Procédures légères

9 144 souris de huit lignées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection d'un virus AAV sous la rétine sous anesthésie, des anesthésies répétées pour des examens de la vision (électrorétinogramme, tomographie optique) et des tests comportementaux nommés, optocinétique et exploration d'une boîte claire ou obscure, pour valider une thérapie génique de surexpression du gène CRX. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal ne reproduit la rétine, tissu complexe, et conclut à la "nécessité" de recourir à la souris. Les retombées annoncées pour les patients atteints de rétinopathies restent renvoyées à un stade ultérieur, l'objectif immédiat étant de tester l'efficacité et la sécurité du traitement chez la souris.

Objectifs

La perte progressive des photorécepteurs (PR), les cellules sensibles à la lumière de notre œil, sont des causes fréquentes de déficience visuelle avec une prévalence de 1/4 000. Certaines de ces pathologies sont liées à des facteurs de transcription spécifiques aux photorécepteurs, comme le cone-rod homeobox (CRX). Les facteurs de transcriptions sont primordiaux pour le développement des photorécepteurs, leur différentiation en cônes ou en bâtonnets, leur maintien et leur fonctionnement. Ils permettent l’expression d’autres gènes, et sont donc en amont de nombreuses voies. Une mutation, un défaut, dans ce genre de gène induit donc de nombreux changements qui peuvent conduire notamment à la mort des photorécepteurs. Par ce projet, nous souhaitons valider notre traitement thérapeutique pour soigner les patients atteints de ces mutations sur Crx, mais aussi sur d’autres gènes important pour la rétine. Les modèles de souris mimant ces pathologies, et présentant différentes mutations dans Crx ont déjà permis de comprendre le fonctionnement de ce gène et d’approfondir nos connaissances sur les rôles tenus par ce facteur de transcription. Il nous est désormais possible d’exploiter nos nouvelles connaissances pour proposer des solutions thérapeutiques aux pathologies liées à Crx. Nous proposons de surexprimer Crx au moyen d’un Adeno-Associated Virus (AAV). L'efficacité et la sécurité des thérapies géniques, au moyen d'injections d’AAV, ont été prouvées avec des succès précliniques démontrant leur efficacité clinique. Chez un de nos modèles de souris Crx aveugle, nous avons précédemment montré que notre traitement permettait de restaurer partiellement les photorécepteurs et ainsi d’établir une basse vision. Nous devons maintenant tester cette thérapie sur d’autres modèles présentant d’autres mutations dans Crx pour valider notre thérapie sur plusieurs pathologies. Nous souhaitons améliorer l’efficacité de notre AAV, pour répondre plus efficacement à ces différentes pathologies. Nous souhaitons également pouvoir proposer notre traitement à d’autres patients, atteints de dégénérescence rétinienne non liée à Crx. Pour cela, nous utiliserons encore une fois des souris qui mimeront des pathologies telle que la rétinite pigmentaire (RP), et qui nous permettront de valider l’effet protecteur de Crx pour d’autres pathologies.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, peu de thérapies sont proposées aux patients atteints de rétinopathies, ou dégénérescence visuelle. La plupart permettent uniquement de ralentir les symptômes, mais ne ralentissent pas la mort des cellules et encore moins des photorécepteurs, nos cellules sensibles à la lumière. Ils doivent donc vivre avec leur perte de vision sans solutions efficace. Il existe actuellement quelques traitements de thérapie génique, qui sont eux plus efficaces, mais ils ne sont proposés qu’en fonction de la mutation génétique du patient induisant la maladie. Hors il existe des dizaines de gènes, ayant eux-mêmes des dizaines de mutations possibles, qui peuvent entrainer une même maladie. Ces traitements sont donc à usage très limités. Nous réalisons ce projet afin de développer une thérapie génique efficace aussi bien pour des rétinopathies liées à un facteur de transcription spécifique, CRX, que ce soit une mutation dominante ou non, qui n’ont pour l’instant pas de traitement disponible, que pour des rétinopathies liées à d’autres gènes, et entrainant la perte des photorécepteurs. Ce serait donc un traitement plus général, applicable au plus grand nombre. Nous espérons par ce projet démontrer l’efficacité de notre traitement sur plusieurs modèles de souris. Ces différents modèles présentent soit une mutation dans le gène Crx, soit une mutation sur d’autres gènes connus. Dans tous les cas, ces souris miment les pertes de visions humaines. Si notre produit s’avère efficace sur ces animaux, nous auront alors la preuve de notre concept. Nous pourrons donc produire notre traitement à plus grande échelle, afin de le proposer en essai clinique pour les patients. Nous espérons ainsi pouvoir proposer un réel traitement thérapeutique qui permettra aux patients de voir aussi longtemps que possible.

Procédures

Nous utiliserons 8 lignées de souris ayant des pathologies différentes, qui permettront de mesurer l’impact que pourrait avoir notre traitement thérapeutique et le nombre de patient que cela pourrait aider par la suite. Toutes les souris recevront une injection sous rétinienne d’AAV sous anesthésie générale (1 à 2 min par œil). La bonne réalisation de l’injection sera validée par observation sous macroscope. Certaines souris seront euthanasiées à différents temps après les injections, pour collecter les rétines, sans suivre d’autres expérimentations. Une partie des animaux seront de nouveau anesthésiés à 35, 60, 90, 155, 270 et/ou 360 jours, pour réaliser un ERG (mesure non invasive de la réponse électrique de la rétine à un stimulus lumineux) et un OCT (visualisation non invasive de la rétine en coupe chez la souris) sur les deux yeux (environ 20/30 minutes pour les deux tests). Ces examens sont non invasifs et nous permettent de mesurer la fonction visuelle de la souris. Une autre partie des souris passeront un test d’optocinétique à 65, 95, 155, 275 et/ou 365 jours (3 x 20minutes espacés d’1 heure minimum). Ce test permet de quantifier les reflexes oculaires de la souris et se fait donc sur animal vigil. Elles pourront également réaliser un test comportemental appelé clair/obscur (5 minutes), ou la souris est filmée en train d’explorer une boite soit noire soit éclairée, afin de visualiser son comportement face à la lumière, les souris étant des animaux nocturnes. Ces tests nous permettent de mesurer la vision réelle de la souris. A chaque temps, à la fin de ces tests, des souris seront euthanasiées pour analyser les rétines en coupe histologiques, ou quantifier la production d’ARN ou de protéines.

Impact sur les animaux

Plusieurs modèles de souris seront utilisés dans cette étude. Les techniques qui seront effectuées pour évaluer l’efficacité de notre thérapie génique sont peu invasives et couramment utilisées en recherche ophtalmologique (électrorétinogramme, tomographie par cohérence optique, tests d’optocinétique). Les phénotypes des animaux utilisés sont restreints à la rétine. La vision est un des sens les moins utilisé par la souris, qui est plutôt un animal nocturne. Le caractère non dommageable des lignées murines utilisées pour ce projet a d’ailleurs été établi précédemment par la Structure chargée du Bien-Être Animal (SBEA). Les souris élevée dans le noir jusqu’à leur 28 ème jour (chez les rd10, afin de préserver la rétine du stress dû à la lumière, qui induit la dégénérescence rétinienne dans ce modèle) ne développent pas de stress particulier. Les anesthésies répétées peuvent être dommageables pour les souris, mais elles sont espacées de 14 jours minimum, et les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et quotidiennement. Une grille d’évaluation nous permet d’ailleurs de suivre le bien-être de l’animal tout au long de sa vie, par différentes observations. Si un animal présente des signes de douleurs, il sera pris en charge. L’injection sous rétinienne se réalise également chez l’homme, et n’engendre pas de douleurs. Le décollement rétinien dû à la procédure se résorbe en 48h. Par précaution, nous prévoyons d’utiliser un analgésique local et un anti-inflammatoire. Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Si une cataracte apparait néanmoins, elle se résorbe normalement d’elle-même rapidement. Si les animaux présentent des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection ou avant leur réveil, ils seront euthanasiés. A la fin des procédures, les animaux sont euthanasiés, ce qui permet d’étudier la rétine à un niveau cellulaire et moléculaire, pour valider l’efficacité de notre traitement.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, afin de récupérer les rétines et réaliser des marquages immunologiques sur les coupes histologiques, ou analyser les effets de notre traitement au niveau transcriptomique et protéique.

Remplacement

Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Notre étude se déroule sur 5 ans, et comprend l’analyse de plusieurs lignées. Ces différentes lignées sont importantes pour vérifier que notre stratégie thérapeutique va cibler le plus grand nombre de patients ainsi que pour comprendre le mécanisme d’action. Nous indiquons ici un nombre d’animaux surestimé pour réaliser toutes les expérimentations que nous pensons nécessaire, mais cela sera ajustable. Le nombre de modèles à étudier pourra être revu à la baisse en fonction des résultats obtenus sur les autres modèles. Finalement, si nous nous apercevons que le traitement n’est plus efficace à partir d’un certain temps, les temps restant supérieurs ne seront pas réalisés. Notre étude commencera toujours par établir la dose d’AAV à injecter à chaque modèle sur les temps courts. Nous comparerons ensuite l’efficacité de nos deux AAV, pour ne réaliser les procédures chez ce modèle qu’avec l’AAV à la dose efficace. Si les anesthésies répétées s’avèrent trop néfastes pour les animaux (difficultés au réveil, difficultés de récupérations…) nous réduirons le nombre de tests nécessitant une anesthésie. Les animaux étudiés aux temps les plus lointains pourront donc être moins suivis que prévu. Si un nombre d’individus correctement injecté pour obtenir les résultats statistiques souhaités est atteint avant d’avoir utilisé tous les animaux prévus, nous pourrons utiliser les animaux pour les autres expériences ou stopper la reproduction. Le but est d’obtenir 12-18 yeux, en fonction des expérimentations, pour chaque vecteur, à la fin de la procédure. Le taux de réussite d’injections pouvant varier entre 50% et 75%, nous prévoyons donc plus d’animaux que nécessaire. Nous ne garderons que les animaux correctement injectés dans au moins un œil, ceux-ci pouvant être analysés séparément dans la plupart des expériences. Les autres seront sacrifiés à la fin de l’injection, encore sous anesthésie.

Raffinement

Durant l’injection sous-rétinienne, une anesthésie locale sera effectuée en plus de l’anesthésie générale. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur, les animaux recevront un anti-inflammatoire suite à l’opération. Ils seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire. Une grille d’évaluation de la douleur est utilisée pour apprécier l’état des animaux. Si des signes de douleur ou de gêne se manifestent, ou en cas de perte d'appétit ou de prostration, les animaux seront soignés autant que possible, mais pourront être euthanasiés si leur état se dégrade trop. Les animaux qui entreront dans notre protocole seront suivis à divers temps de manière non invasive et indolore, grâce à nos équipements. Dans le but de réduire le plus possible la douleur, souffrance ou angoisse, nous imposons : - des conditions d’élevage conformes à la directive 2010/63/UE et à la STE123 (animaux en groupe autant que possible, nidification et abris, croquettes et eau à volonté, change hebdomadaire). - des méthodes d’anesthésie adaptées à l’âge de l’animal. - des méthodes d’évaluation de la douleur par une observation et un suivi quotidiens.

Choix des espèces

La thérapie génique que nous souhaitons développer nécessite d’être validée in vivo avant d’être testée chez l’homme. Afin d’être le plus proche des pathologies humaines que nous souhaitons traiter, et ainsi évaluer les bénéfices/risques de notre approche thérapeutique, nous prévoyons d’utiliser des souris comme modèle d’étude. L’existence de lignées de souris atteintes naturellement ou non de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. Nos modèles sont bien établis en recherche ophtalmologique. Chaque modèle est différent, et les temps choisis pour les injections correspondent aux contraintes imposées par la dégénérescence rétinienne. Nous observerons ensuite les effets de notre traitement entre 3 semaines et 1 an après injection.

3 204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souris receveuses sont irradiées pour détruire leur moelle osseuse, greffées avec des cellules mutées, puis suivies jusqu'à deux ans par prises de sang répétées, avec des injections induisant une inflammation chronique. Le porteur indique que l'irradiation peut entraîner infections opportunistes, anémie, apathie et perte de poids dans les deux semaines suivant la greffe. Il conclut qu'il est "indispensable" de développer un modèle murin, la leucémie ne pouvant selon lui être étudiée in vitro.

Objectifs

Les leucémies sont des cancers du sang c’est-à-dire qui affectent la production normale des cellules sanguines. Les cellules du sang sont renouvelées quotidiennement à partir de cellules souches qui se trouvent dans la meolle osseuse : les cellules souches hématopoïétiques. Ces cellules sont douées d’auto-renouvèlement et sont donc responsables de la production des toutes les cellules du sang (les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes) tout au long de la vie. Il est donc tout à fait crucial de préserver leurs fonctions. Quand ces fonctions sont altérées, par exemple par exemple par des stress environnementaux (radiations) induisant des changements dans l’expression de certains gènes, cela conduit au développement de leucémies. La leucémie myélomonocytaire chronique est une leucémie caractérisée par l’accumulation de monocytes, un type des globules blancs circulants dans le sang. Cette maladie touche le sujet âgé. Elle est peu fréquente mais grave, avec une survie inférieure à 3 ans. L’âge avancé des patients ne permet pas d’utiliser la greffe de moelle osseuse et il n’existe actuellement aucun traitement curateur. De nouvelles approches thérapeutiques sont donc nécessaires. Il n'est pas possible de modéliser les fonctions des cellules souches hématopoïétiques, base du cancer, in vitro. De même, le processus de développement d’une leucémie requiert l’environnement de la moelle osseuse impossible à reproduire dans une boite de pétri. Il est donc indispensable de développer des modèles murins mimant le plus fidèlement possible le développement de la maladie pour tester des molécules d’intérêt thérapeutique et en découvrir de nouvelles. Notre projet a pour but de : 1/ Développer des modèles de leucémie myélomonocytaire chronique chez la souris ressemblant au plus près à la maladie humaine et qui s’adapteraient à une étude clinique. Comprendre les mécanismes d’aggravation de la maladie. (2) Etudier le rôle d’une inflammation chronique sur le développement de la leucémie. Au cours de la vie nous subissons de nombreuses infections bactériennes ou virales qui mettent en jeu le système immunitaire et la production de monocytes dans le sang et créent une inflammation chronique. (3) Etudier les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie et analyser les mécanismes de la naissance du cancer pour découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. (4) Tester un composant chimique sur le développement et la guérison de la maladie.

Bénéfices attendus

Il n'existe pas de traitement curatif spécifique de cette leucémie qui reste donc une maladie très sévère, induisant la mort des patients dans les 30 mois après le diagnostic. Il n’existe pas non plus de bons modèles de souris mimant cette pathologie humaine. En développant de tels modèles, notre projet permettra de tester de nouveaux traitements spécifiquement adaptées à cette leucémie incurable et sera à terme très bénéfique pour les patients. Au niveau plus fondamental, notre projet permettra de comprendre comment la maladie survient, quel est le rôle de l’inflammation chronique qui survient avec l’âge sur son développement ou son accélération.

Procédures

Pour étudier le développement de cette leucémie, nous utiliserons la transplantation de moelle osseuse. Les transplantations sont réalisées par injection par voie veineuse, sous anesthésie, de cellules de moelle osseuse de souris donneuses, portant des mutations dans des gènes, dans des souris receveuses préalablement irradiées. L’irradiation a pour but de tuer toutes les cellules de la moelle osseuse et de libérer ainsi de la place pour les cellules transplantées qui vont venir s’y greffer. La prise de greffe est analysée un mois après la transplantation par la présence de cellules donneuses dans le sang des animaux, par une prise de sang à la veine faciale, effectuée sous anesthésie. Nous suivrons ensuite le développement de la maladie au cours du temps, jusqu’à 2 ans, par prise de sang régulières (toutes les deux semaines ou toutes les semaines si la maladie s’aggrave) et analyse des différentes cellules sanguines. Toutes les souris receveuses seront soumises à ces injections et prélèvements sanguins. Pour induire une inflammation chronique, des injections intra-péritonéales seront réalisées 2 fois par semaine pendant un mois. Une anesthésie locale avec de la lidocaïne sera utilisée pour ces injections.

Impact sur les animaux

Malgré la greffe de d’un nombre important de cellules de moelle qui permet aux cellules du sang de se reformer rapidement après l’irradiation, il se peut que dans les 2 semaines suivant la transplantation, les animaux souffrent : 1/ d’infections opportunistes, les cellules de l’intestin pouvant être aussi étant affectées par l’irradiation. 2/ d’une mauvaise prise de greffe et des difficultés à récupérer un taux normale de cellules dans le sang qui pourrait engendrer une diminution des globules rouges (anémie), fatigue, apathie, perte de poids, et perte de l’alimentation et dégradation de l’état général.

Devenir

Les animaux sont les animaux receveurs de cellules de moelle osseuse lors des transplantations dans nos procédures. Ils seront mis à mort et leurs organes prélevés pour étudier le phénotype et les mécansimes de la maladie.

Remplacement

Il n’est pas possible in vitro d’étudier les fonctions des cellules souches hématopoïétiques qui se trouvent dans la moelle osseuse, les mécanismes de production des cellules du sang et le développement de leucémies in vitro. Le développement de ces maladies requiert l’environnement de la moelle osseuse impossible à reproduire in vitro. Enfin, la prolifération in vitro de cellules cancéreuses est limitée et ne reflète pas ce qui se passe dans un individu. Il est donc indispensable de développer des modèles de souris mimant le plus fidèlement possible le développement de la maladie leucémique pour tester et sélectionner de nouvelles thérapies.

Réduction

La maladie évolue avec l’âge donnant des variations importantes d’un animal à l’autre. Pour avoir un pouvoir statistique suffisant nous pourrions être obligés d’étendre l’élevage pour avoir un nombre suffisant d’animaux du même âge au temps de l’expérience. Pour pallier cela (réduction), nous utiliserons la transplantation qui consiste en une greffe de moelle osseuse provenant d’une même souris donneuse à plusieurs souris receveuses qui développeront alors chacune une maladie identique. Nous pouvons utiliser moins d’animaux pour tester rapidement plusieurs conditions avec un pouvoir statistique important. Cette approche permet aussi de réduire considérablement les élevages et d’avoir des groupes de souris greffées à traiter du même âge. Nous pouvons greffer 10 souris à partir d’une souris donneuse. Ces modèles de leucémie sont nouveaux, le rythme de développement de la maladie n’est donc pas encore connu. En conséquence, nous avons calculé le nombre de souris nécessaires par groupe de greffe en nous fondant sur les données du laboratoire et de la littérature pour des pathologies similaires.

Raffinement

Immédiatement après irradiation, une observation des animaux sera réalisée 2 à 3 fois par semaine, afin de s’assurer que l’animal ne présente pas de complications directement liées à l’irradiation. Afin de favoriser le bien-être des animaux, l’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux et la nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu (coton de nidification, cabanes) sera mis en place dans chaque cage. Les procédures seront réalisées par un personnel expérimenté et sous anesthésie pour tous les gestes techniques. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des points limites généraux sont établis. Les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi en tout temps. Du DietGel Energy sera ajouté dans les cages après transplantation ou en cas de diminution de la prise alimentaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier l’hématopoïèse et les cancers du sang car elle possède un système hématopoïétique et immunitaire proche de celui de l’Homme. Les souches des animaux sont bien caractérisées ce qui permet d’effectuer des greffes de moelle osseuse en évitant les problèmes liés au rejet de greffe. Enfin, il s’agit d’espèces faciles à élever qui permettent l’obtention relativement rapide de résultats du fait de leur temps de génération réduit. Nous utiliserons des souris de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adultes. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte pour être dotées d’un système immunitaire fonctionnel.

900 animaux non-humains, dont des souris, rats, cobayes, hamsters, chats et chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des administrations répétées de formulations vétérinaires par voies variées et de multiples prélèvements de sang, jusqu'à dix chez les chiens et chats sur 48 heures. Le porteur indique que les rongeurs sont tués en fin d'étude tandis que les 250 chiens et 250 chats sont réutilisés puis proposés à l'adoption. Il qualifie ces études de "stricte nécessité" réglementaire, ne pouvant selon lui être remplacées pour la mise sur le marché des produits.

Objectifs

Lors de la mise au point de nouvelles formulations à usage vétérinaire, le screening de substances actives ou le choix des ingrédients de la formulation est basé entre autres sur leur propriétés pharmacocinétiques. La connaissance des principes actifs et/ou ingrédients (bibliographie, historique des études etc...), l’usage de méthodes alternatives in silico et in vitro ainsi que de la modélisation pharmacocinétique permet une première sélection mais la complexité d’une formulation (mélange d’excipients, pH, volume injecté, etc.) nécessite une ou plusieurs évaluations préliminaires avant le choix définitif de la formulation (sélection ou optimisation de formulations) et de son utilisation (posologie, voie d’administration). En amont des essais sur espèces cibles, il est possible de réaliser des études sur des rongeurs. Si les résultats sont concluants, le produit pourra être testé sur la ou les espèces cibles.

Bénéfices attendus

Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits pharmaceutiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les exigences réglementaires pour la mise sur le marché de ces produits. Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de cette procédure seront la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, innocuité, efficacité, mécanisme d’action) ainsi que la réalisation des études réglementaires permettant la mise sur le marché de ces produits.

Procédures

●Prélèvements de Sang : - chiens chats : 2 minutes par prélèvement, maximum 10 prélèvements sur 48h et dépendant du volume et du temps de récupération sur une période d’une semaine. - Rongeurs : 1 minute par prélèvement . Souris, rats : maximum 1% du volume circulant total sur 24h et maximum 15% du volume circulant total sur une période de 28 jours. - Hamsters, cobayes : maximum 5 prélèvements par 48 h et dépendant du volume et du temps de récupération sur une période d’une semaine. ●Prélèvements avec écouvillons : nasal, salive, larmes. Chiens et Chats : 1 minute par prélèvement. Rongeurs : 1 minute par prélèvement sur animal anesthésié. ●Prélèvements non invasifs : poils : sans restriction de nombre. Des administrations de produits pour toutes les voies : -1 traitement par voie (durée environ 5 minutes chez les carnivores et 1 minute chez les rongeurs. Les voies d’administration peuvent être orale (ou per os), gingivale, parentérale (entre autres sous-cutanée, intradermique, intrapéritonéale, intramusculaire, ou intraveineuse), nasale, topique (par exemple spot-on, pour-on, collier, patch), auriculaire.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une douleur transitoire aux sites d’injection lors de l’administration du produit testé, d’anesthésique ou de médication, liée à l’introduction d’une aiguille. Suite à l’administration du produit testé, les animaux pourront présenter des signes cliniques locaux et/ou généraux, qualifiés d’effets indésirables transitoires comme une réaction cutanée locale (prurit, œdème, tuméfaction, nodule, douleur à la palpation), des réactions systémiques transitoires (perte de poids, réduction de consommation alimentaire). Ces nuisances pourront être répétées car plusieurs administrations pourront être réalisées selon la posologie envisagée. Le suivi de la température par voie rectale pourra causer de l’inconfort temporaire. Enfin, lors du suivi régulier des animaux, les nuisances envisagées seront fonction du type de prélèvements réalisés telles qu’une légère gêne (ex : écouvillon oral), ou douleur transitoire liée à l’introduction de l’aiguille (ex : prise de sang), le cas échéant.

Devenir

Pour les rongeurs, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’étude. Pour les carnivores, l’ensemble des animaux sont ré-utilisés puis proposés à l’adoption.

Remplacement

Cette procédure a un caractère de stricte nécessité : elle ne peut pas, pour le moment, être remplacée par des méthodes alternatives car elle répond à l’obligation réglementaire ou scientifique d’être conduite sur l’espèce de destination du produit ou sur un modèle de rongeurs le cas échéant lors d’études préliminaires.

Réduction

Le nombre d’animaux envisagés dans cette procédure à été défini à son minimum : - soit en conformité avec la réglementation et la pharmacopée - soit étayé à l’aide d’un raisonnement scientifique et/ou d’une analyse statistique et/ou d’une recherche bibliographique permettant l’atteinte de l’objectif du projet. Il est également évalué en fonction du développement des projets sur les 5 ans à venir et des animaux déjà utilisés sur ceux-ci. Les études peuvent être réalisées selon différents designs : - design croisé (cross-over) : tous les animaux reçoivent successivement tous les traitements (test et référence) dans un ordre aléatoire. L’essai croisé utilise le sujet comme son propre témoin ; - design en parallèle : chaque groupe d’animaux reçoit un seul type de traitement. L’essai en parallèle utilise généralement un groupe témoin versus un ou des groupes traités car les groupes sont indépendants entre eux ; - design par étapes : quand le nombre de sujets est important, l’étude peut être réalisée en deux étapes avec un nombre inférieur de sujets. Si la première étape (plus de 50% des sujets totaux) ne permet pas de répondre à la question, la seconde étape est réalisée avec le nombre de sujets pour compléter le nombre total. Entre chaque période de traitement, une période d’attente sera définie pour permettre aux animaux de récupérer et/ou permettre l’élimination du produit administré précédemment (principe actif et métabolites) ou de son effet pharmacologique. Des tests statistiques seront adaptés à chaque design d'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement utilisées sont : - Une période d’acclimatation adaptée aux conditions de l’étude - Habituation des chats aux prélèvements de sang sur animaux vigiles. - socialisation des carnivores domestiques à l’aide d’une période de jeu dans une pièce dédiée. - Enrichissement des box afin d’améliorer le confort des animaux (musique, jouets adaptés...). - renforcement positif (récompenses ou caresses) - Selon le produit et l’étude, possibilité d’utiliser un sédatif/anesthésique pour soit l’administration, soit les prélèvements, soit les 2, selon les caractéristiques du produit et l’instruction d’utilisation en vigueur. - Une surveillance sera mise en place jusqu’au réveil complet de l’animal - Médication : selon le produit, l’objectif de l’étude et l’impact scientifique, l’utilisation d’anti-douleur sera étudiée au cas par cas et selon les caractéristiques du produit. - Adaptation du type de nourriture afin de faciliter l’alimentation des animaux (pâtée). - Observation quotidienne des animaux et examen/suivi clinique effectué aussi souvent que cela sera jugé nécessaire avec une fréquence qui pourra être augmentée en cas de besoin (en particulier pour le suivi d’innocuité). - Mise en place de points limites adaptés et précisément définis qui pourront être réévalués en fonction des observations recueillies. - En cas d’obligation d'héberger les animaux individuellement, des mesures complémentaires seront mises en place: une présence augmentée du personnel, possibilité pour les animaux de voir, sentir et entendre leurs congénères, augmentation du nombre de jouets dans l’hébergement, un suivi renforcé par les vétérinaires avec une attention particulière sur le comportement des animaux.

Choix des espèces

De façon réglementaire, les études de pharmacocinétique doivent être menées sur la ou les espèces de destination. Il est possible d’utiliser les rongeurs dans les études préliminaires de sélection de nouvelles molécules, formulations, voies d’administration ou posologie si pertinentes et avant les études sur espèces de destination. Les études sont réalisées chez des animaux sevrés, représentatifs de l’espèce de destination et de son statut physiologique, ceci comprenant entre autres l’âge ou la maturité sexuelle. Ces choix sont faits selon l’utilisation future du produit.

2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un régime gras jusqu'à douze semaines, des tests métaboliques avec prélèvements de sang caudal toutes les quinze minutes pendant deux heures, un jeûne intermittent et des injections sous-cutanées de cellules cancéreuses avec suivi tumoral. Le porteur indique que le régime gras dégrade leur statut métabolique et que les greffes induisent des tumeurs sous-cutanées, mammaires ou prostatiques. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives" à ces expériences de preuve de concept in vivo.

Objectifs

L’inflammation, processus naturel permettant déliminer des pathogènes tels que bactéries, virus et parasites, peut dans certaines conditions s'installer à long terme. On parle alors d’inflammation chronique. Cette inflammation excessive semble avoir un rôle causal dans de nombreuses affections, tels que l'arthrite, l'obésité/diabète, le sporiasis ou encore le cancer. L'activation de l'immunité innée, responsables de la production de cytokines pro-inflammatoires notemment les interférons de type I participe à l'installation et la persistance de l'inflammation chronique. Nous souhaitons ici comprendre le lien entre inflammation chronique due à l'accumulation d'acides nucléiques cytosoliques et les déréglements métaboliques chez l'obèse ainsi que leur effet sur la tumorigènèse. Les résultats obtenus au sein du laboratoire d’accueil suggèrent que l'activation de l’immunité innée et l'inflammation chronique dans les cellules cancéreuses favorise la prolifèration tumorale. De façon intéressante, l’analyse de l’impact de facteurs environnementaux sur l’apparition des cancers met en évidence un lien étroit entre l’adiposité et l’incidence du cancer. Vu le caractère fortement inflammatoire du tissu adipeux, il est tentant d’émettre l’hypothèse que le tissu adipeux promeut la tumorigénèse au cours de l'obésité.

Bénéfices attendus

Les résultats de notre projet permettra de mieux comprendre le lien entre inflammation et co-morbidités au cours de l'obésité. Ces résultats ouvriront la voie à de nouvelles appoches thérapeutiques pour limiter l'inflammation chronique dans un contexte d'obésité. En effet ce projet permettra également de déterminer l'intérêt de l'utilisation d'un inhibiteur de la voie de reconnaissance des acides nucléiques (cGAS/STING) dans le traitement du cancer en particulier chez le patient obèse.

Procédures

Les animaux recevront 5 types différents d'interventions: 1- intervention diététique pendant 12 semaines maximum: régime normal ou gras 60% 2- tests métaboliques avec injection intrapéritonéale d'insuline ou de glucose selon le test puis prélévement de sang caudal (une goutte toutes les 15 minutes pendant 2 heures) sur animaux vigiles. 3- jeûn intermittent 24h jeun/ 24h nourri pendant 20 jours maximum. 4- injection en sous-cutanée de cellulales cancéreuses (injection 5 minutes puis suivi tumoral environ 3 semaines) sous anesthésie (isoflurane). 5- injection de cellules cancéreuses (injection 15 minutes puis suivi tumoral environ 3 semaines) en orthotopique (sein ou prostate) sous isoflurane. 5- administration d'un inhibiteur de notre voie d'intêret pendant 4 semaines (sous-cutanée ou intrapéritonéal) pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux soumis à un régime gras vont prendre du poids rapidement et voir leur statut métabolique ( sensibilité à l'insuline, tolérance au glocuse) se dégrader. L'injection de cellules cancéreuses chez les animaux va induire le dévelopement d'une tumeur sous cutanée ou mammaire/prostatique selon le type d'injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au CO2 ou par discolacation des cervicales afin de prélevements les organes et /ou la tumeur des animaux.

Remplacement

Il s’agit ici de l’effet in vivo du régime gras sur l’inflammation et son impact sur le développement tumoral ainsi que l'effet d'un nouvel inhibiteur de l'inflammation : Il n'existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo. Cependant des tests in vitro sur des lignées adipocytaires sont menés afin de mieux comprendre l'activation de notre voie d'interet.

Réduction

Le chercheur en charge du projet a déjà mis en place des études similaires dans le passé et s'appuie sur les données des précedentes études pour établir le nombre d'animaux nécessaire dans les cohortes afin d'observer une différence significative si elle existe.

Raffinement

Le changement de litière, la pesée des animaux pourront être amener à etre plus fréquents si besoin.

Choix des espèces

La souris immunocompétente de type C57BL/6 J ou N constitue un modèle expérimental de référence pour ce type d'expérience sur le métabolisme et les greffes de cellules tumorales murines. La C57BL/6N présente des caractéristiques proches de la C57BL/6J. La C57BL/6N n’est pas porteuse de la mutation du gène Nnt contrairement à la C57BL/6J. Cette différence induit une légère différence de phénotype face au régime gras et au développement de l’insulinorésistance. Nos lignées mutantes sont majoritairement sous fond 6J, cependant 2 d’entre elles sont 6N, nous sommes dans l’optique de les backcrosser pour les passer en J. Nos résultats préliminaires ont donné des résultats positifs chez les souris STING sous fond B6J que cela soit en termes de métabolisme ou de tumorigénèse. Souris adultes de 8 à 12 semaines afin d’avoir des animaux adultes (d’âge mûr), pour une utilisation dans un protocole classique de métabolisme et de croissance tumorale.

132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime riche en fibres par gavage trois à cinq fois par semaine, une implantation de tumeur sous la peau ou une injection intraveineuse de cellules cancéreuses, et sont privées d'eau et de nourriture jusqu'à quatre heures lors des mesures de dihydrogène expiré. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et présente l'implantation de tumeurs comme n'induisant pas de souffrance. Il indique que le rôle du microbiote ne peut être étudié qu'in vivo et qu'il n'existe "pas d'alternative à ce jour".

Objectifs

Nous avons montré qu’un régime riche en fibre (High Fiber Diet - HFD) permet de moduler positivement la composition de la flore intestinale, ainsi que ses fonctions, impactant sur le métabolisme et l'immunité de l’hôte. Ceci conduit à l’activation de cellules immunitaires particulières au niveau intestinal. Dans un modèle de mélanome chez la souris, nous montrons qu’un pré-conditionnement à l’aide d’un régime HFD permet de prévenir la pousse tumorale, grâce aux mêmes cellules immunitaires que celles retrouvées dans l'intestin. Ainsi, nos données suggèrent qu’un régime riche en fibre, en modulant le microbiote intestinal et ses métabolites, dont le dihydrogène, active l’immunité locale et systémique de l’hôte, permettant une immunosurveillance accrue des cancers. De plus, nous avons montré qu’un régime HFD conduit à la production de dihydrogène (H2), connu pour ses propriétés immunostimulantes. Afin d’étudier le rôle du H2 dans l’effet immunostimulant et antitumoral du régime HFD, nous proposons de comparer les effets d’un régime HFD avec ceux induits par l’administration d’H2 (hydrogénothérapie). Cette démonstration renforcera nos observations et permettra le transfert rapide du régime HFD en clinique humaine, ainsi que dans la population générale.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de répondre à deux questions : (i) La quantité d’H2 produit par consommation d’inuline alimentaire peut-elle suffire à induire, par inhalation, une inhibition de la croissance tumorale ? Pour répondre à cette question, nous déterminerons tout d’abord la quantité d’H2 produite chez des souris nourries avec un régime HFD. Cette dose d’H2 déterminée sera ensuite administrée à des souris porteuses de tumeurs afin que nous étudiions la croissance tumorale et la réponse immunitaire anti-cancer. (ii) L’H2 produit par la consommation de fibres participe-t-il à l’induction de l’immunité anti-cancer ? Pour répondre à cette question, l’immunité basale des animaux sera analysée après 2 semaines de traitement. En démontrant l’effet anti-cancer d’une dose modérée d’H2 et son implication potentielle dans l’effet anti-tumoral du régime HFD, nous aurons des données préliminaires solides pour demander des financements de recherche préclinique (sur le mécanisme d’action de prébiotiques) et pour engager rapidement des essais cliniques. Enfin, ce projet doit permettre de développer de nouvelles technologies applicables dans des études précliniques sur des rongeurs de laboratoire et qui pourront être transférées en clinique (dispositifs de mesure de H2 exhalé et/ou dispositif d’administration de H2).

Procédures

Une partie des animaux sera nourrie avec un régime HFD, administré par gavage oral 3 ou 5 fois par semaine durant 1 mois (1 minute / gavage). Les animaux sont hébergés dans l'enceinte de mesure d'H2 pendant au maximum 4h consécutives, durant lesquelles ils seront surveillés par l'expérimentateur. Les fèces des animaux seront collectés après 2 semaines de préconditionnement (< 1 minute / souris). Une partie des animaux recevra une implantation tumorale par injection sous-cutanée (1 minute / souris), ou une injection de cellules cancéreuses par voie intra-veineuse, sous anesthésie (5 minutes / souris). Les prélèvements sanguins (2 minutes / souris) seront réalisés uniquement en fin d'expérience, sous anesthésie volatile, et sans réveil. Lorsque les animaux (ou un des animaux) atteindront un des points limites, ils subiront une anesthésie volatile terminale puis un prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Nous n'attendons pas d'effet indésirable dans ce projet. Le traitement des animaux sera apporté par des gestes expérimentaux de classe légère (gavage ou inhalation). L'implantation de tumeurs en elle-même n'induit pas de souffrance des animaux. Les prélèvements sanguins seront systématiquement réalisés sous anesthésie générale. En revanche, durant la mesure d'H2 exhalé et l'hydrogénothérapie, les animaux n'auront pas accès à l'abreuvement et à l'alimentation, pour une durée relativement courte (maximum 4 heures).

Devenir

Les animaux en fin d'expérimentation seront euthanasiés après avoir atteint les points limites, pour des prélèvements d'organes et de tissus.

Remplacement

Le rôle du microbiote intestinal ne peut être étudié qu'in vivo. En effet, les interactions hôte/microbes et notament système immunitaire de l'hôte/microbes et les réponses anti-tumoralesinduites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n'existe donc pas d'alternative à ce jour.

Réduction

Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse aux différents traitements, des groupes de 6 animaux seront constitués. Ainsi, malgré la variabilité, ce nombre d'animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique. De plus, plusieurs conditions expérimentales seront testées en parallèle, afin de mutualiser les groupes contrôles, et donc de réduire le nombre d'animaux contrôles utilisés. La dernière expérience ne sera réalisée que si les précédentes donnent des résultats satisfaisants.

Raffinement

Afin d'assurer le bien-être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire sera administré par gavage, et l'hydrogénothérapie par inhalation. L'injection sous-cutanée ou intra-veineuse de cellules cancéreuses n'induit qu'une légère souffrance des animaux. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés à la suite des implantations tumorales. Les injections et prélèvements sont réalisées sous légères anesthésies générales.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d'étude. La manipulation de leur flore est acquise. De plus, les modèles tumoraux ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développées pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique l'ont été avec ce même modèle murin. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d'âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées et le système immunitaire est pleinenement mature et permet donc son étude.

128 brebis et agneaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Les brebis gestantes reçoivent injections et perfusion d'hormones puis une césarienne, et les agneaux prématurés, en difficulté respiratoire, sont tués à vingt-quatre heures pour prélèvement d'organes. Ce volet complète une étude sur l'adaptation respiratoire du nouveau-né testant l'ocytocine et les corticoïdes. Le porteur invoque aussi la mortalité des agneaux en élevage et affirme qu'aucun modèle non animal ne répond à ce questionnement.

Objectifs

La détresse respiratoire du nouveau-né est une cause fréquente d’hospitalisation en réanimation néonatale,tout particulièrement chez les prématurés mais aussi chez les nouveau-nés à terme après césarienne programmée.Elle entraine une séparation de la mère et de l’enfant ainsi que des coûts importants.Sur le plan thérapeutique préventif,seule l’administration anténatale de glucocorticoïdes chez les prématurés avant 34 SA(Semaine d’Aménorrhée) a fait la preuve de son efficacité lors de cas avérés de naissance prématurée. Dans les cas de naissance par césarienne programmée avant travail, aucun traitement n’est disponible pour les nouveau-nés à terme ou prématurés « tardifs » (34-37 SA).Passé 34 SA, les corticoïdes ne sont plus recommandés car les risques à long terme chez les enfants deviennent prépondérants aux bénéfices néonataux sur le plan respiratoire. L’analyse des mécanismes physiologiques de régulation de la production du surfactant et de la réabsorption du liquide pulmonaire dans les cas de naissance physiologique à terme montre que d’autres hormones que les corticoïdes sont impliquées dans l’adaptation respiratoire à la vie extra-utérine.Celles-ci pourraient être à la base de futures thérapies de la détresse respiratoire néonatale, mais peu de travaux portent sur les effets de leur administration anténatale. Parmi elles, l’ocytocine représente une piste intéressante.Notre hypothèse est que l’adaptation respiratoire à la vie extra-utérine, qui dépend de la sécrétion du surfactant mais également de la réabsorption du liquide pulmonaire, est régulée conjointement par les voies endocriniennes minéralocorticoïde et glucocorticoïde ainsi que par celle de l’ocytocine.Les cas de détresse respiratoire néonatale dans les césariennes programmées en prématurité tardive pourraient être le fait d’une absence de mise en route de ces cascades hormonales.Nous souhaitons mettre en évidence que l’administration anténatale de glucocorticoïdes et/ou d’ocytocine, en venant compenser cette immaturité ou ce défaut de sécrétion, permettrait de limiter la détresse respiratoire chez l’ovin né prématurément par césarienne.De par ses caractéristiques, l’ovin est un modèle animal reconnu pour mener des recherches précliniques sur le système respiratoire. La mortalité néonatale impacte également fortement la filière ovine puisqu’on estime qu’elle concerne en moyenne 15 % des agneaux nouveau-nés en France.Cette avancée pourrait permettre de diminuer la mortalité en élevage

Bénéfices attendus

Au-delà du modèle d’étude, la mortalité néonatale impacte également fortement la filière ovine puisqu’on estime qu’elle concerne en moyenne 15 % des agneaux nouveau-nés, ce qui représente environ 1 million d’agneaux chaque année en France. Or plus de la moitié de cette mortalité intervient dans les 48 heures suivant la naissance et serait directement ou indirectement liée à un défaut d’adaptation à la vie extra-utérine. A l’heure actuelle, les possibilités de traitement de ces agneaux sont très limitées et reposent essentiellement, lorsqu’elles sont possibles, sur l’administration anténatale de corticoïdes. Si les bénéfices d’une administration anténatale de corticoïdes sont bien documentés, il n’existe pas à notre connaissance de travaux portant sur les effets d’une administration anténatale d’autres hormones comme l’ocytocine. De plus, si notre hypothèse est confirmée, la perfusion de glucocorticoïdes et/ou d’ocytocine chez la mère en préalable à une césarienne programmée avant le début du travail devrait permettre d’améliorer chez l’humain l’adaptation respiratoire du nouveau-né lors de sa naissance et donc de limiter les conséquences délétères en lien avec la détresse respiratoire néonatale : séparation de la mère et de l’enfant, réalisation de nombreux gestes invasifs quotidiens chez le nouveau-né, ainsi que des coûts de santé publique importants. L’objectif in fine sera de proposer des thérapies préventives maternelles de la mauvaise adaptation à la vie extra-utérine chez l’humain mais également chez l’ovin.

Procédures

Procédure de traitement anté-natal, sur animaux vigiles - Brebis : pour chaque brebis o 3 injections (durée moyenne : 30 secondes par injection): • 72h avant césarienne • 48h avant césarienne • 24h avant césarienne o Une pose de cathéter intraveineux sur la veine jugulaire puis perfusion pendant les 5 heures précédant la césarienne (durée moyenne : 5 minutes pour la pose de cathéter et 5 heures de perfusion) Prélèvements sur animaux vigiles - Brebis : pour chaque brebis o 1 prélèvement sanguin (20 ml à la veine jugulaire, durée moyenne : 1 minute) - Agneaux : pour chaque agneau o 1 prélèvement de sang de cordon juste au moment de la naissance réalisé avant la sortie de l’agneau de l’utérus (durée moyenne 30 secondes) o 2 prélèvements sanguins à J0+1h puis à J1 (durée moyenne : 1 minute par prélèvement) o 1 prélèvement urinaire à J1 sur miction spontanée ou, à défaut, par ponction de la vessie lors du prélèvement des organes suite à l’euthanasie Procédure chirurgicale sur animaux anesthésiés après sédation - Brebis : pour chaque brebis o 1 césarienne (durée moyenne 1h30)

Impact sur les animaux

Pour les brebis, les actes prévus consistent en : - des injections sur animal vigile (douleurs légères de courte durée liée à l'injection) ; - la pose d’un cathéter veineux en vue de l’administration d’une perfusion associée à des traitements expérimentaux et un prélèvement sanguin unique par ponction veineuse sur animal vigile (douleurs légères de courte durée liée au prélèvement ou la pose d’un cathéter); - hébergement individuel pendant la perfusion - la procédure chirurgicale (césarienne)(douleurs modérées gérées par analgésie). Pour les agneaux, - prise de sang par ponction à la veine jugulaire (douleurs légères de courte durée liée au prélèvement) - difficultés respiratoires dans les premières minutes à premières heures de vie

Devenir

Les Brebis (déjà réutilisées après un autre projet) seront euthanasiées, de plus, des prévèlements d’organes post-mortem seront réalisés pour d’autres projets. Les agneaux doivent quand à eux être euthanasiés dans le but de prélever les organes nécessaires pour les analyses biologiques.

Remplacement

Le questionnement scientifique de ce projet porte sur des mécanismes de régulation hormonale et d’adaptation de l’organisme à un changement de milieu de vie (passage de la vie utérine à la vie aérienne) qui impliquent de multiples organes. Or il n’existe pas à notre connaissance de modèle non animal permettant de répondre à ce questionnement.

Réduction

Le projet prévoit la constitution de 4 lots expérimentaux. Nous prévoyons donc l’inclusion de 32 brebis (portée de 3 agneaux) pour un objectif de 24 agneaux par groupe expérimental. Il est suffisant pour réaliser une analyse préliminaire de caractérisation d’une sélection de marqueurs moléculaires et cellulaires des mécanismes impliqués dans l’adaptation respiratoire du nouveau-né. Cette taille d’échantillon est cohérente avec les effectifs rencontrés dans la bibliographie dans ce type d’étude.

Raffinement

Le transport, l’hébergement et la conduite des animaux sera réalisée de façon à maintenir les animaux en groupe dans des cases collectives aux dimensions suffisantes pour permettre aux animaux de satisfaire à leurs comportements normaux. L’accès à l’eau et à une alimentation adaptée sera ad libitum. Tous les traitements ne nécessitant pas d’isolement de l’animal seront réalisés dans le box, en présence des congénères. Lors de soins demandant un hébergement individuel des animaux traités (perfusion, surveillance post-opératoire), les animaux garderont, dans la mesure du possible, un contact visuel, sonore et olfactif avec au moins l’un de ses congénères (deux brebis seront prévues par journée de manip). Un soin particulier sera apporté à la contention des animaux lors de la réalisation des injections (traitements) ou des prélèvements biologiques (sang) de façon à limiter au maximum les sources de stress pour les animaux. Ces actes font partie des actes pratiqués régulièrement en élevage (soins lors de maladie ou prélèvements sanguins réalisés dans le cadre du suivi sanitaire réglementaire de toute exploitation ovine). La procédure de césarienne est utilisée en routine dans le cadre des interventions réalisées en élevage : intervention sur animal vigile ou sédaté debout ou maintenu couché sur le coté ou sur le dos, sur une table opératoire, sous anesthésie locale ou générale. Une attention particulière est mise en œuvre pour limiter la douleur et la souffrance des brebis césarisées. La prise en charge de la douleur a pour but de couvrir l’ensemble des sources de douleur et comprend l’administration préopératoire d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (antidouleur) associée à la réalisation d’une anesthésie locale et d’une sédation ou à celle d’une anesthésie générale. Les agneaux des deux brebis opérées le même jour seront hébergés en groupe dans la même case collective pour éviter leur isolement. La température de la case sera controlée (lampe chauffante). Les agneaux seront biberonnés toutes les trois heures à l’aide de lait reconstitué à partir de poudre de lait maternisé pour agneaux (les césariennes intervenant avant le terme de la gestation, les brebis ne disposent pas de lait pour l’allaitement maternel).

Choix des espèces

De par ses caractéristiques de corpulence et de développement périnatal semblables à l’humain, l’ovin est un modèle animal reconnu pour mener des recherches précliniques sur le système respiratoire et hémodynamique néonatal. Mais au-delà du modèle d’étude, la mortalité néonatale impacte également fortement la filière ovine puisqu’on estime qu’elle concerne en moyenne 15 % des agneaux nouveau-nés, ce qui représente environ un million d’agneaux chaque année en France. Or plus de la moitié de cette mortalité intervient dans les 48 heures suivant la naissance et serait directement ou indirectement lié à un défaut d’adaptation à la vie extra-utérine. Pour l’heure, les modalités de prise en charge thérapeutique de ces agneaux sont très limitées et reposent essentiellement, lorsqu’elle est possible, sur l’administration anténatale de corticoïdes. Si les bénéfices de ce traitement sont bien documentés, peu de travaux portent sur les effets d’une administration anténatale d’autres hormones comme l’ocytocine. Il est nécessaire de disposer de brebis adultes pour mener une gestation. La gestation des brebis sera synchronisée de façon à maitriser le stade de gestation. Les césariennes seront réalisées entre les stades J135 et J140 (pour mimer une césarienne programmée chez l’humain vers 35-36 SA). Les agneaux issus de ces césariennes seront réanimés puis suivis cliniquement pendant 24h avant d’être euthanasiés à 24h pour dissection et prélèvement des organes d’intérêt.

128 brebis et agneaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Les brebis gestantes reçoivent des injections d'hormones et une perfusion puis subissent une césarienne, et les agneaux nés prématurément présentent des difficultés respiratoires avant d'être tués à vingt-quatre heures pour prélèvement d'organes. L'étude teste l'ocytocine et des corticoïdes contre la détresse respiratoire du nouveau-né. Le porteur relie ce travail à la mortalité des agneaux en élevage et affirme qu'aucun modèle non animal ne permet d'étudier cette adaptation à la naissance.

Objectifs

La détresse respiratoire du nouveau-né est une cause fréquente d’hospitalisation en réanimation néonatale,tout particulièrement chez les prématurés mais aussi chez les nouveau-nés à terme après césarienne programmée.Elle entraine une séparation de la mère et de l’enfant ainsi que des coûts importants.Sur le plan thérapeutique préventif,seule l’administration anténatale de glucocorticoïdes chez les prématurés avant 34 SA(Semaine d’Aménorrhée) a fait la preuve de son efficacité lors de cas avérés de naissance prématurée. Dans les cas de naissance par césarienne programmée avant travail, aucun traitement n’est disponible pour les nouveau-nés à terme ou prématurés « tardifs » (34-37 SA).Passé 34 SA, les corticoïdes ne sont plus recommandés car les risques à long terme chez les enfants deviennent prépondérants aux bénéfices néonataux sur le plan respiratoire. L’analyse des mécanismes physiologiques de régulation de la production du surfactant et de la réabsorption du liquide pulmonaire dans les cas de naissance physiologique à terme montre que d’autres hormones que les corticoïdes sont impliquées dans l’adaptation respiratoire à la vie extra-utérine.Celles-ci pourraient être à la base de futures thérapies de la détresse respiratoire néonatale, mais peu de travaux portent sur les effets de leur administration anténatale. Parmi elles, l’ocytocine représente une piste intéressante.Notre hypothèse est que l’adaptation respiratoire à la vie extra-utérine, qui dépend de la sécrétion du surfactant mais également de la réabsorption du liquide pulmonaire, est régulée conjointement par les voies endocriniennes minéralocorticoïde et glucocorticoïde ainsi que par celle de l’ocytocine.Les cas de détresse respiratoire néonatale dans les césariennes programmées en prématurité tardive pourraient être le fait d’une absence de mise en route de ces cascades hormonales.Nous souhaitons mettre en évidence que l’administration anténatale de glucocorticoïdes et/ou d’ocytocine, en venant compenser cette immaturité ou ce défaut de sécrétion, permettrait de limiter la détresse respiratoire chez l’ovin né prématurément par césarienne.De par ses caractéristiques, l’ovin est un modèle animal reconnu pour mener des recherches précliniques sur le système respiratoire. La mortalité néonatale impacte également fortement la filière ovine puisqu’on estime qu’elle concerne en moyenne 15 % des agneaux nouveau-nés en France.Cette avancée pourrait permettre de diminuer la mortalité en élevage

Bénéfices attendus

Au-delà du modèle d’étude, la mortalité néonatale impacte également fortement la filière ovine puisqu’on estime qu’elle concerne en moyenne 15 % des agneaux nouveau-nés, ce qui représente environ 1 million d’agneaux chaque année en France. Or plus de la moitié de cette mortalité intervient dans les 48 heures suivant la naissance et serait directement ou indirectement liée à un défaut d’adaptation à la vie extra-utérine. A l’heure actuelle, les possibilités de traitement de ces agneaux sont très limitées et reposent essentiellement, lorsqu’elles sont possibles, sur l’administration anténatale de corticoïdes. Si les bénéfices d’une administration anténatale de corticoïdes sont bien documentés, il n’existe pas à notre connaissance de travaux portant sur les effets d’une administration anténatale d’autres hormones comme l’ocytocine. De plus, si notre hypothèse est confirmée, la perfusion de glucocorticoïdes et/ou d’ocytocine chez la mère en préalable à une césarienne programmée avant le début du travail devrait permettre d’améliorer chez l’humain l’adaptation respiratoire du nouveau-né lors de sa naissance et donc de limiter les conséquences délétères en lien avec la détresse respiratoire néonatale : séparation de la mère et de l’enfant, réalisation de nombreux gestes invasifs quotidiens chez le nouveau-né, ainsi que des coûts de santé publique importants. L’objectif in fine sera de proposer des thérapies préventives maternelles de la mauvaise adaptation à la vie extra-utérine chez l’humain mais également chez l’ovin.

Procédures

Procédure de traitement anté-natal, sur animaux vigiles - Brebis : pour chaque brebis o 3 injections (durée moyenne : 30 secondes par injection): • 72h avant césarienne • 48h avant césarienne • 24h avant césarienne o Une pose de cathéter intraveineux sur la veine jugulaire puis perfusion pendant les 5 heures précédant la césarienne (durée moyenne : 5 minutes pour la pose de cathéter et 5 heures de perfusion) Prélèvements sur animaux vigiles - Brebis : pour chaque brebis o 1 prélèvement sanguin (20 ml à la veine jugulaire, durée moyenne : 1 minute) - Agneaux : pour chaque agneau o 1 prélèvement de sang de cordon juste au moment de la naissance réalisé avant la sortie de l’agneau de l’utérus (durée moyenne 30 secondes) o 2 prélèvements sanguins à J0+1h puis à J1 (durée moyenne : 1 minute par prélèvement) o 1 prélèvement urinaire à J1 sur miction spontanée ou, à défaut, par ponction de la vessie lors du prélèvement des organes suite à l’euthanasie Procédure chirurgicale sur animaux anesthésiés après sédation - Brebis : pour chaque brebis o 1 césarienne (durée moyenne 1h30)

Impact sur les animaux

Pour les brebis, les actes prévus consistent en : - des injections sur animal vigile (douleurs légères de courte durée liée à l'injection) ; - la pose d’un cathéter veineux en vue de l’administration d’une perfusion associée à des traitements expérimentaux et un prélèvement sanguin unique par ponction veineuse sur animal vigile (douleurs légères de courte durée liée au prélèvement ou la pose d’un cathéter); - hébergement individuel pendant la perfusion - la procédure chirurgicale (césarienne)(douleurs modérées gérées par analgésie). Pour les agneaux, - prise de sang par ponction à la veine jugulaire (douleurs légères de courte durée liée au prélèvement) - difficultés respiratoires dans les premières minutes à premières heures de vie

Devenir

Les Brebis (déjà réutilisées après un autre projet) seront euthanasiées, de plus, des prévèlements d’organes post-mortem seront réalisés pour d’autres projets. Les agneaux doivent quand à eux être euthanasiés dans le but de prélever les organes nécessaires pour les analyses biologiques.

Remplacement

Le questionnement scientifique de ce projet porte sur des mécanismes de régulation hormonale et d’adaptation de l’organisme à un changement de milieu de vie (passage de la vie utérine à la vie aérienne) qui impliquent de multiples organes. Or il n’existe pas à notre connaissance de modèle non animal permettant de répondre à ce questionnement.

Réduction

Le projet prévoit la constitution de 4 lots expérimentaux. Nous prévoyons donc l’inclusion de 32 brebis (portée de 3 agneaux) pour un objectif de 24 agneaux par groupe expérimental. Il est suffisant pour réaliser une analyse préliminaire de caractérisation d’une sélection de marqueurs moléculaires et cellulaires des mécanismes impliqués dans l’adaptation respiratoire du nouveau-né. Cette taille d’échantillon est cohérente avec les effectifs rencontrés dans la bibliographie dans ce type d’étude.

Raffinement

Le transport, l’hébergement et la conduite des animaux sera réalisée de façon à maintenir les animaux en groupe dans des cases collectives aux dimensions suffisantes pour permettre aux animaux de satisfaire à leurs comportements normaux. L’accès à l’eau et à une alimentation adaptée sera ad libitum. Tous les traitements ne nécessitant pas d’isolement de l’animal seront réalisés dans le box, en présence des congénères. Lors de soins demandant un hébergement individuel des animaux traités (perfusion, surveillance post-opératoire), les animaux garderont, dans la mesure du possible, un contact visuel, sonore et olfactif avec au moins l’un de ses congénères (deux brebis seront prévues par journée de manip). Un soin particulier sera apporté à la contention des animaux lors de la réalisation des injections (traitements) ou des prélèvements biologiques (sang) de façon à limiter au maximum les sources de stress pour les animaux. Ces actes font partie des actes pratiqués régulièrement en élevage (soins lors de maladie ou prélèvements sanguins réalisés dans le cadre du suivi sanitaire réglementaire de toute exploitation ovine). La procédure de césarienne est utilisée en routine dans le cadre des interventions réalisées en élevage : intervention sur animal vigile ou sédaté debout ou maintenu couché sur le coté ou sur le dos, sur une table opératoire, sous anesthésie locale ou générale. Une attention particulière est mise en œuvre pour limiter la douleur et la souffrance des brebis césarisées. La prise en charge de la douleur a pour but de couvrir l’ensemble des sources de douleur et comprend l’administration préopératoire d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (antidouleur) associée à la réalisation d’une anesthésie locale et d’une sédation ou à celle d’une anesthésie générale. Les agneaux des deux brebis opérées le même jour seront hébergés en groupe dans la même case collective pour éviter leur isolement. La température de la case sera controlée (lampe chauffante). Les agneaux seront biberonnés toutes les trois heures à l’aide de lait reconstitué à partir de poudre de lait maternisé pour agneaux (les césariennes intervenant avant le terme de la gestation, les brebis ne disposent pas de lait pour l’allaitement maternel).

Choix des espèces

De par ses caractéristiques de corpulence et de développement périnatal semblables à l’humain, l’ovin est un modèle animal reconnu pour mener des recherches précliniques sur le système respiratoire et hémodynamique néonatal. Mais au-delà du modèle d’étude, la mortalité néonatale impacte également fortement la filière ovine puisqu’on estime qu’elle concerne en moyenne 15 % des agneaux nouveau-nés, ce qui représente environ un million d’agneaux chaque année en France. Or plus de la moitié de cette mortalité intervient dans les 48 heures suivant la naissance et serait directement ou indirectement lié à un défaut d’adaptation à la vie extra-utérine. Pour l’heure, les modalités de prise en charge thérapeutique de ces agneaux sont très limitées et reposent essentiellement, lorsqu’elle est possible, sur l’administration anténatale de corticoïdes. Si les bénéfices de ce traitement sont bien documentés, peu de travaux portent sur les effets d’une administration anténatale d’autres hormones comme l’ocytocine. Il est nécessaire de disposer de brebis adultes pour mener une gestation. La gestation des brebis sera synchronisée de façon à maitriser le stade de gestation. Les césariennes seront réalisées entre les stades J135 et J140 (pour mimer une césarienne programmée chez l’humain vers 35-36 SA). Les agneaux issus de ces césariennes seront réanimés puis suivis cliniquement pendant 24h avant d’être euthanasiés à 24h pour dissection et prélèvement des organes d’intérêt.

12 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, six chiens atteints d'une forme canine de myopathie de Duchenne et six chiens sains. Ils reçoivent trois molécules par voie orale ou par patch, un enregistrement ECG continu non invasif et neuf prises de sang, pour comprendre une anomalie cardiaque précoce. À l'issue, les chiens sains sont proposés à l'adoption et les chiens GRMD réutilisés dans un autre projet, sans mise à mort prévue. Le porteur affirme que cette anomalie ne peut être modélisée in vitro et que le chien GRMD est le modèle "le plus fidèle" de la maladie humaine.

Objectifs

La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui touche le muscle chez l'enfant. Les patients sont contraints à l'usage du fauteuil roulant vers l'âge de 10 ans, et décèdent d'insuffisance respiratoire ou cardiaque vers l'âge de 30 ans. Le chien GRMD (golden retriever muscular dystrophy) reproduit de manière fidèle la maladie humaine, dans un organisme de grande taille, pouvant être suivi sur le long terme. Il occupe donc une place pré-clinique immédiate dans le développement de thérapies pour la myopathie de Duchenne. Au cours d'une étude visant à décrire les anomalies de l’électrocardiogramme des chiens GRMD à l'aide d'enregistrements holter réalisés au cours d'un suivi longitudinal de plusieurs années, la proximité des anomalies rencontrées chez le chien et chez l'Homme, tant dans leur nature que dans la séquence de leur survenue, a pu être démontrée. Cependant, une anomalie, encore jamais investiguée chez les patients, a été identifiée et est celle qui survient le plus précocement chez le chien et permet de prédire, plusieurs mois auparavant, l’atteinte fonctionnelle cardiaque ultérieure. Cette même anomalie a été relevée dans plusieurs études chez l'Homme, dans des contextes pathologiques divers, comme un marqueur de mauvais pronostic très robuste. L'origine de cette anomalie est cependant mal comprise, mais plusieurs hypothèses sont avancées. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l’origine de cette anomalie chez le chien GRMD en ciblant par voie pharmacologique les différents acteurs possiblement impliqués dans sa survenue. Cela permettra de mieux comprendre cette anomalie électrocardiographique très précoce et prédictive de la dégradation de la fonction cardiaque et de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre l'origine de cette altération électrocardiographique chez le chien GRMD, et plus largement de contribuer à la compréhension de l'origine de la puissance générée dans les très basses fréquences en variabilité de fréquence cardiaque. Cette anomalie survenant précocement dans le cours de la maladie, et semblant liée à la dégradation ultérieure de la fonction cardiaque, comprendre son origine permettra éventuellement d'identifier des cibles thérapeutiques permettant de retarder la survenue de la dysfonction cardiaque chez les chiens GRMD et a fortiori chez les patients atteints de myopathie de Duchenne.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les seuls gestes invasifs effectués sur les animaux seront des prises de sang (9 prélèvements), effectués sur animaux vigiles, en prenant soin d'effectuer une contention la plus douce possible, de prendre le temps de rassurer les animaux, d'effectuer un prélèvement rapide (durée du prélèvement en lui-même = moins d'une minute) et indolore, et de récompenser les animaux après chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Les 3 molécules testées sont des molécules utilisées chez le chien, pour lesquelles les doses sont bien connues ainsi que les potentiels effets secondaires. Ces derniers seront principalement à surveiller pour ce qui concerne le donneur de NO (trinitrine). Une baisse importante de la pression artérielle pourrait être observée chez les animaux en cours de traitement. Afin d'éviter tout incident grave lié à une hypotension, les chiens seront surveillés de très près durant les premières heures de traitement, et leur pression artérielle (brassard) sera mesurée toutes les heures, la fréquence de ces mesures sera augmentée en cas de chute de plus de 20 %. Si la pression artérielle chute en dessous de 100 mm Hg, le patch de trinitrine sera immédiatement retiré. Le retrait des électrodes adhésives utilisées pour l'ECG pouvant être douloureux pour la peau, un anti-adhésif sera préalablement appliqué.

Devenir

Les chiens sains utilisés dans ce projet seront mis à l'adoption à l'issue du projet. Les chiens GRMD pourront être réutilisés dans un autre projet compatible, sous réserve de l'accord du vétérinaire désigné.

Remplacement

L'anomalie de l'électrocardiogramme étudiée dans ce projet ne pourrait pas être modélisée in vitro/ex vivo. En effet, il s'agit de mesurer la modulation de fluctuations des intervalles entre pulsations cardiaques, celle-ci étant sous le contrôle de facteurs multiples hormonaux, neurovégétatifs, vasculaires qui ne peuvent donc être étudiés autrement que dans un organisme vivant. L'anomalie que nous cherchons à comprendre ayant été identifiée chez les chiens GRMD, ce projet sera donc conduit chez ces animaux.

Réduction

Grâce à la variabilité connue de l'indice étudié chez les chiens GRMD, nous avons pu déterminer que 6 chiens seraient nécessaires et suffisants pour démontrer une augmentation de cet indice à une valeur intermédiaire entre celle mesurée chez les chiens GRMD non traités et celle observée chez des chiens sains du même âge. Dans un souci de réduction, les 6 chiens GRMD inclus dans ce projet seront réutilisés d'un projet précédent, sous réserve de l'accord du vétérinaire désigné, et/ou pourront être réutilisés dans un autre projet après celui-ci. De plus, les chiens sains ne seront inclus que si les données obtenues chez les chiens GRMD ne vont pas dans le sens de celles attendues au vu des données bibliographiques disponibles sur des chiens sains. Dans ce cas les chiens sains seront inclus afin de vérifier les données obtenues dans les conditions expérimentales de l'étude, sur des chiens sains de la même souche que les chiens GRMD.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, nous aurons recours à un enregistrement de l'ECG non invasif (électrodes adhésives de surface), et de type holter, permettant au chien de mener une vie normale tout en permettant l'enregistrement continu de son électrocardiogramme. Cela permet une réduction du stress et une meilleure représentativité des données obtenues par rapport à un enregistrement ponctuel. Par ailleurs, les trois molécules dont nous testerons l'effet seront administrées de manière également non invasive, soit par voie orale dans une friandise, soit par diffusion continue à l'aide de patches. Les prises de sang seront effectuées par des personnels formés à la fois au geste technique et aux méthodes de réduction du stress des animaux pendant un geste médical. Les animaux seront récompensés (voix, caresses et friandise) après chaque prélèvement. Sur le plan de l'hébergement, les chiens sont hébergés en petits groupes sociaux compatibles, sur litière, et ont à leur disposition des plateformes, lieux de couchage et jouets. Ils bénéficient de sorties quotidiennes 7j/7 en groupes plus larges et d'interactions quotidiennes avec l'Homme. Leur état clinique est étroitement surveillé : pesée et prise de température quotidienne et présence d'un vétérinaire 7j/7.

Choix des espèces

Le chien GRMD est le modèle de DMD présentant la plus grande pertinence translationnelle. En effet, il mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle murin, dans un organisme de grande taille, et permet donc de modéliser au plus près, au stade préclinique, les enjeux qui seront rencontrés dans les essais cliniques chez les patients. Dans le cadre de ce projet plus précisément, le fait de travailler sur les chiens permet de se placer dans le seul modèle animal qui reproduit de manière fidèle les anomalies électrocardiographiques décrites chez les patients DMD. Les chiens inclus dans cette étude devront être d'âge supérieur à 6 mois afin que les anomalies électrocardiographiques étudiées soient clairement présentes, et également que leur poids corporel soit compatible avec les dispositifs d'administraton utilisés (patches notamment), mais inférieur à 24 mois afin de ne pas être dans une situation d'insuffisance cardiaque.