladie vasculaire rétinienne ou à des lésions de la rétine causées par un flux sanguin anormal. L'angiogenèse est le processus physiologique de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux sanguins préexistants. La néovascularisation fait référence à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, en particulier à une croissance anormale ou excessive des vaisseaux.
Bénéfices attendus
La rétinopathie du premature (ROP) est un trouble de la rétine qui peut entraîner une perte de vision importante chez les prématurés. La rétinopathie du prématuré est le résultat de perturbations du développement déclenchées par plusieurs facteurs, dont le niveau d'oxygénation. En France et en Europe, environ 30 pourcent des prématurés de moins de 31 semaines d'âge gestationnel développent une ROP. Le projet permettra de mieux comprendre pourquoi le risque de maladies rétiniennes sévères chez les individus prématurés est augmenté lorsqu’ils souffrent d'apnée du sommeil. Elle permettra de définir les mécanismes et les expressions géniques qui entrent en jeu. Cela permettra de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques chez l’Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des variations de concentrations d’oxygène (hyperoxie pendant 5 jours et hypoxie intermittente pendant 4 ou 10 jours). Certains recevront des injections intraoculaires (qui durent entre 2 et 3 minutes), une fois, sous anesthésie. Des tests d'imagerie rétinienne et fonctionnelle (5-10 min par test) seront réalisés sous anesthésie (2 ou 5 fois par animal, selon le groupe, avec un intervalle minimum d’une semaine). Certains animaux recevront un régime particulier pendant maximum 4 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une stabulation dans un environnement modifié (hyperoxie ou hypoxie). Le modèle d’hyperoxie peut induire chez les adultes une difficulté de réadaptation en conditions standard, ce qui peut provoquer une détresse respiratoire. Certains souriceaux subiront une injection intraoculaire. Dans de rare cas, cela peut induire une inflammation localisée de l’œil. L'anesthésie générale peut entrainer chez la souris une hypothermie avec un possible arrêt cardio-respiratoire. La contention légère de l'animal pour les injections intra péritonéales et les examens de l'œil peuvent entrainer un léger stress des animaux. Les injections intrapéritonéales entrainent également une douleur légère de courte durée liée à la piqure de l’aiguille. Le changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme, changement de régime alimentaire) peut aussi générer un léger stress chez ces derniers.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem sur les souriceaux, cela implique donc leur euthanasie. Les mères, ne pouvant être replacées, seront également euthanasiées.
Remplacement
Les études in vitro ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’oeil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.
Réduction
Pour cette étude nous utiliserons un total de 3360 souris. Nous devons répéter les expériences (5 expériences/groupe expérimental) en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables selon nos précédentes expériences (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 6 animaux défini par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet, selon nos expériences antérieures.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par portée dans des cages ventilées ou caissons d’expérimentation. Les cages comportent plusieurs cotons et une petite maisonnette pour pouvoir faire leur nid. Les animaux sont hébergés avec alimentation et abreuvement à volonté. Lors des expériences de d’hyperoxie et d’hypoxie, les animaux sont stabulés dans des cages ayant les mêmes dimensions qu’en stabulation normale, avec les mêmes enrichissements. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Suite à l’hyperoxie, le retour en condition de normoxie est mal supporté par les mères et peut induire une détresse respiratoire, afin d’éviter cela nous euthanasions les mères dès le retour en normoxie. Les souriceaux bénéficieront d’une mère adoptante swiss à la sortie du caisson. En effet, les souris Swiss sont connues pour être de bonnes mères adoptantes. Certains souriceaux subiront une injection intraoculaire sous anesthésie générale et anesthésie locale. L’animal est placé sur tapis chauffant durant l’anesthésie pour prévenir le risque d’hypothermie.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier les pathologies de la rétine. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence rétinienne sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développé le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène et l’hypoxie intermittente. Pour le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène, les animaux seront utilisés dès 8 jours de vie. En effet, chez la souris la vascularisation rétinienne se développe à la naissance jusqu’à 21 jours. Les variations d’oxygénation déclenchent une néovascularisation que pendant la vasculogenèse rétinienne qui a lieu les 3 premières semaines de vie de la souris. L’hyperoxygénation entre 8 et 13 jours de vie entraine une perte des vaisseaux. Au retour en normoxie à 13 jours l’hypoxie relative mène à une néovascularisation pathologique.
Étude de l’effet des molécules pro-coagulantes dans des modèles murins de maladie hémorragiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
776 souris porteuses de maladies hémorragiques familiales vont être utilisées, 429 d'entre elles opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 347 autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le test de saignement consiste en une incision suivie de trente minutes d'observation sous anesthésie, certaines souris recevant d'abord une biopsie de l'oreille puis trois injections rapprochées sur trois semaines. L'objectif déclaré est d'établir la preuve de concept de molécules pro-coagulantes déjà développées pour les patients hémophiles, les essais cliniques restant renvoyés au long terme. Le porteur justifie les actes finaux sans réveil par la collecte de quantités de sang qu'il qualifie d'"indispensables", et affirme que la coagulation "nécessite absolument un organisme vivant entier" pour être reproduite.
Objectifs
Les maladies hémorragiques familiales autre que l’hémophilie (maladie de Willebrand ou de Stuart Prower) restent assez méconnues. Ces maladies empêchent l’arrêt des saignements. En fonction des différents anomalies génétiques, les patients ont des formes plus ou moins sévères. Les traitements disponibles sont lourds et pas toujours efficaces. Récemment, des molécules pro-coagulantes avec différents mécanismes d’action sont été développées pour les patients hémophiles (une autre maladie hémorragique) avec des résultats prometteurs. Notre projet va consister à tester l’efficacité de ces nouvelles molécules médicamenteuses dans des modèles murins de ces maladies en utilisant des tests de saignement bien standardisés.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de cette étude doivent permettre d'établir la preuve de concept de l'efficacité d’une ou plusieurs molécules dans des maladies hémorragiques autres que l’hémophilie. A long terme, ce projet pourra servir de base pour la mise en place d'essais cliniques visant à déployer les molécules identifiées comme efficaces chez les patients.
Procédures
Un groupe de souris reçoit une anesthésie, une administration rapide (3-5 seconds) de médicament, un test de saignement (30 minutes) et sont ensuite euthanasiées par les méthodes réglementaires. Les administrations (3-5 seconds) des médicaments se font selon différents protocoles, soit par une seule injection, soit par deux injections (a deux semaines d’intervalle). Les tests de saignement effectués toujours sous anesthésie consistent en une petite incision (2-4 seconds), puis les souris sont observées pour 30 minutes maximum. Un groupe des souris reçoit une biopsie une anesthésie, un prélèvement (rapide- moins de 5 seconds) et sont euthanasiées. Une biopsie a l’oreille rapide (
Impact sur les animaux
Stress léger lors de la préhension des animaux. Douleur légère et transitoire après les injections intrapéritonéales et sous-cutanées et après les prélèvements du sang et biopsies.
Devenir
Les actes expérimentaux finaux sont sans réveil du fait de la collecte de quantités importantes de sang, indispensables pour nos recherches scientifiques.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Afin de déterminer le plus petit nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse mathématique de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience en utilisant ces modèles en prenant en compte les variabilités de chaque test.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. Les animaux ne sont jamais seuls dans les cages d’hébergement et ils ont un accès libre à la nourriture et à l'eau. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et l'acte expérimental aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les souris sont sous observation quotidienne (une fois pendant le weekend) et la quantification des points limites, susceptibles d'entraîner une procédure d’euthanasie immédiate de l'animal, sont strictement appliquée.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins des maladies hémorragiques familiales déjà développés. Ces modèles ont d’ores et déjà montré leur pertinence en tant que modèles des pathologies humaines, sans pourtant que ces souris manifestent des saignements spontanées. Les souris adultes, entre 8 et 20 semaines d’âge, des deux sexes seront utilisées.
Évaluation de nouvelles thérapies dans le domaine des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 1750
Pesées jusqu'à cinquante-deux fois, colite déclenchée par une administration intrarectale sous anesthésie, puis gavage jusqu'à trois fois par jour pendant cinquante-deux jours: 8 750 souris et 1 750 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 3 150 d'entre eux en gravité sévère. S'y ajoutent une coloscopie hebdomadaire jusqu'à huit fois par animal avec prélèvement de micro-biopsies, des prises de sang rétro-orbitales et des mises à jeun de douze à vingt-quatre heures. Les modèles de colite provoquent perte de poids, diarrhées et présence de sang dans les fèces, une perte de poids supérieure à 20 % en 24 heures justifiant selon le porteur une mise à mort immédiate. Tous ces animaux sont tués à l'issue, le prélèvement de tissus et l'examen de leur système immunitaire servant à fixer les doses qui seront ensuite administrées à des patients en essai clinique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements sur des modèles d’inflammation chronique de l’intestin chez le rongeur. Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (ou MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Toutes deux se caractérisent par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire intestinal. Cette inflammation incontrôlée est responsable de lésions tissulaires et de la chronicité de la maladie. Son origine semble résulter de la combinaison complexe de facteurs environnementaux, associés à une susceptibilité génétique du patient et à la réactivité particulière de son système immunitaire, et au microbiote. Les traitements actuels sont peu nombreux et sont dans 70% des cas inefficaces. Les cycles récurrents d’inflammation peuvent conduire à des complications : sténose, fistules, perforations entrainant une urgence chirurgicale. Les MICIs sont également associés à un risque accru de cancer colorectal. Les informations qui seront générées par le biais de ces études seront utilisées pour préparer les phases précliniques et cliniques du développement pharmaceutique de ces nouveaux traitements. Ces informations comprennent entre autres : • Dose minimale produisant un effet thérapeutique • Dose minimale pour lequel l’effet thérapeutique est le plus élevé. • Déterminant pharmacocinétique qui conduit à l’efficacité thérapeutique • Régime de doses pour les études toxicologiques exploratoires et règlementaires. • Régime de doses pour les essais cliniques chez le volontaire sain, puis chez le patient.
Bénéfices attendus
La colite ulcérative et la maladie de Crohn sont contrôlées à l’aide de médicaments immunosuppresseurs et antiinflammatoires (acide 5-aminosalicylique) qui atténuent l’inflammation intestinale. Ces traitements peuvent durer plusieurs mois, voire plusieurs années. Les traitements biologiques prescrits en deuxième intention sont très coûteux et peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d’efficacité due à la production d’anticorps neutralisants par le patient. De nombreux patients sont également réfractaires à ces traitements. Les études qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes dont des thérapies cellulaires et des fécalothérapies. A court terme, elles permettront de confirmer l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les MICIs. A plus long terme, ces études constitueront la base pour un traitement applicable à l'homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients dans les essais cliniques.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. - Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour soit jusqu’à 52 fois par animal. - Administration d’agent inducteur d’une inflammation intestinale, 3 possibilités : par voie intrarectale : 30 secondes sous anesthésie gazeuse, une fois par animal. Avec ou sans présensibilisation par voie cutanée : 15 secondes sur animal vigile, une fois par animal. par voie intraveineuse : 30 secondes sous anesthésie, une fois par animal. par voie intrapéritonéale : 10 secondes sur animal vigile. - Prélèvement de sang par voie retro-orbitale : 30 secondes, sous anesthésie générale , 1 fois par œil et par animal. Le prélèvement retro-orbital sera utilisé, seulement dans le cas où un volume plus large et un prélèvement rapide est nécessaire. Prélèvements de sang via la veine caudale : 30 secondes, sur animal vigile ou anesthésié. • Prélèvements de sang terminaux par ponction cardiaque ou veine abdominale : 30 secondes, sous anesthésie générale profonde. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique: voie selon le composé : o Par voie orale à l’aide d’une sonde gastrique : 10 secondes sur animal vigile, jusqu’à 3 fois par jour, max 52 jours. o Par voie intrapéritonéale : 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, jusqu’à 7 jours, 7 fois max par animal. o Sous-cutanée : 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, 52 jours max. o Par voie intraveineuse retro-orbitale : 30 secondes, sous anesthésie générale, Une fois par œil et par animal. o Par voie intraveineuse via veine caudale : 30 secondes, sur animal vigile ou anesthésié, Une fois par semaine pendant 8 semaines. Pour certaines procédures seulement :•Coloscopie (proc.1): 15 minutes sur animal anesthésié, une fois par semaine soit jusqu’à 8 fois par animal. Prélèvement de 2 micro-biopsies 2 fois par animal max.• Test de perméabilité intestinale/administration de dextran par voie orale : 10 secondes sur animal vigile, une fois toute les 2 semaines soit 4 fois par animal; •Mise à jeun pour l’induction de l’inflammation intestinale (proc.2). Durée 12 à 24 heures, une fois par animal. •Mise à jeun pour le test de perméabilité intestinale (proc. 1). Durée 4 heures, une fois toutes les 2 semaines soit 4 fois par animal.
Impact sur les animaux
Ces procédures induiront chez l’animal des nuisances modérées à sévères : pesée quotidienne (30s), injection de cellules (30s), administration de traitement par gavage ou injection (i.p., i.v., s.c.) (15 à 30s) pendant plusieurs jours ainsi qu’une préhension accompagnant ces administrations (1 min). De plus, les animaux seront également soumis à des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent générer également des nuisances (30 à 60s). Des microéchantillons de sang pourront également être prélevés sur animaux vigiles (30s). Une mise à jeun de 4h, pendant le cycle diurne, pourrait être réalisée pour une étude perméabilité intestinale (4h par étude). Une mise à jeun de 12 à 24 heures, pourrait être réalisée pour induire le modèle TNBS selon la procédure numéro 2. Les effets indésirables attendus des modèles de colite sont une perte de poids, des diarrhées, la présence de sang au niveau des fèces et/ou du rectum. Une piloérection, une réduction de la mobilité et une perte de poids > à 20% en 24h ou 30% depuis le jour 0 justifieraient une mise à mort immédiate.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. L’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différents tissus et du système immunitaire
Remplacement
Il existe des modèles ex-vivo d’organoïdes intestinaux permettant un premier criblage pour évaluer l’efficacité des composés permettant de limiter le recours à l’animal dans les premières phases de développement. Cependant, ce système dépourvu d’autres organes et de structures immunologiques clés (ganglions mésentérique, rate, système lymphatique, hépatique, rénale et circulatoire) ne peut pas à ce jour constituer un environnement fiable pour prédire la pharmacologie in vivo. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des entités à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes impliquant entre autres la migration de cellules immunitaires vers l’intestin. Cependant, des tests in vitro et in silico qui permettent de prédire les profiles pharmacocinétiques et les interactions avec la cible moléculaire d’intérêt seront utilisés en amont des études de ce projet. Ceci permettra de limiter le recours à l’animal.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évaluées de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent par exemple de prédire le profil pharmacocinétique d’un composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. Ainsi, les tests sur animaux sont réduits au minimum nécessaire. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux exigences règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront hébergés en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement afin favoriser un comportement naturel (nidification, instinct grégaire, recherche de nourriture...). Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des études en utilisant exclusivement des techniques non-aversives (ex : prélèvement de l’animal de sa cage avec l’aide d’un tunnel). Les procédures potentiellement douloureuses ou sources d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique a minima journalière sur la durée des procédures. Les locaux et systèmes d'hébergement suivront un programme de contrôle d’hygiène et sanitaire afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adapté sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet, par ou sous l'autorité du vétérinaire. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car le stress lié à la manipulation non seulement affecte le bien être mais peu aussi impacter la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris. De nombreuses données sur les modèles de MICIs chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour l’avancement des projets. Adulte : Les données de la littérature indiquent que les rats (min. 5 semaines) et les souris (min. 7 semaines) adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine des MICIs car ils disposent d'un système immunitaire mature
Elevage et maintien de souris et de rats variants et transgéniques à des fins de recherche biomédicale à visée thérapeutique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Rats : 6500
25 600 souris et 6 500 rats vont être produits et génotypés sur la durée du projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une seule intervention, un prélèvement de queue ou d'oreille sur animal éveillé accompagné d'un tatouage des phalanges, moins de cinq minutes en tout. Les animaux issus de ces quinze lignées génétiquement altérées, treize de souris et deux de rats, sont destinés à d'autres projets sur les dystrophies musculaires, puis tués, gardés pour la reproduction ou transférés vers une utilisation continue. Le porteur indique développer en parallèle des muscles artificiels dérivés de cellules de patients, tout en qualifiant les expériences prévues d'"absolument indispensables".
Objectifs
Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux. Ce projet permettra l’élevage de 13 souches de souris et de 2 souches de rats génétiquement altérées nécessaires à la mise en oeuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie des maladies étudiées et de trouver des approches thérapeutiques innovantes pour des dystrophies musculaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour un groupe de maladies humaines sur des modèles de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie, et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour (maladies orphelines de traitement).
Procédures
Les prélèvements de tissus (queue et/ou oreille) se font sur animaux vigiles. Cet acte se fait en même temps que le tatouage des phalanges et n’est pratiqué qu’une seule fois. Au total, moins de 5 minutes sont nécessaires pour réaliser tous les actes. En effet, les prélèvements de tissus se font en moins d'une minute, mais les instruments sont nettoyés entre chaque animaux ce qui augmente un peu le temps total. Les tatouages se font également en quelques minutes. Pour une durée total (néttoyage compris) n'excédant pas 5 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu (queue ou oreille) sur jeunes animaux vigiles. La contention d’animaux jeunes peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures.
Devenir
Euthanasie des animaux ou gardé en vie pour la reproduction ou une utilisation continue.
Remplacement
Un effort de remplacement est réalisé en amont et en parallèle de ce projet. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions scientifiques dans des modèles cellulaires et nous développons des muscles artificiels dérivés notamment de cellule de patient. L’utilisation d’animaux dans des études scientifiques ne se fait que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions. Par exemple quand il est nécessaire d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des dystrophies musculaires. Enfin, dans le but de diminuer le nombre d’animaux à produire, certaines de nos lignées ayant le même fond génétique, les animaux contrôle peuvent être utilisés comme contrôles pour plusieurs lignées.
Réduction
Nous avons prévu d’utiliser un total de 25600 souris et 6500 rats pour fournir les animaux nécessaires à l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues.
Raffinement
Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. En cas d’observation de la moindre douleur, définit par des points limites stricts en fonction des procédures, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi, ils sont observés quotidiennement pendant les jours ouvrés. Les souris et rats étant des animaux sociaux, aucun animal n’est seul dans une cage, sauf si problème d’agressivité.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris et rat car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur ces espèces. Pour évaluer les effets des fortes doses, nous utiliserons l’espèce rat car elle est plus sensible au niveau cardiaque, ce qui nous permet d’avoir une meilleure sensibilité de l’expérience. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Après le sevrage, les animaux présentent une taille de muscle et des conditions physiques suffisantes pour évaluer les fonctions musculaire ou cardiaque et présentent déjà des signes histologiques pour les modèles pathologiques les plus sévères.