Procédures légères
Analyse histologique de cerveau de souris porteuses de mutations humaines associées à des déficiences intellectuelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris porteuses de mutations humaines liées a des deficiences intellectuelles vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance leger, une partie etant tuee sans reveil pour prelever le cerveau. Elles sont genotypees par ablation d'une phalange ou prelevement d'oreille, recoivent une injection intraperitoneale, puis sont tuees a trois semaines ou a quatre mois pour analyser leurs structures cerebrales. Le porteur affirme que le modele murin reste "indispensable" pour evaluer le cerveau adulte des mammiferes, que les organoides ne reproduisent pas. Les retombees therapeutiques evoquees, une restauration de la proteine normale, sont renvoyees au conditionnel et au long terme.
Objectifs
Nous nous intéressons aux protéines qui sont associées avec l'expression des gènes. Une étape importante est la reconnaissance des gènes par des protéines particulières qui sont présentes dans toutes les cellules. De manière surprenante, des mutations dans les gènes codant pour ces protéines ont été identifiées chez des patients humains présentant un retard de croissance et du développement moteur, une microcéphalie, des difficultés d'alimentation, et une déficience intellectuelle sévère. Nous avons développé des modèles de souris qui reproduisent deux de ces mutations humaines. Nous souhaitons voir si les structures cérébrales sont affectées chez les souris mutantes.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettera de valider nos deux modèles murins en tant que modèles de pathologie humaine afin de pouvoir étudier les mécanismes moléculaires qui sont perturbées de manière spécifique dans le cerveau. A plus long terme si ces modèles sont validés, ils pourront servir de modèle expérimental pour explorer la restauration de l'expression de la prtotéine sauvage comme hypothèse thérapeutique.
Procédures
Les souris seront génotypées et identifiées par phalagectomie (1 prélèvement, 1 seconde) ou par prélèvement auriculaire (1 prélèvement, 1 seconde). Les souris seront soumises à une anesthésie par une injection intrapéritonéale qui dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une injection intrapéritonéale et les animaux dont les cerveaux seront prélevés à 21 jours (PE1) subiront un prélèvement de la dernière phalange. Ces deux nuisances sont associées à une douleur légère.
Devenir
Il s'agit d'une procédure terminale pour analyser les cerveaux des animaux.
Remplacement
Le modèle animal murin reste indispensable afin d’évaluer la structure complexe du cerveau des mammifères, en particulier du cerveau adulte qui n'est pas modélisable par les alternatives organoïdes (mini-cerveau) qui ne sont pas des structures adultes.
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé selon une étude publiée permettant une mesure fiable de différents paramètres structuraux du cerveau et une comparaison entre contrôles et mutants selon un pipeline statistique standardisé développé à cet effet.
Raffinement
Cette procédure ne débutera qu'après l'évaluation préalable d'un phénotype dommageable potentiel de chaque mutation. Les patients humains ont des troubles moteurs, des difficultés d'alimentation et la possibilité de développer des crises d'épilepsie pendant l'enfance. Si ces phénotypes sont observés chez nos modèles murins, nous renforcerons le suivi réglementaire des animaux en suivant leur poids 3 fois par semaine et en mettant de la nourriture gélifiée.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier l'effet d'une mutation en générant des lignées proteuses de mutations ciblées. De plus, nous nous intéressons à des mutations identifiées chez l'homme associées à des déficiences intellectuelles donc le recours à un modèle mammifère est nécessaire. Nous souhaitons étudier l'évolution potentielle du phénotype qui est détecté après la naissance chez les patients humains pour les deux mutations. Nous avons sélectionné un âge jeune à 3 semaines (P21) et un âge adulte à 4 mois (P120) pour des mâles et de femelles.
Etude de l’effet de différentes formulations de la copie synthétique de la phéromone maternelle de la poule sur le stress et le développement du microbiote intestinal en élevage avicole.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
750 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevés dans des conditions d'élevage intensif reproduites pour l'étude, ils reçoivent une phéromone de synthèse censée réduire leur stress, puis sont tués par lots à intervalles réguliers pour prélever duvet, plumes et organes. Le porteur indique que la souche Ross 308, sélectionnée pour atteindre le poids d'abattage en quarante-deux jours, ne peut être gardée vivante car ses pattes ne soutiennent plus son poids. Il présente ce produit commercial comme un moyen d'améliorer le bien-être des animaux non-humains, dont les conditions de détention restent la source première du stress étudié.
Objectifs
L’élevage avicole et notamment du poulet de chair peut comprendre des pratiques susceptibles de causer un stress et d’altérer le bien-être animal. Le stress réduit la qualité de vie des poulets et entraîne une diminution de la croissance, une baisse de l’immunité, une diminution de la fonction gastro-intestinale. Un stress prolongé contribue à l’augmentation des maladies, mortalité, une diminution de la qualité des productions. L’optimisation de l’élevage avicole est donc souhaitable d’un point de vue éthique et sociétal. Un traitement capable d’apaiser les animaux, les aider à s’adapter à l’environnement et à soutenir leur défense immunitaire est de grand intérêt. La copie de la phéromone maternelle de la poule dite MHUSA protège les individus contre les effets négatifs du stress. La sécrétion naturelle est produite par la poule pour apaiser et protéger les poussins dans l’environnement. Le produit est commercialisé sous forme de bloc diffuseur. Une étude précédente a testé le MHUSA en formulation spray appliqué sur les animaux en montrant des effets bénéfiques du produit sur l’adaptation des poussins au nouvel environnement et leur défenses immunitaires. Une application sur les animaux permet aux individus d’être eux-mêmes les diffuseurs de la phéromone, qui étant diffusée en permanence et à hauteur des poulets, améliorerait sa captation et donc ses effets. Le laboratoire en charge de la fabrication des produits développe une formulation qui puisse durer longtemps sur les animaux afin de limiter les renouvellements par l’éleveur. Pour cela, le MHUSA est dilué dans une solution contenant une substance retard. Deux types de substances retard sont possibles et seront testées. L’objectif est de tester ces deux nouvelles formulations sur des poussins de chair maintenus dans des conditions d’élevage similaires au milieu agricole. Ces nouvelles formulations seront comparées à la formulation précédente (sans la substance retard) et une solution témoin (eau). Nous proposons une étude composée de deux expériences réalisées l’une après l’autre : un test de rémanence pour les deux nouvelles formulations ; un essai d’efficacité pour étudier les effets des 3 traitements sur le stress et le développement de la flore intestinal vu sa possible altération en cas de stress. L’essai d’efficacité vise à identifier la formulation qui, en prolongeant la diffusion de MHUSA, améliorerait aussi les paramètres sélectionnés.
Bénéfices attendus
Les pratiques d’élevage du poulet de chair sont souvent source de stress et peur; cela peut compromettre le bien-être animal ainsi que la qualité de la production. Du fait des conditions de détention basée sur le confinement en bâtiment et sur un grand nombre d’animaux pour une surface limitée, les oiseaux ont du mal à s’adapter à leur environnement; aussi, leurs besoins naturels sont peu respectés, avec des conséquences négatives sur l’état de santé et la croissance. En parallèle, les consommateurs sont de plus en plus sensibles aux questions de bien-être animal et demandeurs d’un produit de meilleure qualité sous un point de vue aussi éthique. L’utilisation d’un produit capable de réduire les effets négatifs du stress en élevage est de grand intérêt, donc, pour les animaux, pour les producteurs et pour les consommateurs. Pour ces propriétés, le produit à base de phéromone maternelle de la poule, ou MHUSA, est un outil visant à réduire le stress en élevage et améliorer le bien-être animal et la production des animaux. Cette expérience a pour objectif d’étudier les effets d’une nouvelle formulation vaporisée sur une bande de poussins de chair. Nous attendons que les animaux traités aient un meilleur développement et fonctionnement des organes députés à la défence immunitaire, un meilleur développement de la flore intestinale et ainsi un meilleur état général de santé, qui donnera finalement de meilleures performances en termes de production. On s’intéresse aussi à l’étude du comportement. L’utilise de MHUSA en élevage a été associé, par retours des éleveurs, à des animaux plus calmes et moins peureux lors du passage du personnel à travers le bâtiment. Il est attendu que MHUSA soit associé à une réduction de l’agressivité et de la peur. Le développement d’une nouvelle technologie étant sensée améliorer la formulation et prolonger la persistance du produit, on s’attend aussi à ce que l’une des deux formulations contenant la substance retard soit associée à de meilleurs résultats.
Procédures
Pour l’application du traitement qui se réalisera lors du test de rémanence ainsi que durant l’essai, l’opérateur utilisera un flacon vaporisateur. La durée d’application du traitement sera d’environ 5 minutes/groupe. Lors du test de rémanence il y aura 3 applications aux jours J0 - J15 - J21. Concernant l’essai, la première application du traitement sera réalisée chez le couvoir avant le transport. Chaque groupe des poussins sera ensuite traité de nouveau durant l’expérience selon une fréquence qui sera connue après le test de rémanence. Pour le test de rémanence, 5 animaux/groupe seront retirés de leur enclos aux jours J0 (2 points) – J5 – J10 – J15 – J18 – J21 – J26 – J31 – J33 – J36 – J39 – J42 ; les animaux seront mis à mort pour récupérer les duvets ou plumes pour les analyses. Pour l’essai, 10 animaux/groupe seront retirés de leur enclos aux jours J0 – J2 – J6 – J12 – J18 – J24 – J30 – J42 ; les animaux seront anesthésiés pour la réalisation d’une prise de sang, pesés, et mis à mort pour le prélèvement d’organes devant être analysés. Aussi, des observations comportementales seront réalisées à travers l’enregistrement de vidéos réalisés à J1 – J14 – J27 – J40. Chaque vidéo durera environ 30 minutes; durant la vidéo, une personne marchera dans l’enclos pendant 30 secondes pour évaluer la peur des animaux à l’homme (test d’évitement).
Impact sur les animaux
Les conditions de détention tendant à simuler celles de l’élevage commercial peuvent être une source de nuisance, en particulier le nombre élevé d’animaux confinés dans des enclos. Le traitement lui-même n’est pas sensé créer d’effet indésirable sur les poussins, bien que cela soit surveillé tout au long de l'étude. La rentrée du personnel dans l’enclos pour l’enlèvement des animaux et leur transfert en salle de test pourrait engendrer une peur chez les animaux prélevés et restants. L’anesthésie pourraient être source de peur et représenter une nuisance. Concernant les observations comportementales, l’entrée de l’opérateur pour poser les cameras ou pour réaliser le test d’évitement pourrait engendrer de la peur et du stress chez les animaux.
Devenir
Pour le test de rémanence, 5 individus/groupe sont mis à mort à 13 moments pour la récupération et l’analyse des duvets et plumes. Pour l’essai d’efficacité, 10 animaux/groupe seront mis à mort à 8 moments pour réaliser les prélèvements d’organes à étudier. Le surplus de poulets restants à la fin des expériences sera mis à mort par le vétérinaire en charge des animaux. Les animaux ne pourront pas être gardés en vie, ni réutilisés dans d’autres projets car la souche Ross 308 n’est pas compatible avec une vie plus longue. En fait, ces poulets ont été sélectionnés pour atteindre le poids d’abattage en un laps de temps très court, les filets deviennent très gros et les pattes ne pourraient plus soutenir leur poids. Les animaux n’arriveraient plus à se tenir debout et à rejoindre leur mangeoire.
Remplacement
Il s’agit d’une étude qui nécessite l’implication d’êtres vivants, dans ce cas des poulets, pour étudier les effets du traitement appliqué sur les paramètres de stress et de bien-être, y compris le comportement. Il n’est pas envisageable donc de remplacer les animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux impliqué dans le projet a été déterminé par une approche statistique et il a été réduit en veillant toutefois à travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les différents groupes pour les comparaisons. Pour le test de rémanence, 5 individus/groupe mis à mort à chaque point de prélèvement sont considérés suffisant pour juger chimiquement de la présence d’une substance, cela aussi sur la base s’une variabilité interindividuelle considérée très faible. 13 moments de prélèvements seront nécessaires pour réaliser la courbe de rémanence. Pour l’essai d’efficacité, 10 individus/groupe/temps est jugé suffisant pour montrer une différence significative pour chaque paramètre à l’étude. Un surplus d’animaux est prévu pour les deux procédures pour maintenir une densité d’animaux souhaitée et balancer une éventuelle mortalité. Compte tenu que la haute densité d’animaux est parmi les facteurs stressants pour les poulets de chair, il est important de la respecter pour pouvoir observer les effets du traitement sur le stress.
Raffinement
L’hébergement suivra les recommandations législatives concernant les poulets destinés à la production de viande. La densité animale ne dépassera pas les 33kg/m². Le calcul tiendra compte du poids final des poulets et la réduction des effectifs. Les enclos seront aménagés pour répondre aux besoins de l’espèce. Une litière fournira un lieu de couchage confortable, une protection des pattes et permettra aux comportements naturels (gratter, picorer le sol) de s’exprimer. Des éléments d’enrichissement seront utilisés, par exemple : ballots de paille, des blocs à piquer, balles de fourrage. La nourriture et l’eau seront en libre accès. Les paramètres d’ambiance tels que la température, luminosité, ventilation et humidité seront adaptés et monitorés. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement : à chaque fois que l’opérateur rentrera dans l’enclos il devra observer des animaux qui mangent, qui boivent, qui se reposent, qui jouent, qui vocalisent ; les animaux ne devraient jamais être amassés. Le vétérinaire réfèrent sera contacté en cas de problème. L’application du traitement sera réalisée dans le calme. Les mises à mort et les prélèvements seront réalisés par le même vétérinaire et par le même personnel expérimenté. Une attention toute particulière est portée à la diminution des contraintes exercées aux animaux, les procédures seront en fait réalisées entièrement sous anesthésie pour une partie, et après la mise à mort pour une autre partie.
Choix des espèces
Le projet vise à étudier l'effet de différentes formulations de la phéromone maternelle de la poule. Cette étude sera réalisée sur des poulets de chair de la souche ROSS 308. Ce poulet est la variété la plus répandue de poulet de chair et caractérisée par une croissance très rapide. Il est en effet sélectionné pour atteindre son poids d'abattage en 42 jours. Les conditions d’élevage utilisées pour atteindre cet objectif exposent les animaux à divers facteurs de stress qui peuvent impacter négativement leur bien-être ainsi que la qualité de la production. Pour cela, l’étude sur les effets de la phéromone est de grand intérêt dans l’optique de fournir aux éleveurs un outil pour limiter les effets négatifs du stress chez les animaux, améliorer leur bien-être ainsi que la production. Les animaux impliqués dans le test de rémanence et dans l’essai seront des poussins Ross 308 de l’âge de 1 jour. Le but scientifique est en effet d’étudier les effets du traitement sur une bande de poussins Ross durant un cycle entier d’élevage, c’est-à-dire 42 jours.
Evaluation du risque chimique d’éléments métalliques libérés dans l’eau par des protections anti-corrosion chez un poisson.
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
2 844 médakas marins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère. Les poissons sont exposés pendant six mois à l'aluminium et aux métaux relâchés par des protections anti-corrosion, par l'eau et par la nourriture, avec des anesthésies répétées pour biométrie et des tests comportementaux, avant d'être tués pour analyse. Le porteur indique tester volontairement de fortes concentrations pour établir une dose-réponse, ce qui peut provoquer désorientation, noircissement de la peau et mortalité. Il affirme qu'aucune alternative non-animale ne permet d'étudier croissance, reproduction et comportement chez ces poissons.
Objectifs
Les protections anti-corrosion telles que les anodes sacrificielles sont utilisées pour réduire la dégradation des structures métalliques immergées dans l’eau de mer. Leur mise en place est amenée à augmenter avec le développement de parcs éoliens offshore. Cependant, ces méthodes conduisent à la libération d’une grande quantité d’éléments chimiques dans l’environnement marin dont l’effet nocif potentiel encore mal évalué préoccupe les autorités environnementales et la société civile. En effet, l’accumulation de métaux peut s’avérer toxique pour les organismes aquatiques et leur toxicité à long-terme est encore mal connue chez les poissons marins, notamment en mélange (« effet cocktail »). L’objectif de ce projet est donc d’étudier la toxicité de ces éléments chez le médaka marin (Oryzias melastigma) en considérant survie, croissance, effort reproducteur et comportement (neurotoxicité). Le projet sera divisé en deux procédures qui permettront d'évaluer la toxicité des éléments étudiés par balnéation (procédure 1) et par transfert trophique c’est-à-dire à travers la nourriture (procédure 2), représentant les deux voies de contamination subies par les poissons dans leur environnement.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de raffiner l’analyse du risque chimique causé par l’aluminium ainsi que de celui causé par les protections cathodiques telles que les anodes galvaniques en milieu marin. Ainsi, ils permettront de calculer des valeurs de toxicité prenant en compte plusieurs aspects de la physiologie animale (survie, croissance, reproduction, comportement) non disponibles à ce jour. Ces résultats chiffrés permettront de fournir des valeurs seuil de concentrations en aluminium à ne pas dépasser dans l’environnement et serviront 1) d’indicateurs de santé de l’environnement étudié et 2) de valeurs de référence sur lesquelles s’appuyer pour le déploiement raisonné et sécuritaire de protections cathodiques en milieu marin. Les résultats seront également communiqués aux parties prenantes (public, industriels, professionnels à activité maritime) afin d’informer sur la toxicité ou l’absence de toxicité liée à la présence de ces protections dans l’environnement, et donc renseigner sur la pertinence de leur utilisation pour la protection des systèmes de production d'énergie renouvelable offshores.
Procédures
Durant le projet, les individus seront chacun soumis à un maximum de cinq anesthésies pour biométrie (mesures taille et poids). L’ensemble de l’intervention ne dure pas plus que 5 min par poisson (transfert en quelques secondes dans le bac d’anesthésie, biométrie ~1 min) puis transfert en bac de réveil où le poisson est laissé pendant quelques min pour récupérer. Chaque individu est également soumis à 4 tests comportementaux non-invasifs (comme décrits en section 4.2 – procédure 1), à raison d’un test quotidien sauf en jour 1 où un test en groupe puis un test en individuel s’enchaînent pour une durée totale de 14 min de test) avec une période de repos total de 24 h pendant laquelle le poisson est nourri et placé dans un bac individuel en contact visuel proche avec ses congénères. Ci-dessous est présenté le détail des durées des différents tests : - Test 1 (en groupe) (jour 1): 5 minutes - Test 1 (individuel) (jour 1) : 9 minutes - Test 2 (individuel) (jour 2) : 7 minutes - Test 3 (individuel) (jour 3) : 42 minutes - Test 4 (individuel) (jour 4, 5) : divisé en 3 “sessions”, chacune d’une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Des études précédentes ont montré l’absence de toxicité aiguë, i.e. effectuées sur des stades embryo-larvaires et de courte durée, de l’aluminium chez les poissons marins. Dans le cadre de ce projet, les poissons seront exposés sur une durée plus longue impliquant les stades juvéniles et adultes afin de pouvoir étudier les effets des métaux sur des fonctions physiologiques intégratives telles que la reproduction et la croissance des poissons marins. Des expositions chroniques sur poissons à ces composés n’ayant jamais été réalisées, l'apparition d'effets léthaux au cours des 6 mois d'exposition est donc pour l’heure inconnue. Il est cependant possible d’observer des effets subléthaux et léthaux (e.g. baisse de croissance, désorientation, noircissement de la peau) durant la période d’exposition, résultats qui viendront nourrir les données du projet. En effet, dans la mesure où les résultats de ce projet servent à une analyse de risque chimique, celui-ci doit inclure des concentrations fortes (conditions très défavorables) afin de pouvoir en tirer une dose-réponse valide (càd. avoir une gamme comprenant au moins une forte concentration où un effet toxique est observé, et au moins une faible concentration où aucun effet toxique n’est visible).
Devenir
En fin de projet, les animaux seront prélevés après euthanasie pour l’analyse moléculaire et histologique des organes.
Remplacement
Le projet dans lequel s’inscrit ce travail a été financé afin d’étudier les effets à long-terme de l’aluminium et des éléments relargués par les protections anti-corrosion sur la croissance et les aptitudes de reproduction et comportementales des poissons. Il n’existe à ce jour aucune alternative non-animale valide pour l’étude des fonctions physiologiques intégratives que sont la croissance, la reproduction, et le comportement chez les téléostéens spécifiquement. Cependant, nous avons mené des expériences préliminaires sur des stades hors-champ expérimentation animale (eleuthéroembryons) afin de faire une première évaluation de la toxicité des produits chimiques étudiés sur notre modèle, le médaka marin (ligne directrice OCDE 212). Il s’est avéré que les résultats étaient concordants avec ceux obtenus dans la littérature, soit aucun effet léthal ou subléthal (malformations, taux d’éclosion) observé même aux concentrations les plus fortes testées.
Réduction
Les effectifs ont été estimés à partir d’une analyse de puissance statistique afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé dans le projet tout en conservant un effectif suffisant pour avoir des résultats fiables. Cela nous a permis d'arriver à un nombre de poissons de 50 individus / sexe / condition testée pour la procédure 1, et 81 individus / sexe / condition testée pour la procédure 2. A ces valeurs s'ajoute un coefficient de 20% de risque de perte (mortalité naturelle), ce qui nous amène à utiliser 60 individus / sexe / condition pour la procédure 1 et 97 individus / sexe / condition testée pour la procédure 2. D’une façon générale, un soin a été apporté afin d’utiliser les mêmes individus pour les différentes analyses.
Raffinement
Les individus, élevés en groupe dans des structures adaptées à l’espèce, sont observés trois fois par jour lors du nourrissage, ainsi l’atteinte d’un des points limites fixés (mélanisation, infection, nage altérée) est identifié de manière précoce. Le poisson est ensuite immédiatement isolé en bac individuel. Si son état ne s’améliore pas dans un délai de 24 h, l’individu est euthanasié à l’aide d’une surdose d’anesthésiant par balnéation. Pendant les expériences menées pour l’étude des aptitudes comportementales, les individus sont gardés en bacs individuels pendant 5 jours afin de pouvoir conserver leur identité. L'individualisation des poissons lors des expériences de comportement est maîtrisée et a déjà été mis en place au laboratoire dans le cadre d’un autre projet. Le stress qui pourrait être provoqué par l’isolement est réduit par la mise en place d’un contact visuel de proximité entre les poissons. Enfin, lors des mesures de taille et poids, les poissons sont maintenus en groupe jusqu’à l’anesthésie et manipulés seulement sous anesthésie. Le poisson ne reste pas plus de 1 min hors de l’eau avant d’être transféré en bac de réveil.
Choix des espèces
Le médaka est caractérisé par une reproduction non-saisonnière en laboratoire, une bonne fécondité et par des cycles de vie courts (3-4 mois) qui permettent d’aborder aisément les questions des effets à long-terme impliquant des expositions à l’ensemble des stades de vie. Dans ce projet, il est utilisé comme un poisson modèle pour les poissons vivant en eau de mer.
Etude du rôle du toucher affectif dans les troubles autistiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
674 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une mutation liée à l'autisme, elles reçoivent des injections quotidiennes, une partie subissant en plus l'implantation d'une puce, puis sont suivies dans des tests comportementaux nommés, suivi automatisé en cage, test de sociabilité à trois chambres et caresses au pinceau sous enregistrement cardiaque. Le porteur indique que la chirurgie d'implant peut provoquer stress et gêne durant une semaine. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou mathématique ne reproduit la dimension émotionnelle du toucher, et que la souris ne peut être remplacée, les retombées pour les personnes autistes restant lointaines.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en évidence l’importance du toucher affectif et social dans les troubles du spectre autistique et son rôle potentiel en tant que thérapie dans ce genre de trouble neurodéveloppementaux
Bénéfices attendus
Ce projet permettre de mettre en évidence l’effet du toucher dans le neurodéveloppement et son rôle dans les troubles neurodéveloppement tel que les troubles du syndrome autistique (TSA). Si l’hypothèse de vase est validée, cela permettra à court terme de réduire les déficits des animaux atteint de ce syndrome par nos différentes approches. A long terme ce projet permettra de proposer des interventions sur les patients autistiques basé sur le toucher affectif ou une approche pharmacologique afin de réduire les déficits liés au TSA.
Procédures
544 animaux recevront des injections intrapéritonéales quotidienne pendant 7à 10 jours sous anesthésie gazeuse (5 minutes) pour limiter la souffrance et le stress des animaux. 302 animaux subirons en plus une petite chirurgie unique (5 minutes) sous anesthésie gazeuse pour implanter des puces d'identification radio (puce RFID) en sous-cutanés à l'aide d'un trocart. Ces animaux seront ensuite testé dans le système du live mouse tracker (ou LMT) et dans le test d'interaction social sans aucune intervention autre que le déplacement de l'animal dans la cage du LMT (enregistrements uniques de 120h) et du test de sociabilité à trois chambres de (enregistrement uniques de 30 minutes). Le système du Live mouse tracker (LMT) a été spécialement conçu pour permettre le suivi, l'identification et la caractérisation automatiques en direct par étiquetage comportemental d'un maximum de quatre souris dans un environnement enrichi standardisé, sans limite de temps avec de la nourriture et de l’eau ad libidum. Le système est constitué d'une cage de 50x50cm reposant sur un plancher contenant 16 antennes radios RFID et une camera infrarouge sur le dessus. La cage contient de la litière, deux biberons d'eau, une mangeoire contenant des croquettes à volonté, divers enrichissements (coton, papier, carton) et une maison en plexiglas rouge. Le LMT permet d’accumuler de grandes bases de données de façon non biaisé sur le comportement social des animaux avec une granulométrie beaucoup plus grande que les tests classique sans avoir à manipuler les animaux. Le test de sociabilité quand à lui est constitué deux trois arènes de 40cm² connectées par des portes que l'animal test peut explorer librement. dans deux de ces compartiments se situe soit une autre souris, soit un objet. Le déplacement de la souris et suivie grâce à une camera et le temps d'interaction avec la souris ou avec l'objet est calculé. Les animaux sont vigil durant ces tests. 268 animaux, tous vigiles, seront placés dans le système ECgenie deux fois au cours de leur vie (p15 et p80) pendant que l'expérimentateur appliquera sur le dos à l’aide d’un pinceau en poil de martre souple une caresse à une vitesse de 3 cm/s pendant 10 minutes. Le système ECG génie est un système d'enregistrement du rythme cardiaque non-invasif. l'enregistrement est réalisé lorsque l'animal pose ses pattes sur deux électrodes posées au sol. Il ne nécessite aucune contention et les animaux sont donc libres de leur mouvement dans le système.
Impact sur les animaux
Ce projet se base sur l’utilisation d’un modèle murin génétique de trouble du spectre autistique couramment utilisé en recherche sur l'autisme. La souris posedant une mutation humaine relié au TSA (Shank3ΔC) présente une anxiété accrue, des troubles de reconnaissance sociales ainsi que des comportements compulsifs. Les chirurgies nécessaires à ce projet pour poser les implants nous permettant de suivre les animaux dans le live mouse tracker est une petite chirurgie similaire à celle utilisée pour identifier des animaux avec des puces radio. Dans ce cas, nous prévoyons que des effets indésirables liés à cette chirurgie (stress et gêne) peuvent durer 1 semaine.
Devenir
La plupart des animaux utilisés étants génétiquement modifiés et/ou infectés par des virus génétiquement modifiés eux aussi, il nous est impossible de replacer ou de faire adopter ces animaux. Ils seront donc mit à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
La perception du toucher est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul, en particulier sa dimension émotionnelle. Il n’existe pas de modèles in-vitro ou de modèles mathématiques permettant de modéliser la représentation du toucher pouvant mimer une émotion, en dehors des animaux de laboratoire. De plus, la variété des techniques de modifications génétiques chez la souris permet d'identifier et de cibler spécifiquement des mécanismes moléculaires ou cellulaires à un niveau où l’expérimentation humaine n’atteint pas ce niveau de résolution. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Chez l’homme, la dimension émotionnelle du toucher est un paramètre confondant, qui rend difficile la constitution de petites cohortes homogènes. À l’inverse, les modèles animaux sont homogènes et fournissent des résultats reproductibles. Ceci permet d'établir avec précision le nombre d'animaux nécessaire à la validation des hypothèses de travail par des tests de puissance statistique. Nous exploitons au mieux nos enlevages, puisque nous étudions mâles et femelles, et que nous étudions la majorité des génotypes produits. De plus, le test de LMT (qui est un des tests comportementaux principalement utiliser dans ce projet) est un test où aucune intervention extérieure n’est nécessaire et permet de grandement enrichir la cage des animaux, réduisant leur niveau de stress tout en garantissant l’enregistrement d’une grande quantité de donnée. Cela permet aussi de faire des tests comportementaux conventionnels sur ces animaux, réduisant le nombre d’animaux total utilisés. Ce projet propose d’utiliser plusieurs approches afin d’achever le même objectif, mais dès les premiers résultats prémilitaires obtenus, il sera possible de juger laquelle de ces approches est la plus efficace et donc de réduire le nombre de procédures qu’au modèle le plus efficace (viral contre génétique par exemple).
Raffinement
Nos procédures requièrent que tous nos animaux soient suivis dès leur naissance. Ceci permettra de s’assurer du bien-être des animaux tout au long de leur vie en suivant certains paramètre définis par une fiche et grille de suivi clinique au minimum trois fois par semaine (en annexe). L'aspect extérieur (ex: piloérection, signes d’infection ou de plaie, paralysies, forme et orientation des yeux, oreilles et moustaches), le comportement (ex: activité, vocalisation spontanée, prostration) et le poids (perte de plus de 20 % du poids) sont particulièrement suivis. Ce suivi tout a long de la vie par les expérimentateurs permettra aussi de réduire le stress des animaux qui y seront habitué. Cela augmentera aussi la qualité et la reproductibilité des résultats, et donc in fine le nombre d’animaux nécessaire. Tous les tests comportementaux présents dans cette saisine ne sont pas stressants ou anxiogènes et laissent une liberté d’action maximale aux animaux. Toutes les manipulations, pharmacologiques ou génétiques, ont pour but d’améliorer les symptômes du trouble autistique et donc d’améliorer les conditions de vie des animaux, et cela, très tôt après leurs naissances. De plus, le test de LMT (qui est un des tests comportementaux principalement utiliser dans ce projet) est un test où aucune intervention extérieure n’est nécessaire et permet de grandement enrichir la cage des animaux, réduisant leur niveau de stress tout en garantissant l’enregistrement d’une grande quantité de donnée. Toutes les douleurs opératoires et postopératoires seront prises en compte avec une prise en charge pharmacologique adaptée.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris, car c’est le modèle mammifère de référence pour la technique de modification génique. Le projet scientifique vise à utiliser la puissance de la génétique chez la souris pour étudier le rôle des gènes essentielles dans la perception et l’intégration sensorielle normale et pathologique dans un modèle d'autisme. Notre projet vise à moduler différentes voies neuronales durant les étapes précoces du développement neuronal qui ont lieu entre la naissance et l'adolescence pour en observer les conséquences à l'état adulte. Par conséquent nous manipulerons les animaux dès la naissance et jusqu'à l'âge adulte.
Comprendre l’origine génétique de la mortinatalité associée à des modèles de trisomie 21.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à léger, certaines menées sans réveil. Des femelles gestantes porteuses de modèles de trisomie 21 sont tuées pour extraire leurs foetus, ceux prélevés à un stade précoce étant rendus inconscients par le froid puis immergés dans un fixateur, les autres euthanasiés chimiquement, afin d'analyser à quel stade survient la mortalité de ces lignées. Le porteur reconnaît que la sortie et l'isolement des foetus entraînent stress et angoisse, qu'il dit limiter à moins d'une heure. Il affirme que l'étude de ces gènes du développement ne peut se faire que sur un modèle animal.
Objectifs
Un des objectifs de notre laboratoire consiste à créer et à étudier de nouveaux modèles murins de trisomie 21 (T21)obtenus par ingénierie chromosomique, afin de mieux connaître les mécanismes de cette pathologie. C’est une maladie congénitale complexe, neuro-dégénérative, qui affecte le développement embryonnaire. Ce syndrome résulte de la présence en trois copies de tout ou partie (trisomie complète ou partielle) du chromosome 21 humain (HSA21). L’homologie entre le HSA21 et les chromosomes murins est maintenant bien définie et approximativement 99% des gènes murins possèdent un orthologue chez l’homme. Afin de mettre en évidence des gènes ayant un impact majeur dans le phénotype, et ainsi proposer de nouvelles voies thérapeutiques, nous avons créés différentes lignées de souris porteuses de trisomies partielles. En étudiant la transmission de la trisomie de ces différentes lignées, nous nous sommes rendus compte que le taux de transmission n’était pas celui attendu (uniquement 36% de trisomiques en moyenne dans la descendance) notamment pour une lignée porteuse d’une petite trisomie partielle correspondant à une région bien déterminée (alors qu’il devrait être de 50%). Il semblerait donc que cette région dites "critique" soit responsable d’une léthalité in utéro ou post naissances. Afin de mieux caractériser ce phénomène de mortinatalité, nous voulons étudier la viabilité des souris de 4 lignées différentes : 1modèle correspondant à la plus petite région où apparait la léthalité et 3 autres modèles plus complets pour identifier d'éventuelles interactions génétiques.
Bénéfices attendus
Nous espérons pouvoir déterminer le stade de la léthalité observée dans différents modèles de souris de trisomies partielles ou complètes et faire une relation entre les phénotypes et les gènes de ces régions.
Procédures
Après mise à mort de la femelle gestante, les fœtus à E18.5 seront sortis des cornes utérines en incisant longitudinalement le muscle utérin. Après une observation macroscopique, ils seront ensuite euthanasiés par administration d’un euthanasiant chimique (contention de 10 secondes pour administrer l’euthanasiant). Les fœtus à E14.5 seront sortis des cornes utérines après mises à mort de la femelle gestante. Après une observation macroscopique sous loupe binoculaire, ils seront rendus inconscients par le froid (15 minutes). L'engourdissement par le froid entraine une perte de conscience car une stimulation de la pointe de la patte avec une pince n’entraine aucune réaction du foetus. Ensuite, les foetus seront euthanasiés par immersion dans le fixateur histologique.
Impact sur les animaux
La souffrance fœtale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour éviter que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort anticipée ou un jour avant la naissance.
Devenir
Les fœtus à E14.5 et à E18.5 sont euthanasiés pour les analyses histologiques ou biologie moléculaire.
Remplacement
Le modèle animal est le seul qui nous permet d’étudier dans son ensemble les effets des gènes d’intérêts sur les fonctions vitales ainsi que le développement. Le développement de maladies congénitales, dont on ne connait à priori pas la nature avant de les avoir observées ne peut pas être remplacée par une autre approche que l’expérimentation animale.
Réduction
Cette stratégie permet de réduire le nombre d’animaux utilisés car les stades sont choisis à des moments clés pour la survie et permettent d’éviter la dissection au hasard afin de déterminer le stade de létalité. Nous suivons aussi la gestation des femelles grâce à un examen échographique, et cela permet d’euthanasier uniquement les femelles dont nous avons besoin c’est-à-dire gestantes et pas des non gestantes (car à des stades embryonnaires précoces, la détermination de la gestation par palpation est sans garantie). Les nombres d’animaux sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique.
Raffinement
Tout est mis en œuvre pour le bien-être des animaux, la surveillance de l’état de santé et des actions appropriées sont réalisées à l’animalerie si nécessaires (soins, analgésie, …). Une attention particulière sera aussi appliquée lors du test de viabilité sur les fœtus qui ne dépassera jamais une heure. Ce test nécessite la sortie de fœtus de la mère et leur isolement, ce qui entraîne nécessairement un stress et une angoisse. Nous nous appliquerons à réduire ce stress au minimum en gardant les fœtus proches les uns des autres sur une plaque chauffante afin d’éviter une hypothermie et en limitant leur manipulation au stricte nécessaire.
Choix des espèces
De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal de la souris est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Le stade 18.5 jpc est choisi comme point de départ car c’est le stade qui précède la mise bas et les foetus normaux sont déjà viables pour le test d’adaptation à la vie extra-utérine. Le stade 14.5 jpc correspond à l’achèvement de l’organogenèse.
Rôle des hormones sexuelles femelles sur la régénération musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit des lavages vaginaux, une lésion musculaire provoquée par électrostimulation sous anesthésie, des mesures de force et des injections, avant d'être tué pour prélever l'utérus et le muscle. Le porteur indique que le cumul de ces actes induit un stress. Il reconnaît que la régénération musculaire peut être étudiée en partie in vitro, mais affirme que l'interaction entre cellules ne s'observe qu'in vivo.
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Il a été montré que ce processus est plus efficace chez les souris femelles par rapport aux souris mâles. Cette différence pourrait être liée, au moins en partie, aux variations d’un type d’hormones sexuelles femelles au cours du cycle ovarien. L’objectif de cette étude est d’évaluer le rôle des hormones sexuelles femelles dans un modèle standardisé de dommage musculaire induit par électrostimulation
Bénéfices attendus
Le projet vise à comprendre le rôle des hormones sexuelles femelles dans la réparation du tissu musculaire. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques affectant la production/disponibilité des hormones sexuelles femelles (ménopause, cancer…).
Procédures
Les souris sont soumises à des lavages vaginaux (2 au maximum, durée 1 minute maximum), un protocole d’électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 10-15 minutes), une mesure de force musculaire (5 au maximum, anesthésie générale de 5-10 minutes) et des injections intrapéritonéales (2 au maximum)
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables légers sont attendus du fait d’un cumul d’actes (lavages vaginaux, injections, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer l’utérus et le tissu musculaire pour des analyses histologiques
Remplacement
Des travaux ont déjà démontré in vitro le rôle des hormones sexuelles femelles sur la prolifération des cellules souches musculaires. Aussi, bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. La réalisation complète du projet est conditionnée à la mise en évidence des effets des hormones sexuelles femelles lors d’une première phase expérimentale.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle de dommage musculaire et de lavages vaginaux montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques. Un lavage vaginal est effectué ce qui permet d’éviter la réalisation d’un prélèvement intravaginal (frottis)
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Le projet porte sur le rôle des hormones sexuelles dans la régénération musculaire. Des souris adultes, âgées de 8-12 semaines, sont donc utilisées afin que la production de ces hormones soit fonctionnelle.
Etudes de toxicologie, tolérance locale, pharmacocinétique et pharmacologie chez le miniporc
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 110 miniporcs vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à modéré, la plupart tués à l'issue, 160 réutilisés et 40 adoptés. Chaque animal reçoit un produit à tester par administration unique ou répétée, avec pose de cathéters ou d'implants et prélèvements sanguins, avant l'analyse de ses organes, pour des études de toxicologie exigées par la réglementation avant les essais cliniques. Le porteur indique que ces actes peuvent provoquer douleur post-opératoire, perte de poids, léthargie et inflammation locale. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative pour déterminer la toxicité d'une substance après exposition systémique et qu'il faut accéder à l'animal "dans son entièreté".
Objectifs
La réalisation d’études de toxicologie générale, toxicologie de la reproduction, toxicologie juvenile, tolérance locale, de pharmacologie de sécurité est une obligation réglementaire avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (dispositif médical, médicament vétérinaire, produit chimique). Ces études sont réalisées selon les guidelines ICH, EMA, OCDE, US FDA ou toute autre guideline applicable. Préalablement aux études réglementaires, la réalisation d’études de pharmacocinétique / pharmacodynamique, pharmacologie d’efficacité, dose maximale tolérée et étude de recherche de doses est un prérequis nécessaire afin de collecter des données d’exposition, de toxicité et de pharmacologie sur le produit et de choisir ou ajuster de manière raisonnée les doses et le design des études réglementaires.
Bénéfices attendus
Les études de toxicologie par administration unique ou répétée sont réglementairement requises par les lignes directrices Européennes et Internationales et représentent une etape essentielle avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain (sur des volontaires sains en court terme et sur les patients dans le moyen et long terme), ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (dispositifs médicaux, médicament vétérinaire, produit chimique ). Pour les médicaments humains et vétérinaires et dispositifs médicaux, ces études sont des pré-requis indispensables aux essais cliniques. Ils visent à définir le profil de toxicité ou de tolerabilité des produits à tester et donc rendre les essais cliniques plus sures pour les patients ou volontaires participant à l'essai. Ils permettent aussi de définir le niveau de dose (marge de sécurité) pour la première administration à l’homme ou l’animal. Ces études incluent des évaluations toxicocinétiques pour déterminer les taux d’exposition entrainant une toxicité. En ce qui concerne les produits chimiques ce projet permettra d’evaluer la sécurité des molecules chimiques dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal comme demandé par la loi et par les lignes directrices européennes. Ce projet permettra donc d’avancer dans le développement des solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques innovantes pour le traitement de certaines maladies chez l’homme, les animaux ou les plantes et de contribuer à l’evaluation de la sécurité des produits chimiques.
Procédures
Ces études consistent en administration unique ou répétée du produit à tester. La fréquence de ces administrations varie en fonction du produit (par exemple 1 fois par jour, 1 fois par semaine). La durée des administrations est généralement rapide quelques secondes à quelques minutes, pour les administrations orales, souscutanée ou intraveneuse en bolus. Elles peuvent parfois être plus longue pour les perfusions (de plusieurs minutes à continue). Les administrations sont suivies d’observations régulières des animaux (plusieurs fois par jours), pesées corporelles (généralement de 1 fois par jour à 1 fois par semaine), évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires (généralement 1 à 4 fois par étude), sur le développement neurocomportemental, squelettique et des fonctions reproductives, évaluation des fonctions respiratoires et cardiovasculaires et analyse macroscopique ou histopathologique. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les autres techniques ou procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec le cas échéant un protocole d’analgésie adapté. Le nombre et la durée des interventions sont adaptés en fonction de l'utilisation clinique, de la durée d'étude, de la cinétique d'exposition, des effets attendus et sont définis dans le plan d'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration, de prélèvement de sang ou de pose de cathéter - Douleur légère à modérée en post-opératoire (quelques jours) pour la pose des cathéters ou d’implants de capteurs collectant des données physiologiques (par exemple pression artérielle, ventriculaire, pleurale, ECG, EMG ou autres) - Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration des médicaments ou produits chimiques à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Des points limites précoces adaptés sont mis en place selon la typologie d’etude et la classe du produit à tester afin d’eviter une prolongation inutile des effets observés. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures sont rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie)
Devenir
En accord avec le plan d’étude utilisé les animaux pourrons être 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques, microscopiques et/ou squelettiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles ; 2) gardés en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies ; 3) replacés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude, conditionnée par un examen vétérinaire favorable.
Remplacement
Pour ce qui est du remplacement, il n’existe pas actuellement d’alternatives à l’expérimentation animale qui permettent de déterminer la toxicité de substances suite à une exposition systémique. L'utilisation du mini-porc répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Dans ces études, un relevé des signes cliniques et des paramètres sanguins des animaux est requis, il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, il est impossible de le remplacer par des méthodes alternatives pour évaluer les effets du produit.
Réduction
Le nombre d’animaux pour les études réglementaires est défini dans les guidelines internationaux applicables (Guidelines ICH, …) et adapté en fonction du nombre de doses testées, du nombre de produit testés et de la présence ou non d’une période de réversibilité. Pour les études préliminaires, le nombre d’animaux par lot est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des objectifs de l’étude, du nombre de doses testées et du nombre de produits et est précisé dans le plan d’étude.
Raffinement
Pour améliorer leur bien-être, les miniporcs males et femelles seront hébergés en groupes sociaux sauf incompatibilité avec la procédure expérimentale ou incompatibilité comportementale. Les miniporcs seront hébergés sur litière (copeaux de bois) dans un box avec un panier et un jouet (chaine métallique,…). Un enrichissement alimentaire est distribué quotidiennement aux miniporcs et réparti dans la litière permettant aux animaux de fourrager. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les actes pouvant engendrer du stress ou de l’inconfort seront réduits au minimum nécessaire (nombre et durée) et seront réalisés sous anesthésie avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption des administrations, réduction de la dose testée par exemple). Les autres techniques ou procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec le cas échéant un protocole d’analgésie adapté.
Choix des espèces
Il s’agit d’une justification réglementaire. En effet, le mini-porc est une espèce non-rongeur acceptée par les agences réglementaires. Le choix de cette espèce répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Il est fait en fonction de critères scientifiques précis, des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques disponibles et en fonction des analogies entre l’homme et l’animal. De la naissance à adulte mature. En fonction du type d’étude et de la population ou des animaux cibles du produit, nous choisirons l’âge le plus adéquat. Ce choix et la justification sont détaillés dans le plan d’étude.
Travaux pratiques en Neurobiologie en troisième année de Licence : étude de l’effet d’une douleur chronique sur la neurogenèse hippocampique adulte chez le rat.
- Enseignement supérieur
40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit dans la cheville une injection d'adjuvant de Freund qui déclenche une douleur inflammatoire chronique de six à huit semaines, avec boiterie et hypersensibilité, avant d'être tué au vingt et unième jour pour prélever son cerveau. Cette douleur chronique est provoquée non pour produire des connaissances mais pour fournir à des étudiants de licence un modèle sur lequel s'exercer à une technique d'immunohistochimie, durant deux jours de travaux pratiques. Le porteur suit les animaux par pesée quotidienne et mesure des articulations, et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne remplace ce protocole, la douleur chronique impliquant selon lui de nombreuses régions du système nerveux.
Objectifs
Le projet concerne la production d’un modèle de douleur chronique inflammatoire qui sera utilisé par des étudiants en 3ème année de Licence ayant choisi de suivre le parcours « Neurosciences » lors d’une séance de 2 jours de travaux pratiques. Les étudiants ne sont pas chargés de la mise en œuvre du modèle animal en raison des impératifs de formation réglementaire. Sur les cerveaux de rats, ils évalueront l’impact d’une douleur chronique inflammatoire sur la neurogenèse adulte hippocampique (gyrus denté). Les étudiants seront formés à la technique d’immunohistochimie : coupe de cerveaux, révélation immunohistochimique, quantification de la neurogenèse. La technique d’immunohistochimie est largement utilisée en laboratoire de Neurosciences permettant de localiser des protéines à l’aide d’anticorps spécifiques. L’objectif est de leur permettre d’acquérir une connaissance pratique complémentaire de la connaissance théorique qu’ils ont en cours magistral (la neurogenèse, la douleur, les techniques expérimentales) et la conduite d’une technique d’expérimentation (révélation immunohistochimique) dans des conditions réglementaires de sécurité. Les données collectées chez l’animal durant ce TP seront remises en perspective par rapport aux données humaines existantes.
Bénéfices attendus
Ce modèle de douleur chronique inflammatoire induit une diminution de la neurogenèse hippocampique adulte. Ce projet permettra au étudiants d’acquérir une connaissance pratique complémentaire de la connaissance théorique qu’ils ont en cours magistral (la neurogenèse, la douleur, les techniques expérimentales) et la conduite d’une technique d’expérimentation (révélation immunohistochimique) dans des conditions réglementaires de sécurité.
Procédures
Les animaux modèles subiront une injection unique d’adjuvant de Freund complet (50µl) dans l’articulation de la cheville de la patte postérieure droite. L’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane (après un pré-traitement antalgique) et durera environ 5 minutes. Ils seront ensuite laissés 20 jours en stabulation , manipulés uniquement pour le suivi de l’inflammation et de leur état général, afin que la douleur chronique inflammatoire se développe. Le 20eme jour, ils subiront deux injections intrapéritonéale du marqueur de neurogenèse espacées de 2 heures. Les injections sont réalisées sur animal éveillé et sont très rapides (1 minute de contention au maximum). Le 21eme jours, l’ensemble des animaux (modèles et contrôles) sera anesthésié puis euthanasié par une méthode réglementaire et le cerveau sera ensuite prélevé (45 minutes).
Impact sur les animaux
Suite à l’injection de l’Adjuvant Complet de Freund dans l’articulation de la cheville, les animaux développeront une douleur chronique inflammatoire. Le lendemain de l’injection, une réaction immunitaire va se développer, strictement localisée à la patte injectée. Cette réaction va s’accompagner d’une inflammation de la cheville, d’un gonflement et d’une rougeur modérés et d’une hypersensibilité qui dure de 6 à 8 semaines et qui débute le lendemain de l’injection. Durant la période de douleur chronique, la mobilité des animaux est légèrement diminuée (apparition d’une boiterie) mais pas de façon significative. Ceci entraine une tendance à la diminution du comportement exploratoire mais sans significativité. La mise en position debout est diminuée mais pas abolie, l’animal portant son poids sur la patte non inflammée. Le comportement de toilettage n’est pas modifié.
Devenir
L’euthanasie utilisée en fin de procédure pour l’ensemble des animaux est nécessaire 1/ pour pouvoir réaliser des coupes fines (50µm) d’hippocampe qui nécessitent un cerveau fixé et 2/ pour retirer l’ensemble des globules rouges du cerveau afin de réaliser la révélation immunohistochimique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de développer une douleur chronique car une douleur aiguë n’induit pas de modulation de la neurogenèse hippocampique adulte. Il est nécessaire de réaliser ce modèle in-vivo car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.
Réduction
Les étudiants travailleront en binôme. 1 membre du binôme traitera le cerceau contrôle et l’autre membre traitera le cerveau modèle de douleur chronique (coupe et révélation immunohistochimique). Ils pourront ainsi comparer la quantification des cellules neo-formées entre les rats controles et modèles, à l’intérieur du binôme et entre les différents binômes. Chaque étudiants prélèvera 4 coupes frontales d’hippocampe de rat, à différents niveaux de l'hippocampe. De ce fait, au vu de la sélection d’étudiants pour ces unité d’enseignement, 1 cerveau contrôle et 1 cerveau modèle sont suffisants par groupe. Ils présenteront les résultats sous forme d’un mini article scientifique. Les résultats seront regroupés afin qu’ils puissent réaliser des analyses statistiques, mettre en forme et discuter les résultats obtenus. Sur 5 ans, 40 animaux maximum seront utilisés.
Raffinement
Durant toute leur période de présence à l’animalerie, l’état général des animaux sera très attentivement suivi. Les animaux seront observés et pesés quotidiennement. Le poids de référence de l’animal sera celui à J0. Une signalétique adaptée (étiquette de suivi post-opératoire) sera placée sur les cages. Un suivi particulier sera fait pour les animaux modèles de douleur inflammatoire chronique en s’attachant à leur état général et à l’aspect de la patte injectée. Ils feront l’objet de tests aux jours J0 (avant l’injection), J4, J8, J12, J16 et J20. Les tests incluront la mesure du diamètre des articulations (mesuré à l’aide d’un calibre à coulisse) et une évaluation clinique reposant sur l’évaluation de l’inflammation (points limites). Un soin particulier sera apporté à la limitation de toute souffrance non liée au modèle ainsi qu’à leur bien-être (enrichissement de l’environnement, paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation d’une semaine à la pièce de stabulation, litière souple). Des points limites précoces et spécifiques sont définis qui conduiront si nécessaire à l’interruption de l’expérimentation si les critères d’arrêt sont atteints. L’injection de l’agent inflammatoire se fera sous anesthésie générale avec un prétraitement antalgique. Pour l’acte terminal, les animaux recevront une injection d’antalgique suivi de l’injection du mélange anesthésique.
Choix des espèces
Ce projet pédagogique porte sur la modulation de la neurogenèse hippocampique chez le rat adulte. J’utiliserai donc des rats mâles Spague-Dawley âgés de 7 semaines, comme généralement utilisés par la communauté scientifique. Le choix du rat se justifie également au regard de la taille du cerveau et de l’hippocampe. L’étendue rostro-caudale de l’hippocampe est suffisante chez le rat pour que l’ensemble des étudiants d’un groupe puisse récupérer 4 coupes chez un seul animal (limitation du nombre d’animaux utilisé). Choix de la souche Sprague-Dawley : c’est un bon modèle car les animaux sont 1/naturellement peu stressés (le stress est un des meilleurs modulateurs de neurogenèse) et les marquages contrôles de la neurogenèse donnent d’excellents résultats reproductibles et 2/ répondent bien au développement de la douleur chronique inflammatoire garantissant une modulation de qualité de la neurogenèse.
Impact de l’obésité sur les vaisseaux lymphatiques dans les différents territoires adipeux et métaboliques.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Selon les groupes, elles reçoivent des injections, un gavage ou une application cutanée quotidiens, puis sont soumises ou non à un régime gras, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur indique qu'une dysfonction lymphatique intestinale peut provoquer un amaigrissement, surtout chez les nouveau-nés, et prévoit d'abandonner cette procédure le cas échéant. Il affirme qu'aucun système in vitro ne préserve l'intégrité des vaisseaux et présente le poisson zèbre comme un remplacement seulement partiel, faute d'un nombre suffisant de valves lymphatiques.
Objectifs
Le système lymphatique joue aussi un rôle important dans l’initiation de la réponse immunitaire en transportant les cellules immunes vers les ganglions lymphatiques. Or, une altération de ce réseau lymphatique induit des désordres au niveau métabolique (expansion du tissu adipeux, lipides inflammatoires) et inflammatoires (inflammation chronique des tissus). Par ailleurs, l'obésité est connue comme un facteur de risque à l'altération du système lymphatique. L’architecture du système lymphatique et sa fonction sont étroitement dépendantes du tissu dans lequel il se trouve. C’est pour cela, que ce projet vise à cibler le système lymphatique de manière tissu-spécifique. Nous souhaitons dans un premier temps, visualiser l’architecture du système lymphatique in vivo, et comprendre les modifications et l'adaptation des cellules endotheliales lymphatiques dans les modèles d'obésité. Dans un deuxième temps, nous souhaitons établir le rôle de nouveaux gènes impliqués dans le développement et/ou le maintien du système lymphatique dans des contextes physiologiques et pathologiques. Ces études nous permettront de déterminer in vivo les conséquences d’une altération de ce gène sur le système lymphatique et sur le tissu environnant.
Bénéfices attendus
Une altération du système lymphatique est connue pour engendrer une pathologie, le lymphœdème. Par ailleurs, cette maladie est aggravée par l'obésité. Or, les mécanismes moléculaires et cellulaires ne sont pas compris, et il n’existe à ce jour aucun traitement pour limiter une dysfonction lymphatique. Ces modèles permettront une approche intégrée permettant l’étude du système lymphatique et ses communications avec le microenvironnement. En combinant nos approches in vitro et in vivo, nous souhaitons déchiffrer finement les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu dans la communication des cellules endothéliales lymphatiques avec les cellules du microenvironnent (cellules de l'immunité, pre-adipocytes ou adipocytes...) dans les différents territoires adipeux et métaboliques (foie, intestin). Le but est d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques visant à restaurer la fonction lymphatique et/ou limiter les aspects inflammatoires et métaboliques, qui sont délétères dans des contextes pathologiques.
Procédures
selon les groupes d'animaux, les types d'interventions seront soit des injections intrapéritoneales (1 fois par jour pendant 4 jours) ou un gavage oral (1 fois par jour pendant 5 jours) ou une application locale sur la peau (1 fois par jour pendant 5 jours). Les animaux seront ensuite ou non mis sous régime alimentaire riche en lipides.
Impact sur les animaux
Une dysfonction importante du système lymphatique au niveau intestinal peut altérer la prise alimentaire des lipides au niveau intestinal entrainant un amaigrissement des animaux, notamment au niveau postnatal dans la procédure 1. Dans ce cas, nous abandonnerons la procedure 1 et nous retarderons l'invalidation du gène après le sevrage ou chez l'adulte. Les autres procédures ne devraient pas entrainer d'effet indésirables.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélévements d'organes/tissus à la fin du projet.
Remplacement
Nous étudions le système vasculaire et lymphatique dans plusieurs organes dont notamment la peau, le tissu adipeux, l'intestin et le foie. A ce jour, il n'existe pas de système 3D, d'organoïdes ou d'explants permettant de garder l'intégrité et la fonctionnalité des vaisseaux. Une des alternatives qui est envisagée pour des questions relatives au développement des vaisseaux est d'utiliser le modèle du zébrafish. Ce modèle est à l'étude afin de déterminer si ce modèle répond de manière identique à nos hypothèses nous permettant de transposer nos résultats de la souris vers le zébrafish. Cependant ce remplacement ne sera que partiel car le nombre de valves lymphatiques chez le zebrafish est tres limitant.
Réduction
Le modele d'obésité entraine une variabilité des résultats qui est aussi augmentée par la différence des sexes femelles/mâles. Nous avons donc compté n=12 pour avoir des résultats statistiques pour chaque groupe d'animaux c'est à dire pour chaque génotype (contrôle ou gene invalidé), par sexe, et par traitement (Normal diet/high fat diet). Cependant, certaines expérimentations nous demandent de regrouper le nombre de tissus pour faire l'analyse, notamment les analyses par Tri cellulaire ou single cells. Afin de minimiser le nombre d'animaux, plusieurs organes seront prélevés pour chaque experimentation.
Raffinement
Critères d'arrêt par rapport à la souffrance: dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessus, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux seront observés par le chercheur ou les personnels de l’animalerie tous les jours pendant 1 semaine puis 3 fois par semaine pendant le reste de l’expérimentation. Ce suivi aura pour but de détecter la douleur (signes tels que le dos encourbé, poils hérissés, isolement...), détecter la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer selon une grille de lecture par score. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, l'animal sera anesthésié par anesthésie chimique (mélange kétamine/xylazine 150 mg/kg et 10 mg/kg respectivement) et après perte de conscience, les animaux seront euthanasiés. Une observation quotidienne sera réalisée pendant la durée du projet. Dans nos connaissances actuelles, les procédures ne doivent pas changer le comportement des animaux et leur bien-être, même si les animaux sont gardés jusqu’à l’âge adulte.
Choix des espèces
L'étude des souris génétiquement modifiées est largement répandue et partagée dans la communauté scientifique internationale ce qui est un avantage en termes de transmission et de validité de nos résultats. Nous avons choisi les stades de développement au niveau postnatal et adulte afin de comprendre le rôle et la fonction du système lymphatique dans les pathologies cardiovasculaires liées à l'obésité.
Étude de composés anti-virulence dans un modèle murin d’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
4 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère. Elles sont infectées aux poumons par Pseudomonas aeruginosa au moyen d'injections intratrachéales et intranasales sous anesthésie, pour tester des composés anti-virulence et un candidat vaccin. Le porteur indique que l'infection non traitée provoque perte de poids, catarrhe oculaire, baisse de température et repli, les souris trop atteintes selon un score clinique étant mises à mort. Il affirme que les lignées cellulaires ne peuvent pas remplacer totalement le modèle murin pour étudier les interactions hôte-pathogène et justifie l'euthanasie de toutes les souris par le risque de dissémination des pathogènes.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie opportuniste multi-résistante qui représente la troisième cause d’infections acquises à l’hôpital en France. P. aeruginosa est responsable de pneumonies aiguës chez le patient bénéficiant d’une ventilation mécanique ou d’infections chroniques chez les patients présentant une pathologie respiratoire chronique suppurative comme la mucoviscidose. La morbi-mortalité importante, l’incidence croissante de souches multi-résistantes associées à l’absence de développement à court terme de nouvelles molécules antibiotiques d’intérêt a conduit à classifier cette bactérie parmi les pathogènes prioritaires pour la recherche de nouvelles thérapeutiques par l’OMS. L'incidence élevée, la sévérité et la résistance croissante sont caractéristiques des infections à P. aeruginosa et soulignent la nécessité d'ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Une première possibilité serait de cibler un des nombreux mécanismes pathogéniques dont est doté P. aeruginosa grâce à son génome de grande taille codant pour de nombreux facteurs de virulence et de régulation. La seconde voie thérapeutique choisie serait le développement d’un candidat vaccinal potentiellement bispécifique ciblant 2 facteurs respectivement impliqué dans les infections aiguës et chroniques et utilisant un adjuvant constitué d’une structure en nanodiamant comme thérapeutique préventive des infections à P. aeruginosa aiguës et chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet consiste à évaluer l’efficacité de nouvelles molécules permettant d’inhiber la virulence de P. aeruginosa et d’un nouvel agent vaccinal, pour un transfert vers une filière de développement pharmaceutique.
Procédures
Les injections intratrachéales seront effectuées sous anesthésie générale,d’une durée de 30 minutes, via une injection de kétamine-xylazine tandis que les injections intranasales et sous-cutanées le seront sous anesthésie générale gazeuse, d'une durée de 5 minutes, par isoflurane. Les injections intra-péritonéale seront administrées sur animaux vigile. De même le suivi du poids et du score clinique se fera sur animaux vigile. Aucune prélèvements sur animaux vigiles ni procédures chirurgicales ne seront fait dans ce projet.
Impact sur les animaux
L'infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa non traité se traduit chez la souris par plusieurs effets délétères. L'animal perd du poids, peut présenter une inflammation des muqueses notamment un catarrhe oculaire, sa température corporelle peut baisser et son comportement également (dos courbé et réduction de l'activité et de la mobilité).
Devenir
Tous les animaux devront être euthanasiés à l'issue de chaque procédure du fait du double risque de dissémination dans le milieu extérieur des pathogènes et des souris, génétiquement modifiés ou non .
Remplacement
La sélection des composés ayant la meilleure efficacité contre P.aeruginosa sera réalisée grâce à des modèles in vitro. Des lignées cellulaires épithéliales pulmonaires et des lignées immunitaires (lymphocytes, cellules dendritiques et macrophages) seront utilisées pour évaluer l’innocuité des composés, la production d’anticorps spécifiques, la protection contre l’infection bactérienne.Il n’est pas possible de totalement remplacer l’utilisation d’un modèle murin par l’utilisation de lignées cellulaires seules. En effet, nous nous intéressons aux interactions hôte pathogènes lors d’une infection pulmonaire pour lesquels l’interaction de nombreux acteurs de l’immunité innée et adaptatives sont mises en jeu simultanément.
Réduction
Il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’un modèle murin par l’utilisation de lignées cellulaires seules. En effet, nous nous intéressons aux interactions hôte pathogènes lors d’une infection pulmonaire pour lesquels l’interaction de nombreux acteurs de l’immunité innée et adaptatives sont mises en jeu simultanément. Pour réduire le nombre de souris nécessaires au strict minimum, nous nous appuierons sur les méthodes statistiques suivantes. Pour pouvoir mettre en évidence une différence au niveau des résultats microbiologiques, il nous faudra inclure 15 sujets par groupe. Une comparaison entre les groupes Pour respecter le principe des 3R, les mesures de raffinement suivantes seront employées : les souris seront hébergées en armoire ventilée sous conditions de température contrôlées. Elles auront accès à un enrichissement pendant toute la durée de l’expérience. Une surveillance clinique quotidienne est réalisée afin d’identifier les potentiels signes de douleur engendrée par le protocole durant toute la durée de l’étude. En cas de besoin, un traitement antalgique sera instauré́, et adapté au type de procédure invasive.
Raffinement
Durant toute la durée des expérimentations, les animaux seront surveillés pluri-quotidiennement. Des critères d’évaluation de leur état clinique seront utilisés afin d’établir un score de maladie. Cela nous permettra de déterminer le besoin de me mettre en place un traitement analgésique pour garantir le bien-être des animaux. Si ce score devient trop élevé, notamment lié à une perte de poids trop importante, la mise à mort de l’animal devra avoir lieu. Durant les phases d’anesthésie ou d’injection, une surveillance particulière d’une quinzaine de minutes suivant l’acte sera réalisée pour s’assurer d’un réveil normal. Dès réveil des souris avec reprise d’une déambulation, elles réintégreront leur cage.
Choix des espèces
La validation de nouvelles molécules anti-infectieuses est classiquement effectuée chez la souris du fait d’un recul important en termes de données et d’outils de suivi disponibles sur les infections respiratoires et digestives. C’est le seul modèle officiellement validé et nécessaire au préalable sur le plan pharmaceutique avant un transfert pour un éventuel essai chez l’humain. Dès la réception de souris mâles âgées de 6 à 7 semaines, une stabulation d’une semaine dans l’animalerie sera respectée. Ces dernières seront alors utilisées à un âge compris entre 7 et 10 semaines. Les animaux utilisés doivent avoir atteint la maturité sexuelle pour éviter les biais dus à la perturbation hormonale. Le protocole expérimental a une durée maximale de 28 jours.
Mise au point d’un modele murin de carcinogenèse hepatique sur cirrhose metabolique en vue d’évaluer le rôle de l’inhibition de TREM-1 sur la prévention et le traitement du carcinome hépatocellulaire. (2/3 EUs)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
63 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère. Dès le deuxième jour de vie, les souriceaux reçoivent une injection de streptozotocine puis un régime gras destiné à faire évoluer une stéatohépatite vers la cirrhose et le cancer du foie, avec suivi par scanner et IRM sous anesthésie. Le porteur indique une mortalité prévisible d'environ 40 % en fin de protocole liée au régime et à la maladie, et classe la procédure sévère sur ce motif, tout en envisageant un reclassement en modéré selon les données. Il affirme qu'aucune approche in vitro n'existe pour ce type de pathologie et juge le recours à un organisme vivant "indispensable".
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est classe comme le sixième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès par cancer. Le développement du carcinome hépatocellulaire est étroitement lié à la présence de la maladie du foie gras non alcoolique appelée « steato-hepatite non alcoolique » ou NASH en anglais. Cette maladie est caractérisée par une inflammation chronique du foie conduisant à une mauvaise cicatrisation appelée fibrose dont le stade ultime est la cirrhose. Or, la réponse inflammatoire des cellules immunitaires est amplifiée par triggering receptor expressed on myeloid cells1 (TREM-1). L’inhibition de TREM-1 dans un modèle murin de NASH diminue l’inflammation du foie et restaure les capacités de «recyclage » cellulaire. Ces résultats sont confirmés chez les souris génétiquement invalidées pour le gène TREM-1. Néanmoins, les limites de ces modèles animaux de NASH sont l’absence d’évolution vers la cirrhose et le CHC. Afin d’évaluer à terme l’inhibition de TREM-1 dans le CHC, il nous faut d’abord développer un modèle de NASH évoluant jusqu’au stade CHC. Le modèle de souris C57BL/6 traitées par streptozotocine et soumises a un régime riche en graisse a l’avantage d’induire une véritable NASH avec toutes les composantes évolutives : excès de graisse semaine 6 (S6) ; NASH avec fibrose sévère a S8-10 et CHC entre S16-S20. Ces CHC sont constants et sont très proches des CHC humains sur le plan moléculaire. Dans ce projet, l’objectif est de mettre au point ce modèle, d’en caractériser les évolutions par imagerie IRM et Scanner et d’en adapter la résolution de façon à disposer des outils de suivi dans les futurs projets
Bénéfices attendus
Le développement du carcinome hépatocellulaire est étroitement lie à la présence d'une maladie chronique du foie conduisant à une cirrhose. Une des causes la plus fréquente est la steato-hepatite non alcoolique liée au syndrome métabolique. TREM-1 pourrait être un déterminant essentiel du développement, de la progression et du mauvais pronostic du CHC comme suggéré dans un modèle murin de steatohepatite non alcoolique mais cela reste à confirmer. L’inhibition de TREM-1 dans un modèle murin de NASH précoce diminue les lésions histologiques hépatiques (steatose, inflammation, ballonnisation, fibrose) via une diminution de l’inflammation et la restauration des capacités d’autophagie cellulaire. Ces résultats sont confirmés chez les souris génétiquement invalidées pour le gène TREM-1. Néanmoins, les limites de ce modèle animal de NASH sont l’absence d’évolution vers la cirrhose et le CHC.
Procédures
- Induction de la stéato-hépatite par une injection de streptozotocine de 10 secondes à J+2 de vie sur 58 souris avec un régime riche en graisse. - Imagerie par paliers du cancer du foie sous anesthésie générale à l’isoflurane : 1) Réalisation d’une imagerie par scanner avec et sans injection : réalisé par des personnes compétentes et avec le matériel adapté à la souris (plaque chauffante, monitoring des paramètres vitaux) avec une durée totale de 15 minutes par animal sous anesthésie par isoflurane. L’injection d’un produit de contraste aura une durée de 2 minutes par souris. Les séquences seront obtenues à 0,5 min, 4,5 minutes et 8 minutes de l’injection de produit de contraste iodé. 2) Réalisation d’une IRM (imagerie par résonnance magnétique) : la durée totale de l’acte sera de 30 minutes par animal réalisé par des personnes compétentes et avec le matériel adapté à la souris (plaque chauffante, monitoring des paramètres vitaux). - Injection de bromodeoxyuridine 2 heures avant la mise à mort des souris concernées (marquage cellulaire non toxique) d’une durée de 3 secondes par animal.
Impact sur les animaux
Dans la littérature, il existe une mortalité induite par le régime et par la maladie du foie à partir de la semaine 11 d’environ 5% par semaine soit 40% de mortalité en fin de protocole. Cliniquement, certaines souris vont perdre du poids en raison du manque d’appétit et de la fatigue. Néanmoins, ce régime n’induit pas de douleurs pour l’animal. Nous ne savons pas encore si notre procédure de raffinement permettra d’endiguer suffisamment la perte de poids et permettre une survie prolongée des souris. Par conséquent, la procédure a été jugée sévère en raison du taux de mortalité prévisible mais pourrait être effectivement reclassifiée en modérée en fonction des données du protocole. Le protocole ne sera pas réalisé d’une traite sur les 58 souris mais plutôt par étape ce qui permettra d’adapter la suite du protocole et de reclassifier la procédure si besoin. Des nuisances (stress) provoquées par les anesthésies nécessaires pour l’imagerie, ainsi que des douleurs légères lors des injections de bromodeoxyuridine, un marquage cellulaire, sont également à mentionner.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d'étude et les procédures. Les mises à mort sont réalisées pour récupérer les organes afin d’analyser les tissus et en particulier hépatiques (présence de cancer, degré de fibrose, d’inflammation et de graisse).
Remplacement
Il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’évolution d’une pathologie inflammatoire multifactorielle comme la stéato-hépatite non alcoolique vers la fibrose sévère et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez un organisme vivant est indispensable.
Réduction
Le nombre total d’animaux est de 63, il a été calculé à l'aide d'analyses statistiques intégrant, la mortalité potentielle (basée sur notre expérience des modèles de fibrose), la variabilité entre chaque souris et leur sexe. Nous suivrons dans le temps le développement de la pathologie à l'aide de l'imagerie, nous obtiendrons donc un volume important de données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. L'utilisation de l'imagerie offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux.
Raffinement
Dès leur réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, ...) à leur bien-être. Le cancer du foie se développera de manière insidieuse et indolore. Il sera induit par une injection sous-cutanée unique d’un antibiotique associé à un régime riche en graisse. Les stades de la maladie seront évalués de manière non invasive par imagerie : scanner avec injection de produits de contrastes et IRM. Les examens d’imageries prévus dans ce protocole (IRM et Scanner) ne produisent aucune forme de douleur, ils sont non-invasifs et réalisés sous anesthésie générale. Cette dernière peut tout de même être source de stress pour l’animal. Les animaux sont surveillés durant l'examen : si l'animal présente une détresse respiratoire (dont le stade le plus sévère est la capacité à compter à l’œil nu le rythme respiratoire de l’animal), il sera immédiatement retiré de l'appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil. Une injection sera effectuée à la fin du protocole 2h avant la mise à mort. Celle-ci ne génère pas de souffrance chez l’animal car ce n’est ni un produit toxique ni corrosif, ni nauséeux. La piqure, qui peut être légèrement douloureuse, est effectuée par un zootechnicien entrainé, ce qui limite grandement le risque d'erreur et la douleur qui pourrait être infligée aux animaux. D’autre part cette injection protocolaire est prévue juste à l’issue des examens d’imagerie chez un animal encore endormi et qui sera mis à mort quelques heures plus tard limitant encore le risque de souffrance inutile. Les animaux seront surveillés plusieurs fois dans la journée jusqu'au moment de la mise à mort, et si un animal montrait des signes de ralentissement net de sa motricité, de sa respiration, ou tout autre signe évoquant un stress, il serait mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les principaux modèles de stéato-hépatites non alcoolique ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle transgénique (KO TREM-1) permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) du récepteur TREM-1 dans la pathogenèse de la NASH et du CHC sur projets futurs en cas de mise au point réussie de ce modèle. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issues de souris gestantes. Comme mentionné dans la description du projet, le pancréas des jeunes souriceaux possède des capacités régénératives de ses îlots pancréatiques. Cette propriété nous permet d’utiliser la streptozotocine et son action toxique sur les îlots sans induire un vrai diabète mais plutôt un état d’insulinorésistance qui caractérise la NASH.
Identification de gènes de E. coli importants pour la colonisation de l’intestin de la souris par criblage CRISPRi et RecordSeq
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à modéré. Elles reçoivent un gavage puis une inflammation du côlon déclenchée par du dextran sulfate de sodium ajouté à l'eau de boisson pendant sept jours, avec prélèvement quotidien de fèces, avant d'être tuées pour prélever côlon, iléon, rate, ganglions et foie. Le porteur indique que la colite peut provoquer diarrhées, déshydratation et perte de poids, et que le gavage peut irriter l'œsophage. Il affirme qu'un système vivant est nécessaire pour reproduire les interactions entre bactéries et hôte et retient la souris comme espèce de référence, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme.
Objectifs
L’implication du microbiote intestinal dans la physiologie intestinale mais aussi dans la santé humaine de façon plus générale a largement été démontrée. Par exemple, la prolifération de certaines bactéries, telles que des souches de E. coli Adhérentes et invasives (AIEC), a été associée aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Dans ce contexte, le but de notre projet est d'identifier, chez les différentes souches de E. coli, les gènes importants pour leur survie dans l’intestin. De tels résultats fourniront également des informations sur l’environnement intestinal et pourront donc nous permettre de mieux comprendre comment le microbiote, mais aussi l’alimentation et le mode de vie impactent la physiologie intestinale.
Bénéfices attendus
Connaître les gènes importants pour la survie de bactéries (pathogène ou non) dans l’intestin nous permettra de mieux comprendre comment le microbiote impacte la physiologie intestinale. De tels résultats de recherches fondamentales pourront permettre de mieux comprendre les mécanismes de pathogénicité de certaines souches impliquées dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Ces connaissances pourront à long terme contribuer au développement de thérapies pour ces maladies.
Procédures
- Gavage (quelques secondes sur chaque souris, une seule fois au cours de l’expérience) - Prélèvement de fèces (quelques secondes, une fois par jour sur chaque animal, pendant toute la durée de l’expérience) - Induction d’une inflammation de l’intestin (ajout du produit inflammatoire dans l’eau de boisson pendant 7 jours)
Impact sur les animaux
Ce projet occasionnera quelques effets néfastes pour les animaux. Notamment lors des gavages, dont le niveau de sévérité attendu est léger, et qui peuvent causer des irritations de l’œsophage dues à la sonde. Ou lors de l’induction de la colite au dextran sodium sulfate, dont le niveau de sévérité attendu est modéré, et qui pourra causer une inflammation du colon, des diarrhées, une déshydratation et donc une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de prélever les organes et tissus d’intérêt (colon, iléon, rate, ganglion mésentériques, foie) et effectuer des analyses complémentaires.
Remplacement
Remplacement : Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour reproduire les interactions entre les bactéries étudiées et l’hôte dans l’environnement intestinal, qui n’est pas possible de reproduire avec exactitude in vitro dû à sa complexité et au nombre d’acteurs impliqués (système immunitaire, microbiote, etc…). Nous travaillons avec un modèle animal (modèle de colite induite au dextran sodium sulfate) reconnu pour l’étude des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et déjà bien caractérisé.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 (4 cages : 2 cages de femelles et 2 cages de mâle, 3 souris par cage) souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 648 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Approche statistique : Le plan d'expérience envisagé permet une analyse à deux niveaux : une étude qualitative pour l'étude d'effets forts (screening des guides présents/absents entre les groupes expérimentaux) et une analyse raffinée permettant le recherche d'effets plus fins par des méthodes de type ANOVA à 3 facteurs (condition, sexe, éventuellement cage) en prenant en compte la nature des données (comptage).
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et quotidienne (point limite) et des soins adaptés (gels, anesthésie, analgésie si les actes le nécessitent). De plus, le fait que le gavage sur animal vigile soit pratiqué par une personne formée et expérimentée ainsi que l’utilisation de matériel adapté (telles que des sondes de gavage souples) permettent de réduire significativement les nuisances liées au geste technique lui-même.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence pour étudier les relations hôte-microbiote. De plus, la souris, et notamment le modèle de colite induite au dextran sodium sulfate, est un modèle couramment utilisé pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et donc bien caractérisé. Le microbiote de la souris est aussi bien étudié et caractérisé. Les protocoles et procédures de colonisation de l’intestin de la souris et d’induction de l’inflammation intestinal sont aussi déjà mis au point, nous savons donc ce qu’ils impliquent sur le bien-être des animaux et comment réduire la douleur et les effets néfastes sur l’animal. Nous utiliserons des souris jeunes adultes avec un début d’expérience situé entre 8 et 10 semaines de vie afin qu’elles aient atteint leur poids adulte et que leur microbiote se soit stabilisé. Ce stade est couramment utilisé dans la littérature pour ce type de modèle.