Procédures légères

1 326 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour la plupart, modéré pour 60 d'entre elles. Elles reçoivent des injections d'oligosaccharides bactériens comme les LPS, et 60 subissent en plus une chirurgie sous anesthésie pour prélever un organe lymphoïde. L'objectif est d'identifier les signatures immunitaires déclenchées par ces molécules dans l'"organisme entier", pour repérer des cibles de futures stratégies anti-bactériennes et vaccinales, des retombées thérapeutiques lointaines. Le porteur affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" et que l'approche animale est "inévitable", aucun autre modèle comme le poisson-zèbre ou la mouche n'ayant un système immunitaire assez proche de l'humain.

Objectifs

Objectif n°1: Identification in vitro et in vivo des signatures immunologiques, cellulaires et moléculaires associées à la réponse à différents oligosaccharides bactériens (LPSs et CbG) à partir des données obtenues avec la procédure 1 (analyses de cellules primaires in vitro). Procédure expérimentale 2. Objectif n°2: Utilisation des signatures identifiées lors de la procédure expérimentale 2 pour analyser le rôle de certains organes lymphoïdes, comme l'omentum (sans que ce soit limitatif), dans la réponse des souris à nos différents oligosaccharides bactériens (LPSs et CbG). Procédure expérimentale 3. Au total, cette étude devrait identifier les éléments structuraux des oligosaccharides bactériens objets de notre intérêt qui sont responsables d'une signalisation activatrice et/ou inhibitrice sur les cellules de l'immunité et conduire à la découverte de nouvelles molécules/voies de transduction déclenchées dans l'organisme entier par des LPSs ou des motifs particuliers de ces LPSs, ou par le CbG de bactérie intracellulaire, et qui serviront de cibles pour mettre au point de nouvelles stratégies anti-bactériennes et vaccinales.

Bénéfices attendus

Au total, cette étude devrait identifier les éléments structuraux des oligosaccharides bactériens objets de notre intérêt qui sont responsables d'une signalisation activatrice et/ou inhibitrice sur les cellules de l'immunité et conduire à la découverte de nouvelles molécules/voies de transduction déclenchées dans l'organisme entier par des LPSs ou des motifs particuliers de ces LPSs, ou par le CbG de bactérie intracellulaire, et qui serviront de cibles pour mettre au point de nouvelles stratégies anti-bactériennes et vaccinales.

Procédures

Il n’est attendu aucun stress significatif, ni douleur physique des souris à la suite des deux premières procédure. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum (530 cm²). La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes ou bi-hebdomadaires pour le suivi des animaux seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Pour la dernière procédure 60 animaux seulement,lLa petite chirurgie envisagée pratiquée sur souris anesthésiées (100µL kétamine/xylazine/10g de poids corporel, mélange anesthésiant réalisé par le personnel compétent de l’animalerie) est susceptible d'engendrer un stress et douleur physique modérés des souris, qui après récupération seront injectées avec nos oligosaccharides sans stress significatif ni douleur à la suite de ces injections. En cas de tout signe de douleur, souffrance ou d’angoisse suite à l’intervention, un analgésique (buprénorphine) sera injecté en sous-cutané, à raison de 1-2mg/kg de poids corporel. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum (530cm²). La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier absorbant seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. Nos visites quotidiennes pour le suivi des animaux seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris.

Impact sur les animaux

Il n’est attendu aucun stress significatif, ni douleur physique des souris à la suite de cette procédure proprement dite (cf. commentaire ci-dessus). Les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum (530 cm²). La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes ou bi-hebdomadaires pour le suivi des animaux seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort

Remplacement

Le but de ce projet est de définir précisément les voies de signalisation mises en oeuvre par l'exposition du système immunitaire d'un mammifère à divers oligosaccharides (LPSs ou CbG) de façon à déterminer les éléments structuraux de ces molécules responsables du déclenchement d’une signalisation activatrice et/ou inhibitrice dans les différentes cellules de l'immunité. L’utilisation d’animaux est donc indispensable. Notre connaissance du rôle mécanistique de ces différents oligosaccharides dans la réponse cellulaire et moléculaire d’un hôte proche de l’homme apportera des informations essentielles, qui ouvriront la voie à de nouvelles thérapies anti-bactériennes et vaccinales et rendent l’approche animale inévitable.

Réduction

En ce qui concerne les animaux produits dans l'animalerie du CIML, les femelles seront utilisées dans la mesure du possible pour les expériences in vivo et un mélange mâle-femelle pour les cultures cellulaires de façon à diminuer le nombre de souris à produire. La réduction du nombre d’animaux sera réalisée par la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal.

Raffinement

L’hébergement des animaux se fera en confinement protégé en cages individuellement ventilées, à raison d'un maximum de 5 souris par cage, dans une animalerie de type A1+, avec eau et boisson à volonté. L’environnement est enrichi par ajout de dômes, papier et copeaux compressés utiles à la nidification. Un délai d’une semaine entre la réception des souris et la date d'expérimentation sera respecté. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience ou avant s'ils présentent des signes de souffrance ou détresse.

Choix des espèces

Le but de ce projet est de caractériser en détail au niveau moléculaire l'impact de l'administration de divers LPSs ou de CbG sur la réponse du système immunitaire dans l'organisme entier et de déterminer les éléments structuraux de ces oligosaccharides responsables de la signalisation activatrice et/ou inhibitrice sur les cellules de l'immunité de façon à proposer de nouvelles thérapies anti-bactériennes et vaccinales. Aucun autre organisme modèle (poisson-zèbre ou mouche) ne permet de répondre à cette question puisque leur système immunitaire est trop éloigné de celui de l'homme, dont le modèle murin est le plus proche tant du point de vue anatomique que physiologique. La caractérisation extensive du système immunitaire murin et les outils techniques, qui en découlent (anticorps pour cytométrie en flux, immunofluorescence et analyse par western ou immunoprécipitation, génome séquencé etc.), constituent des arguments supplémentaires qui font de la souris le modèle le plus pertinent pour notre étude. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes âgées de 6-8 semaines pour la mise en culture et la différenciation des cultures primaires de moelle osseuse en cellules dendritiques car cette différenciation est impossible plus tardivement. En ce qui concerne les cultures primaires de macrophages issus de moelle osseuse des souris de 8-10 semaines seront utilisées pour les même raisons. Nous utiliserons des souris adultes avec une maturité complète du système immunitaire de 8-14 semaines pour les mises en culture de macrophages péritonéaux et les expériences in vivo.

160 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Leur cerveau est irradié aux rayons X en trois séances de 10 Gy, avec prises de sang, IRM cérébrales et musculaires, puis une batterie de tests comportementaux nommés, open-field, test de fatigue, croix surélevée, préférence au sucrose, reconnaissance d'objets et labyrinthe en Y. Le porteur indique que l'irradiation provoque fatigue, perte de poids et dégradation de l'état général, avec porphyrine autour des yeux et pelades sur la tête, et cherche à savoir si l'activité physique et la remédiation cognitive atténuent ces effets. Les retombées annoncées se limitent à des arguments supplémentaires pour les cliniciens afin d'améliorer la qualité de vie des patients traités par radiothérapie.

Objectifs

Le projet analysera les effets de l’irradiation encéphalique par rayons X sur le cerveau et sur les muscles squelettiques, déterminera les mécanismes sous-jacents à ces atteintes tissulaires et évaluera l’intérêt de stratégies thérapeutiques comme l’activité physique spontanée et la remédiation cognitive pour atténuer ces altérations cérébrales, musculaires ainsi que la fatigue et les déficits cognitifs. Ce projet fera suite aux travaux de thèse réalisés au sein de l’équipe, visant à évaluer l’impact de l’activité physique forcée sur les atteintes cérébrales et musculaires radio-induites chez le rat adulte. Notre projet permettra donc de comparer les effets de l’activité physique forcée et spontanée ainsi que d’évaluer l’intérêt de la remédiation cognitive associée ou non à l’activité physique spontanée pour réduire les altérations musculaires, la fatigue et les déficits cognitifs radio-induits.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d'évaluer les effets négatifs de l'irradiation cérébrale sur le tissu sain et de déterminer l'intérêt de l'activité physique spontanée ou forcée, associée ou non à une remédiation cognitive chez le rat. Il permettra donc l'apport d'arguments supplémentaires aux cliniciens pour améliorer la qualité de vie des patients atteints de cancers qui nécessitent l'utilisation de traitement et d'optimiser leurs soins de support.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes procédures comme des prélèvements sanguins (2 fois pendant 5min maximum) et une irradiation cérébrale globale (irradiation fractionnée en 3 fois 10Gy pendant 3min). Ils seront également soumis à des acquisitions IRM cérébrales (2 fois pendant 45min) et musculaires (2 fois pendant 15min). L'ensemble des animaux réaliseront également des tests de comportement : test de l'openfield (activité locomotrice), test de fatigue (fatigue) , test de la croix surélevée (anxiété), test de préférence au sucrose (dépression) , test de reconnaissance d'objets (mémoire à court terme), le labyrinthe en Y (mémoire spatiale). L'ensemble des tests est réalisé 2 fois (à 2sem et 1mois après irradiation). La durée de chaque test est comprise entre 10 et 20 minutes.

Impact sur les animaux

A la suite de l'irradiation cérébrale, les animaux seront fatigués, présenteront une perte de poids (graisseuse et musculaire) et pourront présenter des signes de leur dégradation de leur état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête). L'intérêt de ce projet est d'évaluer l'intérêt de l'activité physique et de la remédiation cognitive pour atténuer et réduire ces effets indésirables. De plus, des soins seront apportés aux animaux irradiés comme du sérum physiologie pour nettoyer la présence de porphyrine ou l'ajout d'une crème cicatrisante pour la pelade sur la tête.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue des procédures #1, 2, 3, 4. Ils seront mis à mort lors de la procédure #5.

Remplacement

L’évaluation des effets de l’activité physique et de la remédiation cognitive après une irradiation encéphalique nécessite l’utilisation d'animaux. Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant une analyse intégrée des phénomènes complexes induits par l’irradiation cérébrale et permettant d’évaluer l’intérêt thérapeutique de l’activité physique en association ou non avec la remédiation cognitive.

Réduction

Grâce à l'utilisation au préalable de tests statistiques appropriés et à l'utilisation de techniques d'investigation non invasives (imagerie IRM, tests comportementaux), le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une puissance des résultats sera réduit au minimum. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est estimé à 160 rats répartis en 8 groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés aux normes requises, avec un ou plusieurs enrichissements dans les cages (roue d’activité, stimulation sensorielle par différents objets, stimulation sociale avec un hébergement avec plusieurs animaux par cage) ; le personnel participant au projet est formé et les inspections du bien-être des animaux seront réalisées quotidiennement. De plus, toutes les mesures visant à réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux seront entreprises, notamment en appliquant une anesthésie et une analgésie appropriées. Enfin, les points limites spécifiques et de critères d'arrêt de souffrance seront utilisés afin de réduire toute souffrance ou douleur chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat possède un cerveau dont la taille est supérieure à la souris et qui est compatible avec les appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée (Irradiateur X-Rad 225CX) ainsi qu’une imagerie de haute résolution (IRM 7T Pharmascan). D’autre part, plusieurs tests comportementaux visant à évaluer les déficits moteurs et cognitifs sont bien décrits chez le rat. Enfin, nous avons développé au sein du laboratoire un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat, pour lequel nous avons déjà très bien caractérisé les dommages cérébraux ainsi que les modifications comportementales (fatigue, mémoire, comportements de type anxiété et de type dépression) jusqu’à 6 mois après irradiation encéphalique. Ainsi nous maitrisons très bien ce modèle animal que ce soit dans le décours temporel de sa physiopathologie et aussi en termes de prise en charge du bien-être animal. Les animaux utilisés auront un poids d'environ 400g, âgés de 6 mois au début du protocole expérimental. Cet âge correspond à l’âge adulte mature chez le rat et est équivalent à l’âge de 18 ans chez l’Homme. A ce stade de développement chez le rat, la substance blanche est complètement mature, ce qui représente un critère très important pour modéliser les atteintes cérébrales observées chez le patient adulte traité par radiothérapie. De plus, à l’âge de 6 mois, le rat présente le maximum de sa croissance squelettique et a atteint sa masse musculaire et sa force musculaire optimales (pic atteint entre 6 et 8 mois chez le rat Wistar).

4 395 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Selon les expériences, elles sont immobilisées vivantes dans un gel d'agarose, soumises à l'ablation de neurones au laser, à l'ablation chirurgicale des deux yeux, au retrait des otolithes d'une oreille ou à la destruction des cellules sensorielles de la ligne latérale par un bain de sulfate de cuivre, pour enregistrer l'activité du cerveau entier. Le porteur justifie le nombre par le fait que seule une petite proportion des larves d'élevage sert au renouvellement de la population, les autres étant utilisées puis tuées. Il affirme que la complexité du système nerveux central "ne peut être reproduite in vitro" et présente ce modèle comme un remplacement partiel de l'expérimentation sur des mammifères.

Objectifs

Comprendre comment le cerveau intègre les multiples informations sensorielles dans son environement afin de produire un comportement approprié est un objectif fondamental des neurosciences. La dynamique cérébrale qui sous-tend ces mécanismes d'intégration est largement distribuée à travers l'ensemble du système nerveux. Son étude requiert donc de pouvoir enregistrer à l'échelle cellulaire l'activité d'une large fraction des neurones. A l'heure actuelle, il n'existe pas de système de réseau de neurones in-vitro comparable à un cerveau entier. La compréhension de sa structure à grande échelle nécessite donc le recours à l'expérimentation animale. Nous utiliserons un organisme modèle vertébré, la larve de poisson zèbre, (Danio Rerio). Cet animal présente à l'état larvaire un ensemble d'atouts - comportements stéréotypés, cerveau de petite taille, transparence des tissus, accessibilité génétique. Cela nous permet d'utiliser des lignées exprimant des rapporteurs optiques de l'activité neuronale pour enregistrer, in vivo et de maniere non invasive, l'activite neuronale de l'ensemble du cerveau, par microscopie optique avec une résolution subcellulaire. Obtenir des données dans plusieurs régions du cerveau simultanément permet ainsi de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés ainsi que le nombre et la durée des manipulations de chaque animal. Au total, 4395 larves de poisson zèbre (Danio Rerio) seront nécessaires pour ce projet de 5 ans. Le stade larvaire du poisson zèbre va d'environ 3 jpf (jours après fécondation) à 21 jpf. Nou utilisons des larves âgées de 6 à 14 jours, un âge où elles sont encore relativement transparentes. Ces larves sont issues de croisements de poissons adultes dans notre animalerie. Nous manipulerons ces larves avec un soin extrême, car nos projets exigent le minimum de perturbations possible pour recueillir des données comportementales et neuronales naturelles et fiables. Notre objectif est d'utiliser ces nouvelles approches expérimentales, couplées à des méthodes de physique statistique et d'apprentissage machine. Notre but est de produire un modèle numérique de la dynamique du cerveau vertébré qui rende compte à la fois de son activité endogène et des processus d'intégration multi-sensorielle et motrice lorsque l'animal évolue dans son environnement.

Bénéfices attendus

L'objectif est de développer un modèle d'interaction d'un vertébré avec son environnement complexe. Les bénéfices attendus sont des avances dans la connaissance scientifique sur l’intégration des stimulus multi-sensoriel et leur hiérarchisation dans la prise de décision motrice. La larve de poisson zèbre dispose par ailleurs d'un riche répertoire de comportements qui ouvrent la possibilité d'étudier les processus d'intégration sensorimotrices dans des contextes éthologiquement pertinents. Ainsi, ce projet devrait également permettre de valider l’utilisation de ce petit modèle dans le cadre du remplacement des modèles mammifères pour l’analyse des réponses sensori-motrices, tout en gardant une très grande pertinence du point de vue neuro-comportemental. Ainsi, nos données fourniront une base de données importante pour tester les modèles basés sur les circuits pour l'intégration sensori-motrice, la prise de décision et l'apprentissage multisensoriel-moteur et pour comparer l'architecture et la fonction des circuits neuronaux biologiques avec les implémentations in silico des réseaux neuronaux.

Procédures

Les expériences de la procédure 2 ont lieu en milieu ouvert: les larves sont libres de nager dans une cuve et leur mouvement est suivi au moyen d'une caméra. Différents dispositifs permettent de soumettre la larve à des stimuli contrôlés (visuels, acoustiques, thermiques, vestibulaires) afin de déterminer sa réponse sensorimotrice. Une larve n'est utilisée qu'une fois par expérience, cette dernière dure entre 30 min et 3h. Pour les expériences des procédures 1 et 3-8, les larves (état vigile) sont immobilisées sous le microscope dans un gel d'agarose qui les tiennent autour du tronc du corps. Nous observons le comportement (mouvement des yeux et de la queue) spontané et évoqué par des stimuli physiologiques variés (vestibulaires, visuels, thermiques, acoustiques) avec une caméra. Simultanément, nous enregistrons de façon non-invasive via des méthodes optiques l’activité neuronale du cerveau entier. Une larve n'est utilisée qu'une fois par expérience, cette dernière dure entre 30 min et 3h. Pendant l'expérience de la procédure 3, certains neurones vont être activés ou désactivés de façon non invasive avec de la lumière. Avant les expériences de la procédure 4, nous injectons un ferrofluide biocompatible de façon uni- ou bilatérale dans les vésicules otiques des larves de poisson zèbre anesthésiées. Après un à deux jours de récupération, les larves (état vigile) sont immobilisées sous le microscope dans le gel d'agarose pour les expériences. Ici le ferrofluide sert de point d’accroche pour stimuler la perception vestibulaire et les mouvements corporels compensatoires grâce à un aimant placé sous le poisson. Pendant l'expérience de la procédure 5, des neurones individuels seront sélectionnés et ensuite ciblés pour une suppression rapide par ablation via un laser . Plusieurs jours avant les expériences de la procédure 6, nous allons enlever via une intervention chirurgicale sous anesthésie les deux yeux des larves. Plusieurs jours avant les expériences de la procédure 7, nous allons inactiver avec une intervention chirurgicale une oreille. Ceci sera réalisé en enlevant les otolites avec un embout de verre fin hors de la vésicule otique sur des larves anesthésiées entre 2 et 4 jpf. Avant les expériences de la procédure 8, nous allons enlever les cellules sensorielles de la ligne latérale par un bain de 2 heures dans une solution de sulfate de cuivre de faible concentration (10 μM/L).

Impact sur les animaux

Pour la procédure 2 aucun effet indésirable est attendu car les larves peuvent nager librement. Pour les procédures 1 et 3-8, les larves (état vigile) sont immobilisées sous le microscope dans un gel d'agarose. Cette méthode permet une oxygénation de l'animal par simple diffusion de l'oxygène à travers la peau. L’immobilisation n’induit pas de douleur mais éventuellement du stress. Toutes les expériences sont effectuées par du personnel formé en expérimentation animale, ce qui permet de garantir de limiter le plus possible le stress. Cela est capital pour le succès des expériences dont le but est de caractériser la réponse comportementale et neuronale sous les conditions les plus naturelles possibles. Toutes les interventions chirurgicales sont exécutées sous anesthésie et la bonne récupération des larves est surveillée au cours du temps pour assurer une bonne cicatrisation et l`absence d’inflammation.

Devenir

Procédure 1 - 8: euthanasie. Pour des raisons de place et de coût, il ne sera pas possible d'amener l'ensemble des individus utilisés jusqu'à l'âge adulte. En milieu naturel, seule une toute petite proportion d’individus atteint l'âge adulte, ce qui signifie que si nous ne limitons pas artificiellement le nombre d'individus la population croît exponentiellement. Ainsi, seule une petite proportion de larves sera utilisée pour renouveler la population d'adultes. Les individus qui ne sont pas utilisés pour ce renouvellement seront utilisés pour les expériences, puis mis à mort à l'issue des procédures expérimentales.

Remplacement

Nos études visent à comprendre comment les capacités computationnelles émergent de l'organisation à toutes les échelles du cerveau chez le vertébré. Compte-tenu de la complexité structurelle et fonctionnelle du système nerveux, une telle recherche ne peut être menée sur des modèle in vitro ou in silico. Le choix du modèle animal (Danio Rerio) permet de répondre aux contraintes physiques (taille et transparence du cerveau) et génétique (disponibilité de méthodes de transgénèse) inhérentes aux méthodes d'enregistrement et de perturbations optiques. L'utilisation de ce modèle permettra de remplacer au moins partiellement l’expérimentation sur des mammifères. La morphogénèse d'un système nerveux central complet et pleinement fonctionnel ne peut pas être reproduite in vitro, ce qui nécessite de recourir à des organismes modèles animaux pour étudier les réseaux neuronal du cerveau. Nos travaux permettrons à terme de définir des paramètre pour une modélisation in silico pour élaborer des hypothèse avant la phase expérimental ce qui permettra à réduire le nombre des animaux utilisés en expérimentation.

Réduction

Afin d’appliquer le principe de réduction, nous suivons les méthodes suivantes : - Pour chaque expérience, nous limitons le nombre d’animaux au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous intégrons cependant assez d'animaux pour ne pas risquer d'avoir à refaire l'expérience. En totale, nous utiliserons 4395 larves de poisson zèbre. - Les expérimentations sont faites de façon séquentielle ce qui permet de ne pas intégrer d'autres animaux si les résultats escomptés ne peuvent être obtenus pour des raison techniques. - Nous partageons toutes les lignées de poissons sauvages et certaines lignées transgéniques entre les projets et les équipes utilisatrices. Si possible nous partageons les pontes lorsqu’il y a suffisamment d’œufs fécondés pour une utilisation par plusieurs expérimentateurs. Nous élevons que le nombre minimal d'embryons nécessaires au maintien d’une lignée (35 adultes). La population adulte de poisons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées et optimales pour le maintien de la diversité génétique (éviter la consanguinité).

Raffinement

Nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse des animaux. Dans toutes les expériences menées, nous suivons systématiquement les signes visibles d’un animal souffrant. Selon les procédures, ces signes peuvent être l’apparence des animaux, leur position dans l'eau, leur cinétique de nage, leur circulation sanguine, leurs battements du cœur, etc. Si des signes d’anomalie apparaissent, nous interrompons immédiatement l’expérience et procédons à une euthanasie. Concernant l’élevage, nous surveillons les conditions d’hébergement des animaux et leur état de santé (établissement des points limites). Les poissons trop vieux pour la ponte ou présentant des signes de maladie sont euthanasiés afin d’éviter tout risque de souffrance. L’hébergement est conforme à la réglementation avec un contrôle permanent et quotidien reporté sur un registre. Pour enrichissement les poissons sont maintenus en groupes de 30-40 poissons dans un régime lumière/obscurité de 12/12 heures.

Choix des espèces

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l'imagerie calcique des neurones. Son développement rapide, le grand nombre d'embryons synchronisés par la ponte et la diversité des lignées génétiquement modifiées disponibles en font un système de choix pour les neurosciences. La transparence et les dimensions réduites du cerveau à l'état larvaire en font un modèle pour étudier les réseaux neuronal à l'echelle du cerveau entier. Nous utiliserons des animaux adultes pour l'entretien des lignées. Toutes les expériences sur les animaux seront réalisées entre 6 et 14 jours après la fécondation (jpf). À cet âge, le cerveau est encore petit et peut être entièrement étudié par les méthodes optiques. En revanche, les systèmes nerveux moteur et sensoriel sont déjà en place et peuvent être analysés sans attendre le stade adulte (12 semaines).

2 368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées, répétées deux fois par semaine pendant quatre semaines pour une partie d'entre elles, et des prélèvements de sang par section de la queue sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser leur sang et leur moelle osseuse. Le porteur étudie la formation des plaquettes et le rôle des forces mécaniques, et annonce des retombées à la fois thérapeutiques et technologiques, dont l'augmentation des rendements de production de plaquettes en bioréacteur. Il affirme que les expériences "nécessitent un animal adulte vivant" et que la souris est la seule espèce pour laquelle il dispose du modèle génétique voulu.

Objectifs

Les principaux objectifs de ce projet seront la compréhension des mécanismes de formation des plaquettes sanguines, et notamment le rôle joué par les forces mécaniques de l’environnement. Ces forces mécaniques sont perturbées dans différentes conditions pathologiques qui modifient l’environnement mécanobiologique, telles que les traitements chimiothérapeutiques, ou les cancers de la moelle osseuses aboutissant au développement de myélofibrose. Bénéfices. La mise en évidence de nouvelles voies importantes pour la formation des plaquettes

Bénéfices attendus

La mise en évidence de nouvelles voies importantes pour la formation des plaquettes permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour augmenter la production des plaquettes chez la patients, ou selon les cas pour prévenir leur chute. Un deuxième bénéfice important est d’ordre technologique. Actuellement on est incapable de produire des plaquettes in vitro à une échelle suffisamment importante pour envisager des transfusions. L’une des raisons en est que la différenciation des mégacaryocytes in vitro est inaboutie en comparaison de la différentiation in vivo. Nous avons montré que la culture des mégacaryocytes en présence de contraintes mécaniques améliore la différenciation de ces cellules et in fine double la quantité de plaquettes produites. L’identification des récepteurs et voies de signalisation nous permettra de les cibler spécifiquement pour mimer l’impact des forces mécaniques, ce qui augmentera les rendements de production de plaquette en bioréacteur en milieu liquide.

Procédures

Les nuisances sont essentiellement liées au stress de contention au moment des injections, soit en i.p., soit en s.c. Les produits injectés ont comme impact soit d’augmenter la quantité de plaquette, soit de la diminuer modérément et transitoirement, de sorte qu’ils n’ont aucun impact négatif sur l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux seront majoritairement soumis à une injection unique, soit en i.p., soit s.c. (animal vigile). L’une des procédures fait appel à des injections s.c. répétées (2 injections par semaine, pendant 4 semaines). Une autre procédure fait appel au prélèvement de sang par section de moins de 1 mm à la queue de souris anesthésiée, puis par grattage de la croute pour les 4 autres prélèvements (toujours sur souris anesthésiée).

Devenir

En fin de projet, les animaux sont tous sacrifiés pour récupérer et analyser le sang et la moelle osseuse

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du rôle de l'environnement de la moelle osseuse dans la différenciation hématopoiétique en mégacaryocytes et dans la libération des plaquettes à travers les vaisseaux sinusoides de la moelle. De plus, nous disposons des souris identiques au niveau génétique et modifiées génétiquement afin de nous permettre d'évaluer spécifiquement l'impact de ces mécanorécepteurs et facteurs de transcription.

Réduction

Le nombre d’animal est réduit par le fait qu’un maximum d’analyses seront réalisées pour une même procédure expérimentale avec un même lot d’animaux, selon la question posée (ex. analyse du sang, récupération des os pour culture de cellules, pour récupération de moelle en vue d’analyses histologiques et de microscopie de transmission), récupération éventuelle d’autres organes. Différents manipulateurs seront ainsi réquisitionnés pour permettre d’effectuer simultanément ces différentes analyses afin d’acquérir des données fiables et définitives.

Raffinement

Tout est mis en place pour limiter l’inconfort des souris durant toute la durée de la procédure, incluant une manipulation et contention par des personnes formées et expérimentées, à l’abris du bruit. Le prélèvement caudal de sang est effectué sur souris anesthésiée à l’isoflurane, permettant une bonne anesthésie et un réveil rapide. Les souris restent ensemble dans la même cage, en présence une litière abondante et permettant la formation de nid, dans un environnement enrichi en jouets.

Choix des espèces

La mise en évidence des proplaquettes à partir des MK et cellules souches hématopoiétiques est bien maitrisée chez la souris. En outre, c'est la seule espèce pour laquelle nous disposons du modèle dont les gènes qui nous intéressent sont inactivés. Animaux utilisés au stade jeune adulte (8-18 semaines), car à ce stade la moelle osseuse du fémur est encore très hématopoiétique et peu d'adipocytes sont présents.