Procédures légères
Influence de deux acides gras (oléate et palmitate) dans l’infection au Sars-Cov-2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent des injections intraveineuses d'acides gras, une injection ou une nébulisation de pseudoparticules virales, des mesures de fréquence respiratoire et cardiaque, puis un prélèvement sanguin terminal. Le porteur attend potentiellement une difficulté à respirer, voire la mort des souris, les pseudoparticules au contact des acides gras étant cytotoxiques in vitro. Il justifie le recours à l'animal par la "nécessité" de valider dans un "organisme entier et complexe" une hypothèse déjà obtenue en culture cellulaire.
Objectifs
Il est connu que pour entrer dans les cellules, le virus Sars-Cov-2 responsable de la pandémie de Covid-19 doit se fixer à un récepteur, le récepteur ACE2 (Angiotensin Converting Enzyme-2). Considérant les profils cliniques des patients atteints de covid sévères, nous avons voulu vérifier in vitro l’impact d’acides gras dans cette infection. Nous avons alors réalisé des études in vitro sur différentes lignées cellulaires et il s’avère que sur des lignées dépourvues du récepteur ACE2 et en présence d’acides gras, le virus était capable de tuer ces cellules. Notre hypothèse est donc qu’il existe un autre moyen au virus pour tuer les cellules. Nos études in vitro ont été réalisées avec du virus fonctionnel et avec des particules de virus inactivées appelées pseudoparticules. Nous souhaitons ici vérifier cette hypothèse en testant deux acides gras et deux voies d’administration des pseudoparticules chez des souris naturellement dépourvues du récepteur ACE2 humain, le Sars-Cov-2 ne se liant pas à l'ACE2 murin.
Bénéfices attendus
Dans cette étude, des souris dépourvues du récepteur ACE2 humain seront utilisées. Si des altérations au niveau des poumons sont observées en présence d’acides gras, cela révèlera la présence d’un second mécanisme d’entrée du virus dépendant de la présence d’acides gras mais indépendant du récepteur ACE2. Il y aura donc d’autres recherches à mener pour identifier cette seconde voie d’entrée, la bloquer et ainsi bloquer l’entrée du virus. Une fois que les deux mécanismes d’entrée du virus dans les cellules seront bloqués (via ACE2 et via le second mécanisme), le virus ne pourra plus se multiplier et provoquer de graves maladies telles qu’observées lors de la pandémie de Covid-19.
Procédures
Les souris seront soumises à 3 injections intraveineuses (3x2min) d’oléate ou de palmitate, 1 injection intrapéritonéale (1min) ou 1 nébulisation de pseudoparticules (30min). Elles seront soumises à une mesure de fréquence respiratoire (5min) et cardiaque (20min). Un prélèvement sanguin (1min) unique sera réalisé à la fin de la procédure juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Les souris seront isolées 30min durant la nébulisation, 5min pendant la mesure de fréquence respiratoire et 20min pendant la mesure de fréquence cardiaque. D'après nos études in vitro, les pseudoparticules en contact de différents acides gras sont cytotoxiques, nous attendons potentiellement une difficulté à respirer, voire une mortalité des souris.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront mises à mort.
Remplacement
Notre hypothèse selon laquelle il existe un second mécanisme d’entrée du virus dans les cellules dépendant des acides gras a déjà été validée in vitro. Nous souhaitons maintenant la valider in vivo, dans un organisme entier et complexe. Des dosages et caractérisations seront effectuées sur les sérums et organes des souris afin d’identifier le rôle des acides gras dans le mécanisme d’entrée du virus dans les cellules.
Réduction
Le nombre de souris a été déterminé statistiquement pour être nécessaire et suffisant pour répondre à notre hypothèse. Des études statistiques seront également réalisées à postériori pour comparer les groupes 2 à 2.
Raffinement
Les gestes effectués sur les souris seront effectués par du personnel entrainé et tout sera mis en œuvre pour assurer le bien-être des animaux. Les souris seront par groupe de 4 ou 6 dans des cages adaptées et leur bien-être sera évalué tous les jours. La température et l'hygrométrie ambiantes seront également suivies quotidiennement et maintenues respectivement entre 20 et 24°C et entre 35 et 75%. Leur milieu sera enrichi avec un objet en plastique rouge transparent tout au long de l’étude et avec des bâtons de coton pour créer un nid. Les souris seront observées quotidiennement et cette surveillance sera accrue durant les 3 jours d’étude. En cas d’atteinte d’un point limite, la décision de mettre à mort la souris selon une méthode réglementaire, sera prise par le responsable du bien-être animal.
Choix des espèces
Nous envisageons d’effectuer la suite de ce projet sur des souris K18-hACE2 (modèle COVID) de fond génétique C57Bl6, c’est pourquoi cette étude sera effectuée sur cette souche de souris. Souris âgées de 6 mois. Les patients atteints de Covid sévère sont en majorité des personnes âgées, c'est pourquoi nous avons choisi de travailler avec des souris âgées.
Caractérisation comportementale et pharmacologique de trois modèles murins de stress chronique : évaluation de leur pertinence pour l’étude de la dépression
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles sont soumises à trois protocoles de stress chronique, dont un modèle de défaite sociale fondé sur des agressions physiques répétées, que le porteur décrit comme le plus sévère, induisant douleur physique et psychique et un état de stress durable. Les deux autres protocoles enchaînent des situations désagréables provoquant peu ou pas de douleur physique. Toutes les souris sont tuées pour prélever le cerveau, l'objectif déclaré étant de comparer ces modèles de dépression et, à terme, de réduire le nombre d'animaux utilisés au laboratoire.
Objectifs
Les troubles dépressifs sont la principale cause d’invalidité dans le monde. Cependant l’efficacité des antidépresseurs est insuffisante chez un grand nombre de patients, ce qui nécessite une meilleure caractérisation des mécanismes neurobiologiques de la maladie ainsi que l’investigation de thérapies alternatives. Il est donc essentiel de développer des modèles précliniques liés à l’exposition à des événements stressants (« stresseurs ») générant des phénotypes comportementaux récapitulant au mieux certains aspects de la pathologie humaine. Nous proposons de comparer trois protocoles de stress chez la souris : le stress de défaite sociale (SDS), le stress variable chronique (SCV), et le stress chronique imprédictible (SCI). Ces trois protocoles diffèrent par la nature, la durée et l’intensité des stresseurs appliqués. La littérature suggère qu’ils ont également des conséquences qui peuvent être différentes sur l’expression des comportements anxiodépressifs selon les individus et le sexe. L’objectif est donc de comparer ces modèles au niveau des comportements anxiodépressifs qu’ils provoquent à différents points dans le temps. Si ces modèles s’avèrent pertinents pour l’étude de la dépression, nous explorerons leur profil de réponse à un antidépresseur couramment utilisé. Ces recherches permettront d’instaurer une diversité de modèles d’étude sur la dépression dans notre laboratoire, et ont le potentiel de mener au développement de thérapies innovantes et différenciées selon le sexe et l’individu. Nous attendons que ces modèles génèrent des résultats différents : par exemple, il est attendu que le SDS ait un impact plus important sur les phénotypes liés à l’interaction sociale étant donné la nature du stresseur par rapport au CVS ou au SCI. Ces différences sont une richesse, le but étant de modéliser différents symptômes présents chez les patients humains en utilisant plusieurs modèles précliniques. Concrètement, le développement et la validation de ces modèles nous servira dans la plupart de nos études postérieures : par exemple, dans nos études sur la neurostimulation ultrasonore et magnétique, qui sont des traitement alternatifs potentiels aux antidépresseurs. Tester ces nouveaux traitements dans ces modèles de stress nous permettra d’une part d’évaluer l’efficacité de ces traitements par rapport aux antidépresseurs, d’autre part de tester ces traitements dans différents types de stress.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra permettre une meilleure utilisation utilisation des modèles précliniques de maladies neuropsychiatriques murins grâce à une caractérisation plus détaillée de trois modèles de stress différents couramment utilisés. Il pourra également identifier de potentielles différences dans les effets du stress ou du traitement antidépresseur selon le protocole, le sexe et les individus. De manière importante, il réduira l’utilisation d’animaux sur le long terme dans notre laboratoire en établissant des protocoles de stress reproductibles et en éliminant des protocoles peu reproductibles. Ces modeles seront par ailleurs essentiels à une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques sous-tendant les atteintes aux différentes dimensions comportementales observées dans les pathologies psychiatriques liées au stress. En effet ces études nécessitent la mise en place d’outils d’imagerie de précision (exemple : imagerie calcique), combinés à des approches mécanistiques (modification d’expression de gènes, optogénétique, électrophysiologie, etc), pour la plupart nécessitant des chirurgies stéréotaxiques, et pour lesquelles il est essentiel de disposer d’un modèle comportemental fiable et reproductible.
Procédures
Le modèle de SDS (stress de défaite sociale) est le plus sévère des trois modèles proposés. Celui-ci étant fondé sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique (de très courte durée, sauf en cas de blessure où elle sera prise en charge par les expérimentateurs) et psychique, ainsi qu’un état de stress aigu pendant la procédure qui deviendra durable après les répétitions (l’impact comportemental constaté dans la littérature est présent jusqu’à 3-4 semaines). Cela induit des comportements anxio-depressifs chez les souris exposées au modèle. Les deux autres modèles provoquent peu ou aucune de douleur physique et consistent en des enchaînements répétés de situations désagréables. L’objectif final de cette étude étant de comparer les modèles puis d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux pertinents pour nos études ayant été validés par la littérature dans ces modèles, il est essentiel de les caractériser. Ces comportements anxio-dépressifs seront évalués par différents tests : l'apathie est mesurée par un test d'éclaboussement du pelage par une solution de sucrose sur 5 minutes, l'état du pelage évalue les mêmes symptômes (mesure hebdomadaire avec préhension des animaux), le test d'hyponéophagie évalue l'anxiété (privation de nourriture 12-24h puis mise en présence de nourriture pendant 5 minutes), l'open field, la boîte claire obscure et le labyrinthe en croix surélevé également (5 minutes dans l'arène), le test de préférence au sucrose évalue l'anhédonie (24h d'accès à une solution sucrée sur 5 jours), le test de nage forcée évalue les symptômes d'abandon (6 minutes). Les tests d'interaction sociales ont lieu sur des plages de 10 minutes qui peuvent être répétées sur 3 jours. De plus, si ces modèles de stress s'avèrent être pertinents, nous caractériserons également leur profil de réponse à un antidépresseur (fluoxétine dans l'eau de boisson 5 semaines) afin de pouvoir comparer avec les réponses aux traitements chez l'humain.
Impact sur les animaux
Le modèle de SDS est le plus sévère des trois modèles proposés. Celui-ci étant fondé sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique (de très courte durée, sauf en cas de blessure où elle sera prise en charge par les expérimentateurs) et psychique, ainsi qu’un état de stress aigu pendant la procédure qui deviendra durable après les répétitions (l’impact comportemental constaté dans la littérature est présent jusqu’à 3-4 semaines). Les deux autres modèles provoquent respectivement peu et aucune douleur physique. L’objectif final de cette étude étant de comparer les modèles puis d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux induits par chaque modèle, et des comportements anxio-dépressifs pertinents pour nos études ayant été validés par la littérature dans ces modèles, il est essentiel de les caractériser. L'administration d'antidépresseurs chez les animaux modèles et contrôles se fera dans l'eau de boisson sur 5 semaines. Aucun effet indérisable de l'antidépresseur n'est attendu : en effet, il sera administré directement dans l'eau de boisson afin d'éviter le stress lié aux injections répétées, et sera utilisé à une dose standard qui ne provoquera pas de nuisances visibles chez l'animal. De fait, l'effet d'un tel traitement est souvent bénéfique : il a été observé dans de mutiples études chez la souris un rétablissement des comportements liés au stress (diminution voire disparition des comportements anxio-dépressifs obtenus suite aux modèles de stress) à la suite d'un traitement chronique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des expériences afin de récupérer les cerveaux pour des études histologiques. Ces études histologiques permettront de décrire les effets de chaque protocole de stress au niveau cérébral afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle. Les effectifs seront adaptés en fonction de la taille des effets et deux cohortes seront utilisées au lieu de trois dans la première partie si nous trouvons les conditions adéquates dès la première cohorte. Egalement, la seconde partie sera abandonnée si nous n’obtenons pas de résultats dans la première partie. La stratégie des trois cohortes suit une analyse statistique a priori utilisée de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique . En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être et intervenir si nécessaire . Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués et la décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation d’un modèle de dépression et de neurostimulation, ainsi que la possibilité d’utiliser des technologies permettant l'étude détaillé du cerveau. Les animauxseront adultes au début de l’étude car il s’agit de comprendre ces phénomènes comportementaux associés à un cerveau adulte.
Optimisation d’un traitement de thérapie génique pour l’hypophosphatémie liée au chromosome X
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Reproduisant un rachitisme génétique lié au chromosome X, elles reçoivent une injection unique d'un virus-médicament, puis des prélèvements sanguins rétro-orbitaux répétés cinq à vingt fois sur trois à dix-huit mois, avec des mesures morphologiques et un test de la grille inversée. Le porteur indique n'attendre aucun effet secondaire du traitement, les nuisances se limitant au stress de contention et à la douleur des piqûres. Il affirme que les résultats sur cellules "ne reflètent pas toujours" ceux obtenus chez l'animal, ce qui justifie le recours à la souris.
Objectifs
Notre projet a pour but de développer une solution thérapeutique pour les patients atteints d’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). L’XLH est la forme de rachitisme génétique la plus fréquente touchant 1 naissance sur 20 000 chaque année. Cette maladie métabolique rare se traduit principalement par des malformations squelettiques. Les patients sont de petite taille et souffrent de douleurs osseuses, dentaires, et musculaires. Leurs os sont plus fragiles et les fractures nombreuses. Deux traitements sont actuellement disponibles, mais ils présentent des limitations importantes : i) leur efficacité est transitoire et/ou partielle et nécessite une réadministration fréquente; ii) ils peuvent provoquer des effets néphrotoxiques sévères. C’est pourquoi nous développons une alternative par thérapie génique, qui a le potentiel de guérir les patients en une seule administration. Ce projet va nous permettre d’identifier chez le modèle murin de XLH, un traitement sûr et efficace.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre au point, chez un modèle murin, un traitement sûr et efficace pour la maladie XLH. Nos précédents travaux ont permis d’établir la preuve de faisabilité d’une approche par thérapie génique. Dans ce projet, qui durera 5ans, nous voulons améliorer le produit que nous avons conçu et réaliser l’ensemble des études nécessaires à son développement vers la clinique. Les résultats obtenus nous permettront alors d’envisager une solution thérapeutique pour patients XLH, efficace sur le long-terme, afin de stopper l’évolution de leur pathologie. Les bénéfices attendus concernent donc directement l’amélioration de l’état de santé des malades et de leur qualité de vie.
Procédures
Les animaux seront injectés une seule fois avec des virus médicaments dans la veine temporale ou les sinus rétro-orbitaux selon l’âge des souris. Ce geste dure moins de 30 secondes. Les animaux seront anesthésiés par voir gazeuse (isoflurane) puis prélevés en sang au niveau des sinus rétro-orbitaux. Ce geste dure moins de 30 secondes. OEil gauche et oeil droit seront alternés. Ce geste sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Les mesures morphologiques (taille du corps, taille de la queue) seront réalisées juste après les prélèvements de sang afin d’éviter une autre anesthésie. Ce geste dure moins de 30 secondes. Ce geste sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Le test de la grille inversée sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Nous réalisons ce test couramment dans d’autres projets, et aucun traumatisme physique n’a été observé. Ce test dure 3 minutes et le nombre de chutes par minute est comptabilisé.
Impact sur les animaux
Traitement injecté : aucun effet secondaire n'est attendu suite à l'injection du traitement. Traitement des souris HypDuk : diminution des problèmes liés à la maladie (augmentation taille et poids des souris) Injection : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure d'aiguille. Prise de sang : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure. Mesures morphologique : Réalisé sur souris endormies lors du prélèvement de sang : pas de stress supplémentaire. Test musculaire : Stress lié à la manipulation. Euthanasie : Stress lié à la manipulation. Souris HypDuk : pas de douleur quotidienne lié à la maladie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Dans un premier temps, nous avons réalisé un premier tri de nos candidats sur des cellules en culture. Ces tests nous ont permis d'éliminer les candidats produisant une trop faible quantité de protéine. Néanmoins, par expérience, nous savons que les résultats obtenus sur cellules ne reflètent pas toujours les résultats obtenus chez l'animal et ne permettent pas d’identifier si l’approche permet de traiter les symptômes de la maladie. L’utilisation d’animaux est donc primordiale pour réaliser cette étude car (1) il est nécessaire de tester nos produits sur un corps entier pour observer les effets simultanés sur le foie, les reins et sur les os (2) il est nécessaire d’évaluer la croissance ainsi que la force musculaire des souris (3) il faut obtenir des fluides (sang, urine) pour mesurer les marqueurs de la maladie.
Réduction
Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 186 souris saines et 166 souris malades). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la deuxième procédure n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes ou seulement avec 1 candidat. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (186 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.
Raffinement
Dès leur arrivée en zone d’expérimentation, les souris seront manipulées et contentionnées afin d’être familiarisées aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Cette habituation devrait réduire le stress et l’angoisse des animaux. Les souris utilisées lors de ce projet ne présentent pas de signes de douleurs évidents. Les virus utilisés sont non dangereux et les doses utilisées ne sont pas toxiques, de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Prélèvements de sang: ils seront réalisés au niveau de la veine mandibulaire sur animal vigile. Une fois le prélèvement terminé, un éventuel saignement sera stoppé par l’application d’une compresse au niveau du point de prélèvement. L’animal sera remis dans sa cage. Si des signes de souffrance venaient à apparaitre, la souris sera pesée et surveillée de manière assidue. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisées. Certaines souris générées ne seront pas utilisées (comme les femelles qui ne portent pas la maladie), elles seront rapidement euthanasiées afin de limiter le nombre de souris en élevage.
Choix des espèces
A notre connaissance, les seuls modèles animaux de la maladie XLH sont des modèles murins. Il y a 2 modèles : le modèle HypDuk-B6 et le modèle HypDuk-Balb. Ces deux modèles reproduisent les signes cliniques retrouvés chez les patients XLH. La population de patients que nous visons sera composée d’enfants, de jeunes adultes et des adultes, aussi, nous avons besoin de traiter des souris à des âges qui correspondent à ces étapes chez l’homme (souris de 0-2 jours, de 2 semaines, de 4 semaines et de 6 semaines) et d’évaluer si notre traitement pourra être efficace en : (1) en prévention de la pathologie : le traitement est-il efficace s'il est administré avant l'apparition de symptômes important (traitement des souris les deux premiers jours de vie (=nourrisson)) ? (2) le traitement est-il efficace s'il est administré à l'apparition des premiers signes de la maladie (traitement des souris à 2 ou 4 semaines (=enfant ou adolescent)) ? (3) le traitement est-il efficace s'il est administré une fois que la pathologie est bien établie et que les symptômes sont important (traitement des souris à 6 semaines (=adulte)) ?
Rôle des nanoplastiques de polystyrène dans l’induction de l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes et leurs petits sont exposés à des nanoplastiques de polystyrène dans l'eau de boisson jusqu'à dix mois, puis les descendants reçoivent des électrodes implantées dans le cerveau et une injection d'un composé déclenchant des crises. Le porteur indique que les nanoplastiques provoquent une nuisance faible, mais que la chirurgie d'implantation et les crises peuvent être douloureuses ou stressantes. Toutes les souris sont tuées pour prélever le cerveau, l'objectif étant de tester si l'exposition aux nanoplastiques favorise l'épilepsie.
Objectifs
L'épilepsie est une maladie qui se traduit par une activité électrique anormale du cerveau. Elle touche surtout les enfants, les adolescents et les personnes âgées à des degrés divers. Les causes peuvent être génétiques, mais dans la plupart des cas, elles ne sont pas identifiées. Dans 60% des cas d'épilepsie, on suspecte des lésions du cerveau qui ne sont pas détectées par les méthodes de diagnostiques actuelles. Notre hypothèse est que les résidus de polluants environnementaux pourraient altérer le cerveau au moment de sa formation et induiraient de l'épilepsie qui apparaitrait plus tard dans la vie de l'individu. Notre objectif est de comprendre si une exposition aux nanoplastiques de polystyrène peut induire de l'épilepsie ou une sensibilité accrue à des stimulants pro-épileptiques chez les souris. Pour cela, nous allons faire des mesures de l'activité électrique cérébrale via des électroencéphalogrammes (EEG) et des observations du comportement dans ces 2 cas. Indépendamment de l'apparition de crises (ou pas), les enregistrements pourront mettre en évidence des modifications de l'activité cérébrale qui pourraient sous-tendre aux troubles du neurodéveloppement liés à l'exposition aux nanoplastiques, ainsi qu'une sensibilité accrue aux stimuli pro-épileptiques. Ceci sera évalué grâce à une injection d'un composé convulsivant, qui, à faibles doses, n'induit pas de réponse chez l'animal sain mais provoque une crise épileptique chez les animaux susceptibles, indicative d'une fragilité du réseau neuronal.
Bénéfices attendus
Le projet aura des bénéfices sur la santé humaine : (i) identification d'un lien entre l'exposition aux nanoplastiques et l'épilepsie; (ii) si les souris développent de l'épilepsie, cela permettrait d'expliquer, en partie, l'origine de certains cas d'épilepsie; (iii) au vu de la quantité de plastiques rejetés dans l'environnement, il a été évalué que les êtres humains ingèrent l'équivalent d'une carte bancaire par semaine (5 g par personne et par semaine). Nos recherches pourraient pousser les autorités à prendre des mesures plus drastiques pour limiter l'usage des plastiques dans les emballages alimentaires et protéger la santé des populations les plus fragiles étant donné que des études récentes ont montré que les nanoplastiques pénètrent dans le cerveau.
Procédures
Trois interventions : 1) Exposition aux nanoplastiques de polystyrène dans l'eau de boisson sur femelles gestantes et leurs petits jusqu'à 10 mois d'âge. Nombre femelles gestantes = 36 et progéniture = 156. 2) Implantation d'électrodes dans le cerveau des souris (progeniture) en vue d'enregistrements électro-encéphalogrammes (EEG). Durée de la chirurgie = 40 minutes maximum. 7-10 jours entre l'implantation et les enregistrements. Nombre d'animaux = 156. 3) Une seule injection de composé pro-épileptique lors de la deuxième session d'enregistrement EEG. Durée du geste: 30 s maximum. Nombre d'animaux = 156.
Impact sur les animaux
D'après nos résultats préliminaires, l'administration de nanoplastiques dans l'eau des biberons induit une nuisance faible, voire inexistante. L'éventuelle survenue de crises épilepsies peut être source de stress pour l'animal. Il est difficile de savoir si une douleur est associée aux crises motrices (secousses) mais chez l'humain il n'y a pas de douleur rapportée en cas de crise. Concernant l'implantation des connecteurs EEG, la chirurgie en soi pourrait induire une douleur, bien que tout soit mis en place pour minimiser ces effets. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale après injection d'anesthésiants. Ces injections peuvent engendrer une légère douleur locale. Un spray anesthésiant est également appliqué dans les oreilles afin d'éviter une douleur locale au réveil. Concernant les suites post-opératoires, et d'après notre expérience, ce type de procédure n'engendre pas de signes de douleur, ni d'infection. L'enregistrement des EEG pourrait engendrer un léger stress dû au changement d'environnement.
Devenir
A l'issue de la procédure tous les animaux seront euthanasiés et leur cerveau prélevé pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, il nous est impossible de remplacer l'animal vivant pour l'étude de l'épilepsie induite par l'exposition chronique aux nanoplastiques. En effet, les phénomènes physiopathologiques que nous souhaitons étudier sont très complexes et ne sont pas reproductibles à ce jour par des modèles in vitro, ni par modélisation. La souris demeure le meilleur choix, surtout en vue de l'existence de souris modèles d'épilepsie.
Réduction
Pour ce projet nous envisageons d'utiliser 210 souris sur la durée du projet. Le nombre d'animaux adéquat a été calculé grâce à un logiciel permettant d'avoir des analyses robustes. Nous avons également tenu compte de notre expertise de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant un nombre suffisant d'animaux pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées.
Raffinement
Concernant le traitement par les polluants, les industriels ne sont pas tenus de faire des tests de toxicité pour les résidus de plastiques car à ces faibles doses, il n'est pas attendu de toxicité. Par ailleurs, des études préliminaires conduites au laboratoire n'ont pas montré de signes de souffrance chez les animaux exposés pendant 10 mois à ces concentrations de nanoplastiques. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale, après injection d'anesthésiants. Un spray anesthésiant est également appliqué dans les oreilles afin d'éviter une douleur locale au réveil. Les animaux seront hébergés en groupe, sauf lors de l'implantation des dispositifs nécessaires pour enregistrer l'activité cérébrale, afin d'éviter le risque de blessure mutuelle (par ex. connecteurs arrachés). L'environnement sera enrichi (copeaux, morceaux de coton, papier, maisonette). Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque étape de la procédure expérimentale (chirurgie, enregistrement EEG). L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de bien-être, utilisée sur notre plateau d'expérimentation. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée en fonction de la grille de score établie et si des signes de souffrance sont détectés (détresse, souffrance, prostration, perte de poids supérieure à 15%, poils ébouriffés) .
Choix des espèces
Dans les modèles d'expositions in utéro aux polluants environnementaux, la souris représente un modèle de choix, pour les raisons suivantes: - ce sont des mammifères donc le mode de transmission des polluants via le placenta et le lait est similaire à l'humain; - des études précédentes sur l'exposition aux plastiques ont permis de mettre en évidence que les nanoplastiques affectent le cerveau et le comportement des souris; - la reproduction et la gestation sont relativement rapides ce qui permet de générer les groupes nécessaires à l'étude assez rapidement; - le nombre de petits par portée est élevé, ce qui permet d'avoir une robustesse dans nos études comportementales, de prendre en compte le sexe dans les groupes et d'avoir des échantillons en nombre suffisant pour les analyses. Les mères (6-8 semaines) seront traitées avec les nanoplastiques de polystyrène à faibles doses avant l'accouplement pendant 1 mois, puis pendant l'accouplement et la gestation. Elles seront en permanence sous traitement à une concentration résiduelle, comme c'est le cas de la population humaine exposée chroniquement aux plastiques tout au long de leur vie. Les petits issus de ces portées seront également soumis aux nanoplastiques de polystyrène à faibles doses pendant le développement (stade foetal), pendant la lactation et jusqu'à la date d'euthanasie prévue des animaux.
Etudes et modulations pharmacologiques des mécanismes liant les troubles métaboliques au déclin cognitif sur un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Soumises à un régime gras sur douze mois, elles subissent des prélèvements sanguins rétro-orbitaux tous les trois mois, un test de tolérance au glucose, une batterie de tests comportementaux non détaillés et, pour certaines, une injection stéréotaxique dans le cerveau. Le porteur indique que le régime peut être mal toléré et que la stéréotaxie ou l'IRM sous anesthésie peuvent provoquer détresses respiratoires et hypothermie. Toutes les souris sont tuées pour prélever le cerveau et réaliser des études histologiques.
Objectifs
Le déclin cognitif est un processus naturel survenant avec le vieillissement. Néanmoins il peut être accéléré et aggravé par la présence de troubles métaboliques, particulièrement lorsque ceux-ci sont présents à un âge moyen. Nous avons montré précédemment sur notre modèle à long terme (12 mois) l'apparition progressive de troubles métaboliques en réponse à un régime enrichi en gras (hypercholestérolémie, intolérance au glucose, hyperglycémie de stade prédiabétique, stéatose, augmentation de la graisse viscérale). Des altérations de la flexibilité de la mémoire, de la mémoire de reconnaissance visuelle ainsi que des altérations fonctionnelles des vaisseaux cérébraux de surface et intraparenchymateux ont été observées de manière concomittante et étroitement corrélées à l'augmentation de la graisse viscérale. Notre hypothèse est qu'une altération du couplage entre activité neuronale et réactivité vasculaire pourrait participer à la mise en place du déclin cognitif, vulnérabiliser le tissu cérébral et favoriser l'évolution vers la démence.
Bénéfices attendus
Ce projet a l'avantage de proposer un modèle murin totalement maitrisé au laboratoire mimant la mise en place progressive de troubles métaboliques. Ce profil pathologique est souvent retrouvé en clinique humaine et les médecins sont parfois indécis quant à la prise en charge de ces troubles, d'autant plus quand ceux-ci sont associées. Grâce à cette étude, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes d’action et les conséquences observées, et envisager des projets de recherche translationnels avec la clinique.
Procédures
La mise en place des troubles métaboliques chez les souris sera évaluée par des dosages plasmatiques des marqueurs standard (cholestérol, triglycérides, glycémie, leptinémie et insulinémie). Des prélèvements sanguins seront effectués tous les 3 mois de 0 à 12 mois de régime au niveau du sinus rétro-orbital, après anesthésie des animaux pendant 10 minutes. En parallèle, un test de tolérance oral au glucose sera effectué sur une durée de 2 heures. Les souris seront mises à jeun 6h avant l'expérience. Tous les animaux sont évalués d'un point de vue comportemental par une batterie de tests aux différents temps d'intérêt. Avant la mise sous régime, certains animaux subiront une injection stéréotaxique d'AAV permettant de cibler les neurones glutamatergiques pour les mettre en évidence lors des expérimentations électrophysiologiques ultérieures (intervention de 30 minutes/souris). Enfin, à tous les temps d'intérêt, certains animaux subiront une anesthésie de 15 minutes pour la mesure du débit sanguin cérébral par laser Doppler en réponse à une stimulation des vibrisses et d'autres animaux subiront une anesthésie de 30 minutes pour la réalisation des séquences d'IRM.
Impact sur les animaux
La mise en place d'un régime HFD peut être mal tolérée par certains animaux et entrainer de l'inconfort. Les injections en stéréotaxie ou l'imagerie en IRM sous anesthésie peut provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie chez certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés. Ils seront analysés au cas par cas.
Devenir
A l'issue des différentes procédures tous les animaux seront mis à mort après les évaluations comportementales aux différents temps d'intérêt. Le cerveau sera ensuite prélevé dans le but de réaliser des études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes d'apparition du déclin cognitif induits par des désordres métaboliques dans un contexte sans facteurs confondants. Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes donc la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro. Les évaluations cognitives ne peuvent se faire que sur l'animal.
Réduction
L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 1840 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les études comportementales et la réponse aux traitements présentent une certaine hétérogénéité qui nécessite d'avoir un nombre d'animaux suffisant par lot ainsi que plusieurs lots pour valider les résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie (Curtis et al, 2018). Ainsi, des études statistiques seront réalisées à l'aide de tests paramétriques ou non paramétriques selon la normalité de la distribution. Pour l'ensemble de ces analyses, les différences seront significatives lorsque p≤0,05.
Raffinement
Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique ou seront euthanasiés dans une salle dédiée. La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.
Choix des espèces
Le projet est basé sur l’évaluation de marqueurs métaboliques, biologiques et comportementaux et sur l’observation de l’impact d’un traitement pharmacologique ou nutraceutique. L’utilisation d’animaux est donc requise. Notre laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur les rats et les souris et nous disposons d’outils fiables et de protocoles bien validés pour l’imagerie, les tests comportementaux, l'électrophysiologie, la réactivité vasculaire, l’histologie, les marquages et les dosages. Les souris C57Bl6/j mâles sont reconnues comme étant des animaux particulièrement sensibles à un régime enrichi en gras. Les souris seront soumises à un régime enrichi ou non à partir de l’âge de 8 semaines, âge le plus couramment utilisé dans la littérature pour induire des troubles métaboliques chez ces souris.
Extension d’indication thérapeutique préclinique
- Recherche appliquée
- Cancers
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Une tumeur cancéreuse leur est injectée sous la peau, suivie de quatre injections d'un vaccin combinant virus atténué, anticorps et fragment d'ADN sélectionné par intelligence artificielle. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer, provoquer douleur et détresse et se propager aux poumons, à l'abdomen, au cerveau et aux genoux. Les bénéfices annoncés pour de futurs essais cliniques sont présentés comme "essentiels", l'objectif immédiat restant de vérifier la réponse immunitaire induite par le vaccin.
Objectifs
Nous souhaitons vérifier la capacité du traitement que nous avons développé à produire des réponses immunitaires permettant de contrôler l'évolution du cancer. Ce traitement consiste en un virus atténué, un anticorps et un fragment d'ADN qui contient des informations sur des mutations génétiques retrouvées au sein de la tumeur que l'on veut traiter. Le choix de ces mutations est réalisé à l'aide d'outils reposant sur l'intelligence artificielle et ce projet nous permettra également de vérifier l'efficacité des mutations choisies par les algorithmes que nous utilisons.
Bénéfices attendus
Nous attendons des bénéfices à deux niveaux à la suite de l’exécution de ce projet : - La meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite par notre vaccin contenant les molécules cibles, et l’analyse des réponses favorables au contrôle de la tumeur permettra potentiellement d’améliorer notre vaccin - Ces données sont essentielles pour les futurs essais cliniques chez l’humain et tester la sureté et l’efficacité de notre vaccin pour soigner des patients atteints de cancer
Procédures
Les souris seront injectées une fois sous la peau avec les cellules de cancer sous anesthésie générale. L’anesthésie dure environ 5 minutes et l’injection 30 secondes. Elles seront aussi injectées 4 fois sous la peau avec notre vaccin sans qu’une anesthésie ne soit nécessaire. Le geste dure environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
La tumeur peut gêner au déplacement de l’animal. La tumeur peut ulcérer et causer douleurs et détresse à l’animal. Le cancer peut se propager à différents endroits de l’organisme. Ce point concerne surtout le modèle de cancer du sein qui peut se répandre aux poumons, dans l’abdomen, au cerveau et aux genoux. Cela peut alors perturber le comportement de l’animal, sa respiration ou ses déplacements
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de procéder au prélévement des organes où s'initie la réponse immunitaire et, le cas échéant, des tumeurs.
Remplacement
Nous voulons étudier les mécanismes mis en œuvre par notre système immunitaire d’une part et par la tumeur d’autre part, ainsi que l’interaction entre ces deux entités. Cette interaction nécessite l’intervention de nombreuses cellules différentes provenant d’organes différents. Cette complexité requiert pour l’heure des études chez l'animal pour évaluer et comprendre les phénomènes mis en jeu.
Réduction
Pour les études de survie chez les souris atteintes de cancer où nous réaliserons des comparaisons 2 à 2 avec un test statistique adéquat, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 20 pour avoir 70% de chances de détecter l'effet recherché. Concernant les autres études, pour avoir 90% de chance de détecter l'effet de notre vaccin en utilisant un test statistique adéquat, nous avons besoin de 9 souris par groupe. Le dosage des composés de notre vaccin est basé sur l’art antérieur issu de la littérature et de nos données propres.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages disposant de matériel de nidification et de bâton à ronger. Le déplacement des animaux, notamment lors des changements de cages, seront réalisés à l’aide de tunnels transparents afin d’éviter au maximum une prise en main stressante pour l’animal. Des pellets de nourriture seront ajoutés au fond de la cage des souris présentant des tumeurs au moindre doute que celles-ci puissent gêner l’accès des souris à la mangeoire et donc leur prise de nourriture. L’observation des animaux sera effectuée tous les jours et un suivi attentif des animaux sera assuré trois fois par semaine, à partir de 7 jours après l’injection des cellules tumorales. Nous effectuerons tout d’abord une observation simple de l'animal, il sera alors jugé de la qualité de son toilettage, de sa posture, de son expression faciale et de sa démarche, à la recherche de signes de douleur potentiels. L’animal sera ensuite pesé en utilisant le tunnel transparent pour le transfert dans le bol de pesée. Cette pesée permettra de détecter toute difficulté à la prise alimentaire et/ou toxicité inattendue du traitement. A partir de 7 jours après l’injection des cellules cancéreuses, les souris pourront être palpées à la recherche de tumeur au site d’injection ou, à la recherche d’une dissémination du cancer. Des points limites ont été mis en place et ces examens réguliers nous permettrons, le cas échéant, de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence en immunologie ainsi qu’en immuo-oncologie et de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles dans cette espèce. De plus, cette espèce dispose de nombreuses ressources en oncologie et notamment des modèles de cancer utilisés dans ce projet. Les souris seront de jeunes adultes (6-8 semaines) ce qui correspond à un stade où le système immunitaire est pleinement mature et fonctionnel. Les animaux ne sont pas choisis plus âgés pour limiter les effets de la dégénérescence immunitaire.
Colisier : « Évaluation d’une méthodologie de surveillance de l’antibiorésistance dans les effluents d’élevages bovins laitiers »
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
40 bovins vont être utilisés, 20 vaches et 20 veaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans mise à mort. Ils subissent des prélèvements de fèces par fouille rectale toutes les deux semaines pendant la période d'hivernage, un geste estimé à moins de deux minutes. Le porteur indique qu'aucune souffrance ni douleur n'est attendue et que tous les animaux reprennent leur place dans le troupeau. L'objectif déclaré est de tester une méthode de surveillance de l'antibiorésistance dans les effluents d'élevage laitier.
Objectifs
A l'heure actuelle, la gestion des effluents d’élevage s’intéresse presque exclusivement à minimiser le risque de pollution azotée. Cependant, l'épandage de fumier et de lisier peut également entraîner la dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques dans l'environnement, la pollution des sols et des cultures avoisinantes par des pathogènes zoonotiques, et la pollution des pâturages par des pathogènes animaux, participant ainsi à leur transmission au niveau du troupeau. Le suivi microbiologique des effluents d'élevage pourrait permettre de mieux maîtriser ces risques sanitaires dans une approche de santé globale, où la santé de l'Homme, des animaux et de l'environnement sont interdépendants. Pour pouvoir mettre en place un suivi des bactéries résistantes aux antibiotiques et de leur virulence dans les effluents et identifier des points de contrôle, il est nécessaire de connaître en amont les niveaux de contamination dans les différentes matrices et la méthodologie la plus adaptée pour suivre ces niveaux de contamination (période de prélèvement, types de matrices, méthodes d'analyse, etc.). C’est l’objet de ce projet, qui s’intéressera en particulier à Escherichia coli.
Bénéfices attendus
Le suivi microbiologique des effluents d'élevage pourrait permettre de mieux maîtriser ces risques sanitaires dans une approche se santé globale, où la santé de l'Homme, des animaux et de l'environnement sont interdépendants.
Procédures
Des prélèvements de fèces par fouille rectale seront pratiqués toutes les deux semaines sur 20 vaches et 20 veaux pendant la période d'hivernage des animaux (15/11 au 15/03). Le prélèvement de fèces est réalisé en moins de deux minutes.
Impact sur les animaux
Les prélèvements de fèces seront réalisés par fouille rectale par un animalier expérimenté, formé afin de maîtriser la technique et effectuer le prélèvement avec douceur. Si l’animal défèque spontanément, les fèces émises seront collectées et échantillonnées directement afin d‘éviter la fouille rectale. Le temps nécessaire au prélèvement fécal est estimé à deux minutes maximum. L’utilisation de gel lubrifiant n’est pas possible dans la mesure où celui-ci contaminerait l’échantillon prélevé et rendrait impossible l’exploitation des résultats des analyses. L'évaluation de la gêne ou éventuellement de la douleur générée par la fouille rectale est faite par observation du comportement des animaux : 1) Pendant la fouille : état calme et animal statique ; 2) Après la fouille : reprise d’une posture normale, état calme de l’animal. Les techniciens intervenants sur ce type de prélèvement ayant une expérience significative, nous n’avons jamais observé de complications nécessitants l’usage de médicaments ou l’intervention d’un vétérinaire.
Devenir
Aucune souffrance ni douleur n'est attendue à l'issur des prélèvements de fèces. L'ensemble des animaux reprendra place dans le troupeau.
Remplacement
Ce projet s’intéresse à la dynamique du microbiote fécal et du microbiote du fumier dans le temps dans une ferme. Ce système naturel complexe ne peut actuellement être remplacé par la culture bactérienne ou la modélisation, étant donné qu’il s’agit de le décrire.
Réduction
Pour cette étude, nous devons comparer les variations de la composition du microbiote intestinal et des gènes de résistance aux antibiotiques avec les variations du microbiote du lisier et du fumier. Lisier et le fumier étant collectés à l’échelle du troupeau, nous avons besoin des fecès d'un nombre suffisant d'animaux pour représenter de manière robuste les variations de la composition du microbiote intestinal à l’échelle du troupeau. La variabilité interindividuelle sur la composition du microbiote et la production d’E.coli est le principal facteur à prendre en compte : plus elle est élevée, plus le nombre d’animaux à prélever pour pouvoir représenter le troupeau est important. De plus, dans une exploitation laitière, veau et vaches laitières composent deux groupes distincts : les veaux sont élevés à part et concentrent une grande partie des problèmes d’excrétion d’E.coli et d’antibiorésistance. La gestion sanitaire du troupeau de veaux et de vaches laitières sont généralement distinct et leurs effluents peuvent également être traités différemment. Chez le veau, dont le microbiote intestinal est en cours d’établissement et qui sont souvent soumis à des problèmes de diarrhées, la variabilité interindividuelle dans la composition du microbiote est très forte. Certains veaux peuvent également excréter un taux élevé d'E. coli. En conséquence, la majeure partie du cheptel présent sera collectée afin de pouvoir représenter le troupeau (20 individus). Pour les vaches adultes, la variabilité interindividuelle est plus faible car le microbiote est considéré comme « à l’équilibre ». D'après notre expérience dans l'identification des communautés microbiennes dans les feces, nous estimons qu'un prélèvement d'environ 10% du troupeau de vaches laitières présentes (20 adultes sur 170) est le strict minimum pour estimer de manière robuste les variations de la composition du microbiote intestinal à l’échelle du troupeau, sans remettre en cause la fiabilité statistique des résultats obtenus. Les données seront traitées selon des modèles linéaires mixtes et des modèles non linéaires, avec la variable d'intérêt à expliquer (prévalence d'E. Coli, quantité de gènes de resistance) en fonction de différentes variables explicatives (individu, matrice prélèvement, pH, Température, traitement antibiotique) prises seules ou en association.
Raffinement
Les conditions de logement des animaux en stabulation répondent aux exigences réglementaires et vont même au-delà grâce à des équipements pemettant un confort optimum des vaches (matelas, brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Le recours à des procédures faiblement invasives, mises en oeuvre par du personnel formé et habitué à ces prélèvements, assure que ceux-ci se feront dans les meilleures conditions possibles pour les animaux.
Choix des espèces
L'étude porte sur le suivi microbiologique des effluents d'élevage ruminant. 20 veaux : Chez le veau, dont le microbiote intestinal est en cours d’établissement et qui sont souvent soumis à des problèmes de diarrhées, la variabilité interindividuelle dans la composition du microbiote est très forte. Certains veaux peuvent également excréter un taux élevé d'E. coli. En conséquence, la majeure partie du cheptel présent sera collectée afin de pouvoir représenter le troupeau (20 individus). 20 vaches : Pour les vaches adultes, la variabilité interindividuelle est plus faible car le microbiote est considéré comme « à l’équilibre ». Nous estimons qu'un prélèvement d'environ 10% du troupeau de vaches laitières présentes (20 adultes sur 170) est le strict minimum pour estimer de manière robuste les variations de la composition du microbiote intestinal à l’échelle du troupeau.
Histoire naturelle et études pilote de thérapie génique chez la souris PKP2_Het, modèle animal de la cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène (CVDA)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation reproduisant une cardiomyopathie du ventricule droit, elles subissent une biopsie de la queue, une évaluation cardiaque sous anesthésie avec stress adrénergique, puis pour certaines une injection d'un vecteur de thérapie génique et des prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que les analyses histologiques et moléculaires "ne peuvent se faire du vivant de l'animal", ce qui justifie la mise à mort de toutes les souris. Il présente ce travail comme une étape préalable à l'évaluation de traitements, l'objectif immédiat restant de décrire l'histoire naturelle de la maladie chez ce modèle.
Objectifs
La Plakophiline 2 (PKP2) est une protéine codée par le gène PKP2. On la trouve en abondance dans la peau et le muscle cardiaque, où elle fait le lien entre différentes protéines. Dans le cœur, elle se trouve au niveau des jonctions cellulaires, où elle participe activement à la connexion mécanique intercellulaire et à la propagation du signal necéssaire aux contractions cardiaques. Une mutation du gène PKP2 provoque une cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène (CVDA). Cette maladie est caractérisée par le remplacement progressif du muscle cardiaque dans le ventricule droit par du tissu graisseux et fibreux. Le cœur perd alors sa contractilité et il en résulte à terme une mort subite, pouvant être déclenchée par l'exercice. Il n'existe actuellement pas de traitement. PKP2 est une protéine assez conservée entre les espèces. Par conséquent, l'étude de la déficience en PKP2 dans des modèles animaux est une approche pertinente. La majorité des mutations du gène PKP2 chez l'homme entraînent une haplo-insuffisance, ce qui signifie que la présence d'environ 50 % seulement de la protéine normale dans le cardiomyocyte entraîne la maladie. Si des modèles de souris haplo-insuffisantes pour PKP2 ont été générées par le passé (avec quelques résultats publiés dans la littérature), aucun modèle de souris transgénique de ce type n'est disponible aujourd’hui sur le marché ou via des collaborations. Afin de comprendre le phénotype de la maladie chez la souris et de surtout pouvoir tester des approches thérapeutiques, un nouveau modèle de souris transgénique mutée sur le gène PKP2 murin a été généré. Nous souhaitons aujourd’hui (i) caractériser la pathologie de ce nouveau modèle de souris appelé PKP2_Het, et (ii) en cas de pathologie avérée, évaluer une approche thérapeutique de thérapie génique. C’est l’objet de ce projet, qui est donc divisé en 2 parties.
Bénéfices attendus
La CVDA est une cardiomyopathie héréditaire caractérisée par un remplacement progressif des cardiomyocytes par du tissu graisseux et fibreux. Les syndromes observés sont des troubles du rythme cardiaque, qui causent une mort subite chez les adultes jeunes et les sportifs (l’effort étant un facteur déclenchant de la mort subite). La prévalence de la CVDA est estimée entre 1/2000 et 1/5000. Une mutation du gène PKP2 est impliqué dans 70 à 90% des cas de CVDA. Le traitement actuel repose sur la prise de bêtabloquants parfois en association avec des anti-arythmiques, l’ablation par radiofréquence, l’implantation d’un défibrillateur automatique implantable ("pace-maker"), et plus généralement le traitement de l’insuffisance cardiaque. La pratique sportive est clairement contre-indiquée, même chez les jeunes patients. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l’efficacité des produits thérapeutiques, études de dose…). Le présent projet vise à évaluer la pertinence d’un nouveau modèle murin créé pour mimer cette pathologie, et en cas de pertinence avérée, réaliser une étude pilote pour évaluer l’efficacité d’un traitement de thérapie génique. C’est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints de CVDA.
Procédures
Pour l'étude d'histoire naturelle du modèle de souris étudié, les animaux seront soumis aux interventions suivantes: - Biopsie de queue pour génotypage (1 biopsie / animal): 2 min - Evaluation de la fonction cardiaque sur animaux anesthésiés, avec induction de stress adrénergique (1 test par animal): 20 min, puis sans réveil de l’animal : prélèvement sanguin (2 min), avant mise à mort. Pour l’étude pilote pour l'évaluation de l'efficacité d'une approche thérapeutique de thérapie génique, les animaux seront soumis aux interventions suivantes: - Biopsie de queue pour génotypage (1 biopsie / animal): 2 min - A un âge déterminé lors de l’étude d’histoire naturelle : injection unique d'un vecteur de thérapie génique ou de véhicule, sous anesthésie ou bien sur animal vigile, selon le site d’injection choisi (1 injection / animal):10 min max - Prélèvements sanguins au niveau d’une veine sous-mandibulaire (2 prélèvements / animal, avant injection, puis avant la mise à mort): 5 min - Evaluation de la fonction cardiaque sur animaux anesthésiés, avec induction de stress adrénergique (1 test par animal): 20 min, puis sans réveil de l’animal : prélèvement sanguin: 5 min, avant mise à mort.
Impact sur les animaux
(i) Injection intraveineuse: l'injection intraveineuse réalisée dans la veine caudale se fera sous contention et pourra provoquer un stress léger le temps de l'injection (moins de 10min), et une petite douleur au niveau du site de ponction. L'injection intraveineuse par voie rétro-orbitale se fera sous anesthésie et ne provoquera pas de stress ou de douleur à l'animal. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez la souris est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) ECG et échocardiographie trans-thoracique : geste non invasif, réalisé sur animal anesthésié pour éviter tout stress à l’animal. (iii) Injection intrapéritonéale d’un mélange d’isoprénaline et de phényléphrine : injection réalisée sous anesthésie générale, donc sans douleur pour l’animal. Par contre, le stress adrénergique qui sera alors appliqué pourrait induire, chez les animaux malades, une arythmie accrue et une mort subite. Cela pourrait toucher environ 20% des animaux (données obtenues dans d'autres modèles d'arythmies cardiaques). Sachant que ce stress sera induit juste avant la mise à mort des animaux (sans interruption de l’anesthésie entre l’évaluation de la fonction cardiaque et la mise à mort), cela n’aura pas d’impact négatif sur les animaux. (iv) Prélèvement sanguin terminal chez la souris au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour l’animal, puisque cet examen sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.
Devenir
A l'issue de cette étude, tous les animaux de cette étude seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.
Remplacement
Ce projet de caractérisation de l'histoire naturelle de la souris PKP2_Het (à différents âges et avec des évaluations adaptées) nous permettra à terme de réaliser l'évaluation préclinique de traitements potentiels de la CVDA dans ce modèle animal, s’il se révèle en effet adapté, et donc de raffiner le nombre d'animaux utilisés dans ces futurs projets précliniques. D'autre part, il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d’administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation d’un modèle animal est donc essentiel pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement de la CVDA.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets et des données de la littérature sur les autres modèles de souris hétérozygotes PKP2, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles.
Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (cages équipées de mezzanine et mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement, coupage des incisives si nécessaire) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (cf exemple en annexe 1 de la saisine). 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
PKP2 est une protéine assez conservée entre les espèces. Par conséquent, l'étude de la déficience en PKP2 dans des modèles animaux est une approche pertinente. Le modèle de souris étudié dans ce projet est partiellement déficiente pour PKP2, comme les patients atteints de cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène (CVDA). Dans ce sens, elle se révèle être un modèle animal pertinent pour notre étude. Pour l’étude d’histoire naturelle, la caractérisation sera réalisée à différents âges, afin d’évaluer le processus évolutif de la maladie, et définir à quel âge il serait pertinent de traiter les animaux lors des études thérapeutiques. Chez l’homme, la pathologie se met en place progressivement et les 1ers symptômes de la CVDA débutent le plus souvent entre 20 et 40 ans (soit au stade adulte). Nous avons donc choisi d’analyser les animaux à l'âge de 3, 6, 9 et 12 mois (également au stade adulte donc). Pour l’étude pilote d’évaluation de l’efficacité d’une approche thérapeutique de thérapie génique, l’âge d’injection sera défini selon les résultats obtenus dans l’étude d’histoire naturelle, cet âge étant choisi pour être un âge où des 1ers symptômes de CVDA peuvent être observés chez les souris après application d'un stress adrénergique.
Maintien des lignées de souris Delta F508 et CFTR à phénotype dommageable.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour maintenir et produire deux lignées reproduisant la mucoviscidose. Ces souris présentent un phénotype dommageable, amaigrissement, difficultés respiratoires et constipation, atténué par un laxatif administré en continu dans l'eau de boisson. Les descendants homozygotes et sauvages sont expédiés à des équipes collaboratrices, les hétérozygotes réutilisés pour la reproduction ou mis à mort. Le porteur affirme que l'étude de cette maladie génétique ne peut se faire que sur un "organisme vivant entier", au motif des interactions entre organes et microbiote.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de maintenir et produire des lots expérimentaux de deux lignées à phénotype dommageable : souris Delta F508 et CFTR. Ces 2 lignées touchent le gène CFTR mais les 2 modifications génétiques sont différentes. Pour la lignée CFTRUNC, le gène CFTR a été modifié afin que celui-ci ne soit plus actif. Cette lignée créée par une équipe américaine a été envoyé en France en 1993 à la demande de l’association Vaincre la Mucoviscidose (anciennement AFLM). Pour la lignée CFTR deltaF508, la mutation est créée dans le gène CFTR en 1995 par une équipe Néerlandaise , celle-ci est identique à celle observée chez certains patients atteints de mucoviscidose. L’association Vaincre La Mucoviscidose est propriétaire des élevages de ces deux lignées dans notre établissement. Elle lance annuellement des appels à projets de recherche sur la mucoviscidose, valide scientifiquement ceux qui seront autorisés à recevoir des lots d’animaux. Notre établissement reçoit la liste des lauréats retenus par l’association et organise les élevages pour être en mesure de distribuer les lots aux chercheurs selon les consignes données. Les souris Delta F508 et CFTR présentent des symptômes proches de ceux des patients atteints de la mucoviscidose : amaigrissement, difficultés respiratoires ou constipation. Ces souris fragiles doivent donc être hébergées dans un environnement propre et à faible empoussièrement (isolateur ou portoir ventilé). Afin de limiter les symptômes, un laxatif doux est administré en continu dans l’eau de boisson et une nourriture riche en protéines/lipides et vitamines doit leur être apportée. Le laxatif doux est un médicament de santé humaine mais il n’existe pas d’équivalence en spécialité vétérinaire aussi efficace et bien toléré par nos souris. Le phénotype dommageable de ces lignées est présent seulement à l’état homozygote. Cependant, le laxatif ainsi que l’alimentation plus riche seront donnés à tous les individus. L’apparition des symptômes est plus précoce et plus marqué chez la lignée CFTR que la lignée Delta F508. Nous pouvons observer les premiers signes dès l’âge de 10 jours. Les expéditions de ces animaux ont lieu vers l'âge de 8- 10 semaines. Seuls les animaux qui présentent un score de 0 seront expédiés aux chercheurs. Une grille de scoring et des points limites seront mis en place.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de fournir des animaux aux porteurs de projet de l’association Vaincre La Mucoviscidose. Les souris Delta et CFTR sont à ce jour les modèles murins les plus utilisés dans la recherche fondamentale sur la mucoviscidose. Notre établissement possède une expertise reconnue dans le maintien des lignées fragiles, nous sommes en capacité de maintenir ces lignées dans les meilleures conditions pour limiter au maximum la souffrance chez ces animaux.
Procédures
Afin de limiter les symptômes, un laxatif doux est administré en continu dans l’eau de boisson.
Impact sur les animaux
Les souris Delta F508 et CFTR présentent des symptômes proches de ceux des patients atteints de la mucoviscidose : amaigrissement, difficultés respiratoires ou constipation. Le laxatif permet d'éviter en très grande partie les symptômes de constipation et donc d'amaigrissement observés chez les individus homozygotes.
Devenir
Les descendants seront sélectionnés selon leur génotype : Les animaux homozygotes et sauvages seront expédiés aux collaborateurs. Les animaux hétérozygotes seront mis en accouplements pour renouvellement des duo/ trio ou mis à mort.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de cette maladie génétique qu'est la mucoviscidose ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, ainsi qu’avec le microbiote intestinal, aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou in silico.
Réduction
Afin de répondre aux besoins annuels d’animaux pour les porteurs de projet, nous mettons en place le nombre minimal d’accouplements nécessaires. Le but étant de limiter au maximum le nombre d’animaux à phénotype dommageable
Raffinement
Ces souris fragiles doivent être hébergées dans un environnement propre et à faible empoussièrement (isolateur ou portoir ventilé). Afin de limiter les symptômes, un laxatif doux est administré en continu dans l’eau de boisson et une nourriture riche en protéines/lipides et vitamines doit leur être apportée. Le phénotype dommageable de ces lignées est présent seulement à l’état homozygote, cependant, le laxatif ainsi que l’alimentation plus riche seront donnés à tous les individus. Le laxatif permet d'éviter en très grande partie les symptômes de constipation observés chez les individus homozygotes. Ce laxatif est un médicament de sante humaine mais il n’existe pas d’équivalence en spécialité vétérinaire aussi efficace et bien toléré. L’aliment enrichi est de type Harlan teklad Global 2018.L’apparition des symptômes est plus précoce et plus marqué chez la lignée CFTR que la lignée Delta F508. Nous pouvons observer les premiers signes dès l’âge de 10 jours. Les expéditions de ces animaux ont lieu vers l’âge de 8- 10 semaines. Seuls les animaux qui présentent un score de 0 seront expédiés aux chercheurs. Une grille de scoring et des points limites seront mis en place. Au sevrage, les souris seront baguées à l’oreille et un prélèvement d’échantillon caudale sera effectué afin de réaliser le génotypage. La taille de l’échantillon prélevé devra être la plus petite possible.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de la mucoviscidose. Dès 1992, trois ans à peine après la découverte du gène Cftr, le premier modèle de souris transgénique est créé, des souris « knock-out » pour CFTR . Elles présentent à l'état homozygote des symptômes communs avec les patients humains : une stérilité, des altérations des glandes muqueuses et séreuses, et des obstructions des structures glandulaires. Sans traitement laxatif, les souris KO-CFTR décèdent au bout de 3-4 semaines en raison d’une sévère obstruction intestinale. Ces souris n’ont pas d’inflammation chronique, ni d’infection pulmonaire. La lignée Delta F508 a été générée par une équipe néerlandaise en 1995. Ces souris montrent un phénotype : un poids diminué, une maladie intestinale aboutissant à une obstruction intestinale non létale. Par contre, aucune accumulation de mucus dans les poumons, le pancréas, les canaux biliaires n’a été observée. L’élevage des lignées Delta F508 et CFTR sera réalisé avec des souris adultes âgées d’environ 2 mois. Les animaux sont envoyés aux collaborateurs vers l’âge de 8 à 10 semaines, afin qu’ils soient assez robustes pour le transport. Les animaux seront observés avant le départ afin de s’assurer qu’ils sont aptes au transport, une pâté aliment enrichi + laxatif est mise dans la boite de transport. Seuls les animaux qui présentent un score de 0 seront expédiés aux chercheurs. Les animaux qui ne présentent pas un score de 0 avant le transport, seront maintenus en hébergement, en attente qu'ils soient aptes au transport (score de 0) Le protocole de traitement du laxatif sera fourni au destinataire en amont de l'expédition.
Analyse de pathologies du développement sexuel
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Cinq cents femelles sont superovulées par injections d'hormones pour produire un maximum d'ovocytes, puis tuées pour les prélever, et cent autres subissent une laparotomie de réimplantation d'embryons. Le porteur indique que les receveuses ne sont pas réutilisées car une seconde laparotomie serait plus douloureuse que la première. Il affirme que le recours à la souris est "essentiel" pour la biologie du développement, les cultures cellulaires ne reproduisant pas la vascularisation et le contexte tridimensionnel des organes.
Objectifs
A l ‘heure ou on constate que l’incidence de la plupart des maladies dépend du sexe, il est paradoxal que certains gènes importants pour la détermination du sexe restent à identifier. Chez l’homme (et la souris), les mutations de certains gènes sont responsables d’anomalies du développement du système urogénital (rein et appareil génital). L’appareil génital comprend différents organes dont les gonades qui sont présentes chez l’embryon. Selon le sexe de l’embryon, différents gènes sont activés et vont permettre aux gonades de se développer en testicules chez le futur petit garçon ou en ovaires chez la petite fille, ce qui va initier tout le développement sexuel de l’individu. Les patients affectés ont des symptômes allant de l’absence de gonades à une inversion de sexe c’est-à-dire que l’appareil génital présente toutes les caractéristiques de l’appareil génital de garçon ou de fille quel que soit le sexe génétique de l’enfant. Pour comprendre le rôle des facteurs responsables du développement normal de la gonade (testicule chez le mâle et ovaire chez la femelle), nous devons reproduire les mutations de ces gènes chez la souris, ce qui nous permet d’étudier finement les conséquences pathologiques à différents stades. Ainsi notre projet permettra d’identifier les facteurs clés des premières étapes du développement de la gonade avec un intérêt particulier sur l’ovaire. Cela nous donnera un point d’entrée pour étudier les pathologies telles que l’insuffisance ovarienne précoce dont les symptômes sont le dérèglement ou l’absence de puberté, les problèmes de fertilité, les dérèglements hormonaux et les cancers de l’ovaire.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, on constate que la plupart des maladies a une incidence et une sévérité qui dépend du sexe de l’individu. Le gène qui est responsable du développement masculin a été découvert il y a plus de 30 ans (gène Sry) mais on ne connait toujours pas à l’heure actuelle, les premières étapes du développement ovarien. Étant donné notre ignorance de ces mécanismes, les cliniciens ont des difficultés à aider les familles dans leur choix pour ou contre une gonadectomie de leur enfant atteint d’anomalies du développement sexuel. Comprendre les mécanismes de différenciation sexuelle et les pathologies associées représentera une aide inestimable pour soutenir les familles dans leur décision.
Procédures
500 femelles donneuses d’ovocytes achetées chez un fournisseur agréé seront superovulées par injection intrapéritonéale afin d’obtenir un nombre maximum d’ovocytes par femelle. Les ovocytes seront microinjectés. La réimplantation des embryons sera réalisée par intervention chirurgicale non dommageable. Cela concerne 100 femelles.
Impact sur les animaux
Pour la procédure 1 de superovulation, les nuisances en lien avec la superovulation est une douleur légère et brève liées aux injections intrapéritonéales d’hormones, les hormones n’induisent pas de douleur chez les femelles. Pour la procédure 2 de réimplantation d’embryons, les nuisances sont principalement la douleur liée à la laparotomie et à sa cicatrisation. Des effets dommageables à court terme et/ou accidentels peuvent résulter de l’intervention. Brièvement, des difficultés opératoires telles qu’une hémorragie supérieure à 0,5 ml, un temps d’intervention de plus de 30 mn ou post opératoire majeures (réveil retardé de plus de 15 mn, saignements, suintements ou ouverture de la plaie, altérations de l’état général : posture de l’animal, mobilité spontanée, entretien du pelage) peuvent subvenir en de rares occasions.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les femelles donneuses seront euthanasiées afin de collecter leurs ovocytes. A l’issue de la procédure 2, les femelles receveuses ne seront pas réutilisées et euthanasiées car une deuxième laparotomie serait bien plus douloureuse que la première.
Remplacement
Ce projet a été élaboré et sera réalisé dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est essentiel pour la biologie du développement et l'étude des causes des maladies de la différenciation sexuelle: en effet, les techniques de culture cellulaire ne permettent pas d'appréhender le développement de certains organes qui nécessite vascularisation et contexte tridimensionnel et ont montré leurs limites en aboutissant à des résultats erronés. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont élaborées, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé pour l’utilisation d’un nombre minimal de souris. Nous avons besoin de femelles donneuses et receveuses et pour ne pas générer des males surnuméraires, nous commandons les femelles chez un fournisseur agréé ce qui permet d’obtenir que le sexe d ‘intérêt et de réduire le nombre de souris. Nous utilisons la super-ovulation des femelles donneuses qui permet de produire de 2 à 3 fois plus d’ovocytes par femelle, ce qui permet de réduire le nombre de femelles donneuses. Les femelles receveuses sont mises en accouplement avec des males stériles. Ainsi si la réimplantation des ovocytes n’a pas pu avoir lieu, ces femelles ne donnent pas de portées surnuméraires et peuvent être remises en croisement rapidement. Cela contribue à réduire le nombre d’animaux nouveau-nés. Les protocoles sont standardisés et nous avons déjà réalisés cette chirurgie permettant la réimplantation d’ovocytes. Ainsi notre rapidité d’exécution nous permet de réimplanter des embryons dans les deux cornes utérines de la souris et ainsi de réduire le nombre de souris receveuse par deux. Nous pouvons anticiper la fréquence d’obtention de certains paramètres tels que le sexe de la souris (nous étudions les femelles soit un animal sur 2) mais nous ne pouvons pas évaluer l’activité du transgène car elle dépend du site d’insertion dans le génome (qui est imprévisible) pour déterminer le nombre de souris à générer (ainsi nous anticipons de 3 à 8 réplicas pour un sexe donné). Cependant les micro-injections d’un transgène donné seront réalisées sur plusieurs jours avec un ou deux jours par semaine, ce qui nous permet d’analyser les résultats de façon échelonnée. Dès que le résultat est reproductible au moins 2 fois, nous arrêterons ces travaux ce qui réduira le nombre d’animaux.
Raffinement
Pour la procédure 1 de superovulation, aucune aggravation résultant directement du traitement n’est attendue. Les animaux sont néanmoins surveillés afin de déceler tout signe de souffrance ou de blessure à l’issue d’accident ou bagarre afin de mettre un terme aux souffrances des animaux le cas échéant. Pour la procédure 2 de réimplantation d’embryons, pendant et après la chirurgie, l’anesthésie au gaz isoflurane et l’administration d’antalgiques permet de limiter au maximum les douleurs engendrées. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences. Ce protocole inclue la mise en œuvre de points limites précoces et adaptés permettant de mettre un terme aux souffrances des animaux le cas échéant. De plus, les souris seront hébergées par deux ou par trois dans des cages comportant des objets à ronger et des igloos pour se faire un nid de façon à garantir leur bien-être et leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier chez la souris, l’impact de copies de gènes contenant les mutations responsables de maladies. Nous utiliserons des femelles adultes âgées de 3 à 4 semaines pour les superovulations ou âgées de plus de 6 semaines car c’est l’âge optimum pour la superovulation (avant la mise en place des cycles ovariens ou après leur stabilisation) et 6 à 20 semaines pour les pseudo-gestantes.
Etude de la résistance du parvovirus de la souris à différents modes de stérilisation (irradiation, autoclavage)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une inoculation du parvovirus par gavage, puis des prélèvements sanguins et de fèces toutes les deux semaines pendant douze semaines. L'objectif déclaré est de mesurer la résistance du virus aux modes de stérilisation, le porteur affirmant que son infectiosité ne peut être validée que par l'inoculation à un "organisme vivant". Toutes les souris sont mises à mort à la fin, en raison de la présence possible de l'agent infectieux dans leur organisme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la résistance du parvovirus de la souris (ou MPV) à différents modes de stérilisation comme l’irradiation et l’autoclavage. Le MPV est un des virus de la souris le plus fréquemment rencontré dans les laboratoires de recherche. Il ne génère pas de signe clinique chez les animaux mais perturbe le système immunitaire de la souris et les résultats de la recherche. Sa présence entraîne donc l’arrêt immédiat des procédures avec un impact éthique non négligeable. Comprendre sa résistance aux modes de stérilisation existants permet d’améliorer la prévention de la présence de cet agent dans les laboratoires.
Bénéfices attendus
Le parvovirus de la souris (MPV) est un virus à ADN non enveloppé qui peut être persistant dans l'environnement et chez les animaux infectés pendant une longue période. Après infection, il n'y a pas de signe clinique détectable chez les animaux, même gravement immunodéficients. Cependant, le MPV provoque de fortes interférences avec la recherche et les résultats obtenus en modulant notamment la réponse immunitaire des souris infectées. Sa présence dans un laboratoire entraîne l’arrêt immédiat des procédures en cours et invalide les résultats préalablement obtenus. La prévention de sa contamination permet donc de garantir un état de santé des animaux n’interférant pas avec les recherches et donc une application des 3Rs (réduction du nombre d’animaux utilisés pour obtenir des résultats exploitables). De nombreuses recherches sur le MPV afin de comprendre sa physiopathologie ont été effectuées. Cependant, aucune donnée quant à sa résistance à différents modes de stérilisation n’existe. Comprendre sa résistance aux modes de stérilisation existants permettrait d’améliorer nos connaissances sur cet agent et la prévention de sa présence dans un laboratoire.
Procédures
Inoculation unique par gavage d’une durée de maximum une minute sur tous les animaux. Prélèvement sanguin d’une durée de maximum une minute toutes les deux semaines sur une durée maximale de 12 semaines pour tous les animaux. Contention d’une durée de maximum une minute pour prélèvement de fèces toutes les deux semaines sur une durée maximale de 12 semaines pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
Stress provoqué par les contentions, l’acte de prélèvement sanguin toutes les 2 semaines sur 12 semaines et l’inoculation par gavage lors du premier jour de la procédure.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux due à la possible présence dans leur organisme d’un agent infectieux interférent.
Remplacement
Les méthodes in vitro actuellement disponibles permettent de tester la présence du MPV dans différents substrats en contact avec l’animal (air, aliment, litière) mais pas son potentiel infectieux dans sa globalité. L’étude finale de son infectiosité ne peut être validée que par l’inoculation de l’agent à un organisme vivant. L’inoculation d’un agent potentiellement infectieux et la compréhension des mécanismes associés à son infection dans un organisme vivant est un phénomène complexe, mettant en jeu divers processus biologiques et systèmes physiologiques, ne permetttant pas de réaliser de nos jours un tel protocole sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été fixé afin d’obtenir des résultats expérimentaux exploitables tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Sur la base de la littérature scientifique existante et de recherches similaires préalables (Henderson et al, 2015), des groupes de 4 animaux maximum sont prévus.
Raffinement
Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentés ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le MPV est un agent infectieux de la souris. L’étude de la possibilité de le détecter après stérilisation par différents procédés (irradiation ou stérilisation à la vapeur) et sa capacité ultérieure à infecter des animaux naïfs ne peut se faire que chez son hôte primaire, la souris. Des animaux de 4 semaines seront utilisés, sur la base de leur sensibilité à une infection au MPV et de la littérature scientifique.
A_OI_17032 Réalisation de tests de contrôle qualité des vaccins équins
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
35 chevaux vont être utilisés, réutilisés ou proposés à l'adoption à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Deux chevaux par lot de vaccin reçoivent des injections intramusculaires puis sont observés durant deux à trois semaines, pour vérifier l'innocuité de vaccins équins avant leur commercialisation. Le porteur indique que la pharmacopée européenne n'exige plus ce test depuis 2013, mais que des pays hors Union européenne le réclament encore pour libérer les lots. Il affirme qu'on "ne sait pas remplacer" les animaux pour ce contrôle sur l'espèce cible.
Objectifs
Le contrôle des vaccins équins répond à la pharmacopée en vigueur dans les pays où ils sont commercialisés. L’objectif est de vérifier l’innocuité des vaccins équins sur l’espèce cible permettant la libération des lots dans les différents pays où ces produits sont distribués.
Bénéfices attendus
Le bénéfice escompté est de s’assurer de l’innocuité des lots de vaccins mis sur le marché.
Procédures
Pour chaque lot de vaccin à tester, 2 chevaux sont recrutés. Pour les vaccins à vecteur Canarypox : A jour 0, les chevaux reçoivent une double dose de vaccin du côté gauche de l’encolure et une simple dose du côté droit, par voie intramusculaire. Ils sont alors observés quotidiennement (température, état général, réactions locales) durant 14 jours. Pour les vaccins dits « inactivés » : A jour 0, les chevaux reçoivent une simple dose de vaccin du côté gauche de l’encolure et une simple dose du côté droit, par voie intramusculaire. Ils sont alors observés quotidiennement (état général, réactions locales) durant 14 jours. A J14 les chevaux reçoivent une simple dose de vaccin du côté gauche de l’encolure par voie intramusculaire. Ils sont alors observés quotidiennement (état général, réactions locales) jusqu’au jour 24. Les injectons de vaccins ne durent que quelques secondes et la durée des examens cliniques est d'environ 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Outre les injections de vaccins, pas ou peu d’effets indésirables sont attendus. Une légère augmentation de la température rectale (moins de 1,5°C) peut être observée, ainsi que l’apparition temporaire d’une grosseur au point d’injection. Toute manifestation post traitement (signe clinique, comportement…) est soigneusement enregistrée.
Devenir
A l’issu d’un test, les animaux seront soit réutilisés pour le même projet ou un projet différent après une période de repos, soit proposés à l’adoption généralement au bout de 4 à 5 tests. Une évaluation vétérinaire est toujours associée à cette décision.
Remplacement
Les tests d’innocuité sont réalisés sur l’espèce cible. On ne sait pas remplacer les animaux pour obtenir de telles données. Néanmoins la pharmacopée européenne n’exige plus ce test depuis le 01/04/2013. Il a été demandé aux producteurs de vaccins de fournir l’argumentaire que le retrait de ce test n’affectait pas la maitrise de la qualité des lots : le retrait des tests a été effectué pour ces pays européens. Cependant, de nombreux pays exigent encore de réaliser des tests d’innocuité sur espèce cible : la démarche de suppression est en cours mais, à ce jour, le test est encore exigé pour certains pays hors Union Européenne.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à un minimum, seuls 2 chevaux sont nécessaires à chaque test.
Raffinement
Les protocoles sont classés en léger. Le stress durant l’hébergement est limité par l’hébergement en groupe des animaux et l’enrichissement de leur environnement. Les animaux sont systématiquement observés et immunisés dans des installations séparées des zones d’hébergement. Ils sont toutefois toujours 2 à être conduits dans la zone séparée. Une récompense alimentaire est systématiquement proposée aux animaux lors de leur manipulation.
Choix des espèces
Les études d’innocuité nécessitent l’injection des vaccins sur l’espèce cible (les chevaux). Ceci est décrit dans les pharmacopées des pays tiers qui requièrent ces tests pour la libération des lots avant commercialisation. Les animaux sont âgés d’au moins 12 mois et au plus de 121 mois. Il n’y a pas de recommandation de la pharmacopée concernant l’âge.