Procédures légères

Tester si un mélange d'acides aminés vendu par une entreprise améliore la croissance des truites d'élevage : 1 600 truites arc-en-ciel juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont pêchées à l'épuisette six fois puis anesthésiées pour la pesée, et 384 d'entre elles subissent une prise de sang avant d'être tuées dans la foulée. Pendant les 28 derniers jours, les 1 344 poissons restants passent quatre heures par jour dans une eau chauffée de 19 à 21 °C et appauvrie en oxygène, un stress d'élevage estival reproduit à dessein. Le porteur indique que ce mélange est déjà commercialisé pour l'alimentation animale et que son usage en salmoniculture pourrait augmenter avec les chaleurs estivales.

Objectifs

Les acides aminés sont des molécules organiques aux multiples rôles, constituants des protéines et polypeptides, indispensables au bon fonctionnement du vivant. Certains de ces acides aminés ne sont pas synthétisés par les organismes vivants et doivent donc être apportés par l’alimentation. Ces dernières années, en élevage, il est devenu courant d’enrichir l’aliment des animaux avec différentes sources d’acides aminés (issus de fermentation bactérienne, d’extraction chimique ou de synthèse de novo), afin d’obtenir un profil nutritionnel optimal. Cette pratique s’est également développée dans les élevages aquacoles, mettant souvent en évidence une amélioration des performances de croissance et de l’état de santé globale des animaux. Cependant, les différents essais sur le sujet ont mis en évidence que l’effet d’une supplémentation en acides aminés pouvait varier d’une espèce de poissons à l’autre. L’entreprise souhaitant mener cette étude, spécialiste de l’extraction d’acides aminés libres, mène depuis plusieurs années des essais sur le sujet qui ont déjà permis de mettre en évidence des améliorations notables pour l’élevage de plusieurs espèces tropicales d’importance comme le tilapia, le barramundi et la crevette à pattes blanches. Elle souhaite à présent étudier l’effet de son mélange d’acides aminés sur une espèce de poisson d’eau froide importante en aquaculture, la truite arc-en-ciel. Cet essai vise 1) à étudier les effets d’une supplémentation en acides aminés sur les performances de croissance de la truite arc-en-ciel et certains de ses paramètres sanguins, et 2) à voir si les effets d’une supplémentation permettent à la truite de mieux résister à des conditions d’élevage stressantes rencontrées en période estivale (température élevée associée à une baisse de l’oxygène dissous).

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu de ce projet est qu’au moins une des doses d’acides aminés incorporées à l’aliment améliore la croissance et/ou la résistance au stress thermique et hypoxique, mettant ainsi en évidence un intérêt pour l’élevage de la truite en conditions stressantes ou non. Ces bénéfices pour l’alimentation piscicole seraient à court ou moyen terme (quelques années), car ce mélange d’acides aminés est déjà commercialisé pour l’alimentation animale. Et si une meilleure résistance des truites à des conditions d’élevage parfois rencontrées l’été était avérée, l’utilisation de ce produit en salmoniculture pourrait rapidement augmenter avec l’augmentation des chaleurs estivales de plus en plus intenses et prolongées.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 types d'interventions : la pêche à l'épuisette et la prise de sang. La pêche à l’épuisette, d’une durée inférieure à la minute, sera réalisée 6 fois sur l'ensemble des poissons présents dans les bassins (transfert dans bac d'anesthésiant avant poids moyens), soit 1600 poissons après 2 semaines, 1536 poissons après 4 semaines, 1472 poissons après 6 semaines, 1408 poissons après 8 semaines, 1344 poissons après 10 semaines, et 1280 poissons après 12 semaines. La prise de sang, d'une durée inférieure à la minute, sera réalisée 1 fois sur 16 poissons par lot (4 par bassin) à la suite du poids moyen, toutes les 2 semaines. Les poissons dont le sang aura été prélevé seront immédiatement mis à mort ensuite.

Impact sur les animaux

Un stress leger d’1 minute sera engendré sur l’ensemble des 1600 poissons de ce projet lors des pêches nécessaires à la réalisation des poids moyens et des prises de sang, réalisées toutes les 2 semaines. Les poissons utilisés pour la réalisation des prises de sang (4 poissons par bac et par prélèvement, soit 384 poissons) subiront une fois chacun, un stress léger supplémentaire d’1 minute. A l’issu des 56 jours (8 semaines) d’alimentation expérimentale, les 1344 poissons encore en essai seront soumis quotidiennement et pendant 28 jours à un stress modéré. Il consistera en une augmentation de la température (19 à 21°C) associée à une baisse en dioxygène dissous (7 à 5 mg/L), pendant 4h chaque jour. Ce stress pourra se traduire par une diminution de l’activité de nage des poissons. L’ensemble de ces nuisances est considéré comme modéré en raison de la courte durée des manipulations et de la durée quotidienne du stress thermique et hypoxique (4h).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour la réalisation de différentes mesures et analyses (taille-poids individuel, prélèvement de tissus).

Remplacement

Il n’existe pas à notre connaissance d’expérimentations déjà décrites dont le but est de montrer l’intérêt de ce mélange d’acides aminés sur une espèce de salmonidés. L’objectif de ce projet étant de démontrer que ce produit amène des atouts supérieurs en termes de nutrition et de résistance à un stress thermique et hypoxique en comparaison d’un aliment non supplémenté en acides aminés, il n’est pas possible d’en faire abstraction. Pour ce type d’approche, il n’existe pas aujourd’hui de méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

Il a été choisi en amont de ce test de réaliser 4 réplicas de bac par régime alimentaire. Ce nombre de répétitions est un bon compromis entre le travail à fournir pour la réalisation de l’étude (en termes de prélèvements, de matériel, de maintiens des animaux) et la puissance statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives. Il a également été décidé de n’intégrer à cette étude, que 100 poissons par bac, permettant d’assurer un comportement normal de truites en élevage et la croissance associée, et un nombre d’animaux suffisant aux analyses post-mortem (24 par bac). Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum, en tenant compte de la densité d’élevage des poissons (entre 10 et 15 kg/m3 en fin d’essai) pour obtenir un optimum pour le bien-être des animaux, sans nuire aux besoins analytiques. Les données issues de cette étude seront étudiées paramètre par paramètre et feront l'objet d'analyses statistiques.

Raffinement

La procédure expérimentale a été conçue pour minimiser les dommages causés aux animaux. Les pêches de poissons seront réalisées avec des équipements adaptés ne risquant pas de blesser les poissons, et les pêches de l’ensemble des poissons de chaque bac se fera par groupe de 15-20 poissons afin de minimiser autant que possible la compression au sein de l’épuisette, tout en limitant le nombre de pêches au sein d’un même bassin. Des tables de suivi de soins et de bien-être des animaux ont été mises en place lors de la réalisation des procédures.

Choix des espèces

L’espèce truite arc-en-ciel a été choisie comme modèle d’étude car il s’agit d’un poisson d’élevage carnivore d’importance économique en France et dans le monde. De plus, les résultats d’essais obtenus sur cette espèce pourrait être transposés au saumon Atlantique, qui appartient à la même famille et est l’un des poissons d’élevage les plus produits au monde, avec 2,7 millions de tonnes produites en 2020. Les animaux utilisés seront des juvéniles de truites arc-en-ciel de 10 g en début d’essai. La croissance et le métabolisme très rapides de poissons de cette taille permettent d’optimiser le temps nécessaire au suivi, et ainsi mettre en évidence un éventuel effet de la dose d’acides aminés testés. Cette taille initiale permet également de réaliser des prélèvements sanguins d’un volume suffisant pour la réalisation des analyses prévues dans cette étude.

Toutes les souris utilisées ici portent une mutation qui supprime la protéine RSK2 et reproduit le syndrome de Coffin-Lowry, avec ses retards d'apprentissage et ses déficits de mémoire. 586 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Biopsie de la queue vers sept jours, injections intrapéritonéales de marqueurs de neurogenèse, open-field, rotarod, puis piscine de Morris pendant sept jours à raison de huit essais quotidiens d'une minute de nage, un protocole que le porteur ramène à un stress léger limité aux premières minutes. Soixante reproductrices seront réutilisées pour des travaux pratiques, les autres tuées pour analyser leur cerveau.

Objectifs

Le projet consistera à étudier le développement de certaines structures cérébrales importantes pour la cognition chez une souris modèle du syndrome de Coffin-Lowry. Les patients atteints de ce syndrome présentent une sévère déficience intellectuelle associée à des retards psychomoteurs qui se mettent en place au cours de l’enfance. Selon des études génétiques, cette pathologie est due à des mutations d’un gène qui conduisent notamment à l’absence d’une protéine appelée RSK2. Pour mieux comprendre les altérations qui se mettent en place lors du développement du cerveau en l’absence de RSK2, nous utilisons des souris modèle du syndrome de Coffin-Lowry qui n’expriment pas RSK2. Au cours des projets précédents, nous avons montré que ces souris modèles présentent de nombreuses altérations comportementales et cognitives comme des retards d’apprentissage et des problèmes de mémoire. Ceci est en accord avec les signes cliniques observés chez les patients. Pour ce projet, nous souhaitons désormais étudier le développement de certaines structures cérébrales qui sont impliquées dans les altérations comportementales et cognitives identifiées chez la souris modèle. Ces structures cérébrales continuent de se développer après la naissance, au moment où apparaissent les problèmes comportementaux et cognitifs. Ainsi, nous étudierons chez la souris modèle, les altérations cellulaires et moléculaires qui impactent le développement de ces structures cérébrales au cours de la période postnatale. De plus, nous envisageons désormais de mettre en place des stratégies thérapeutiques afin de corriger au plus tôt ces altérations dans le but de compenser, voire d’éviter la mise en place des problèmes cognitifs chez la souris. Nous testerons notamment si un enrichissement comportemental partiel (3h/jour pendant 3 semaines) dès le plus jeune âge peut être bénéfique pour restaurer le retard de développement du cerveau et restaurer les fonctions cognitives à long terme.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous comprendrons mieux le rôle de la protéine RSK2 dans le développement cérébral et dans les fonctions cognitives. Nous comprendrons notamment pourquoi, en l'absence de RSK2, le développement du cerveau est retardé au cours de la période postnatale, et analyserons plus particulierement le développement postnatal de deux strucutures cérébrales qui sont impactées dans le syndrome de Coffin-Lowry et qui poursuivent leur développement apès la naissance. De plus, pour la première fois, nous testerons une stratégie thérapeutique (enrichissement comportemental) qui devrait permettre de compenser les déficits cognitifs au plus tôt, ou d'éviter leur mise en place. Le modèle animal nous permettra de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.

Procédures

Pour être génotypés, tous les animaux subiront une biopsie de la queue vers l'âge de 7 jours. Pour le projet, une partie des animaux recevra des injections de marqueurs de neurogenèse. Pour chaque injection, l'animal est maintenu en contention pour effectuer la piqure en intrapéritonéale (durée max 10 secondes). Apres différents délais, ces souris seront euthanasiées afin d'analyser leurs cerveaux. Les prélevements de cerveaux sont réalisés post mortem. Une autre partie des animaux effectuera en plus des tâches comportementales. La locomotion et l’exploration sera évaluée en open-field (duree 20 minutes) et la coordination motrice en rotarod (6 essais sur 3 jours de 3 minutes maximum), ce qui ne génére aucune nuissance. La mémoire spatiale sera évaluée avec le test de la piscine de Morris qui génère un leger stress en début de protocole. Le protocole a une durée de 7 jours, à raison de 8 essais par jour (2 blocs de 4 essais successifs). Chaque essai comprend 1 minute de nage et 1 minute de repos sur une plateforme.

Impact sur les animaux

Pour les génotypages, une douleur légère de courte durée peut être ressentie lors de la biopsie de la queue. Les injections qui nécessitent de prendre l’animal en contention peut générer un stress ponctuel de quelques minutes. Lors des tests de comportement, les souris pourraient ressentir un leger stress pendant les premières minutes.

Devenir

Pour la procédure 1, certains reproducteurs pourront être utilisés pour participer à des études comportementales en travaux pratiques. Il s’agit de tests d'exploration, locomotion, d’apprentissage et de mémoire qui n’engendrent aucun stress chez l’animal et reposent sur les comportements spontanés (eg., openfield, exploration d’objets). Les souris des procédures 2, 3 et 4 seront euthanasiées pour étudier leur cerveau.

Remplacement

Notre problématique de recherche consiste à comprendre les altérations du developpement cerébral impliquées dans la déficience intellectuelle (retard d’apprentissage, déficits de mémoire). Bien que certains mécanismes pourraient être décrits sur des cultures neuronales, il est ensuite absolument nécessaire de valider le rôle des protéines dans le développement cérébral et dans les processus cognitifs chez un animal vivant qui se comporte dans différentes tâches comportementales, d'apprentissage et de mémoire.

Réduction

Le nombre d’animaux correspond aux effectifs nécessaires pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Sur la base des études publiées et de notre expérience, 6-8 souris (analyse de la neurogenèse) à 8-15 souris par groupe (comportement) sont nécessaires. Des tests de puissance seront effectués au cours de nos analyses (à partir de n=5), afin de détecter si des comparaisons suffisamment fiables sont dejà atteintes sans avoir à aller, pour chaque expérience, jusqu'à l'effectif maximum envisagé (c'est à dire 8 souris dans chaque lot).

Raffinement

Limiter la souffrance des animaux, s’assurer de leur bien-être et de leur santé, fait partie de nos préoccupations majeures et conditionne véritablement le bon déroulement de nos études. En effet, nos études comportementales doivent, pour les animaux, impérativement s’effectuer en l’absence de stress, anxiété et douleur afin d’être viables. Ainsi, avant de les soumettre à des tâches d’apprentissage, l’expérimentateur manipule les souris pour limiter stress et anxiété et pour les habituer à sa présence. La mise en place de points limites permettra de réduire de potentielles souffrances. Pour cela une grille d'évaluation sera utilisée.

Choix des espèces

Il n’y a pas d’autre modèle animal présentant des mutations équivalentes dans le gène ciblé pour ce projet. Le modèle murin inclus dans notre projet est déjà élevé au laboratoire et permettra de mener de manière rigoureuse notre étude. Les études passées ont montré que ces souris sont des modèles reproduisant des déficits cognitifs associés à la pathologie humaine (retard d’apprentissage, déficit de mémoire). Afin d’étudier le développement cérébral et notamment la formation des neurones qui continuent de se mettre en place au cours des premières semaines après la naissance, toutes les souris utilisées seront âgées de 0 à 60 jours. Il sera nécessaire également d’utiliser quelques embryons pour suivre la mise en place de certaines structures cérébrales qui s’installent au cours de la période embryonnaire. Des analyses de comportement seront également effectuées à l'âge adulte (vers 60 jours) afin de vérifier les effets bénéfiques de nos enrichissements environnementaux sur les fonctions cognitives à long -terme.

Une partie des rats de ce projet porte la mutation du gène DMD, qui prive les muscles de dystrophine et cause dans la maladie de Duchenne une atrophie progressive des muscles et une atteinte du cœur. 368 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever tissus et fluides, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent un prélèvement au bout de la queue, des prises de sang, trois anesthésies générales, des mesures de la force musculaire, de l'activité électrique du cœur et des muscles, des fonctions cardiaque et respiratoire, et les rats traités reçoivent sans anesthésie une injection intraveineuse unique de thérapie génique. Le porteur conclut que toutes "les nuisances possibles sont localisées et réversibles", et écrit à propos de cette maladie que "les muscles et le cœur perdent progressivement leurs fonctions".

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire récessive liée au chromosome X et elle est causée par des mutations du gène DMD qui entraînent la perte de la protéine dystrophine, une protéine essentielle à la santé et au fonctionnement des muscles. Cette mutation affecte les muscles et provoque leur atrophie progressive causant une perte progressive de la fonction motrice avec, à terme, la perte de la capacité de marcher, puis une insuffisance respiratoire et une cardiomyopathie. La dystrophie musculaire de Duchenne se manifeste dès les premières années de la vie et malheureusement il n'existe pas encore de traitement curatif. La thérapie génique est en cours d’études pour re-établir l’expression de la protéine dystrophine dans les muscles et traiter la maladie. Il existe très peu de modèles animaux de la maladie Duchenne qui manifestent tous les symptômes de la maladie et sur lesquelles les études d’efficacité peuvent être amené. Le modèle de souris reproduit bien la pathologie au niveau des muscles squelettiques, mais seul le modèle de rats présente un déficit cardiaque représentatif de la pathologie. Pour cela nous envisagions la création d’une lignée de rat DMD pour déterminer les anomalies fonctionnelles au niveau des muscles du cœur et le biomarquers sanguing. L’étude de ce modèle au cours du temps nous permettra de mieux comprendre les processus pathologiques afin d’envisager les stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

La caractérisation du modèle rat DMD nous permettra de déterminer la fenêtre optimale pour le traitement par thérapie génique dans la phase suivante. A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les rats DMD devraient permettre d’exprimer la protéine dystrophine au niveau des muscles squelettiques et cardiaques, ce qui devrait entrainer une amélioration du phenotype dystrophique. Ce projet de développement non clinique permettra de comparer la dose minimale efficace de deux terapie genique afin d'envisager, dans un second temps, une application clinique pour le traitement de la DMD par la thérapie génique chez les patients.

Procédures

Afin d’identifier le fond génétique de l’animal, un prélèvement d’un bout de queue sera réalisé sur chaque animal. En cas de doute sur l’échantillon, un deuxième prélèvement sera réalisé à l’oreille au cas par cas. Chacun de ces gestes ne durera en moyenne pas plus d’une minute. Les molécules thérapeutiques (virus non pathogènes transportant le médicament) seront délivrées par une injection intraveineuse unique sur rat éveillé (durée moyenne 2 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés au cours du temps sur rat éveillé (durée moyenne 2 minutes) ou anesthésié (10 minutes maximum avec l’anesthésie). Les rats seront soumis à des tests permettant de mesurer la fonction de différents organes : mesure de la force musculaire (durée moyenne 1 heure), mesure de l’activité électrique du cœur (durée moyenne 30 min), mesure de l’activité électrique du muscle (durée moyenne 15 min), mesure de la fonction cardiaque (durée moyenne 20 min), mesure de la fonction respiratoire (durée moyenne 30 min), mesure d’activité et de mobilité et mesure de composition corporelle (durée moyenne 15min). Certains de ces tests nécessitent une anesthésie ou un traitement antidouleur préalable : pour réaliser l’ensemble des tests, les rats recevront trois anesthésies générales par voie aérienne, une injection d’un traitement antidouleur et une injection d’une molécule anesthésique avant l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention, ce qui pourrait entrainer un stress. Certains actes d’évaluation de la fonction des organes seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un bout de queue ou d’oreille, des injections du traitement thérapeutique, des injections de molécules anesthésiques ou antidouleurs, ainsi qu’au moment des prélèvements de sang. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire. Une sécheresse oculaire pourrait être observée au cours des anesthésies gazeuses. Des irritations de la peau pourraient être observées à l’endroit de l’épilation nécessaire pour la mesure de la fonction cardiaque. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements et analyses des tissus et des fluides.

Remplacement

La maladie de Duchenne est causée par l’absence d’une protéine appelée la dystrophine : les muscles et le cœur perdent progressivement leurs fonctions. Le projet consiste à mesurer l'effet d’un médicament composé d’un virus non pathogène transportant la dystrophine au sein des cellules cardiaques et musculaires malades : ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du médicament entre les différents organes. De plus, l’utilisation de virus transporteurs de notre médicament entraine une réaction de défense immunitaire de l’organisme contre les virus, réaction impossible à recréer en laboratoire à ce jour. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.

Réduction

Le nombre de rats utilisés dans ce projet a été réduit grâce à :1) le calcul par des tests statistiques des effectifs minimaux mais adéquats permettant une analyse fiable et une exploitation garantie des résultats (groupes de 10 ou 11 rats selon les procédures) ; 2) l’analyse d’un maximum de paramètres chez chaque animal (plusieurs dizaines) ; 3) l’obtention des rats non malades et malades en utilisant les mêmes croisements parentaux et 4) un suivi quotidien, des règles strictes de raffinement et le respect des points limites permettant de garantir le bien-être animal et l’exploitation de toutes les données produites.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation avant certains tests visant à mesurer le fonctionnement des muscles. Lors de certains de ces tests, il y a un risque exceptionnel de blessures aux griffes : dans ce cas, un traitement avec un désinfectant sera appliqué jusqu’à la guérison. Afin de contrôler la douleur et le stress de l’animal, certains tests seront réalisés sous anesthésie gazeuse ou sous anesthésie générale et un antidouleur sera administré avant et pendant les 48 heures qui suivront la fin des tests. Dans le cas d’animaux anesthésiés, les tests seront réalisés sur une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle constante. Une application de crème anti-irritation sera appliquée sur le thorax des animaux après l’épilation nécessaire pour la mesure du fonctionnement du cœur. Tous les tests seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés une fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance. Les rats étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés par la communauté scientifique pour mesurer l'efficacité de médicaments pour la maladie de Duchenne (DMD), pathologie qui affecte le bon fonctionnement des muscles et du cœur. Le modèle de souris de cette maladie permet une évaluation très complète des différents muscles, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque typique des Hommes affectés par la maladie. Le rat est le modèle reproduisant tous les aspects de la pathologie (atteinte des muscles et du cœur). L'utilisation du modèle de rats DMD permettra donc de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. Les rats utilisés seront de jeunes adultes âgés de 1 mois à 9 mois. La caractérisation préalable du modèle permettra de déterminer à quel moment la pathologie apparait et son évolution, ce qui permettra de tester l’effet du traitement à différents stades de progression de la maladie (prévention ou guérison), afin de se rapprocher au plus juste des différentes conditions de traitement qui seront testées sur les malades humains.

Placées quatorze ou cinquante-six jours dans un dispositif qui leur coupe l'oxygène par intermittence pour reproduire des apnées du sommeil, 446 souris vont être utilisées dans ce projet, 338 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 108 un niveau léger. S'y ajoutent une injection du traitement testé au premier jour, puis aux jours 28 et 42 pour les plus longuement exposées, deux à quatre prélèvements de sang, trois mesures quotidiennes de pression artérielle sous contention pendant trois jours, une échographie cardiaque de trente minutes sous anesthésie et un transport en voiture entre deux établissements. Le porteur relève un stress modéré et une légère perte de poids les trois premiers jours d'hypoxie, le temps que les souris s'adaptent. Les 338 souris de la partie expérimentale sont tuées par prélèvement de sang sous anesthésie pour analyse de leurs organes, les 108 autres restant en vie pour la reproduction.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une pathologie touchant 5-20% de la population générale, caractérisée par des apnées répétitives pendant le sommeil conduisant à un manque d’oxygène dans le sang, qu’on appelle hypoxie intermittente (HI). Les complications cardiovasculaires qui en découlent posent un réel problème de santé publique, avec en particulier une incidence accrue d’athérosclérose chez les patients SAOS conduisant à une augmentation de la mortalité par infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral. Le traitement de référence du SAOS, la pression positive continue (PPC), permet d’améliorer les symptômes et la qualité de vie des patients, mais son effet sur le risque cardiovasculaire reste controversé. Ainsi, un axe futur de la prise en charge des patients apnéiques est d’associer la PPC à un traitement permettant de réduire le risque cardiovasculaire, mais il est nécessaire de bien connaitre les mécanismes associés au SAOS pour cibler les thérapeutiques les plus pertinentes. Parmi les mécanismes impliqués dans les premières phases de la formation des plaques d’athérome on peut citer une inflammation et des problèmes de paroi des vaisseaux, entraînant une augmentation de la migration des globules blancs et conduisant à un remodelage des vaisseaux avec un épaississement de la paroi et l’apparition de lésions d’athérosclérose. Ces phénomènes vont ainsi être activés chez les patients SAOS. Une protéase d’intérêt à commencer à se détacher ces dernières années dans la recherche sur l’athérosclérose. Notre hypothèse est donc que cette protéase serait un acteur majeur des troubles aux niveaux des parois des vaisseaux induits par l'HI. Afin de confirmer cette hypothèse nous voulons évaluer l’impact d’un blocage de cette protéase sur le remodelage vasculaire provoqués par une hypoxie intermittente, dans nos modèles expérimentaux de souris. Nous espérons ainsi déterminer si cette protéase pourrait servir de cible thérapeutique pour les conséquences cardiovasculaires du SAOS. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si notre protéase d’intérêt pourrait être une cible thérapeutique possible pour lutter contre les conséquences cardiovasculaires du SAOS. Celles-ci n’ayant pas de traitement suffisamment efficace actuellement, et les anticorps contre celle-ci étant déjà approuvés chez l’homme pour d’autres indications, les résultats de cette étude pourraient conduire à proposer un nouveau traitement à moyen terme pour ces malades.

Procédures

Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 14 ou 56 jours selon leur groupe. Le traitement étudié sera injecté aux animaux le premier jour pour les animaux exposés 14 jours et les jours 28 et 42 pour ceux exposés 8 semaines (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Deux prélèvements sanguins auront lieu pour les animaux exposés 2 semaines, et quatre prélèvements pour les animaux exposés 8 semaines (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Tous les animaux seront soumis à des mesures de pression artérielle vigile (3 fois par jour pendant 3 jours, à raison de 15 minutes par session), non-invasives à la queue. La fonction cardiaque et aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole, par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure). L'imagerie sera réalisée dans un des établissements utilisateurs et toutes les autres interventions se dérouleront dans l'autre établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront une injection de médicament ce qui conduira à un léger stress. Les animaux se verront aussi prélever de sang toutes les semaines ou toutes les deux semaines ce qui entrainera un léger stress. La mesure sur animal éveillé de la pression artérielle peut induire un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. Enfin le transport des animaux après les échographies entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront tous maintenus en vie pour effectuer les reproductions. Tous les animaux de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires.

Remplacement

L’étude du remodelage des vaisseaux nécessite des manipulations invasives ce qui exclut une étude in vivo chez l’homme. Nous utilisons des modèles cellulaires pour les premières étapes de nos travaux, mais ils ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier. Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur l’intégrité et le remodelage des vaisseaux. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été défini à minima, soit 12 par groupe, afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Cette valeur a été obtenue par une approche statistique. Nous évaluerons la présence d’un effet sexe sur nos résultats après la première série d’expérimentations. S’il n’y a pas de différences entre les sexes alors nous rassembleront nos groupes d’animaux et réduirons leur nombre de moitié. Après la réalisation des procédures in vivo et l'euthanasie des animaux, nous allons collecter les organes et tissus de ces mêmes animaux pour les utiliser au cours des études ex vivo post-mortem, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés.

Raffinement

Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie des animaux. De plus, une surveillance attentive sera réalisée pendant l'hébergement et lors de la réalisation des procédures expérimentales afin d'évaluer en permanence les nuisances subies (douleur, stress, ...), de façon à pouvoir appliquer immédiatement un renforcement analgésique et/ou anesthésique si nécessaire et faire en sorte que ces nuisances soient absentes ou réduites à leur niveau minimum. Les conditions d'expérimentation seront aussi optimisées pour le confort des animaux, avec habituation à la contention (pour les mesures de pression artérielle) et gel oculaire appliqué lors d'anesthésies longues (échographie). Des points limites prédictifs et précoces, gradés précis et adaptés, ainsi que des critères d'arrêt, sont définis, et un arbre décisionnel mis en place, permettant aux personnels de décider des actions à réaliser pour le bien-être des souris et l'application des points limites et critères d'arrêt définis. Les expérimentateurs et soigneurs seront formés pour appliquer ces procédures et règles de protection du bien-être animal, conformément à la règlementation. Le transport des animaux entre les 2 EU est fait par un expérimentateur compétent, en cage d'hébergement standard, temporairement occultée, avec eau, croquettes et enrichissement. Une fois réceptionnées, les souris seront transférées dans des cages propres pour une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant le début des expérimentations dans la salle où se trouve le dispositif à hypoxie intermittente. Le personnel responsable du bien-être animal veillera à leurs conditions d’hébergement, à leur adaptation à leur environnement et à la mise à disposition ad libitum en nourriture et eau. De plus, un enrichissement de leur milieu de vie adapté sera mis en place pendant la période d’acclimatation et d’expérimentation. Les conditions d’hébergement respecteront les normes relatives au bien-être animal en vigueur. Afin de limiter leur angoisse, ils seront acclimatés à l’expérimentateur pendant ces 7 jours. Tout comportement anormal sera signalé afin de mettre en place des soins adaptés. Le vétérinaire responsable des animaux sera contacté si un animal présente une souffrance inhabituelle. Les animaux seront examinés quotidiennement et pesés de manière hebdomadaire par les zootechniciens ou l’expérimentateur.

Choix des espèces

Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur les parois des vaisseaux et le remodelage des vaisseaux. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser les souris sauvages et génétiquement modifiées, déjà existantes au laboratoire. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. De plus, l’anatomie des vaisseaux de la souris est parfaitement connue et les outils qui permettront l’analyse sont déjà maîtrisés au laboratoire. Nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur le système vasculaire sans être biaisé par l’effet de l’âge.