Procédures légères

Un dernier produit injecté deux heures avant la mise à mort : le protocole est réglé au geste près pour 949 souris réparties en cinq lots, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 877 d'entre elles et modéré pour 72. Selon les lots, elles reçoivent une injection par jour pendant trois à cinq jours, puis un second produit, parfois un troisième sous anesthésie, parfois un prélèvement sanguin. Le projet porte sur le rôle des fibroblastes dans l'intestin et utilise aussi bien des embryons que des souris de vingt-quatre mois, le porteur indiquant produire à partir de ces animaux des organoïdes extensibles "presque indéfiniment", qu'il présente comme un moyen de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Objectifs

Il existe différents types cellulaires, dont les fibroblastes, qui constituent le tractus gastro-intestinal (tube digestif de la bouche à l’anus). Les fibroblastes synthétisent un réseau complexe de protéines et de sucres nécessaires à la bonne santé de l'intestin. Mais ce n'est qu'au cours des dernières années que nous avons commencé à apprécier l'implication des fibroblastes dans le développement intestinal, l’homéostasie intestinale (fonctionnement normal et sain de l'intestin) et les maladies. Ces découvertes ont été suivies d'une analyse génétique approfondie de ces cellules qui a permis d'explorer la diversité des fibroblastes intestinaux de manière remarquablement détaillée. De plus, l'impact du vieillissement sur les fibroblastes reste mal compris. Le déclin de la fonction gastro-intestinale qui accompagne le vieillissement entraîne divers problèmes digestifs, une absorption compromise des nutriments et une susceptibilité accrue aux maladies. Compte tenu des rôles cruciaux que jouent les fibroblastes dans l'homéostasie chez les jeunes adultes, il devient impératif d'explorer leurs fonctions dans le contexte du vieillissement. En outre, le rôle précis des différents sous-types de fibroblastes dans le développement reste également mal compris. Grâce à ce projet, nous souhaitons recenser la fonction et l'identité des fibroblastes intestinaux, en mettant en lumière leur rôle dans l'homéostasie mais aussi lors du vieillissement.

Bénéfices attendus

Les avantages à court terme résident dans les connaissances immédiates acquises pendant la durée du projet, qui permettront de mieux comprendre les fonctions et les identités des fibroblastes intestinaux. Ces connaissances pourraient potentiellement conduire à des traitements et des interventions plus ciblés pour les pathologies gastro-intestinales, ce qui profiterait aux individus à moyen terme. À long terme, les connaissances scientifiques cumulées générées par cette recherche pourraient favoriser des développements innovants dans le domaine des soins de santé. La compréhension de l'impact du vieillissement sur les fibroblastes et de leur rôle dans le maintien de la santé intestinale à différents stades de la vie et du développement embryonnaire pourrait ouvrir la voie à des stratégies préventives, à des approches thérapeutiques et à l'amélioration des résultats pour des pathologies telles que problèmes digestifs : la fibrose intestinale ou la malnutrition. En outre, la communauté scientifique dans son ensemble devrait bénéficier des progrès réalisés dans notre compréhension de la biologie cellulaire des fibroblastes, ce qui ouvrirait la voie à de futures recherches sur ces cellules, même dans d'autres organes. En résumé, la valeur de ce projet ne réside pas seulement dans ses contributions immédiates à la compréhension des fonctions des fibroblastes, mais aussi dans l'impact durable qu'il pourrait avoir sur les traitements médicaux, les connaissances scientifiques et, en fin de compte, le bien-être des individus.

Procédures

Dans un premier lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). 24h après, un second produit sera injecté aux animaux vigiles (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Dans un deuxième lot, les animaux vigiles recevront un traitement à dose unique (durée du geste inf à 10 sec). Dans un troisième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Au moins 24h après, un second produit sera administré aux animaux vigiles (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Enfin, 2h avant la mise à mort un dernier traitement sera administré (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Une partie de ces animaux recevront que le premier traitement en continu jusqu’à leur mise à mort. Dans un quatrième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Une partie d’entre eux auront un traitement sous anesthésie pendant 5 à 20 min. L’autre partie, recevra un traitement différent à dose unique (durée du geste inf à 10 sec). Enfin, les animaux de la deuxième partie seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin (durée du geste 5 min). Dans un cinquième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 3 à 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Au moins 24h après, un second produit sera injecté aux animaux vigiles (injection unique – durée du geste inf à 10 sec).

Impact sur les animaux

Suites aux interventions subies par les animaux, des conséquences directes et courtes sont à prévoir : - Douleur liée aux injections - Stress lié aux contentions - Gêne de courte durée dans la gorge lors des gavages. Aucunes conséquences indirectes et à long terme (c'est-à-dire jusqu'à la mise à mort) ne sont à prévoir suites aux interventions subies par les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

L'intestin est un organe complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, circulation sanguine et lymphatique, neurones, muscles, système immunitaire, etc. Le but de ce projet est d'identifier le rôle des fibroblastes dans l'homéostasie, le développement et le vieillissement de l’intestin. Réduire le projet à un système in vitro pourrait nous priver de découvertes pertinentes liées à la complexité des interactions présentes dans l'intestin. Cependant, nous produirons des lignées cellulaires et des organes en boîte de laboratoire (organoïdes) à partir de nos animaux d’intérêts pour des études in vitro. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, pour limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous isolerons également des fibroblastes de souris mutantes et de type sauvage et testerons l'effet de différents médicaments in vitro, ainsi que leur interaction avec les organoïdes épithéliaux. De plus, nous utiliserons des méthodes de substitution partielles telles que des explants de tissus utilisés ensuite ex vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l'échantillon, nous utiliserons autant que possible des animaux de mêmes portées. Plusieurs types d'analyses seront effectués sur la même souris, comme le suivi de la prolifération et de la migration. Les tissus extraits seront utilisés pour des expériences multiples afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les croisements de souris seront optimisés pour produire le plus grand nombre d'animaux de tous les génotypes d’intérêts. Des outils statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaires pour chaque expérience, afin de produire des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Pour les injections dans l’abdomen ou l’administration orale d’un produit non douloureux, une surveillance sera mise en place une fois par semaine jusqu’à la récupération post-mortem des tissus. Durant cette période, la mise au point de points limites permettra la détection de signes précoces de détresse ou de mal être avant que cela n’impacte les souris ou le projet. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront mis à mort. Pour les nouveau-nés, aucun changement de cage ne sera effectué durant la première semaine après la naissance, afin de limiter le stress. De plus, la mère sera manipulée à chaque fois avant les jeunes, de manière à incorporer son odeur sur les gants, afin d'éviter tout risque d'abandon de la part de la mère. La mère sera contrôlée pour s'assurer qu'elle s'occupe bien des jeunes souriceaux. Pour l'effet à long terme, les animaux seront surveillés tous les 2-3 jours. Leur poids, leur comportement général et leur apparence seront notés, et les signes d'inconfort seront évalués selon la grille de score. Si des signes de douleur sont identifiés, l'animal sera mis à mort dans les 24 heures.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. De plus, les bases de données d'expression chez la souris, les lignées de souris et les protocoles déjà établis permettraient d'étendre facilement ce projet à l'avenir en utilisant des modèles déjà existants, ou de comparer les résultats du projet à différents ensembles de données provenant d'autres projets. Également, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude pour notre projet. Le système intestinal des souris, semblable à celui de l'Homme, nous aidera à mieux comprendre sa fonction dans la vie quotidienne et les maladies. Des embryons de souris (E = jour du développement embryonnaire) à l'âge de E15 et E18 seront utilisés pour étudier le rôle des fibroblastes dans l'embryogenèse et le développement de l'intestin. Des nouveau-nés de 2 jours, 3, 7, 10, 14 et 21 jours ainsi que des souris adultes âgées de 2 et 12 mois, seront utilisées pour tester le rôle de différents groupes de fibroblastes dans le développement postnatal de l'intestin. À ces âges, la morphologie de l'intestin change considérablement et nous aimerions tester l'implication des fibroblastes dans ces changements Pour tester le rôle des fibroblastes dans l'homéostasie, nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 4 mois. À cet âge, le système intestinal est considéré comme mature et sa fonction est connue, ce qui constitue une bonne base pour étudier le rôle des fibroblastes dans l'homéostasie et la maladie. De plus, comme nous nous intéressons au rôle des fibroblastes chez les souris âgées, nous utiliserons également des souris âgées (16 à 24 mois).

Douze rats sur 111 seront maintenus en vie et placés en retraite ou réaffectés à d'autres projets, les 99 autres tués pour des analyses de tissus, y compris les ratons surnuméraires des portées jugées trop nombreuses. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour douze animaux et modéré pour 99. Neuf rates gestantes sont gavées quarante-deux jours d'affilée avec un retardateur de flamme ou reçoivent une injection du médicament de référence, puis sont tuées au sevrage de leurs petits. Leurs 90 descendants passent quatre tests comportementaux destinés à repérer ceux qui présentent les signes autistiques recherchés, et dix-huit au maximum iront en imagerie cérébrale sous anesthésie, quatre séances en deux semaines.

Objectifs

Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiées comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à ce polluant pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à ceux observés dans un modèle autistique médicamenteux de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles, observés après la mort des animaux. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet validera une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant. Deux traceurs seront utilisés pour mesurer l'activité métabolique du cerveau et son inflammation afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Pour la première fois, ce projet utilisera l'imagerie cérébrale pour étudier comment le métabolisme et l'inflammation du cerveau sont affectés par un polluant chimique de l'environnement, en lien avec les Troubles du Spectre Autistique. Il aidera à définir et valider les paramètres de la méthode d’imagerie (comme l’anesthésie et la durée du protocole d’imagerie) pour voir, à l’échelle du cerveau entier, où et comment les dommages se produisent et à établir un lien potentiel entre ces dommages.

Procédures

Femelles gestantes : Administration unique par gavage avec le polluant ou le véhicule (huile neutre) quotidiennement pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation, injection avec le médicament de référence ou le véhicule (eau stérile) une seule fois au 12ème jour de gestation et suivi régulier du poids. Jeunes rats : suivi régulier du poids et tests comportementaux après sevrage. Chaque jeune rat passera 4 tests comportementaux (sensibilité sensorielle, niveaux d’activité et d’anxiété, interactions sociales, comportements répétitifs) pour sélectionner ceux qui présentent des signes d’autisme, en vue des études d’imagerie. Imagerie cérébrale : À partir de 60 jours, certains rats passeront des séances d'imagerie cérébrale (4 fois en tout sur 2 semaines) sous anesthésie (6 fois), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale et pour détecter l’inflammation. La durée de chaque session (1 à 2 h) sera définie pendant cette phase de mise au point.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : Pour les femelles gestantes : - La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale de VPA entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). - L’administration du polluant par gavage (42 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée. Pour les descendants : - L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine notamment un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (4) entraine un stress physique mineur de courte de durée.

Devenir

Neuf femelles gestantes seront réparties en trois groupes. Elles seront maintenues en vie jusqu'au sevrage de leurs petits à 21 jours, puis euthanasiées. Le sang et les tissus seront utilisés notamment pour l’analyse des hormones. En cas de portées trop importantes (supérieures à 10 ratons), la portée sera réduite par placement des ratons surnuméraires dans d’autres portées plus faibles ou euthanasie. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des ratons (10 par portée soit 90) réaliseront 4 tests comportementaux afin de s’assurer qu’ils présentent le phénotype autistique recherché et de pouvoir en sélectionner pour les études in vivo par imagerie (dix-huit mâles et femelles maximum). A l’âge adulte, l’imagerie sera réalisée sur 3 rats par groupe et par sexe. Si nécessité de renforcer les résultats, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté à chaque groupe pour augmenter la taille de l’échantillon. L’ensemble des rats nés dans cette étude sera euthanasié pour des analyses en histologie et biologie moléculaire ou des ajustements de techniques en vue de la phase 2 du protocole qui fera l’objet d’une future demande d’autorisation. Enfin les 12 rats (6 femelles et 6 mâles) ayant participé aux tests de sociabilité seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets ou placés en retraite.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Les modèles autistiques utilisés dans ce projet, reconnus et validés chez les rongeurs, permettent de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux de l'Homme. Ils permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.

Réduction

Chaque portée sera considérée comme une unité statistique. Dans chaque portée, un raton mâle et un raton femelle seront sélectionnés pour réaliser des analyses par imagerie in vivo. Comme il y a peu de données sur l'utilisation des deux radiotraceurs de l’étude, cette première phase vise à tester la faisabilité de l'imagerie sur un échantillon de 3 ratons par groupe et par sexe, pour 3 groupes. Si besoin, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté pour augmenter la taille de l'échantillon. Ainsi, cette phase exploratoire inclura un total de 9 rates gestantes, 90 jeunes et 12 autres rats adultes pour un test de sociabilité. Au total, 111 animaux seront impliqués dans cette étude, avec un minimum de 9 rats mâles et 9 rats femelles (jusqu'à un maximum de 18 de chaque sexe) utilisés en imagerie.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans l’EU1 dans des conditions standards, respectant les réglementations en vigueur. Les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe et placés par deux dans des cages ventilées, avec des buchettes de bois et de la frisure de papier Kraft pour enrichir leur environnement. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être, et manipulés par le même personnel entraîné pour réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2, avec des conditions similaires à leur habitat précédent (cycle lumineux, nourriture, enrichissements environnementaux) pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Les radiotraceurs seront injectés par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications.

Choix des espèces

Les modèles de Troubles du Spectre Autistique médicamenteux ou après exposition des mères au polluant ont été développés et sont reconnus chez le rat dont le comportement social est proche de celui des humains, ce qui en fait un bon choix pour étudier ces troubles. Les femelles adultes utilisées pour la reproduction auront entre 12 et 13 semaines, comme dans les études précédentes, pour assurer la comparabilité des résultats. Les petits seront étudiés de la naissance jusqu'à 80 jours pour suivre leur croissance, évaluer leur comportement (entre 36 et 43 jours) et analyser les modifications métaboliques et inflammatoires par imagerie (entre 60 et 80 jours). Cette période permettra de définir les protocoles d'imagerie.

240 souris passent toute leur adolescence sous régime obésogène, douze semaines à partir du sevrage, avant que leur humeur soit évaluée. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 195 d'entre elles et modéré pour 45, et toutes sont tuées pour le prélèvement du cerveau. À l'obésité induite s'ajoutent un gavage quotidien de probiotiques pendant deux semaines, des injections dans l'abdomen et, pour une partie des animaux, une chirurgie d'une heure destinée à insérer une fibre dans le cerveau. Le porteur annonce à plus long terme des stratégies nutritionnelles ou pharmacologiques pour les personnes dépressives, quand l'état dépressif est ici provoqué chez les souris par le régime qu'on leur impose.

Objectifs

Le thème général du projet concerne l’étude de la physiopathologie des troubles de l’humeur et de l’amélioration potentielle des symptômes par l’apport de probiotiques. Nous nous intéressons particulièrement aux effets de l’inflammation dans l’apparition des troubles dépressifs, induits par la consommation chronique d’une alimentation déséquilibrée. En effet, la consommation chronique d'un régime alimentaire obésogène contribue à générer une inflammation dite "de bas bruit" qui va médier un certain nombre de processus conduisant à la perturbation du fonctionnement des systèmes de neurotransmission monoaminergiques qui peuvent sous-tendre le développement des troubles de l'humeur, jusqu'à la dépression. Si certains effets de l'inflammation dans ces phénomènes sont aujourd'hui décrits, les mécanismes neurochimiques précis mis en jeu ne sont pas encore totalement élucidés. En particulier, leur implication dans le déficit de réponse aux antidépresseurs, dont la proportion est largement plus présente chez les patients dépressifs présentant une inflammation chronique, est peu étudiée et reste à démontrer. Le travail chez le rongeur, ici la souris, est complémentaire des travaux cliniques qui sont par ailleurs menés dans notre équipe, car il nous permet un contrôle des conditions expérimentales très précis et permet également de procéder à des analyses moléculaires et pharmacologiques au niveau de structures cérébrales bien identifiées. Dans ce projet, nous nous intéressons précisément au rôle d'une voie enzymatique potentiellement altérée en condition inflammatoire, et qui conduit à la synthèse d'un facteur essentiel au fonctionnement des systèmes de neurotransmisssion monoaminergiques. Nous mesurerons chez des souris soumises chroniquement à un régime alimentaire obésogène, l'apparition de comportements de type dépressif, et étudierons les mécanismes neurochimiques impliqués. Nous étudierons également l'effet bénéfique d'une supplémentation par un probiotique sur ces comportements dépressifs et sur l'efficacité d'un traitement par anti-dépresseur, dont la réponse est réduite chez les sujets obèses.

Bénéfices attendus

Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la dépression associée à l’inflammation. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte inflammatoire.

Procédures

Les souris seront exposées chroniquement à un régime obésogène induisant une prise de poids. Elles recevront une administration quotidienne pendant 2 semaines de probiotiques par gavage et des injections intra-péritonéales seront réalisées, nécessitant une légère contention de courte durée. Des chirurgies stéréotaxiques seront réalisées sous anesthésie générale afin d'insérer une fibre intracérébrale (environ 60 minutes, 1 fois). Les souris seront soumises à des tests comportementaux.

Impact sur les animaux

La prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisance pour les souris. Un comportement anxieux et/ou de type dépressif (modèlisé ici) est attendu chez les souris soumises au régime hyperlipidique.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les cerveaux et réaliser des analyses biochimiques.

Remplacement

L'objectif général du projet est de mieux comprendre chez l'animal les mécanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur en condition inflammatoire. Un second objectif est de tester l'effet de l’apport en probiotiques favorisant la synthèse de BH4 sur les altérations comportementales associées à l’inflammation. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l'étude des troubles de l'humeur reste une nécessité expérimentale afin d'appréhender la réalité physiologique de nos résultats. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.

Réduction

Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes évitant la répétition des expériences.

Raffinement

En concertation avec la structure Bien-Etre du laboratoire, nous avons défini les meilleures conditions d'hébergement possibles ainsi que les points limites et les points d'arrêt précoces et adaptés. Les souris seront ainsi hébergées par 5, avec présence de différents enrichissements, surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalables soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation. Pour les procédures invasives et/ou susceptibles de générer une douleur, les soins pré- et pos-opératoires sont appliqués, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie sont mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. C’est un animal sur lequel les traitements nutritionnels et les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les animaux sont mis sous régime obésogène au sevrage, pendant 12 semaines. Ceci correspond à une exposition chronique débutant à l'adolescence ,stade particulièrement sensible aux effets néfastes de ce régime sur les sphères émotionnelles et cognitives. Les différents test comportementaux et analyses sont alors réalisés à l'issue de cette période d'exposition, correspondant au stade adulte, récapitulant le modèle d'obésité clinique chez la personne adulte.

Opérées à la cuisse droite pour provoquer une douleur chronique d'environ dix semaines, les souris passent jusqu'à 24 tests comportementaux en six semaines. 8 560 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, après une biopsie de génotypage à l'âge de cinq à sept jours, et une partie reçoit des antidépresseurs ou des anticonvulsivants dans l'eau de boisson ou par gavage. Le porteur écrit qu'elles "ressentiront une douleur modérée qui ne peut pas être soulagée, car c'est le sujet de la recherche", affirme que les points limites existent "pour garantir leur bien-être", et ne précise pas quels tests mesurent cette douleur. Les souris sans le génotype recherché sont tuées, les autres à l'issue de chaque procédure, le porteur les décrivant comme des "animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés".

Objectifs

Ce projet de recherche vise à améliorer les traitements contre la douleur neuropathique, une douleur causée par des lésions ou des maladies du système nerveux, touchant environ 6 % de la population en France. Actuellement, certains antidépresseurs et anticonvulsivants sont les meilleures options disponibles, mais ils ne fonctionnent pas pour tout le monde et ont de nombreux effets secondaires. De plus, on comprend mal comment ces médicaments soulagent la douleur neuropathique. Comprendre comment ces médicaments fonctionnent est essentiel pour améliorer les traitements actuels et en développer de nouveaux, plus ciblés. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels les antidépresseurs et les anticonvulsivants soulagent la douleur neuropathique. Nos recherches ont déjà montré que ces traitements ont un effet anti-inflammatoire et influencent le système circadien, qui régule nos cycles biologiques. Nous voulons maintenant explorer plus en détail ces cibles pour améliorer les traitements de la douleur neuropathique.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à améliorer les traitements contre la douleur neuropathique. Nous pensons que les résultats de ce projet pourraient non seulement améliorer les traitements actuels en permettant une meilleure utilisation clinique grâce à une meilleure compréhension de leur fonctionnement, mais aussi aider à développer de nouveaux traitements plus ciblés et avec moins d'effets secondaires que ceux existants.

Procédures

Les animaux subiront une biopsie unique sur animal vigil à l'âge de 5 à 7 jours afin de réaliser leur génotypage. Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale induisant une douleur chronique pendant environ 10 semaines. La chirurgie, réalisée au niveau de la cuisse droite, durera environ 5 minutes sous anesthésie générale. Certains animaux subiront une injection au niveau thoracique sous anesthésie générale, d’autres animaux subirons des injections intrapéritonéales (vigile) répétées pendant 1 semaine à raison d’1 injection par jour. Une partie des animaux recevra un traitement (soit administré pendant 3 semaines dans leur eau de boisson, soit par gavage vigile une unique fois). De plus, les animaux seront soumis à plusieurs tests comportementaux afin de vérifier l'efficacité des traitements étudiés sur la douleur neuropathique d'une durée de 3 à 10 minutes chacun (avec un maximum de 24 tests par animal sur une période de 6 semaines), avec un intervalle minimum de 24 heures entre chaque test. Certains animaux subiront une chirurgie terminale pour prélèvement d'organes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux ressentiront une douleur modérée qui ne peut pas être soulagée, car c'est le sujet de la recherche. Après la chirurgie neuropathique, ils auront des difficultés à se déplacer pendant 48 à 72 heures. Certains animaux recevront des injections dans la région lombaire. Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux pour évaluer la douleur, où ils peuvent retirer leur patte si nécessaire. Les animaux recevront des traitements d’antidépresseurs ou d'anticonvulsivants, soit en dose unique, soit en traitement prolongé. Pour les doses uniques, les animaux seront habitués à une légère contention avant un gavage effectué par une personne formée. Pour les traitements prolongés, les médicaments seront mélangés à l'eau de boisson, une méthode non invasive. Les biberons seront pesés régulièrement pour surveiller la quantité de liquide consommée par les animaux.

Devenir

Les animaux ayant le génotype recherché continuent vers l'ensemble du projet et ceux n'ayant pas le génotype attendu sont mis à mort. A l’issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs

Remplacement

Pour notre étude, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Pour analyser l'effet des antidépresseurs ou des anticonvulsivants sur la douleur chronique et les réactions émotionnelles, nous devons observer le comportement des animaux vivants.

Réduction

Nous essayons de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats scientifiques fiables. D'après les études et la variabilité individuelle, chaque groupe expérimental comprendra au maximum 12 souris mâles et 12 femelles. Un calcul statistique a été fait pour s'assurer que nos résultats seront valides. Les animaux passeront par plusieurs tests comportementaux pour réduire leur nombre. Les analyses statistiques finales seront réalisées pour confirmer la validité de nos résultats.

Raffinement

Les animaux sont logés par groupes de 4 ou 5 pour répondre à leurs besoins sociaux. Nous mettons du coton dans les cages pour qu'ils puissent faire des nids et des barreaux en bois pour qu'ils puissent ronger, ce qui réduit l'agressivité. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe de stress ou d'inconfort. Pendant les chirurgies, des anesthésies sont toujours utilisées et un suivi post-chirurgical est effectué. Des points limites sont mises en place pour garantir leur bien-être. Si de nouvelles méthodes moins stressantes ou douloureuses sont découvertes, nous les intégrerons à nos procédures.

Choix des espèces

Le modèle d’animal neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris (travaux antérieurs de notre équipe). En outre, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles, facilitant ainsi l’étude génétique des mécanismes. Pour le génotypage, les souriceaux seront utilisés avant d'avoir 10 jours car la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation ne sont pas encore complets, ce qui minimise la souffrance des petits. Pour toutes les autres procédures, étant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).

Six vecteurs viraux, trois doses, une injection dès la naissance et jusqu'à quatre séries de tests de force et d'activité par souris : 2 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, celles qui n'ont pas le génotype recherché étant tuées avant le sevrage et les autres à la fin de chaque procédure. Le projet cherche un vecteur de thérapie génique contre un syndrome myasthénique congénital lié au gène COLQ, après une étude où, écrit le porteur, un vecteur non optimisé "a provoqué une toxicité inattendue". Les tests comprennent des mesures d'activité d'une heure trente, de force d'agrippement, de coordination et de fatigabilité musculaire, et quatre prises de sang sous anesthésie. Les souris mutantes, privées de collagène Q, développent une faiblesse musculaire généralisée, et le porteur dit avoir choisi l'espèce parce qu'elle offre "le plus petit modèle animal" présentant les signes de la maladie.

Objectifs

Le syndrome myasthénique congénital est une maladie rare d’origine génétique, ayant une incidence estimée à 1 personne sur 250 000. Elle présente des caractéristiques cliniques et génétiques hétérogènes, puisque différents gènes déficients peuvent être individuellement associés à ce type de pathologie. Ces gènes sont impliqués dans le bon fonctionnement des jonctions neuromusculaires, qui est la structure permettant la transmission de l’information nerveuse vers les muscles et donc la contraction musculaire. L’un des syndromes myasthéniques congénitaux est associé à des mutations dans le gène COLQ, pour collagène Q. Les patients souffrent de faiblesse musculaire sévère, de fatigue, de scoliose importante, d’insuffisance respiratoire et ont une espérance de vie réduite. Pour le moment, il n’existe pas de traitement curatif mais uniquement des traitements symptomatiques. Le but du projet est de concevoir une approche de thérapie génique innovante pour le syndrome myasthénique congénital lié à ColQ, consistant à l’introduction du gène sain dans les cellules à l’aide de vecteurs. Pour cela, nous disposons d’un modèle murin déficient en ColQ qui reproduit les symptômes observés chez l’Homme. Dans une étude précédente, nous avons administré un vecteur viral non optimisé, porteur du gène sain COLQ, pour une première preuve de concept à un stade post-symptomatique et qui a provoqué une toxicité inattendue. Nous souhaitons, dans ce projet, traiter les animaux avec un vecteur viral que l’on optimisera pour une meilleure spécificité et efficacité pour le transfert du gène COLQ et son expression en protéine essentiellement dans le muscle squelettique, en tenant compte des résultats obtenus précédemment dans l’équipe. Nous avons sélectionné à partir d’études sur cellules en culture, 6 vecteurs différents. Le phénotype des souris traitées avec ces vecteurs à différentes doses sera analysé jusqu’à 3 mois ou 1 an, en évaluant l’état général des souris, la force musculaire et globale, l’état des jonctions neuromusculaires et la structure des fibres musculaires.

Bénéfices attendus

Grâce à l’étude de différents vecteurs, à différentes doses, ce projet pourrait permettre d’identifier chez la souris, un vecteur efficace pour traiter à une dose la plus faible possible le syndrome myasthénique congénital liée à l’absence de collagène Q, tout en réduisant le risque de toxicité. Ce vecteur optimisé pourra être utilisé pour le développement préclinique et clinique d’un candidat médicament pour cette pathologie mais pourra également être utilisé pour traiter d’autres syndromes myasthéniques congénitaux, en changeant uniquement le gène responsable de la pathologie.

Procédures

Injection des traitements : injection unique, environ 2min par souris. Mesure de l’activité des animaux : 1h30, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Mesure de la force d’agrippement : 2min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Test de coordination et de force musculaire : 10min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Test de fatigabilité musculaire : 5min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Mesure de la force globale : 1 fois 10min par souris. Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés : 4 fois, environ 5 min par souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine collagène Q. Les animaux malades développeront des troubles du comportement moteur liés à une faiblesse musculaire généralisée. Suite aux traitements, dans le cas d’une injection à dose suboptimale, les nuisances seront liées à celles du modèle. Les injections intraveineuses ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère équivalente au seuil de douleur lié à l’introduction d’une aiguille sous bonne pratique vétérinaire. L’animal subira, au cours des évaluations fonctionnelles, un stress lié à la manipulation. Rarement, certains animaux pourront souffrir de blessures des griffes/doigts ou de petites plaies suite aux tests de force.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés avant sevrage s’ils ne possèdent pas le génotype nécessaire pour être inclus dans les études. Le reste des animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever les tissus qui nous permettront de déterminer l’efficacité des traitements.

Remplacement

Dans ce projet, une présélection de vecteurs a été réalisée en mesurant l’efficacité de ces vecteurs à délivrer le gène thérapeutique dans les cellules musculaires, et à produire la protéine d’intérêt. Cependant, ces modèles en laboratoire ne nous permettent pas d'observer comment le vecteur se répartit dans tout le corps ni d'étudier les effets thérapeutiques, car ils ne peuvent pas simuler les problèmes de fonctionnement des muscles, comme la perte de force. Pour évaluer l’efficacité et la spécificité d’un vecteur administré dans l’ensemble du corps, l’utilisation d’animaux est indispensable. Notre modèle de souris reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui nous permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’Homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des muscles squelettiques et la distribution du vecteur dans les différents tissus pour analyser leur spécificité. Ils permettent d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle et de la jonction neuromusculaire ou encore les niveaux de biomarqueurs dans le sang.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre un animal sain et un animal traité. En amont de cette étude expérimentale sur des modèles animaux, nous avons sélectionné grâce à des études sur cellules les 6 meilleurs vecteurs viraux capables d’exprimer fortement la protéine COLQ dans les cellules musculaires. La première étape de ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de ces 6 vecteurs à 3 doses différentes pour cibler l’ensemble des muscles et traiter la pathologie à moyen terme, sur 3 mois. Les 2 meilleurs candidats seront sélectionnés afin de déterminer la dose thérapeutique optimale sur une période de 1 an. Dans l’étude à 3 mois, nous procèderons par étape, en injectant en premier les animaux avec la plus forte dose de vecteurs. Si des animaux injectés avec une certaine dose d’un vecteur donné montrent des signes d’absence d’efficacité, nous n’injecterons pas les doses plus faibles pour ce vecteur. Si un des vecteurs injectés dans l’étude à 3 mois a un effet thérapeutique nettement supérieur aux autres, l’étude de dose à un an se fera uniquement avec ce vecteur. La toxicité d’un médicament est évaluée avec la dose thérapeutique optimale sur des animaux sains. Dans cette étude, des animaux sains seront injectés avec les 3 doses de ce vecteur car la portée est entièrement injectée à la naissance. Par conséquent, nous utiliserons ces animaux pour l’étude de toxicité, au lieu d’injecter ultérieurement de nouvelles portées lorsque nous serons capables de déterminer la dose thérapeutique optimale. Nous réduisons ainsi le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

D’une façon générale, toutes les mesures possibles permettant d’améliorer les conditions de vie des animaux seront prises. Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. S’il s’avère qu’un seul animal se retrouve dans une cage, au sevrage, puisqu’il est le seul à devoir être suivi sur la période d’étude, un animal compagnon sera ajouté pour éviter l’isolement. Pour éviter des bagarres entre mâles, le compagnon sera un frère de la même portée si possible. Sinon un autre mâle du même âge sera ajouté dès le sevrage, ce qui réduira les risques. Après sevrage, les souris mutantes traitées ou non seront observées quotidiennement avec attention et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine. Avant sevrage, la fréquence est réduite à une fois par semaine pour limiter les manipulations et donc le stress pour la portée et la mère. Un aliment hydratant et nourrissant sera appliqué dès constatation que les animaux éprouvent des difficultés à se mouvoir. Des points limites adaptés ont été mis en place afin d’éviter toute souffrance animale. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène ColQ (pour collagène Q), responsable d’un syndrome myasthénique congénital, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques caractéristiques de cette maladie. Afin de favoriser l’expression de la protéine COLQ le plus tôt possible et de ralentir la progression de la maladie, les animaux seront traités dès la naissance, sachant que les animaux malades présentent des signes de la pathologie dès les premiers jours de vie. Les animaux seront suivis sur une période de 3 mois ou de 1 an, pour déterminer l’efficacité des traitements à moyen et long terme.

Biopsiées à la queue entre sept et dix jours de vie pour établir leur génotype, une partie des 803 souris subit ensuite jusqu'à six prises de sang, puis une chirurgie d'une heure pour implanter une sonde dans la tête. Ces souris-là vivent seules jusqu'à leur mort, sept mois au plus, le temps de trois ponctions de liquide céphalorachidien de quatre heures chacune réalisées sur animal éveillé. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 185 d'entre elles et modéré pour 618. Deux des trois lignées génétiquement modifiées développent des crises d'épilepsie ou une paralysie des pattes arrière, et toutes les souris finissent tuées pour que leur cerveau soit prélevé, y compris les reproductrices et celles qui ne portent pas la modification recherchée.

Objectifs

Il existe une demande croissante pour utiliser des biomarqueurs (substances ou signes mesurables dans le corps qui peuvent indiquer la présence d’une maladie) pour comprendre et identifier les maladies comme la maladie d'Alzheimer. Ces biomarqueurs aident à voir comment la maladie évolue, comment les gens réagissent aux traitements et ce qui se passe dans le cerveau. Mais certains de ces tests sont compliqués et coûteux, comme les prélèvements de liquide céphalorachidien (LCR) ou l’imagerie du cerveau. On essaie donc de trouver des façons plus simples, comme des tests sanguins, pour diagnostiquer Alzheimer. Cependant, on ne sait pas encore très bien comment certains de ces biomarqueurs dans le sang ou le liquide céphalorachidien sont liés aux problèmes dans le cerveau lui-même. Comprendre cela est important, surtout maintenant que les essais de médicaments se font de plus en plus tôt, avant même que les symptômes n'apparaissent. Ce projet vise à examiner de près ces signes dans le sang et le liquide céphalorachidien chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer pour mieux comprendre la maladie et sa progression.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre comment les biomarqueurs (substances ou signes mesurable dans le corps qui peuvent indiquer la présence d’une maladie) dans le sang et le liquide céphalorachidien (LCR) évoluent lorsque quelqu'un a la maladie d'Alzheimer et le lien entre ces changements et la façon dont la maladie se développe dans le cerveau, notamment en termes d’atteintes tissulaires cérébrales caractéristiques de la maladie. La contribution de ce projet pour la compréhension des mécanismes de la maladie pourrait ainsi aider à trouver de nouveaux traitements pour la ralentir. Ce projet pourrait également permettre d’identifier de nouveaux biomarqueurs dans le sang et le LCR afin d’aider au diagnostic précoce de la maladie, ce qui aurait un bénéfice réel pour les personnes à haut risque notamment, qui pourraient alors bénéficier d’un traitement avant même qu'ils aient des symptômes.

Procédures

Pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux génétiquement modifiés un prélèvement d’un fragment de l’extrémité de la queue sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours, une fois par animal, durée inférieure à 1 minute. Pour une partie des animaux 6 prélèvements de sang maximum seront réalisés par animal avec un minimum de 2 mois de récupération entre chaque prélèvement, durée inférieure à 3 minutes par animal. Il y aura deux méthodes pour prélever le liquide céphalorachidien (LCR) : -Pour une partie des animaux, une sonde sera implantée au niveau de la tête de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie adaptées (une fois par animal, durée : 1h). Ces animaux sont ensuite hébergés seuls pendant 7 mois maximum au cours desquels des prélèvements de LCR seront réalisés sur animal vigile : 3 maximum avec un minimum d’1 mois de récupération entre chaque prélèvement et durée de la collecte environ 4h. -Une autre partie des animaux sera anesthésiée, puis le LCR sera prélevé au cours d’une procédure chirurgicale (une fois par animal, durée 30 minutes), les animaux sont ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire. 2 des lignées génétiquement modifiées utilisées dans le projet présentent un phénotype dommageable au cours du développement de la pathologie. Concrètement, des problèmes moteurs dans les pattes-arrières peuvent survenir à partir de 9 mois d’âge pour une des lignées. Les animaux de la deuxième lignée pourront présenter des crises d’épilepsie occasionnelles. En fin de procédure l’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement d'échantillons pour connaitre leur patrimoine génétique. Pendant le prélèvement des échantillons de sang, l'animal est maintenu en contention ce qui peut générer un stress passager. Lors du prélèvement l’animal pourra ressentir une légère douleur et un inconfort de courte durée. À la suite du prélèvement il existe un risque rare d’hémorragie et/ou d’hématome. L'anesthésie générale utilisée pour la procédure chirurgicale et pour le prélèvement de liquide céphalorachidien peut entraîner une hypothermie et des problèmes cardiovasculaire et respiratoire. Après la chirurgie les animaux pourront ressentir une douleur et un inconfort. Un risque rare de complications existe en post-chirurgie telles que infections ou problèmes de cicatrisations. La canule de dialyse implantée pourra induire une gêne pour l’animal due à l’encombrement qu’elle génère. Après la chirurgie, les souris seront hébergées seules, s’agissant d’animaux grégaires cela pourra générer un stress. Elles seront isolées jusqu’à la fin de leur vie (pendant 7 mois maximum). Les souris des lignées génétiquement modifiées utilisées dans le projet peuvent avoir des problèmes de santé qui raccourcissent leur durée de vie, comme des crises d'épilepsie occasionnelles ou des difficultés de mouvement pouvant aller jusqu’à une paralysie, surtout au niveau des pattes arrière. Ceci pourra générer un stress pour les animaux et des pertes de poids.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de collecter leur cerveau pour réaliser des analyses. Les animaux reproducteurs et les animaux non porteurs du patrimoine génétique d’intérêt seront euthanasiés par une méthode réglementaire car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leurs modifications génétiques spécifiques.

Remplacement

Pour le déroulement de ce projet, il est essentiel d'utiliser des modèles animaux car nous nous concentrons sur le diagnostic et le pronostic de la maladie d’Alzheimer. Nous étudions un processus vraiment complexe qui ne dépend pas seulement des mécanismes de base de la maladie, mais aussi de la diffusion de protéines dans les fluides corporels (sang et liquide céphalorachidien). Dans d'autres modèles tels que les cellules, nous ne pouvons pas étudier la libération et la détection de ces molécules dans le corps.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques et statistiques du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment élaborées et publiées et de notre expérience. Ainsi nous avons défini qu’il nous faudrait des groupes de 10 à 30 souris en fonction du type de prélèvement (sang ou liquide céphalorachidien). Afin de prendre en compte un pourcentage de perte au cours des procédures, nous prévoyons plus d’animaux que ce nombre minimal. Bien entendu nous adapterons notre production et le nombre d’animaux inclus en procédure afin de n’utiliser que le nombre strictement nécessaire (très probablement inférieur à ce qui est prévu ici). Nous estimons que nous utiliserons sur la durée du projet 803 animaux maximum. Lors de la procédure d’élevage nous piloterons la production de souris pour obtenir le nombre strictement nécessaire d’animaux pour nos lots expérimentaux. Pour l’évaluation des biomarqueurs, pour l’ensemble des lignées, nous utiliserons des femelles et des mâles afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits et permettre une meilleure transposition de nos résultats. Nous réaliserons une partie de nos prélèvements de liquide céphalorachidien (LCR) à plusieurs reprises sur un même animal nous permettant d’une part de réduire la variabilité inter-individuelle et d’autre part d’éviter l’euthanasie de l’animal après le prélèvement, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires à nos analyses.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les méthodes et le traitement des animaux lors des expériences et dans l'animalerie visent à assurer leur bien-être maximal avec le moins de contraintes possible. Les conditions de vie, les soins et les procédures expérimentales sont conçus pour minimiser toute douleur ou souffrance. Les animaux seront observés quotidiennement, toute anomalie sera suivie et tracée en lien avec la structure chargée du bien-être animal (SBEA). Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Lors du prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux la portée complète sera apportée dans une pièce dédiée, au calme, dans leur cage d’origine avec la mère. Nous utiliserons du matériel adapté pour le prélèvement, désinfecté entre chaque animal afin d’éviter tout risque de contamination croisée ou infection. Le prélèvement sera limité à la taille la plus petite possible et réalisé sur de jeunes animaux. Les souriceaux seront surveillés immédiatement après le geste puis 20 minutes après environ pour s’assurer de l’absence de saignement et la bonne prise en charge par leur mère. Pour les souris de phénotypes dommageables, nous ferons des observations régulières pour les détecter. En élevage nous utiliserons seulement des mâles transgéniques pour favoriser la bonne prise en charge des petits par leur mère. En cas de signes de difficultés motrices nous mettrons en place un soutien nutritionnel. Pour les souris qui seront hébergées seules, nous fournirons un enrichissement supplémentaire tel que des maisonnettes, bâtonnet de bois à ronger, papier kraft, etc. La procédure chirurgicale sera réalisée avec une anesthésie et une analgésie adaptées. La température de l’animal sera maintenue durant toute la durée de l’anesthésie à l’aide d’un tapis chauffant et d’une chambre de réveil chauffée pour éviter toute hypothermie. Nous mettrons en place une surveillance accrue en post-opératoire et un soutien nutritionnel si nécessaire. De plus, si la canule de dialyse présente une gêne pour l’animal pour l’accès à la nourriture, nous retirerons la grille de croquettes et mettrons l’aliment à disposition directement dans la cage.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris car il existe de nombreux modèles génétiquement modifiés déjà caractérisés, parmi eux nous avons choisi de travailler avec 3 modèles de maladie d'Alzheimer qui présentent un intérêt pour ce projet. Pour l’étude des niveaux de biomarqueurs nous réaliserons des prélèvements de l’âge d’1.5 mois jusqu’à l’âge de 18 mois afin de suivre leur évolution au cours de la progression de la pathologie.

8 120 souris et 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les molécules candidates leur sont administrées sous la peau, dans la veine, dans l'abdomen ou par gavage, avec des prises de sang à la queue jusqu'à trois fois en deux heures, et pour la dernière expérience un gavage quotidien pendant quatorze jours destiné à trouver la dose maximale supportée. Les souris utilisées portent une maladie neurodégénérative dont les symptômes moteurs et mentaux s'aggravent avec l'âge, et le porteur reconnaît que la toxicité des doses testées peut provoquer des effets secondaires. Rien dans le texte n'explique comment on arrive à 8 240 animaux : le porteur décrit seulement quatre expériences enchaînées, chacune conditionnée aux résultats de la précédente.

Objectifs

Des études in vitro récentes ont permis de découvrir une molécule permettant de retarder l’évolution d’une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié. Ce projet vise donc à trouver d’autres molécules, dérivées de la molécule initiale, dont les propriétés chimiques auraient des effets optimaux sur le traitement de cette maladie par rapport à la molécule initiale. Nous vérifierons d'abord si ces nouvelles molécules présentent un meilleur potentiel thérapeutique que la molécule initiale. Si c’est le cas, parmi tous les candidats, nous sélectionnerons les 3 meilleurs afin de réaliser une étude d’efficacité sur le long terme. Enfin, nous procéderons à des tests sur les 3 molécules sélectionnées pour déterminer la dose maximale sans danger pour l’organisme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à trouver des molécules qui soient aussi efficaces, voire plus, avec de meilleures propriétés chimiques. Une molécule qui se dissout bien et est bien absorbée peut être prise par voie orale, ce qui permet de réduire la dose nécessaire pour obtenir l'effet thérapeutique. Cela diminue également le risque d'effets secondaires indésirables, qui sont souvent la raison pour laquelle les patients arrêtent leur traitement.

Procédures

Quatre voies d’administration différentes seront testées : injection sous-cutanée, injection intra-veineuse, injection intra-péritonéale et gavage oral. Quelle que soit la voie, l’administration du médicament sera réalisée par un geste d’une durée inférieure à 30 secondes pour limiter le possible stress engendré par l’administration du traitement. Dans la 1ère expérience, du sang sera prélevé à la queue à 3 reprises au cours des 2h suivant le traitement. Ce geste sera limité à 30 secondes. Dans la 2e expérience, du sang sera prélevé à la queue juste avant le traitement, puis 1h, 3h et 6h après. Ce geste sera limité à 30 secondes. Dans la 3e expérience, du sang sera prélevé à la queue tous les mois (un seul prélèvement/animal/mois) durant toute la durée du traitement. Ce geste sera limité à 30 secondes. Dans la 4e expérience, les animaux seront quotidiennement traités par gavage oral pendant 14 jours. Au 14e jour, du sang sera prélevé à la queue de chaque animal. Ces deux gestes auront une durée inférieure à 30 secondes chacun.

Impact sur les animaux

Le modèle animal de cette maladie présente des symptômes moteurs et mentaux qui s’aggravent progressivement avec l’âge. Un stress lié à l’administration du traitement est possible. Le prélèvement sanguin peut aboutir à une légère baisse du volume sanguin. Des effets secondaires dus à une toxicité des doses testées peuvent être observés.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin de prélever les cerveaux. Ces derniers serviront à réaliser des analyses biologiques qui nous permettront de comprendre le mécanisme d’action du traitement et de démontrer que les symptômes de la maladie sont atténués voire résorbés par le traitement.

Remplacement

Nous cherchons à étudier les effets d’un traitement avec nos médicaments sur l’amélioration et l’apparition des symptômes de la maladie. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu notre projet de façon progressive. Ainsi, le projet est constitué de 4 expériences indépendantes : l’expérience 2 ne sera réalisée que si l’expérience 1 a montré des résultats satisfaisants et ainsi de suite. Si dès l’expérience 1 les résultats ne sont pas satisfaisants, l’étude sera arrêtée et les expériences 2, 3 et 4 ne seront pas réalisées.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement sera administré par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.

Choix des espèces

Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à montrer qu’un traitement améliore les symptômes voire retarde leur apparition, notre étude sera réalisée sur des souris adultes présentant les symptômes de la maladie. Enfin, l’utilisation du rat adulte, en parallèle de la souris, pour l’étude de toxicité se justifie par le fait qu’elle prépare aux futures études de toxicité exigées par la réglementation et qui doivent être réalisées chez le rat.