Procédures légères

338 souris reçoivent une ou deux injections intrapéritonéales de chimiothérapie, puis une injection intradermique cinq jours par semaine pendant quatre semaines qui leur induit une sclérodermie systémique. Elles développent une fibrose de la peau au point d'injection et une fibrose pulmonaire que le porteur qualifie de modérée, accompagnées de démangeaisons et parfois d'irritations cutanées dans les minutes qui suivent chaque piqûre. Vient ensuite l'injection intraveineuse de cellules CAR-T anti-CD19 ou d'un anticorps de référence, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées pour le prélèvement du sang, des poumons, de la rate et de la peau.

Objectifs

La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie auto-immune rare et hétérogène qui est caractérisée par le développement anormal d’une fibrose de la peau pouvant aussi atteindre les organes internes et d’anomalies vasculaires. C’est la maladie auto-immune avec la plus grande mortalité individuelle au sein des maladies systémiques et la première cause de mortalité associée à la SSc est l’atteinte pulmonaire. Les progrès thérapeutiques et de gestion des complications ont permis au cours des dernières décennies une amélioration de la survie liée à cette pathologie. Néanmoins, la mortalité reste trop élevée : 15% à 5 ans du diagnostic et 30 % à 10 ans. Le développement de nouvelles thérapeutiques est donc une nécessité. L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser le traitement par immunothérapie dans la sclérodermie systémique. Ce traitement utilise des cellules immunitaires prélevées chez le patient et génétiquement modifiées pour les rendre plus efficaces pour reconnaitre et éliminer les cellules responsables de la maladie après leur réinjection chez le patient. Cette thérapie cellulaire déjà approuvée dans le traitement de certains cancers est en cours de développement dans le traitement des maladies auto-immunes. Nous évaluerons si cette thérapie est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet montrera les effets bénéfiques du traitement par immunothérapie de la sclérodermie systémique tout en apportant de nouvelles connaissances sur les mécanismes d’actions de ce traitement.

Procédures

Les souris seront soumises à une ou deux injection(s) intrapéritonéale(s) de traitement de chimiothérapie ou à une injection intraveineuse d’un anticorps. Les souris pourront également être soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines du traitement induisant la sclérodermie systémique. Enfin, elles pourront recevoir une injection intraveineuse de l’immunothérapie ou de l’anticorps de référence.

Impact sur les animaux

L'injection intra-dermique permettant d’induire la sclérodermie systémique peut entrainer une gêne (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des irritations cutanées, qui pourront être apaisées par l'application d'un spray anti-inflammatoire. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires. Les risques d’embolie pulmonaire et de forte réaction inflammatoire liées à l’injection de l’immunothérapie ne sont a priori pas attendues ici grâce au conditionnement des souris qui sera réalisé au préalable et au contexte non tumoral de cette étude.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau).

Remplacement

Il est important de voir les effets thérapeutiques du traitement CAR-T (traitement utilisant des lymphocytes T de souris contenant une molécule récepteur antigène chimérique leur permettant de reconnaître une cible plus efficacement) au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une auto-immunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.

Réduction

Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire. Les expérimentations seront réalisées successivement afin de limiter au mieux le nombre d’animaux utilisés puisqu’en fonction des premiers résultats, les étapes suivantes seront réalisées ou non. L’expérience précédente que nous avons sur ce modèle nous a permis de dimensionner nos groupes d’animaux à 10 souris afin de garantir l’obtention de données exploitables et de réaliser toutes les analyses sur tissus qui permettront de caractériser l’effet thérapeutique obtenu et d’investiguer les mécanismes d’action du traitement testé. Ainsi, pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre maximal de 338 souris sera utilisé.

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel permettront de limiter le stress et la souffrance des animaux. Ils bénéficieront également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et afin de se construire un «nid». Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux (apparence physique, comportement) et un suivi bihebdomadaire des signes cliniques permettront d’avoir recours à des anti-douleurs adaptés si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, et à l’euthanasie dès que nécessaire.

Choix des espèces

Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps.

Les souris de ce projet sont hémophiles A sévères et portent en plus un récepteur plaquettaire humain, ce qui les expose à une hémorragie au moindre geste. 890 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit jusqu'à six injections intraveineuses hebdomadaires sous anesthésie et jusqu'à quatre prélèvements de sang, pour tester des molécules destinées à remplacer le facteur VIII chez les patients hémophiles. Une partie subit un prélèvement de sang de grand volume et est tuée immédiatement après, une autre une section de la veine de la queue sous anesthésie, suivie elle aussi d'une mise à mort immédiate, pour mesurer si les molécules testées arrêtent le saignement.

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but de générer de nouvelles molécules thérapeutiques, destinées à remplacer le Facteur VIII (FVIII) de la coagulation utilisé actuellement en thérapie chez les patients hémophiles A. La demi-vie dans le sang de ces molécules est augmentée tandis que leur capacité à induire une réponse immunitaire est réduite comparé au FVIII thérapeutique. Ces nouvelles molécules sont des protéines de FVIII modifiées ou des fragmetns d’anticorps (Région variable d’anticorps de camélidés). La validation de ces nouvelles molécules nécessite leur essai dans des modèles murins d’hémophilie A. Notre modèle de souris hémophiles A exprime aussi un récepteur plaquettaire humain à la surface de leur plaquettes sanguies ce qui permet de tester l’interaction du FVIII à la surface des plaquettes. Des résultats préliminaires positifs chez la souris permettront d’envisager leur essai chez l’homme.

Bénéfices attendus

La demi-vie des FVIII thérapeutiques de première génération n’excède pas 15 heures, ce qui oblige les patients à se traiter tous les deux jours pour prévenir les hémorragies et les dégradations articulaires. L'hémophilie A affecte 1 naissance de garçon sur 5000. C'est la plus fréquente des maladies hémorragiques graves. Des FVIII thérapeutiques à demi-vie allongée ont été générés au cours des 10 dernières années, mais, à l’exception notable d'un FVIII thérapeutiq dont la demi-vie atteint 35 heures, leurs demi-vies sont inférieures à 19 heures. Avec ces molécules, les patients doivent continuer à s’injecter fréquemment, entre 1 et 3 fois par semaine. En ciblant les plaquettes, nous espérons bénéficier de leur demi-vie de 7 à 9 jours, ce qui allègerait considérablement le traitement des patients et améliorerait leur qualité de vie. Ainsi, des résultats positifs représenteraient une avancée notoire pour le traitement de l’hémophilie A.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intraveineuses de molécules thérapeutiques innovantes à tester sur animaux anesthésiés. Six injections maximum seront réalisées de manière hebdomadaire, ces injections demandent moins de 1 minute d’immobilisation de l’animale. Les animaux seront également soumis à des prélèvements de sang sous anesthésie: 4 prélèvements maximum d’une durée inférieure à 1 minute. Afin d’évaluer les interactions des molécules thérapeutiques avec les plaquettes sanguines, un grand volume de sang est nécessaire et dans ce cas, les souris subiront un prélèvement de sang important sous anesthésie/ analgésie et seront euthanasiées immédiatement après. Certains animaux subiront également une section de la veine de la queue sous anesthésie et seront euthanasiés immédiatement après afin d’évaluer l’effet bénéfique des molécules thérapeutiques pour stopper le saignement.

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé est un modèle préclinique de l'hémophilie A sévère, des risques hémorragiques liés à l'absence du FVIII de la coagulation sont possibles en cas de blessure, de traumatisme, lors des injections ou prélèvements. Les procédures ont donc été adaptées à ce modèle. L'induction d'une douleur ou d'une lésion lors des injections et des prélèvements est possible. L'induction d'une détresse respiratoire ou d'une hypothermie sont possibles lors de l'anesthésie, de même qu'un stress lors du réveil.

Devenir

L'euthanasie des animaux est requise à l'issue des procédures afin d'évaluer l'activité pro-coagulante de nouvelles molécules thérapeutiques mais également leur demi vie dans l'organisme et leur capacité à stopper un saignement sans déclencher une réponse du système immunitaire. Dans le cadre de l'élevage, les animaux seront euthanasiés en fin de période reproductive ou s’ils ne disposent pas du génotype nécessaire dans les expériences du présent projet.

Remplacement

Le projet fera appel à un modèle expérimental chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment les mécanismes d'éliminations des molécules thérapeutiques circulantes). Aucun système in vitro actuel ne permet de déterminer les paramètres pharmaco-cinétiques de molécules, leur effet hémostatique ou leur immunogénicité.

Réduction

Le nombre de répétitions des expériences sera défini de manière rationnelle. Si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs avec une puissance appropriée, elle ne sera pas répétée. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés. Ainsi, aucune expérience supplémentaire ne devra être faite si des questions nouvelles surviennent. Un total maximum de 890 animaux est prévu pour ce projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux disposent de nourriture et de l’eau ad libitum. L’environnement est enrichi par ajout de nids végétaux et de tunnels en carton. Les souris seront hébergées avec un maximum de 5 souris par cage. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Des points limites ont été définis et les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.

Choix des espèces

La seule alternative connue à l’utilisation d’un modèle murin est l’utilisation d’un modèle canin hémophile. Cependant, la souris est la seule espèce qui permet d’avoir un nombre d’individus de même âge suffisant, de génotype homogène, qui permet l’obtention de résultats statistiquement fiables, et pour lequel les outils nécessaires à l’étude de la réponse immunitaire sont disponibles sans restriction. Nous avons généré et validé in vitro deux nouvelles molécules dont nous avons démontré : l’activité pro-coagulante et la capacité à se lier à un récepteur plaquettaire. Pour démontrer l’efficacité hémostatique et pharmaco-cinétique de nos molécules et évaluer leur immunogénicité, nous devons utiliser des souris hémophiles A exprimant ce récepteur plaquettaire. Des souris adultes, âgées de 7-14 semaines en début d’expérimentation (systèmes immunitaires et hémostatiques matures) seront utilisées. L’utilisation de ce modèle est la seule solution pour apporter la preuve de concept de la faisabilité de notre approche avant de breveter nos molécules et d’envisager des essais en clinique humaine.

900 souris et 900 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacun recevant jusqu'à quatre traitements par jour, soit 68 administrations au total, après deux applications d'une substance allergisante sur la peau. S'y ajoutent jusqu'à sept mesures de l'épaisseur des oreilles, des prélèvements sanguins quotidiens, un rasage et, pour certains, une mise à jeun de moins de seize heures avant le prélèvement terminal. Tous sont tués à la fin, une partie pour les prélèvements, l'autre parce que le porteur juge impossible de les replacer ou de les réutiliser après un traitement aux effets inconnus à long terme. Ces 1 800 animaux sont répartis sur 30 études menées en cinq ans, dont le porteur attend de participer à la sélection de traitements contre les inflammations cutanées et de mieux connaître la prédictivité de ses propres modèles.

Objectifs

Les inflammations cutanées comme par exemple les dermatites de contact, les dermatites atopiques et le psoriasis impliquent une réaction inflammatoire cutanée résultant de l'exposition à diverses substances. On recense actuellement jusqu'à 4000 molécules potentiellement allergisantes. Les seuls traitements disponibles sont les médicaments à base de corticostéroïdes qui ont des effets non désirés. La recherche actuelle porte sur le développement de nouveaux médicaments comme des anti-inflammatoires non-stéroïdiens. Chez les rongeurs, la mesure de la réaction cutanée après application d’un agent allergisant est un modèle standard validé par la communauté scientifique. Dans ce projet, ces différents inducteurs allergisants sont utilisés pour déclencher une inflammation cutanée chez les rongeurs puis des molécules en développement sont évaluées pour leur aptitude à modifier l’inflammation induite.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter les inflammations cutanées. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.

Procédures

Les animaux de ce projet seront tous amenés à subir deux contacts avec une molécule allergisante. Ils ont un maximum de 4 traitements par jours soit 68 administrations au total. Ce nombre de traitement se rapproche des prises quotidiennes chez l’Homme, notamment lorsque les médicaments ne sont pas disponibles sous forme à libération prolongée ou dans le cas de la prise de plusieurs types de médicaments, en parallèle les animaux effectueront un maximum 7 mesures de l’épaisseur de leurs oreilles. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins journaliers (ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) afin de pouvoir suivre des paramètres plasmatiques. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée ce temps comprenant systématique une compression finale afin de contrôler l’hémostase. L’immunisation application sur la peau du ventre dure 5 min alors que les mesures d’épaisseur d’oreille prennent 3-4min.

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Une gêne liée au rasage peut également être attendue. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) peut apparaître. L’application d’inducteur sur le plan cutané peut induire des rougeurs et des démangeaisons. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des phénomènes inflammatoires et allergiques nécessite une observation globale, uniquement possible chez l’animal vivant. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. Quand, chaque animal peut être utilisé comme son propre contrôle, les animaux non induits ne sont pas mis en œuvre. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 30 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en œuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu. Pour les rats, nous proposons un tunnel en carton afin de leur permettre de se cacher et des boules de bois permettant de jouer et de grignoter. Pour les souris nous proposons un tunnel en carton accroché à la grille de la cage afin d’en augmenter le volume utile, une maisonnette en carton afin de permettre aux animaux de se cacher, et de la frisure pouvant servir de matériel de nidification, de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Nous privilégions les administrations et les prélèvements de sang sous anesthésie autant que possible. De plus, nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui serait inattendue. Si le traitement par le composé à tester induit des souffrances, nous envisagerons, en accord avec notre sponsor, la modification des doses ou l’arrêt du traitement. Si aucune solution n’est possible, l’animal sera euthanasié. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA (Structure du Bien Être Animal) sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats ou souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des rats de 10-12 semaines ou des souris de 7-8 semaines au moment du début de l’expérience. En effet, la dermatite peut apparaître à n'importe quel âge, mais elle survient préférentiellement chez l'adulte jeune.

Tester des combinaisons de médicaments déjà autorisés contre un lymphome T rare conduit à greffer des cellules tumorales de patients dans des souris privées de système immunitaire. 991 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 675 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent les cellules tumorales par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée sous anesthésie, puis un prélèvement de sang chaque semaine pour suivre les cellules tumorales circulantes, et de sept à vingt-et-un jours de traitement par injections intrapéritonéales. Le porteur fixe la mise à mort au moment où la tumeur atteint le "maximum tolérable" et affirme que sa croissance ne semble pas faire souffrir l'animal jusqu'à ce seuil, les souris dont la tumeur ne se développe pas étant gardées six semaines puis tuées.

Objectifs

Notre projet de recherche vise à surmonter les défis associés à l'étude du lymphome T angioimmunoblastique, une maladie caractérisée par une prolifération anormale de lymphocytes T. En raison de l'absence de modèles de culture cellulaire représentatifs, nous avons opté pour des modèles de souris basés sur des xénogreffes, en implantant des cellules tumorales de patients dans des souris immunodéprimées. Cette approche permet non seulement d'établir des lignées de lymphome pérennes mais aussi de tester l'efficacité de traitements en combinaison avec d'autres thérapies disponibles. Nous utiliserons 991 souris sur 5 ans pour obtenir des conclusions robustes sur l'efficacité des traitements, tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Les procédures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie pour minimiser l'inconfort pour les animaux, avec l'assurance que les traitements testés ne seront pas toxiques pour les souris. En utilisant ces modèles, nous espérons non seulement mieux comprendre les mécanismes de la maladie mais également identifier des thérapies potentielles pour améliorer le pronostic des patients atteints de ce lymphome difficile à traiter.

Bénéfices attendus

Notre projet utilise actuellement 28 lignées différentes de lymphome T angioimmunoblastique, avec une dizaine de plus en cours de développement, pour représenter l'hétérogénéité moléculaire et mutationnelle de cette maladie complexe. Cette approche nous permet de tester des traitements en fonction des profils mutationnels des modèles, ouvrant la voie à des combinaisons de traitements plus personnalisées. Notre but sera de tester des combinaisons de traitements déjà approuvé pour potentialiser les effets en fonction des profils mutationnels et pour faciliter ainsi une potentielle transition rapide de la recherche vers les essais cliniques et vers une utilisation clinique plus étendue. Bien que nous ayons recours à l'injection de cellules tumorales chez les souris pour générer nos modèles en l'absence de lignées cellulaires représentatives, cette approche diversifiée nous permet de mieux caractériser le lymphome T angioimmunoblastique et de comprendre quelles manipulations pourraient améliorer le pronostic vital des patients, actuellement limité à 5 ans.

Procédures

Nous allons injecter des cellules tumorales en intrapéritoénale ou par voie sous cutanée sur des souris anesthésiées. 2 semaines après l'injection, nous allons leur prélever du sang sur des souris endormies pour voir la proportion de cellules tumorales circulantes ce qui nous permettra de savoir quand débuter les traitements. Pour les traitements, nous allons séparer les souris en différents groupe pour tester différentes molécules et la combinaison de ces molécules. Pour cela, leur traitement variera de 7 jours à 21 jours en fonction des traitements avec des injection en intrapéritoénale. Nous préleverons du sang sous anesthésie toutes les semaines pour ainsi voir la progression de la proportion des cellules tumorales. Nous euthanasierons les souris sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Nous allons injecter des cellules tumorales en intrapéritoénale ou par voie sous cutanée sur des souris endormies ce qui provoquera une douleur légère aux souris. 2 semaines après l'injection, nous allons leur prélever du sang quand les souris seront endormies. Cela leur provequera une douleur modérée. Nous sacrifierons les souris sous anesthésie.

Devenir

Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mis à mort quand le volume tumoral attendra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de souffrance pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines après traitement (durée la plus couramment publiée) puis euthanasiées pour analyse.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de modèles de culture cellulaire spécifiques pour le traitement des lymphomes angioimmunoblastiques. Ce type de lymphome présente des caractéristiques biologiques complexes et hétérogènes, rendant difficile la création de modèles in vitro représentatifs. L'absence de ces modèles limite la capacité des chercheurs à étudier les mécanismes pathogéniques de manière détaillée et à tester efficacement de nouvelles thérapies ciblées. La recherche dans ce domaine se concentre donc souvent sur des modèles in vivo et sur des analyses cliniques, bien que le développement de modèles cellulaires appropriés reste un objectif important pour l'avenir. Nous utilisons des souris spéciales sans système immunitaire pour implanter des tumeurs humaines, ce qui nous permet de recréer fidèlement les caractéristiques du lymphome T angioimmunoblastique observées chez l'homme. Avec 28 types différents de ce lymphome, ces modèles de souris nous aident à comprendre la diversité des tumeurs et à observer comment différents sous-types de la maladie réagissent à divers traitements. Cela est essentiel pour développer des thérapies personnalisées. En testant l'efficacité de nouveaux traitements ou de combinaisons de traitements nous pouvons évaluer leur efficacité et sécurité avant de passer aux essais cliniques chez l'homme. En résumé, l'utilisation de ces souris dans notre projet est cruciale pour reproduire la maladie humaine, évaluer les traitements, comprendre les mécanismes de résistance, valider de nouvelles cibles thérapeutiques, et contribuer à la recherche biomédicale, afin d'améliorer les traitements pour les patients atteints de lymphome T angioimmunoblastique.

Réduction

Pour limiter le nombre de souris utilisées, nous avons d'abord effectué des tests en laboratoire sur des cellules dérivées de tumeurs humaines implantées dans des souris. Ces tests nous ont permis d'évaluer l'efficacité et la toxicité des traitements et de sélectionner les combinaisons les plus prometteuses, réduisant ainsi le nombre de tests nécessaires sur les souris. Nous avons testé différentes combinaisons de traitements et nous avons sélectionné trois combinaisons avec 3 molécules déjà mises sur le marché. Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous avons utilisé des calculs statistiques ce qui nous a permis de déterminer le nombre de souris par groupe par traitement. Ainsi, nous avons besoin d'au moins 11 souris par groupe pour garantir la validité des tests. Pour établir les modèles de tumeurs, nous injecterons 5 souris par voie permettant la meilleure greffe (soit intrapéritonéale, soit sous-cutanée). Nous maintiendrons ces lignées en utilisant le minimum de souris possibles, soit 2 par passage et par voie de greffe.

Raffinement

Afin de limiter la souffrance et la douleur des animaux, des points limites précis ont été définis (volume maximum de la tumeur , perte de poids...). Aussi, lors des phases d'implantation des PDX, les souris seront anesthésiées sous isoflurane. Dans notre laboratoire, nous mettons en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Les cages sont spacieuses et équipées de litières absorbantes et non toxiques, renouvelées régulièrement pour assurer un environnement propre. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, tels que des tunnels, des roues d'exercice, et des matériaux de nidification, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Les souris sont maintenues à une température et une humidité contrôlées, avec un cycle lumière/obscurité approprié pour respecter leur rythme circadien. De plus, nous effectuons des évaluations régulières de la santé et du comportement des animaux, et ajustons les conditions d'hébergement en fonction des besoins spécifiques identifiés. Ces pratiques de raffinement sont essentielles pour garantir le bien-être des souris tout en obtenant des résultats expérimentaux fiables et reproductibles.

Choix des espèces

En l'absence de modèles en culture cellulaire, nous devons utiliser un modèle animal pour étudier le lymphome T angioimmunoblastique. Selon de nombreuses études le modèle de souris est le plus fiable pour caractériser ce lymphome. Nous utilisons des souris immunodéficientes, c'est-à-dire sans système immunitaire fonctionnel pour éviter les rejets de greffes. Ainsi, nous pouvons implanter des cellules tumorales humaines dans ces souris. Nous pouvons alors caractériser ce lymphome et créer des traitements plus personnalisés en fonction du profil mutationnel des patients. Nous allons sélectionner des jeunes souris adultes âgées de 6 à 10 semaines. Ces souris ont terminé leur croissance et reflètent mieux la physiopathologie du lymphome T angioimmunoblastique, dont les tumeurs apparaissent principalement chez les adultes. En standardisant l'âge des souris, nous améliorons la reproductibilité de nos expériences.

Rendre des lignées de souris exemptes de pathogènes pour qu'elles puissent entrer dans le maximum d'animaleries du monde entier : c'est le service qu'une plateforme propose ici à d'autres laboratoires. 5 305 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles sont vasectomisés à cinq semaines et maintenus en accouplement pendant deux ans avant d'être tués. Les femelles donneuses reçoivent deux injections d'hormones puis sont tuées à cinq semaines, le prélèvement d'ovocytes imposant leur mise à mort, tandis que les femelles receveuses subissent une chirurgie de réimplantation d'embryons. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne recrée la complexité d'un "organisme entier" et justifie l'opération par l'harmonisation du statut sanitaire entre établissements.

Objectifs

Les animaleries d'hébergement gèrent leur statut sanitaire. Suivant le statut sanitaire d'une animalerie, il se peut que des animaux ne puissent pas être transférés d'un établissement utilisateur vers un autre ce qui peut être un frein à un projet et au bon déroulement de la recherche scientifique. De plus, harmoniser le statut sanitaire des animaux permet de diminuer l'hétérogénéité entre les individus et donc d'améliorer les résultats des différents projets. Pour pallier à ce problème de statut sanitaire, la plateforme scientifique propose à la communauté scientifique de réaliser la décontamination de leurs animaux. Ceci signifie : rendre des animaux dépourvus de pathogènes spécifiques pour pouvoir permettre leur importation dans le maximum d'animalerie du monde entier.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont 1) permettre des importations d'animaux dans un grand nombre d'animalerie grâce à leur statut sanitaire exempts de pathogènes et d'opportunistes spécifiques 2) contribuer aux développements et aux collaborations dans les projets de recherche 3) réduire les biais dans les résultats scientifiques en diminuant l'hétérogénéité entre les animaux. Les lignées décontaminées sont nécessaires dans le cadre de nombreux projets scientifiques préalablement validés qui permettront de répondre à des questions scientifiques précises et aux enjeux de santé/société (domaines de recherche : pathologies respiratoires, musculaires, du système nerveux, métaboliques, cardiovasculaires ou génétiques).

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales d'hormones (vigil, 2x par femelles donneuses, quelques secondes) ou une chirurgie de vasectomie sous anesthésie et analgésie (1x par mâle, 10 minutes) ou une chirurgie de réimplantation d'embryons sous anesthésie et analgésie (1x par femelles receveuses, 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales pourront induire un stress et une douleur de courte durée aux animaux. Les chirurgies peuvent induire des difficultés post-opératoire comme des douleurs ou une mauvaise cicatrisation. Les anesthésies pourront engendrer une baisse de la thermorégulation. L'hébergement individuel des mâles pourra engendré un stress.

Devenir

Une femelle receveuse sur trois sera exportée en laboratoire d'analyse pour obtenir les résultats sanitaires et valider la procédure de décontamination des animaux. Les autres animaux seront euthanasiés à la fin du projet : les mâles vasectomisés lorsqu'ils ne seront plus de bons reproducteurs (2 ans), les autres femelles receveuses (deux sur trois) à 4 mois de vie après le sevrage des souriceaux car elles ne pourront pas avoir une seconde chirurgie puis les femelles donneuses d'ovules à 5 semaines de vie car le prélèvement nécessite l'euthanasie.

Remplacement

Actuellement il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Un organisme vivant est donc nécessaire pour mener à bien les divers projets scientifiques autorisés au sein de l'établissement. La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. La décontamination d'une lignée murine nécessite obligatoirement qu'elle soit respirante. La souris ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.

Réduction

5305 animaux pourront être utilisés dans ce projet pour les 5 ans. Le nombre de mâles et de femelles utilisées par lignée pour les transferts d'embryons est le minimum requis pour obtenir les animaux d'intérêt suite à la redérivation. Les mêmes mâles vasectomisés sont utilisés pendant 2 ans. Les lignées décontaminées seront utilisées dans un projet de recherche autorisé. La plateforme scientifique propose la cryoconservation de sperme si une lignée n'est plus utilisée dans un projet de recherche. Ceci permet de conserver une lignée de manière non respirante et donc d'éviter de produire des animaux uniquement pour le maintien d'une lignée. Il n'y a pas de tests statistiques ou de calcul de puissance mais cela sera systématiquement appliqué dans le cadre de l'utilisation continue des animaux au sein des projets de recherche qui découlent de ces élevages.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum les nuisances. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les chirurgies sont réalisées par des spécialistes sous anesthésie et analgésie pour garantir le bien être des animaux. L'analgésie est poursuivie en post-opératoire et des croquettes humidifiées seront disposées au fond de la cage pendant 1 semaine. Les animaux nécessitant un hébergement individuel bénéficieront de 3 enrichissements dans leur cage. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. La surveillance attentive quotidienne sera accompagnée de points limites définis.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. En effet, il existe de nombreux modèles génétiquement modifiés pour de très nombreuses pathologies humaines. Les mâles vasectomisés sont vasectomisés à 5 semaines. Les femelles receveuses sont utilisés à partir des 8 semaines car elles doivent être matures sexuellement. Les femelles donneuses d'ovule sont utilisées à 5 semaines. Les injections d'hormones doivent se faire sur des femelles prepubères pour maximiser le nombre d'ovules relachés et, ainsi, améliorer le taux de reusite de la décontamination. Les mâles pour accouplement sont utilisés entre 8 et 15 semaines.

Destinées à alimenter d'autres projets autorisés, 5 210 souris porteuses d'un gène humain muté impliqué dans la sclérose latérale amyotrophique naissent dans cet élevage, 2 610 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 600 un niveau léger. Chacune subit le prélèvement d'un bout de queue pour être génotypée. Ces souris développent une dégénérescence progressive des motoneurones, et le porteur écrit qu'il ne laissera pas les symptômes se développer, la plupart des animaux étant mis à mort au plus tard à soixante jours et les mâles reproducteurs à quatre-vingt-dix jours. La plupart partent vers d'autres projets autorisés, les mâles reproducteurs et celles qui n'y sont pas retenues étant tuées.

Objectifs

Il s'agit d'une procédure d'élevage de souris modèles de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). La SLA appelée aussi Maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative touchant spécifiquement des neurones, appelés motoneurones, qui innervent les muscles. La maladie se déclare à l’âge adulte, elle provoque la paralysie du patient et son issue est fatale. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer plusieurs modèles murins de la SLA. Toutefois, les mécanismes conduisant à la dégénérescence spécifique des motoneurones restent inconnus. Il a toutefois été montré que la dégénérescence des motoneurones est due à des interactions complexes avec les muscles mais aussi avec plusieurs types cellulaires (neurones, cellules gliales) dans le système nerveux central. Les recherches actuelles ont pour objet 1) d'éclaircir les mécanismes conduisant à la dégénérescence des motoneurones spinaux, 2) de découvrir un traitement qui puisse ralentir l'évolution de la maladie.

Bénéfices attendus

Les animaux issus de cet élevage serviront à étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et d'essayer de découvrir un traitement destiné à ralentir les symptômes de cette maladie.

Procédures

Prélèvement d'un petit bout de queue pour génotyper les animaux.

Impact sur les animaux

Nous ne laisserons pas les symptômes de la SLA se développer. En effet, la plupart des animaux de cet élevage seront mis à mort au plus tard à l'âge de 60 jours (à ce stade les symptômes sont inexistants ou quasiment imperceptibles). Les mâles reproducteurs seront seront mis à mort au plus tard à l'âge de 90 jours où les symptômes sont légers et n'entravent pas les mouvements de l'animal.

Devenir

La plupart des animaux issus de cet élevage seront utilisés dans des projets autorisés. Seuls les mâles reproducteurs et les animaux non-utilisés dans des projets autorisés seront mis à mort.

Remplacement

La SLA est une maladie de l'adulte, or à ce stade, les motoneurones spinaux, qui sont les cellules qui dégénèrent dans cette maladie, ne peuvent pas être étudiés dans des systèmes in vitro dans lesquels ils ne survivent pas à ce stade du dévelopement (tranches de moelle épinière, moelle épinière entière ex vivo). De plus, nous savons que la dégénrescence des motoneurones dépend étroitement de leur environnement cellulaire dans la moelle épinière (circuits neuronaux spinaux, cellules gliales comme les astrocytes, les cellules microgliales et les olygodendrocytes) et des interactions que font leurs axones moteurs à la périphéries avec les cellules de Schwann et les fibres musculaires. Pour ces raisons, les études des mécanismes physiopathologiques de la SLA et aussi les effets de traitements éventuels ne peuvent se faire que sur l'animal entier.

Réduction

Cet élevage sera utilisé pour un ensemble de projets de recherche destinés à mieux comprendre les mécanismes de la SLA et découvrir un traitement potentiel pour ralentir l'évolution de la maladie chez les patients humains.

Raffinement

L'élevage est conçu pour apporter le moins d'inconfort possible aux animaux. Les animaux seront soit utilisés, soit mis à mort avant l'apparition de symptômes susceptibles d'entraver leurs mouvements.

Choix des espèces

La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la SLA. Nous utiliserons ici des souris dans lesquelles un gène humain muté, connu pour être impliqué dans la SLA, a été inséré par transgénèse dans le génome des souris. Histologiquement, ces souris présentent une dégénérescence progressive des neurones moteurs spinaux et aussi des neurones du cortex moteur, reproduisant les atteintes spinales et corticales caractéristiques de cette maladie. Cette souris est un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet de thérapies potentielles. Les animaux utilisés seront des animaux adultes car la SLA est une pathologie qui touche les adultes.