Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 08/10/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-817726)
Gavées une seule fois avec une souche de Citrobacter rodentium, 145 souris sont ensuite manipulées chaque jour pendant quatorze jours pour la récolte de leurs excréments. Pour 115 d’entre elles, le niveau de souffrance déclaré est sévère, avec perte de poids et inconforts liés à la maladie intestinale, les 30 autres relevant d’un niveau léger. Le porteur écrit que la première procédure « ne génère aucune nuisance sur les animaux mise à part le gavage », formulation qui cohabite mal avec les 115 souris déclarées en souffrance sévère dans la seconde. Toutes sont tuées par dislocation cervicale, et il précise qu’ayant reçu des souches pathogènes, elles ne peuvent être ni réhabilitées ni transférées vers un autre établissement.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les Escherichia coli entéropathogène (EPEC) et E. coli entérohémorragique (EHEC) sont des bactéries responsables d’infections intestinales chez l’homme. Si la plupart de leurs facteurs de virulence ou de fitness ont été identifiés et bien caractérisés dans la littérature, le comportement dynamique des pathogènes au cours du processus infectieux a été moins étudié. Dans le même temps, les progrès récents en technologies de la cellule unique ont révélé qu’une population bactérienne clonale n’est pas une somme de cellules bactériennes identiques mais rassemble plutôt des individus avec des phénotypes potentiellement distincts, un phénomène appelé hétérogénéité phénotypique. Cette nouvelle vision des populations bactériennes a conduit à l’émergence de concepts écologiques qui changent notre compréhension de la façon dont les micro-organismes s’adaptent à leur environnement fluctuant. Cependant, le rôle de l’hétérogénéité phénotypique dans le processus infectieux bactérien a été peu étudié à ce jour. Afin de caractériser le rôle de l’hétérogénéité phénotypique dans les processus de virulence, le projet aura pour objectif d’identifier des gènes exprimés de façon hétérogène par un pathogène au cours de l’infection. Pour cela, nous prévoyons d’utiliser la bactérie Citrobacter rodentium comme modèle d’étude car i) il s’agit d’une bactérie aux propriétés de virulence similaires à celles des EPEC et des EHEC et ii) c’est un agent pathogène intestinal naturel de la souris avec un processus infectieux très bien caractérisé dans la littérature.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Nous espérons identifier plusieurs gènes de C. rodentium dont l’expression est hétérogène lors de la première étape du processus infectieux. La mise en évidence de ces gènes est un point de départ pour i) comprendre comment C. rodentium s’adapte à l’environnement intestinal et prépare son expansion dans le côlon et ii) explorer si l’hétérogénéité phénotypique a un rôle dans la virulence de C. rodentium et plus largement dans la virulence d’agents pathogènes proches tels que les EPEC et les EHEC. A plus long terme, ces données pourraient conduire à de nouvelles pistes thérapeutiques via une interférence de l’expression de gènes clés dans l’adaptation des pathogènes à leur environnement infectieux.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux subiront un seul gavage intra-gastrique avec la souche infectieuse (durée~10sec). Les souris seront manipulés quotidiennement pendant 14 jours afin de récolter des féces.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La première procédure impliquant une infection des souris pendant 24h seulement ne génère aucune nuisance sur les animaux mise à part le gavage par voie orale. La seconde procédure évaluant le rôle des gènes identifiés sur la virulence de C. rodentium pendant 15 jours va quant à elle induire différents effets indésirables sur les animaux tels que perte de poids et inconforts associés à la pathologie intestinale.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des animaux prévus pour chaque procédure expérimentale sera euthanasié par dislocation cervicale. Les souris ayant été gavées avec des souches pathogènes, il est impossible de réhabiliter ces animaux ou de les transférer vers d’autres établissement expérimental pour réutilisation.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’objectif du projet est d’évaluer le rôle de l’hétérogénéité phénotypique au cours du processus infectieux. Il est donc nécessaire de réaliser ces essais chez l’animal afin de prendre en compte la complexité du tractus intestinal qui intègre à la fois la réponse immunitaire, la structure du tractus digestif ainsi que la présence du microbiote. Il n’existe pas de modèles cellulaires reproduisant la complexité de ces interactions. Cependant, les étapes de tri cellulaire prévues dans le projet seront d’abord réalisées in vitro en mélangeant une culture bactérienne seule ou en mélange avec des feces de souris dilués de facon à optimiser le process de tri sans devoir ajouter des animaux supplémenatires.
2. Réduction
Pour nos expérimentations, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé par une approche statistique. Ce nombre est nécessaire pour réaliser la sélection de gènes d’intérêt et pour répondre aux différentes questions scientifiques tout en gardant une puissance statistique suffisante dans le traitement de nos résultats, et pour palier à l’exclusion de certains animaux au cours de l’expérimentation. Il s’agit d’un nombre d’animaux maximal qui sera revu à la baisse en fonction des premiers résultats obtenus qui pourront dans certains cas ne pas nécessiter de répétitions pour valider les observations.
3. Raffinement
Les protocoles expérimentaux ont été raffinés à partir des données de la littérature et de notre expérience antérieure. Un enrichissement de l’environnement est prévu par ajout de cylindre de coton dans les cages. L’ensemble des animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié selon une grille de suivi clinique claire comprenant 4 stades distincts établis en fonction de la perte de poids et de l’état visuel des animaux (pelage et comportements). Si les points limites tels que définis dans le projet sont atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole expérimental et euthanasiés selon la réglementation en vigueur.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est l’hôte naturel de l’agent pathogène Citrobacter rodentium utilisé dans cette étude et constitue un bon modèle pour étudier les infections bactériennes intestinales chez les mammifères. Animaux de 4 à 6 semaines. L’utilisation d’animaux pesant entre 18 et 20 g le jour de l’infection permet de limiter la variabilité de réponse entre animaux vis-à-vis de l’infection