Procédures légères

40 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis replacées à l'issue. Chacune reçoit une éponge vaginale posée douze jours, une injection intramusculaire d'hormone puis une prise de sang à la jugulaire, le porteur signalant un stress de contention et un possible hématome. Leur sang sert à préparer du sérum de brebis en œstrus, un composant du milieu de fécondation in vitro d'ovocytes de brebis. Le porteur affirme qu'aucun protocole sans sérum n'est efficace et rattache l'ensemble à des perspectives lointaines de restauration de la fertilité chez la femme.

Objectifs

L’objectif est de préparer du sérum de brebis en œstrus, qui est un composant du milieu de fécondation in vitro (FIV) des ovocytes ovins. Cette technologie sera mise en œuvre au laboratoire dans le cadre d’un programme de recherche ne faisant pas appel à d’autres animaux expérimentaux (ovocytes obtenus à partir d’ovaires collectés post-mortem sur des animaux abattus dans des abattoirs commerciaux). Le programme de recherche vise à optimiser la qualité des ovocytes cultivés in vitro par l’addition de facteurs biologiques (notamment des facteurs de croissance ou des hormones) dans le milieu de culture des ovocytes. Après cette étape, la FIV permet de vérifier l’aptitude des ovocytes à être fécondés et à évoluer en embryons, deux indicateurs de leur qualité.

Bénéfices attendus

Le projet scientifique global contribuera à la mise au point de la culture in vitro des ovocytes de brebis, une espèce qui présente des similarités avec l’espèce humaine (en termes de taille des ovocytes, nombre d’ovulations, chronologie de la croissance des ovocytes dans l’ovaire et du développement des embryons). A court terme, il s’agit d’obtenir, à partir d’ovocytes présents dans l’ovaire mais bien en amont de l’ovulation, des ovocytes fécondables et capables d’évoluer en embryons. Le projet s’insère dans le développement à moyen terme de stratégies de restauration de la fertilité chez la femme : soit en produisant des embryons à partir des ovocytes contenus dans des biopsies ovariennes cryoconservées (conservation qui est proposée aux patientes avant un traitement potentiellement toxique pour les ovocytes), soit en stimulant in vitro la maturation d’ovocytes qui n’ont pas atteint in vivo le stade désiré en dépit d’un traitement de stimulation ovarienne (pour des patientes présentant des troubles de l’ovulation par exemple).

Procédures

Après une pose d’éponge vaginale pendant 12 jours suivie d’une injection intramusculaire de PMSG, chaque animal sera soumis à une prise de sang. Chaque opération a une durée inférieure à une minute.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lié à une contention brève (de l’ordre de la minute) et ressentiront la piqûre de l’aiguille lors de la prise de sang ou de l'injection intramusculaire. La prise de sang peut entraîner un hématome.

Devenir

Les animaux seront replacés à l’issue de la procédure.

Remplacement

La très grande majorité des protocoles rapportés dans la littérature mentionne l’addition de serum de brebis au moment de la fécondation in vitro ou lors d’une étape précédente dans l’espèce ovine (24/25 références). Une équipe espagnole a publié un protocole sans sérum, mais rapporte un taux de développement embryonnaire le plus faible de l’ensemble des 25 études (12% seulement des ovocytes génèrent des embryons atteignant le stade de blastocystes). A ce jour, il n’y a donc pas d’alternative efficace à l’utilisation de serum pour la production in vitro d’embryons ovins.

Réduction

Un prélèvement de de 4 à 5 mL de sang sera réalisée sur deux lots de 20 brebis, pour constituer deux pools de 40 mL de sérum. Il est prévu de pratiquer environ 80 fécondations in vitro sur quatre ans (soit une toutes les deux à trois semaines). Ceci requiert 80 mL de sérum, soit 160 mL de sang. Pour la reproductibilité expérimentale, il faut utiliser le même serum pour chaque série d’expériences, donc limiter le nombre de serums différents sur l’ensemble du projet. Nous prévoyons donc de préparer 2 fois 40 mL de serum, qui sera ensuite aliquoté et congelé. Une variabilité entre individus est observée dans l’efficacité du serum sur la production d’embryons par fécondation in vitro. Pour éviter le risque que le sérum constitué s’avère peu efficace et de ce fait inutilisable, nous faisons le choix - de réaliser les prélèvements sur des animaux du troupeau de l’établissement utilisateur au moment où ils vont être mis à la reproduction. Ils ont en effet reçu dans cette optique un traitement hormonal de synchronisation des chaleurs qui va réduire le nombre d’individus présentant un sérum pauvre en hormones sexuelles et potentiellement peu efficace en fécondation in vitro. - de constituer des pools de sérum à partir de 20 animaux chacun. Ce nombre d’individus représentés dans le pool va limiter la variabilité de la composition du sérum. Remarque 1 : Le prélèvement de 10 mL de sang sur 20 animaux pour constituer un pool unique a été envisagé, mais nécéssiterait une contention plus longue de chaque animal et le prélèvement risquerait d’être plus difficile. Remarque 2 : Le serum collecté peut se conserver plusieurs années au congélateur ; il pourra donc être utilisé même en cas de retard dans l’avancée du programme de recherche.

Raffinement

Les brebis seront dans leurs conditions d’élevage habituelles dans un bâtiment d’élevage conventionnel, en case collective à clairvoies sur litière paillée. La pose d’éponge, l’injection intramusculaire et le prélèvement de sang se feront en présence de congénères pour éviter le stress dû à l’isolement. La contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. Les opérations, et particulièrement le prélèvement de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. L'animal sera récompensé par des granulés. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s'avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Un baume végétal aux propriétés décongestionnantes, antiseptiques et cicatrisantes sera appliqué en massage sur la veine pour prévenir la douleur post-procédure et une infection éventuelle. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera ensuite assurée dans le cadre du suivi de la mise à la reproduction. En cas de signes de maladie, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil de l’installation expérimentale.

Choix des espèces

Le sang est collecté sur des brebis en vue de préparer du sérum pour la mise en œuvre de la fécondation in vitro d’ovocytes dans cette espèce. Afin de collecter le sang de brebis en oestrus, le prélèvement sanguin sera réalisée sur des brebis adultes de l’élevage de l’établissement au moment de leur mise à la reproduction.

288 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis envoyés à l'abattoir vers 155 à 160 jours puisqu'ils sont destinés à la consommation. Chaque animal subit une prise de sang sous contention au lasso, des prélèvements de salive et de soies, et la moitié passe des tests comportementaux évaluant la réactivité face à un environnement nouveau, la relation avec l'humain et les capacités cognitives. Le projet compare l'effet d'un accès extérieur temporaire sur le bien-être des porcs en engraissement. Le porteur affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne peut prédire cet effet et présente l'étude comme une réponse aux attentes citoyennes sur l'élevage conventionnel.

Objectifs

De nos jours, les systèmes d’élevage dits « conventionnels » sont questionnés par les citoyens européens tant sur leur impact environnemental que sur le respect du bien-être animal. Ces questionnements concernent particulièrement les porcs charcutiers, principalement élevés en bâtiment sur caillebottis intégral. Ainsi, l’accès extérieur et l’exposition à la lumière naturelle figurent parmi les préoccupations principales des citoyens concernant le bien-être animal. Des systèmes d’élevages avec accès extérieur existent mais ils ne concernent encore qu’une minorité des porcs en France (moins de cinq pour cent). Si l’accès extérieur expose les animaux à un plus grand nombre et à une plus grande diversité de stimulations et diminue le risque d’agressions entre congénères, il augmente également le risque d'exposition aux agents infectieux ainsi qu’aux prédateurs potentiels et rend plus difficile le maintien de conditions optimales d’hygiène. En outre, les éleveurs sont souvent hésitants à s'engager dans la transition car l'accès à l'extérieur pose la question de la disponibilité des pâtures, entraîne des investissements structurels ainsi qu’une augmentation de la charge de travail. De plus, des baisses de production parfois importantes peuvent survenir pour des raisons sanitaires ou d’exposition aux aléas climatiques. Dans ce contexte, identifier des solutions facilement transposables sur le terrain et permettant d'offrir aux porcs charcutiers un accès extérieur, même ponctuel, constitue un enjeu majeur. Notre projet vise à étudier l'intérêt de proposer des récréations régulières à des porcs pendant leur phase d'engraissement, à une période de leur vie où ils sont les moins vulnérables, en analysant leur état de santé et de bien-être par rapport à ceux de leurs congénères élevés en conditions standard. Pour cela, différents paramètres seront mesurés (observations et tests comportementaux, suivi des performances, relevé de signes cliniques, analyse de la compétence immunitaire et mesure de l’exposition au stress chronique).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à obtenir des données objectives et facilement actionnables pour améliorer le bien-être des porcs charcutiers actuellement élevés dans des élevages conventionnels.

Procédures

Chaque porc sera soumis à un prélèvement de sang sous contention au lasso, à deux prélèvements de salive et à deux prélèvements de soies, chacun durant moins de 5 minutes et ne nécessitant ni l’isolement des animaux ni le recours à l’anesthésie. Des tests comportementaux seront effectués sur la moitié de l'effectif (12 porcs par groupe soit 144 individus au total) permettant aux expérimentateurs d’évaluer leur réactivité émotionnelle face à un environnement nouveau, la relation Homme-animal et d’étudier leurs capacités cognitives. Chacun de ces tests dure de 30 secondes à 5 minutes maximum, montre en main. Ces tests seront répartis sur 2 séances : 3 tests lors de la première séance pour une durée totale de 8 min par porc (5 + 2 + 1), et 2 tests lors de la deuxième séance 15 jours plus tard pour une durée totale de 6min30 par indvidu (2’30 + 4).

Impact sur les animaux

Les pesées ainsi que les prélèvements de soie et de salive ne nécessitent pas de contention et sont réalisées par des personnes expérimentées, limitant le risque de stress. La contention au lasso nécessaire pour réaliser la prise de sang est susceptible d’induire un stress transitoire et d’intensité légère. Enfin, un saignement léger et transitoire, plus rarement un hématome, est susceptible d’être induit par le prélèvement mais la fréquence de ce type de nuisance est réduite par le savoir-faire des opérateurs associé à la réalisation d’une compression après le prélèvement si nécessaire.

Devenir

Les animaux étant destinés à la consommation, ils seront maintenus en vie jusqu’à l’âge classique d’abattage vers 155-160 jours d’âge.

Remplacement

S’agissant d’un projet visant l’amélioration des conditions de vie des porcs charcutiers en élevage, il n'existe pas de méthode alternative (in silico ou in vitro) permettant de prédire l’effet de l'exploration extérieure sur les paramètres étudiés.

Réduction

L’effectif de porcs inclus dans ce projet a été réfléchi de façon à assurer la validité statistique des données (3 saisons, 2 sexes) et favoriser la transposabilité des données aux élevages conventionnels.

Raffinement

Les porcs impliqués dans ce projet seront hébergés dans des locaux adaptés. Des enrichissements variés et régulièrement renouvelés (cordes, chaines, bouchons de fibre) seront proposés aux animaux. Les mâles et les femelles seront élevés dans des cases différentes à partir du sevrage afin d’éviter les conflits. La pâture possède un point d’eau et des zones d’ombre puisqu’elle est bordée d’arbustes et des toiles d’ombrage pourront être installées si nécessaire. L’ensemble des actes (pesées, observations, prélèvements de soies, de salive et de sang) sera réalisé par des personnes expérimentées après une phase d’habituation des animaux. Les prélèvements de salive seront réalisés en utilisant une salivette simplement passée sur la gencive. Ce prélèvement indolore ne nécessite pas de contention particulière, dès lors que les animaux se seront habitués au contact avec les expérimentateurs. Les prélèvements de soies à la nuque seront réalisés sur animal vigile et sans contention. Les prélèvements débutent lorsque les animaux se laissent caresser la nuque, si besoin en utilisant du jus de pomme distribué à la seringue. Ce geste, également indolore, se fait à l’aide d’une tondeuse adaptée et silencieuse permettant de n’entraîner aucune angoisse chez les animaux. Pour minimiser autant que possible le stress lié à la réalisation des prises de sang, la durée de contention des animaux sera strictement limitée à 2 minutes.

Choix des espèces

S’agissant d’un projet visant l’amélioration des conditions de vie des porcs charcutiers, il est pertinent d’étudier les conséquences d’un accès régulier à l’extérieur directement sur l’espèce cible, à savoir le porc. Les animaux utilisés seront de jeunes porcs charcutiers, sevrés depuis 6 semaines (sevrage à 28 jours). Ils seront suivis durant toute la durée de la phase d’engraissement (entre 70 et 160 jours d’âge environ), tel que classiquement fait en élevage conventionnel de porcs charcutiers, garantissant la transposabilité des données obtenues sur le terrain.

3 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés en vie et réutilisables ensuite. Chacun subit jusqu'à trois prélèvements sanguins vigiles espacés de trois semaines, avec un stress de contention décrit comme modéré et un risque faible d'hématome. Les globules blancs prélevés servent à tester in vitro un immunomodulateur, afin de déterminer si le chien est l'espèce pertinente pour de futures études de toxicité réglementaire. Le porteur inscrit le projet dans une démarche de remplacement, alors qu'il prépare des essais de toxicité ultérieurs sur des chiens.

Objectifs

Les maladies dites "auto-immunes" touchent, toutes confondues, 5 à 8 % de la population et surviennent suite à un dysfonctionnement du système immunitaire qui se retourne contre une cible du "soi" comme s'il s'agissait d'un élément étranger. Cette perte de tolérance du soi conduit à des maladies souvent graves et pour lesquelles les solutions thérapeutiques font communément appel à des molécules immunomodulatrices peu spécifiques et qui sont associées à des effets secondaires parfois lourds. Dans ce contexte, des petites molécules à propriétés immunomodulatrices qui présentent de puissantes propriétés anti-inflammatoires en diminuant efficacement la libération de facteurs de l'inflammation ont été développées. Des résultats convaincants ont été obtenus in vivo dans différents modèles de maladies auto-immunes/inflammatoires, permettant d'envisager un essai clinique. En préparation de celui-ci, des études de toxicité doivent être menées. La question de l'espèce adaptée à ce type d'étude pour cet immunomodulateur se pose. Le chien est l'une des deux espèces non-rongeurs requises pour la réalisation des études de toxicité réglementaire. Ce projet s'inscrit dans cette étape de détermination de l'espèce optimale pour mener à bien l'étude de toxicité. Le chien étant une espèce couramment utilisée dans les études de toxicité, l'objectif de ce projet sera de déterminer si dans cette espèce, in vitro, sur des cellules prélevées sur des chiens de même race que ceux qui seraient utilisés par la suite, l'immunomodulateur à évaluer entraîne les effets attendus.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, en utilisant un faible nombre d'animaux sur une procédure légère, de déterminer si l'espèce canine est pertinente pour répondre aux phases ultérieures de l'étude.

Procédures

Les chiens seront soumis à des prélèvements sanguins, vigiles. Un maximum de trois prélèvements sera effetcué sur chaque chien, en ménageant un repos minimal de 3 semaines entre chaque prélèvement. La durée estimée du prélèvement sanguin est d'environ 1 minute. La durée estimée totale maximale de l'intervention sur les animaux (incluant le temps passé à mettre les chiens à l'aise, à préparer le site de prélèvement, à effectuer une compression après le prélèvement et à récompenser le chien après) est de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Stress lié à la contention et à la ponction sur chien vigile: modéré et de courte durée. Risque d'hématome après la ponction : faible en raison de l'attention portée à l'hémostase (point de compression).

Devenir

Ce projet n'induira pas de séquelle sur les animaux ni de modification physiologique susceptible de biaiser les résultats d'une étude ultérieure. Ils pourront donc être réutilisés.

Remplacement

Ce projet s'inscrit dans une approche de remplacement, car il consiste à effectuer in vitro des tests préalables à une possible étude in vivo. Les molécules qui seront testées in vitro sur les cellules prélevées sur les chiens l'ont déjà été in vitro sur des lignées cellulaires, et in vivo dans des modèles rongeurs des maladies ciblées par l'approche thérapeutique.

Réduction

L'effectif d'animaux a été déterminé afin d'obtenir des cellules issues du plus petit nombre d'individus permettant de conclure sur l'action de la molécule d'intérêt dans l'espèce canine, tout en tenant compte de la possible variabilité entre individus donneurs, encore inconnue du fait de la nature exploratoire de l'étude.

Raffinement

Une attention sera portée à la minimisation du stress lié à la procédure de prélèvement. Les chiens seront manipulés avec douceur par des personnes de leur entourage habituel. Le temps sera pris avant le prélèvement pour rassurer le chien. A la fin du prélèvement, une friandise sera donnée au chien, qui sera également félicité par la voix et des caresses. Sur le plan de l'hébergement, les chiens seront hébergés en petits groupes compatibles, sur litière végétale. Ils auront à leur disposition un lieu de couchage (corbeille + tapis), une plateforme, des jouets. Ils bénéficieront d'intéractions quotidiennes avec leurs soigneurs (caresses, jeux), et d'une sortie quotidienne 7j/7 dans des espaces de jeux intérieur et extérieur.

Choix des espèces

Le chien a été choisi car il s'agit d'une espèce largement utilisée dans les études de toxicité réglementaires. Ici, il s'agit de vérifier si cette espèce pourrait être adaptée à ce type d'étude pour la molécule immunomodulatrice à tester. Il s'agira d'animaux jeunes adultes, comme le seraient ceux qui seraient utilisés dans une éventuelle étude de toxicité.

16 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés en vie pour être réutilisés dans un projet lié. Ils sont anesthésiés à plusieurs reprises pour des IRM, des scanners et une imagerie au produit radioactif, immobilisés en chaise de contention et transportés entre deux sites, avec un stress et des douleurs aux sites d'injection et d'intubation. Ce volet évalue une neurostimulation cérébrale par ultrasons en vue d'un essai chez l'humain, chaque animal servant de son propre témoin. Le porteur justifie le recours au singe par sa proximité phylogénétique avec l'espèce humaine.

Objectifs

Dans une première approche expérimentale, nous avons testé et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore sur rongeurs. Dans la continuité de ce projet, en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme. Pour cela, nous devons faire des IRMs cérébrales de nos animaux en dehors du site d’hébergement. Nous devons transporter et manipuler les animaux sur le site d’imagerie. Le projet d’origine est évalué par une autre DAP pour les procédures d’habituation, d’imagerie CT/TEP-18FDG et de neurostimulation qui seront réalisées au sein de l'établissement d'hébergement.

Bénéfices attendus

Dans le cadre des troubles neuropsychiatriques (autisme, dépression), notre méthode de stimulation permettrait d'avoir une alternative thérapeutique aux traitements pharmacologiques classiques. De plus, cette méthode de neurostimulation serait plus précise et/ou moins invasive que les méthodes de stimulation actuelles (stimulation magnétique transcrânienne et stimulation cérébrale profonde).

Procédures

Sur l'ensemble du projet les animaux seront soumis aux interventions suivantes : *Habituation – renforcement positif : 2 à 5 fois par semaine ; durée : entre 15 minutes et 1 heure par animal ; pendant au moins 1 mois et jusqu’à l’obtention d’une bonne coopération de l’animal vigile. *IRM cérébrale sous anesthésie générale : 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique intramusculaire puis anesthésie gazeuse. Durée d’anesthésie : environ 60min. *Scanner CT sous anesthésie générale : 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 10min. *Adaptation du dispositif de neurostimulation : jusqu’à 10 fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 30min. *Imagerie TEP-CT sous anesthésie générale : cette imagerie sera réalisée 2 à 3 fois ; injection d’anesthésique (intramusculaire); injection du produit radioactif (intraveineuse, par cathéter veine saphène ; durée d’anesthésie : environ 1h30 à 2h00. *Neurostimulation ultrasonore sous anesthésie générale chimique : 2 à 10 séances de stimulation ; application sur la tête du dispositif de neurostimulation ; injection d’anesthésique et de son antidote ; durée de contention dans une chaise de contention : environ 30min par stimulation.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont les suivants : - Augmentation du stress lors des phases d’induction d’anesthésie (contention dans la cage). - Douleurs/gênes au niveau du site d’injection de l’anesthésie. - Douleurs/gênes oropharyngées liées aux intubations. - Augmentation du stress lors du transport entre les deux sites de manipulation. - Gênes suite à l’installation dans la chaise de contention. - Gênes au niveau du site d’apposition de la sonde ultrasonore.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie pour intégrer les procédures décritres dans une autre DAP en relation avec celle-ci.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore chez les rongeurs. Dans la continuité de ce projet et en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme.

Réduction

Les méthodes d’imageries utilisées pour ce projet permettent d’utiliser un animal comme étant son propre contrôle. Nous n’avons donc aucun recours à un groupe d’animaux contrôle supplémentaire. Nous souhaitons tester les effets de la neurostimulation ultrasonore aigüe (n=8 individus) et la neurostimulation ultrasonore chronique (n=8 individus). Les procédures expérimentales ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi l’activité cérébrale d’un animal après neurostimulation sera comparée avec sa propre activité cérébrale avant neurostimulation, chaque animal sera donc son propre contrôle. Ces activités cérébrales seront statistiquement comparées. En considérant une modification de 10% de l’activité cérébrale par rapport à l’activité contrôle, un effectif de 8 animaux par groupe sera utilisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe pour garder des liens sociaux et en présence d’objets d’enrichissement (manipulation d’objet, vidéo, musique). Ils auront un accès ad libitum à l’eau et seront nourris 2 fois par jour dont au moins une fois avec une ration de fruit. Les animaux seront observés tous les jours. Les procédures expérimentales seront réalisées dans une salle correctement chauffée. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant, un monitoring cardio-pulmonaire sera effectué pendant toute la durée de la manipulation. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Pour le transport entre les sites de manipulations, les animaux seront placés en cage d’isolement. Autant que possible les animaux seront transportés par groupe de deux minimums. Des temps d’habituation entre les transports et la manipulation sont prévus pour faire baisser le stress des animaux.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce se justifie (1) par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et (2) par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques pubères seront utilisés pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubère ayant un âge supérieur à 3 ans et un poids inférieur à 5 kg.

270 poules pondeuses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis renvoyées dans l'élevage et vendues à des éleveurs ou des particuliers en fin de projet. Tous les deux mois et demi, elles reçoivent une anesthésie générale par injection intramusculaire suivie d'une radiographie du bréchet, l'injection pouvant être douloureuse et l'anesthésie comportant un risque d'accident. Le projet développe un outil d'analyse d'image pour détecter les fractures du bréchet, fréquentes en élevage en volière, et étudie le lien entre ces fractures et la douleur. Le porteur présente la volière comme favorable au bien-être des poules tout en reconnaissant qu'elle augmente le risque de fractures par collision.

Objectifs

La transition des systèmes d’élevages s’accélère en France car la plupart des acteurs de l’aval (distributeurs, grandes enseignes de l’agroalimentaire, restauration hors domicile, chaines hôtelières, etc.) ont pris l’engagement de ne plus s’approvisionner en œufs de code 3 d’ici 2025 : 20,4 millions de poules pondeuses en cage passeront en systèmes alternatifs dans les prochaines années. La principale alternative au système cage est la volière (choix fait en Allemagne et aux Pays Bas dans le courant des années 2000). Elle optimise le nombre d’animaux en élevage tout en offrant aux poules la capacité de se déplacer librement, y compris dans une dimension verticale (perchoirs et plateformes). Le libre déplacement permet aux poules d’exprimer leurs comportements naturels propices à leur bien-être tels que les bains de poussière, l’exploration de l’environnement, les battements d’aile, etc. Toutefois, un certain nombre de publications scientifiques soulignent un risque accru de fractures et de déviations du bréchet du fait des collisions avec les équipements suite aux vols au sein de volière, dont la hauteur peut dépasser les 2,5 mètres. Certains vols sont suivis de chutes occasionnant des fractures du bréchet douloureuses. Les déviations du bréchet sont associées aux perchoirs (forme et matière) et aux comportements de perchage (positionnement de la poule sur le perchoir). L’évaluation des déviations est réalisée visuellement, à l’observation du bréchet. Pour les fractures, la palpation est la méthode la plus employée. Cependant elle présente des limites, puisqu’elle ne permet pas d’en évaluer précisément le niveau de gravité et les microfractures ne peuvent être identifiées. Seules les fractures de gravité élevée et les anciennes fractures (palpation du cal de fracture) sont facilement identifiables avec cette technique. Nous souhaitons développer un outil d’analyse d’image du bréchet permettant de prédire la gravité des fractures, particulièrement celles de faibles intensités, et déviations de bréchet des poules élevées en volière, sur la base d’images smartphone (simple à collecter en élevage). Ce projet évaluera également les corrélations entre le degré de sévérité des fractures et la douleur de l’animal, puisque celles-ci sont peu documentées dans la littérature scientifique.

Bénéfices attendus

Les éleveurs et conseillers d’élevage ne sont pas toujours conscients de ces dommages au bréchet car il n’est pas très visible avec les plumes et les performances de ponte ne sont pas altérées par les lésions du bréchet. Au niveau de l'exploitation, la palpation de l'os bréchet prend du temps et les éleveurs et conseillers ne sont pas bien formés pour la pratiquer. Afin de prévenir le plus tôt possible l'apparition de ces dommages en aidant les éleveurs à les identifier, ce projet vise à développer un outil innovant pour évaluer facilement le niveau de sévérité des déviations et des fractures du bréchet en utilisant l'analyse d'image et la modélisation. Identifier la dynamique d'apparition, la sévérité et la prévalence des fractures et déviations est nécessaire pour mettre en place des solutions nutritionnelles ou techniques afin d'améliorer le bien-être des animaux et la production d'œufs. De plus, par l’étude de la corrélation entre la douleur de l’animal et la sévérité des fractures, ce projet permettra également de sensibiliser les éleveurs et conseillers aux conséquences de ces dommages sur le comportement des poules et leur mobilité en poulailler. A court terme après le projet, les algorithmes d’analyse d’images smartphones développés seront facilement disponibles afin que tous les acteurs de la filière oeuf désireux d'utiliser la solution, tels que les fabricants d’aliments, les organisations de production ou les éleveurs indépendants puissent le faire. Ainsi, ils pourront disposer d’une meilleure détection des fractures du bréchet, permettant ainsi une mise en place plus précoce de stratégies de prévention. De plus, ils seront intégrés dans un outil déjà existant qu’est l’application EBENE® d’évaluation du bien-être des volailles de plus en plus utilisée sur le terrain.

Procédures

Anesthésie générale par injection intramusculaire : 1 injection toutes les 10 semaines, 3 fois de suite (âge de 35, 45 et 60 semaines). Radiographie du bréchet : 1 séance sous anesthésie toutes les 10 semaines, 3 fois de suite

Impact sur les animaux

L’injection de l’anesthésique peut être douloureuse (intramusculaire). Certains animaux sont susceptibles d’arriver dans l’unité avec des lésions plus ou moins importantes du bréchet (déviations, fissures, fractures) ou de les développer en cours d’expérimentation : ces lésions sont génératrices de douleurs. Un accident anesthésique est également possible (apnée prolongée, arrêt cardiaque).

Devenir

Après chaque examen, les animaux sont replacés dans l'élevage pour participer au projet global de suivi. En fin de projet, ils seront vendus à des éleveurs ou à des particuliers.

Remplacement

Des études précédentes ont montré les stades lésionnels du bréchet observés. Nous nous appuierons sur ces données antérieures pour déterminer notre échelle de sévérité. Il nous faut cependant compléter ces éléments radiographiques par des critères diagnostiques utilisables en élevage (palpations, observations du comportement) dans des conditions proches du terrain.

Réduction

A 14 semaines d’âge, un effectif de 270 poules reproductrices nous permet de constituer 3 groupes de 90 poules. Ce design permet d’évaluer, en même temps, trois régimes différents par leur teneur en minéraux et oligo-éléments. En fonction de ces régimes, on attend une différence du taux d’incidence des fractures du bréchet de 20%.Pour l’incidence de fractures, l’estimation du nombre d’individus nécessaires par groupe pour mettre en évidence une différence significative entre les groupes est de 90 poules par groupe. Au regard des incertitudes quant à l’incidence de fractures dans notre situation d’élevage « améliorée » par rapport aux conditions d’élevage standard, de la variabilité de réponse, de la bibliographie et d’expériences précédentes, le nombre défini d’animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour mettre en évidence des différences.

Raffinement

les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables, sur litière. Ils seront amenés sur la plateforme et laissés au calme le temps de l'habituation. Ils seront ensuite manipulés avec douceur lors de la séquence d'examen vigile (observation du comportement, palpation des bréchets). Tout animal stressé sera anesthésié rapidement sans attendre la séquence d'examen vigile pour ne pas l'affoler.

Choix des espèces

Il s’agit dans ce projet d’étudier une pathologie de la poule pondeuse élevée en volière : cette étude pilote vise à caractériser finement les lésions associées à ce type d'élevage. Il nous faut donc étudier les animaux concernés en conditions d'élevage. Les animaux seront utilisés entre l'âge de 35 et de 60 semaines afin de les évaluer en pleine période de ponte

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Modèles d'une maladie neurodégénérative pédiatrique, elles sont examinées par IRM sous anesthésie, décrite comme non invasive, puis tuées par prélèvement intracardiaque pour mesurer la teneur en fer de leur cerveau, geste que le porteur présente comme la nuisance principale du projet. Les retombées annoncées, valider l'IRM comme mesure remplaçant l'analyse post-mortem, sont censées à terme réduire le nombre d'animaux utilisés. Le porteur affirme que l'usage de l'animal en fin d'étude est "inévitable" pour confirmer les résultats obtenus sur cellules.

Objectifs

Le projet financé est une étude préclinique de thérapie génique intraveineuse pour le syndrome de Sanfilippo B. Ce syndrome est une pathologie neurodégénérative pédiatrique touchant 1 enfant sur 200 000 et pour lequel il n’y a aucune thérapie aujourd’hui. Ce syndrome est dû à la déficience d’une enzyme lysosomale impliquée dans la dégradation d’un glycosaminoglycane, l’héparane sulfate. Cette déficience conduit à l’accumulation de ce substrat qui présente une toxicité majeure pour les cellules du système nerveux central. Nous souhaitons, à travers cette étude, pouvoir proposer un essai clinique par thérapie génique permettant d’apporter l’enzyme déficitaire (N-acétylglucosaminidase). L'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet réalisée dans l'EU 2/3, sera de vérifier s'il est possible de détecter de façon reproductible et fiable des variations de susceptibilités magnétiques caractéristiques de la teneur en fer (Fe) dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux sans mise à mort des animaux comme c’est le cas pour les méthodes classiques de mesures post-mortem. L'IRM est un outil important pour le diagnostic in vivo des pathologies ainsi que pour suivre au cours du temps la réponse à différents traitements ou procédures chirurgicales. La durée maximale des acquisitions sera d’une heure par animal.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de l’étude physiopathologique, l'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet réalisé dans l'EU 2/3, sera de mesurer des valeurs de susceptibilités magnétiques T2* dans le cerveau des animaux. Ces mesures permettront de comparer la teneur en Fe dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux. L’accumulation de fer ou non dans le cerveau est un marqueur de validation de l’efficacité du traitement de nos souris en préclinique. A terme, cette mesure IRM pourrait remplacer les mesures faites post-mortem et devrait donc nous permettre de réduire le nombre d'animaux mis en œuvre pour mesurer la quantité de fer dans les tissus et permettre de suivre l'évolution au cours du temps de la teneur en fer de différents organes d'intérêt dans un même animal renforçant ainsi la valeur statistique des résultats.

Procédures

L'IRM est une procédure d'imagerie in vivo, non invasive et atraumatique. La totalité de la procédure étant menée sous anesthésie volatile (1h maximum), les animaux ne subissent que le stress dû à la préhension avant induction de l'anesthésie. Le réveil post-anesthésique est la seconde étape critique, les animaux restent sous surveillance pendant toute la phase de réveil.

Impact sur les animaux

L'IRM est une technique non invasive d'imagerie qui n'entraine aucune douleur chez les animaux. Les signes vitaux (respiration, fréquence cardiaque et température) sont contrôlés tout au long des manipulations afin de garantir le suivi du bien-être des animaux. La procédure est cependant susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans la cage d'induction de l'anesthésie. Le prélèvement intracardiaque que subiront les animaux au moment de leur mise à mort (sans réveil) est la nuisance la plus importante du projet, elle est cependant indispensable pour réaliser dans des conditions optimales la mesure de teneur en fer intra-tissulaire de référence.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort dans l'EU 1/3 à l'issue des délais 2, 5 ou 9 mois de vie suivant une technique réglementaire qui permettra de pouvoir obtenir des prélèvements de qualité tout en protégeant l'animal de la douleur jusqu'à son dernier souffle.

Remplacement

Une modélisation intégrée est nécessaire pour valider les études in vitro. Les animaux sont utilisés en fin d’étude afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Les études sont systématiquement optimisées (quantité de vecteurs, temps de traitement et nombre d’animaux) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. Même si le traitement est administré en injection intraveineuse, il est réalisé par un personnel compétent.

Réduction

L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Nous allons utiliser des tests statistiques afin de comparer les groupes. Les tests sont réalisés avec un logiciel de statistique. Nous utiliserons des groupes de 10 souris par expérience et nous répéterons les expériences à 3 âges différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo. L'IRM étant une technique d'exploration non invasive, elle permet le suivi longitudinal des lots d'animaux mis en œuvre ce qui participe à la réduction globale.

Raffinement

Cette procédure expérimentale a pour objectif d'évaluer la possibilité de remplacer une procédure post-mortem (mesure de la teneur en fer dans les tissus prélevés) par une procédure non invasive, in vivo qui permettra de suivre une même cohorte au cours du temps dans un but de raffinement (suivi du même animal pour s'affranchir de la variabilité interindividuelle et réduction du nombre de lots d'animaux nécessaire pour assurer ce suivi longitudinal selon la procédure classique). Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Nous nous attachons à ne pas laisser un animal seul dans une cage (groupes sociaux de 5 individus maximum par cage). Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Lors des expériences d’imagerie, les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane (gaz vecteur O2) dès le début de la procédure pour réduire leur stress et éviter tout mouvement au cours de l’exploration IRM. La cellule d’imagerie dans laquelle est maintenue la souris est thermo régulée. Pendant la phase de réveil, la cage est également placée sur tapis chauffant et reste sous contrôle visuel jusqu’au réveil complet de l’animal. Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus est un modèle animal adapté aux pathologies de surcharge lysosomale. L’application de la politique de réduction mise en place permet d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer d’un minimum d’animal un maximum d’information. De plus la formation des personnes habilitées à manipuler les animaux et la diffusion par ces personnes de leur savoir dans des conditions appropriées (temps de formation respecté) permet de réaliser nos expérimentations animales dans le respect de l’animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Il est nécessaire d’utiliser les souris à partir de d'âge de 2 mois afin de pouvoir comparer les résultats avec ceux obtenus dans nos précédentes études et celles décrites dans la littérature.

10 000 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 8 000 tuées à l'issue faute du bon génotype, 2 000 conservées pour l'élevage. Une biopsie de la queue à quinze jours ou du pavillon de l'oreille à l'âge adulte, inférieure à un millimètre, est réalisée en même temps que l'identification par tatouage ou bague, pour analyser leur ADN. Le porteur reconnaît que la queue remplit de nombreuses fonctions et que son atteinte "entretient un handicap", et que la bague peut être arrachée ou l'oreille mutilée lors de bagarres. Ce prélèvement remplace la section de phalanges pratiquée jusque-là dans l'établissement.

Objectifs

L’établissement est une animalerie d’élevage de souris génétiquement modifiées nécessitant la détermination de la constitution génétique de chaque individu par une amplification précise de séquences d’ADN (génotypage par PCR), qui est généralement réalisée en même temps que leur identification. L’objectif de ce projet est d’utiliser un prélèvement (biopsie) de queue ou du pavillon d’oreille pour obtenir un morceau de tissu de souris transgéniques afin d’effectuer une analyse d’ADN et sélectionner les animaux avec les bonnes séquences d’ADN. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Ce projet ne concerne que les animaux n’ayant pas de caractère qui altère gravement l’état général de l’animal (phénotype dommageable). Le prélèvement de tissu au niveau de la queue/oreille est considéré comme moins invasive que la coupe des phalanges distales, méthode utilisée jusqu’à présent dans l’établissement. La biopsie sera effectuée en même temps que l’identification des animaux, par tatouage à l’aide d’encre appliquée en intradermique ou par la pose d’une bague numérotée à l’oreille (à lâge adulte uniquement). Ce projet sera mis en place dans l’établissement, suite à l’arrêt de l’identification des animaux par phalangectomie. Il ne concerne pas les lignées à phénotype dommageable, la création de nouvelle lignée et les animaux qui ont été inclus dans une procédure d’élevage dans un projet. Pour les nouveaux projets, tous les animaux transgéniques qui devront être identifiés par une biopsie invasive couplée à une identification seront inclus dans une demande de projet impliquant ces animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la réalisation du génotypage, couplé à l’identification des souris transgéniques à phénotype non dommageable en élevage dans l’EU, dès l’arrêt de la phalangectomie. Le projet est limité à une durée de 1 an ce qui permettra la mise en place d’une technique de prélèvement de tissu de préférence non invasive.

Procédures

Les animaux subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 15 jours, réalisé en même temps que leur identification par tatouage. Si le prélèvement de tissu doit être réalisé à l’âge adulte, il sera réalisé sur le bord du pavillon de l’oreille dans une partie souple, non cartilagineuse de l’oreille ; dans ce cas, il sera réalisé en même temps que l’identification de l’animal par tatouage ou par la pose d’une bague à l’oreille. La durée du prélèvement sera de quelques secondes et l’identification des animaux par tatouage ou pose d’une bague à l’oreille nécessite moins de 1 minute.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de tissu sera réalisé à l’extrémité de la queue ou à l’oreille, selon l’âge de la souris, et sera inférieure à 1mm afin de limiter les effets indésirables. La queue de la souris a de nombreuses fonctions (régulateur de température, balancier, organe sensitif du toucher…) et son absence entretient un handicap pour les souris. C’est un élément de l’anatomie de la souris sensible, qui contient des os, du cartilage, des vaisseaux sanguins et des nerfs. La coupe de la queue après 28 jours d’âge occasionne un inconfort prolongé en raison de la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation qui est présent à cet âge. Ainsi, à l’âge de 15 jours, une biopsie de moins de 1 mm peut être envisagée sans induire d’effets indésirables importants pour l’animal. Cet âge est choisi car il est compatible avec une identification précoce des souris par tatouage. A l’âge adulte, le prélèvement au niveau du pavillon de l’oreille sera privilégié et toujours limitée à 1mm pour limiter les nuisances. Cette zone est fibro-cartilagineuse et tapissée d’une fine couche de peau. L’incision sera réalisée dans une zone souple non cartilagineuse sur le bord du pavillon de l’oreille. La pose d’une bague numérotée aux oreilles pour identifier de façon définitive la souris peut entrainer une gêne ou un inconfort d’au poids de la bague. En cas de bagarre entre congénères, la bague peut être arrachée ou l’oreille mutilée.

Devenir

Les animaux dont les séquences d’ADN ne sont pas celles attendues seront mis à mort ; les autres animaux d’intérêt seront conservés pour maintenir l’élevage des lignées de souris transgéniques.

Remplacement

L’utilisation de souris transgéniques permet l’étude d’un gène de façon ciblée ou d’une fonction spécifique de l’organisme. Des techniques génétiques permettent de modifier le génome de façon très précise. De plus, la modification du génome peut induire la perte ou l’activation de l’expression d’un gène, et ceci de façon ciblée dans le temps ou dans un organe, constitutivement ou après induction. Ces modèles animaux sont précieux pour réaliser des recherches scientifiques fondamentales ou précliniques et ne peuvent souvent pas être remplacés car les fonctions étudiées mettent en jeu des interactions inter-organes essentielles au bon fonctionnement de l’organisme, impliquant des réponses hormonales, immunitaires et nerveuses.

Réduction

Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum pour éviter la dérive génétique (environ 10 à 15 souris maximum /lignée âgées de 6 mois au maximum pour garantir leur fertilité). L’élevage de lignées transgéniques est limité et restreint aux lignées utilisées pour la recherche. En cas d’arrêt ou d’interruption de projets, les lignées sont cryoconservées par congélation de sperme ou d’embryons. Il est important de noter que le croisement de lignées transgéniques entraine la production d’animaux de mauvais génotype, c’est-à-dire dont les séquences d’ADN ne correspondent pas à celles ciblées. Certains de ces animaux (mais ne représentant qu’un faible pourcentage) pourront être utilisés pour de la formation aux gestes techniques ou comme animaux « contrôles » d’expérience.

Raffinement

Le prélèvement de tissu à l’extrémité de la queue sera réalisé précocement, à l’âge de 15 jours, avant l’ossification de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, un prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille sera privilégié, et réalisé si possible sous anesthésie gazeuse. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Le tatouage à l’encre par injection intradermique n’entraine pas de nuisance. Des techniques alternatives de biopsie non invasives sont en cours d’évaluation et pourront être utilisées lorsque la validation des séquences d’ADN par PCR sera obtenue et si l’absence de contaminations croisées est démontrée.

Choix des espèces

La transgenèse est généralement réalisée chez la souris et l’établissement est un plateau de conservation et d’élevage de différents modèles de souris transgéniques utilisées en recherche fondamentale et préclinique. Le prélèvement caudal sera réalisé à l’âge de 15 jours afin de limiter les nuisances. Le prélèvement effectué sur le pavillon l’oreille sera réalisé à 4 semaines pour éviter l’incision de la queue qui s’est ossifiée à cet âge.

180 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque lapin est anesthésié, reçoit une injection intramusculaire unique d'un produit à base de fer, puis est tué pour analyser le muscle au point d'injection. Le projet répond à une exigence de la Pharmacopée chinoise pour la mise sur le marché en Chine de produits déjà autorisés en France, à raison de deux à trois lapins par lot testé. Le porteur affirme que l'usage d'animaux est "nécessaire" et qu'"aucune méthode substitutive n'est possible" pour ce test réglementaire.

Objectifs

Les injections de fer sont très souvent utilisées chez les jeunes animaux de rente (porcins, ovins, caprins, bovins…) dans le cadre de la prévention et du traitement de l’anémie ferriprive après la naissance. Dans le cadre de l’élevage porcin, les injections de fer sont presque systématiquement réalisées dans les 3 jours suivant la naissance. La Chine est le 1er producteur de porcs au monde et un marché important pour les industries pharmaceutiques vétérinaires. Ce projet est réalisé dans le cadre de demande de liberation de nouveau lot en Chine de produits vétérinaires injectables composés de fer, possédant déjà des AMM en France. A chaque libération d’un nouveau lot de ces produits en France, un contrôle qualité est réalisé à l’aide de différents tests physico-chimiques décrits dans la Pharmacopée Européenne. Pour la commercialisation sur le marché chinois, les autorités chinoises demandent la réalisation d’un test in vivo d’absorption du fer au point d’injection chez le lapin. Ce test fait partie des tests de contrôle qualité réalisés lors de la libération de lots de produits contenant du fer en Chine. Il permet de valider la qualité du lot en analysant l’absorption du fer après une injection unique et de s’assurer que la quantité de fer non absorbée au niveau du point d’injection ne dépasse pas 20% de la quantité injectée. Le but de cette vérification est de s’assurer que chaque lot commercialisé est conforme, et que le produit est sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. Ce projet a donc pour objectif : la réalisation du test d’absorption de fer au point d’injection demandé par les autorités chinoises dans le cadre d’une nouvelle libération de lot.

Bénéfices attendus

Obtenir l’autorisation de mise sur le marché en Chine des produits testés. Ainsi, chaque lot commercialisé et autorisé sera conforme et sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. En effet, ce projet va permettre de valider en Chine des produits permettant de lutter contre l’anémie ferriprive rencontrée dans les élevages.

Procédures

Les animaux utilisés seront anesthésié chimiquement avant de recevoir une injection unique de produit testé. L'injection liée a l'anesthésie sera une injection unique dans le muscle qui durera quelques secondes. L'injection du produit à tester sera une injection unique dans le muscle qui durera quelques minutes.

Impact sur les animaux

Auncun effet indésirable n'est attendu a la suite de l'injection. Les nuisances attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention pour la réalisation de l'anesthésie et stress lors dur réveil de l'animal.

Devenir

Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser le muscle injecté. Ces prélèvements de muscle sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet.

Remplacement

Le test d’absorption du fer au point d’injection est une procédure expérimentale in vivo éxigée par la réglementation chinoise, dans le cadre de la commercialisation sur le marché chinois de produits vétérinaires composés de fer. Par conséquent, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’est possible.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir des directives mentionnées dans la Pharmacopée Chinoise, dans laquelle il est stipulé qu’il faut utiliser 2 animaux par lot testé, et à partir des besoins pour le projet (estimation du nombre de lots à tester sur la durée du projet). L'injection dans le muscle vaste médial ainsi que le traitement du muscle après sont prélèvement sont des actes techniques et critiques pendant lesquels nous pouvons perdre un échantillon. Par conséquent 1 animal sera ajouté a chaque lot afin de s'assurer d'avoir le nombre minimum d'animaux exigée par la pharmacopée sous peine de devoir recommencer le test pour le lot en question. Sur cinq ans, il a été estimé que 60 lots seraient testés soit 180 lapins maximum.

Raffinement

Après réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une durée propre à l'espèce animale soit 14 jours. Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des intéractions amicales avec les personnels en charge des soins, ceci afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les animaux seront hébergés dans la mesure du possible par paires compatibles ou en groupe et recevront un enrichissement du milieu adapté à leur espèce, régulièrement renouvelé (Tablette de repos pour se cacher et grimper, foin, Buchettes de bois). Des évaluations cliniques sont mises en place (observation quotidienne de l’état général, du comportement, observation du site d’administration, etc.). Tout au long des études les animaux sont manipulés/observés par un personnel formé et habilité à travailler chez l'espèce en question. Les voies et volumes d’administration suivront les recommandations des publications reconnues telles que : A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood, Including Routes and Volumes, Karl-Heinz Diehl et al. JOURNAL OF APPLIED TOXICOLOGY, 2001, 21, 15-23. Pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la contention pour l’injection, l’animal sera anesthésié avec un produit adapté. Il est primordial dans ce projet que l’injection soit réalisée précisément au niveau du muscle vaste médial et pour cela l’animal ne doit pas bouger durant l’injection. Une surveillance accrue de l’animal de l'anesthésie jusqu'a son réveil sera réalisée. Si un animal présente des signes de pathologie, de souffrance ou de douleur, un traitement thérapeutique et/ou des soins seront mis en place après acccord du vétérinaire dans le but de le soigner ou de le soulager. De plus, des points limites adaptés et suffisament prédictifs sont mis en place afin de prévenir toute souffrance des animaux. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront réduites au minimum.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi pour ce projet car c’est cet animal qui est demandé et décrit dans la Pharmacopée Chinoise pour la réalisation de tests d’absorption du fer au site d’injection. Conformément à la Pharmacopée Chinoise, les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 1,5 et 2,5 kg.

150 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par le parasite Babesia microti, subissent des prélèvements de sang à la queue tous les trois jours, puis sont tuées par exsanguination une fois la parasitémie cible atteinte, jusqu'à 50 % des globules rouges parasités. L'objet du projet est de produire du sang parasité servant de contrôle positif pour un test de diagnostic. Le porteur affirme que le parasite n'est pas cultivable in vitro et que l'infection expérimentale reste le "seul moyen" d'en produire.

Objectifs

Afin d'obtenir des molécules parasitaire (protéines, antigènes, ADN...) il est nécessaire de recourir à l'infection expérimentale d'animaux tels que la gerbille de Mongolie, le parasite B. microti n'étant pas cultivable in vitro. L'objectif est d'obtenir la quantité nécessaire et suffisante de matériel, essentiellement sous forme de sang parasité pour extraction d'ADN, pour disposer d'un contrôle positif utilisable sur 1 année complète.

Bénéfices attendus

Le diagnostic des babésioses, humaines ou vétérinaire, repose sur la technique de la PCR (amplification spécifique de l'ADN). Un contrôle positif est nécessaire à la validation des résultats, ce contrôle positif consiste à l'utilisation de sang de gerbille parasité par B. microti.

Procédures

Deux injections intra péritonéales (200 µl) seront réalisées (inoculation du parasite à partir de sang parasité à J1), et surdose d'anesthésique lorsque la parasitémie atteint sa valeur cible. Environ 5 prélèvements de sang (1 goutte, soit 50 µl) au niveau de l'extrémité de la queue seront réalisés pour la réalisation d'un frottis sanguin et une mesure d'hématocrite (1 prélèvement tous les 3j). Un prélèvement de sang à la queue, réalisé sans contention particulière, dure environ 20 s, est quasiment indolore et ne provoque pas de stress ni de réactions particulières.

Impact sur les animaux

Les animaux reçoivent deux injections intrapéritonéales au cours de la procédure: une première injection pour l'inoculation des parasites, la deuxième lors de l'euthanasie. Ces deux injections peuvent entraîner une légère inflammation au point d'injection. Les prélèvements réalisés à la queue peuvent également causer une irritation modérée, leurs réalisations ne nécessitent pas la mise en place d'une contention particulière. Le saignement à la queue est stoppé très rapidement et l'application d'un désinfectant au niveau de la queue limite l'inflammation potentielle. Le développement du parasite dans le sang, au moins jusqu'à une parasitémie de 50%, n'induit pas d'effets notables sur le comportement des animaux.

Devenir

Le prélèvement de sang parasité par exsanguination implique l'euthanasie des animaux à la fin de la procèdure.

Remplacement

Il n'y a actuellement pas de méthodes alternatives à l'infection expérimentale pour propager les parasites B. microti. De plus, l'infection expérimentale reste une méthode de réference pour l'isolement de souches parasitaires issues de prélèvement cliniques. Contrairement à d'autres espèces de Babesia telles que B. divergens (cultivable en hématies humaines venant de l'EFS) ou de B. canis (cultivable en hématies canines venant d'une société d'élevage privée), B. microti ne peut pas être cultivées à long terme sur hématies in vitro (quelle que soit l'espèce de mammifère considérée). La production de matériel biologique ne peut être réalisée par des molécules de synthèse ni simulation informatique, ce qui contraint à l'infection expérimentale.

Réduction

Le nombre d'animaux est déterminé par le volume de sang parasité nécessaire pour l'utilisation du matériel mais aussi pour assurer le renouvellement des stocks congelés, permettant un maintien à long terme de nos capacités de production. Ainsi, nous avons besoin de 30 ml de sang parasité/an. A raison de 2 ml de sang total prélevable par animal, nous avons besoin de 30 gerbilles/an (soit 150 animaux sur 5 ans). L'objectif étant la production de sang parasité, l'approche statistique est sans objet.

Raffinement

Le prélèvement rétro-orbital, utilisé pour la mesure d'hématocrite (sur tube capillaire hépariné) est désormais remplacé par l'utilisation d'un lecteur d'hématocrite avec bandelettes. Ce lecteur utilise 2 µl de sang, qui sera prélevé à la queue dans le même prélèvement que celui nécessaire à la détermination de la parasitémie. Ceci permet donc d'éliminer totalement le prélèvement rétro-orbital de la procédure, ce qui permet de réduire fortement la perte sanguine des animaux, la douleur éventuellement générée et les risques d'infection. A noter que le parasite ne peut survivre ou se développer en dehors de la circulation sanguine de l'animal, et ne peut etre transmis que lors d'une injection expérimentale ou une morsure de tique infectée, ce qui empêche toute contamination de la zone d'hébergement. L'extrémité de la queue, à la suite du prélèvemnet, est désinfectée et le saignement stoppé par une légère pression avec un papier absorbant, ce qui empêche l'écoulement de sang parasité en dehors de la zone d'expérimentation et contribue à la non-contamination de la zone d'hébergement. Le point limite principal est l'hématocrite, et la mise en évidence de signes de souffrances. Lorsque l'hématocrite mesuré est inférieur ou égal à 20% (ou lorsque l'animal présente des signes de souffrance tels que déterminés sur la grille d'évaluation), l'euthanasie de l'animal est décidée et le sang parasité récupéré.

Choix des espèces

Babesia microti est un parasite transmis lors du repas sanguin de tiques infectées sur un hôte sensible. Les gerbilles de Mongolie sont sensible à l'infection par B. microti, et en l'absence de système de culture in vitro du parasite, l'infection expérimentale reste le seul moyen de produire du matériel parasitaire (ADN, protéines...).