Procédures légères

1250 animaux non-humains vont être utilisés, 600 souris, 600 rats et 50 lapins, dont 1190 tués à l'issue et 60 adoptés. Chaque souris ou rat sert de support à une vingtaine d'actes, injections, gavages, prélèvements de sang, tests comportementaux, chaque lapin jusqu'à cinquante, pour former des élèves techniciens animaliers, la mise à mort faisant elle-même partie des gestes enseignés et les corps servant ensuite aux dissections. Le porteur reconnaît que des élèves peu familiers des techniques peuvent provoquer hématomes, fausses routes ou perforations du tube digestif. Il indique commencer chaque séance par des méthodes de remplacement, cartons, fausses peaux, vidéos, mannequins, mais juge "impossible" de se passer totalement d'animaux vivants pour former du personnel.

Objectifs

Ce projet décrit les séances de travaux pratiques d'un programme d'enseignement secondaire destiné à la formation diplomante de techniciens animaliers. Le recours à l'animal vivant n'a lieu que dans le cadre global d'une progression pédagogique qui inclut bien d'autres moyens d'enseignement. Les élèves de notre formation doivent devenir des techniciens animaliers de laboratoire en 3 an avec une progression des apprentissages pratiques. Chacune de nos 3 classes sont divisées en 2 groupes d'élèves dont la progression est suivie par un enseignant. Les animaux utilisés changent entre chaque groupe de TP pour respecter des temps de repos définis. Les élèves réalisent les travaux pratiques en binomes, et ils sont noté individuellement dans l'acquisition de la théorie, de la connaissance de la technique et la réussite dans la réalisation de la technique. Quelle que soit l'espèce, chaque séance d'apprentissage se déroule de la même manière, une première partie est consacrée à l'explication des objectifs et des conditions de réalisations illustré par des vidéos ou des essais sur mannequins. Cette phase est nécessaire pour l'acquisition des automatismes. Elle permet également d'espacer les passages sur animaux vivants facilitant les encadrements. A terme, ainsi, nos élèves peuvent être embauchés dans les laboratoires de recherche animale, avec une dextérité suffisante, et une bonne connaissances des règles éthiques, pour réaliser les protocoles expérimentaux qui leurs sont demandés dans les meilleures conditions. Cette progression pédagogique bénéficie à la fois à la qualité des résultats pédagogiques et à l'amélioration du sort des animaux utilisés en recherche.

Bénéfices attendus

Lors de ce projet, les apprentissages permettent d'aborder et de réaliser différentes procédures expérimentales. Il a pour but de raffiner les procédures de prélèvement et d'injection afin d’éviter la souffrance des animaux, de réduire le nombre d’animaux. Les bénéfices sont multiples : le premier concerne l'objectif pédagogique puisqu'il s'agit de former des personnes compétentes et habilitées à travailler avec des animaux de laboratoire : les élèves formés deviennent des professionnels des techniques enseignées et donc peuvent réaliser les procédures dans des conditions normalisées pour le respect de l’animal. Le deuxieme bénéfice est d'inculquer la culture du soin qui est de faire prendre conscience aux jeunes que l'on travaille avec du vivant et que l'on doit tout mettre en œuvre pour favoriser son bienêtre et pour respecter totalement l'animal. Cette culture du soin tient également compte du manipulateur car un personnel à l'aise et en confiance car bien formé sera d'autant plus respectueux de l'animal.

Procédures

Le projet est prévu pour 5 ans avec un renouvellement total des animaux à chaque année scolaire. Les animaux sont donc utilisés entre septembre et juin en n+1. Durant cette période, ils participent au programme de formation des jeunes. Pour les 120 souris par année scolaire, chacune va participer au maximum à 20 interventions parmi la liste suivantes injection sous cutanée, intra péritonéale,intra musculaire, intra veineuse, gavage, prélèvement sanguin (Saphène, submaxillaire, sinus rétro orbitaire, caudale, cardiaque) et tests comportementaux Pour les 120 rats par année scolaire, chacun va participer au maximum à 20 interventions parmi la liste suivantes injection sous cutanée, intra péritonéale,intra musculaire, intra veineuse, gavage, prélèvement sanguin (Saphène, jugulaire, caudale, cardiaque) et tests comportementaux. Pour les 12 lapins par année scolaire, chacun va participer au maximum à 50 interventions parmi la liste suivantes injection sous cutanée,intra musculaire, intra veineuse, gavage, prélèvement sanguin (Saphène, auriculaire, cardiaque). L’ordre des actes peut varier en fonction des années et surtout de l’habilité des jeunes en vue de pratiquer les actes les plus simples en premier pour un meilleur respect de l’animal. Quelque soit l'animal, un délai minimum de 7 jours est respecté avant son utilisation lors d'une autre scéance de TP. Les séances de TP durent 1 h, et chaque animal est utilisé pendant quelques minutes, avec un nombre limité de tentatives pour chaque étudiant. Si l'élève échoue, l'a nimal est laissé tranquille.

Impact sur les animaux

Le maximum de précautions sont prises pour que les animaux ne subissent pas d’effets indésirables. Néanmoins, les élèves n'étant pas familiers des techniques enseignées, peuvent provoquer des nuisances sur les animaux. Elles peuvent être de différentes natures : stress du à des appréhensions des élèves , contention trop lache ou trop ferme, ou erreurs de manipulations pouvant conduire à des blessures (hématome, fausse route ou perforation du tube digestif) ou des douleurs (intramusculaire, intradermique) . Une autre source de stress peut provenir de la succession des actes invasifs même si des délais entre chaque acte sont respectés. D'autres nuisances peuvent également survenir, il s'agit des blessures infligés par des congénères Vu que les animaux sont surveillés et observés chaque jour, la détection d’un effet indésirable sur un animal conduit immédiatement à la mise en place d’une procédure adaptée : information au responsable, recherche de la cause de cet effet, avis vétérinaire si besoin, et si cela est possible : soulagement de l’animal sinon mise à mort pour éviter les souffrances inutiles.

Devenir

Chaque procédure correspond à une espèce, elles sont donc totalement indépendantes l'une des autres. Les animaux à l'issue de chacue des procédures ont le même sort quelque soit l'espèce. La plupart des animaux sont mis à mort pour différentes raisons. Les élèves doivent être formés sur les techniques de mises à mort. Les animaux morts sont réutilisés l'année suivante pour les dissections et les entrainements à la réalisation de points de suture. Un vide sanitaire de l'animalerie est ainsi possible pendant la période sans animaux permettant de maintenir un statut sanitaire propre. Une faible partie des animaux sont adoptés par les élèves car ceux qui sont en seconde et première doivent faire encore des stages en laboratoires animaliers. Il se pose donc des problème de logistique du à la quarantaine du personnel pour rentrer en zone.

Remplacement

Plusieurs méthodes sont utilisées pour éviter d’avoir recours aux animaux : La première consiste à travailler sur des supports inertes tels que des cartons, fausses peaux... qui permettent de s’entrainer à la manipulation des seringues et aiguilles pour trouver les bons angles, pour apprécier la force de pénétration de l’aiguille et pour rester fixe pendant la manipulation du piston. La deuxième méthode permet de visualiser la procédure grâce à la diffusion de vidéos réalisées en interne en précisant les difficultés et solutions. La troisième permet pour certaines manipulations de la réaliser plusieurs fois sur mannequins avant de passer sur animaux vivants. Quelle que soit la séance de TP, elle débute toujours par au moins une des méthodes de remplacement, mais il est impossible de remplacer totalement les animaux car l'apprentissage des gestes techniques pour former des personnes compétentes et habilitées nécessite de se confronter à des situations réelles où l'animal interagit. La vidéo est utilisée en amont mais également en aval de la manipulation. Cette dernière permet de pointer du doigt les difficultés de chaque apprenant pour qu'il prenne conscience de ses erreurs et qu'il les corrige pour les prochaines scéances.

Réduction

Comme chaque année de formation ne travaille pas sur la même espèce chaque semaine, nous pouvons considérer que nous formons 28 élèves par semaine les souris sont utilisées en actes invasifs pendant 20 TP nécessitant donc 120 souris par année scolaire Il en est de même pour les rats. Pour les lapins, le nombre de TP avec actes invasifs est de 15, les élèves travillent par binome et ou trinome permettant de réduire les animaux à 12 car entre chaque TP, au minimum, une semaine de repos est possible, le plus souvent, ce delai de repos est de 15 jours. De plus, le nombre d'actes invasifs est limité à 3 par TP et par animal. La rotation des espèces entre les années de formations et le suivi individuel des animaux permet de réduire au maximum le nombre d'animaux de chaque espèce.

Raffinement

Le raffinement peut être évalué grâce à plusieurs points par un suivi journalier avec sensibilisation à la détection des comportements des animaux et vérification des résultats des procédures précédentes par la mise en place d’un tableau de suivi individuel de chaque procédure réalisée sur l’animal, ce suivi individuel évite également l'utilisation des mêmes animaux car les apprenants prennent l'habitude de vérifier ceux qu'ils peuvent utiliser. Par un apprentissage progressif des techniques en commençant par les plus simples (identification, injection, prélèvement) ; par la prévention de la douleur pour des actes Par le recours à l’anesthésie pour des prélèvements sanguins difficiles (sinus rétro orbitaire, sub mandibulaire, jugulaire) Par le recours à des prélèvements sanguins tels que l’intra cardiaque sans réveil de l’animal Par une alternance des manipulations au cours des semaines Par un encadrement précis (14 élèves par tp) : surveillance rapprochée de l’enseignant pour des nouvelles procédures avec arrêt de la manipulation de l’élève si danger, aide à la réalisation dans les premiers temps (l'encadrant divisent le groupe en 2 pour pouvoir surveiller les actes de chaque apprenant) Par le travail en binôme pour une entraide et par la mise en place de tutorat entre élève lorsque l’enseignant a validé les compétences des élèves tuteurs Par la participation des élèves à la cellule de Bien être animal pour le développement de la culture du soin Par un suivi vétérinaire Par le respect de l’hébergement en groupe unisexe, les paramètres physicochimiques sont contrôlés et surveillés chaque jour. Si après une session de pratique, un animal présente des signes de douleurs ou présente des différences par rapport à son comportement avant la séance, il sera intégré dans un processus de suivi pour verifier régulièrement l'évolution des signes et prendre les mesures approrpiées (description des signes, chronologie de la surveillance avec délai entre chaque observation, avis vétérinaire..). Par le respect de points limite définis (nombre maximal d'utilisation avec acte invasif, delai entre les utilisation, perte de poids, changement morphologique du corps, masse, blessure, examination physique des yeux orifices, grille de score, …). En fonction du type de point limite atteint, trois possibilités de soulagement sont possibles : arret des actes invasifs, analgésie et soins pour soulager l'animal ou mise à mort immédiate en cas d'impossibilité de soulagement.

Choix des espèces

La souris, le Rat et le Lapin sont les mammifères les plus couramment utilisés en laboratoire de recherche. Nous formons nos élèves à l'utilisation de ces animaux, et pour cela que nous les utilisons. Nous recevons des animaux jeunes adultes, qui sont soit utilisés en travaux pratiques, soit mis à la reproduction. Par la suite, nous utilisons en général des animaux jeunes adultes parce que ce sont qui sont le plus couramment inclus dans des protocooles.

1500 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de lymphome humain par injection ou après une petite chirurgie, incision de la peau et du péritoine près de la rate ou du rein, puis des prélèvements de sang à la joue toutes les deux semaines, pour constituer une collection de tumeurs greffées appelées PDX servant à tester des molécules antitumorales. Le porteur situe les bénéfices pour les patients à long terme, l'objectif immédiat étant de reproduire chez la souris des lymphomes humains qu'il qualifie de "modèle formidable". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de maintenir un lymphome humain en culture et juge "indispensable" de générer ces modèles.

Objectifs

Ce projet vise à améliorer les connaissances et la prise en charge des lymphomes chez l’homme. Les lymphomes sont des cancers du système lymphatique. Ils sont responsables du développement de tumeurs au niveau des organes lymphatiques (ganglions, rate, …). Ces lymphomes ont une grande diversité et une classification complexe. Ils proviennent de cellules transformées du système immunitaire, comme les lymphocytes B ou T. Le but de ce projet est de développer des modèles pré-cliniques chez la souris de lymphomes humains, afin de tester de nouvelles molécules antitumorales. Le développement de modèles animaux est indispensable, seules des études in vivo permettent de valider l’effet antitumorale d’une molécule car les effets que peuvent avoir le microenvironnement et l’architecture même de la tumeur d’origine du patient sont pris en compte. Les modèles pré-cliniques développés ici sont des xénogreffes chez la souris de lymphomes provenant de patients. Ces xénogreffes dont l'anglicisme très utilisé est PDX (Patient-derived xenograft) sont la transplantation d'un greffon de lymphome de patient dans une espèce biologique différente ici la souris. Elle s'oppose ainsi à l'allogreffe où le greffon du donneur vient de la même espèce que le receveur. Les greffes sont réalisées dans des souris très immunodéficientes, particulièrement propices à la survie et à multiplication des cellules tumorales des patients, évitant ainsi le rejet de greffe. Un panel représentatif de PDX pour chaque type de lymphome sera développé, afin de tester l’activité antitumorale de molécules à visée thérapeutique. Le nombre de souris impliquées dans le projet est réduit au minimum, grâce à l’étude approfondie des données de la littérature et aux données déjà obtenues lors de projets précédents réalisés in vitro avec des lignées cellulaires, sans toutefois mettre en péril l’obtention d’un panel de PDX représentatifs des lymphomes connus. Les conditions d’hébergement et les soins donnés aux animaux sont faits dans le respect du bien-être animal, ceci afin de limiter au maximum le stress et de garantir le bien-être de chaque animal. Les méthodes utilisées dans les différentes procédures de ce projet ont été étudiées afin réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Une définition précise des points limites, associée à une surveillance adaptée des animaux ont été définis afin de limiter toute souffrance animale. Au maximum, 1500 souris seront nécessaires pour ce projet.

Bénéfices attendus

Bénéfices à court terme : ce projet fera progresser la connaissance scientifique dans le domaine du lymphome, car il permettra d’avoir un modèle formidable que sont les PDX, qui permettent de reproduire chez la souris un lymphome possédant toutes les caractéristiques phénotypiques, moléculaires et environnementales de la tumeur du patient. Bénéfices à long terme : grâce à ce projet, de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou médicaments pourront être testés afin d’améliorer les traitements actuels, de prévenir la résistance aux médicaments et les rechutes et donc prolonger la vie des patients.

Procédures

Les souris auront pour certaines une greffe par une injection unique d’un fragment d’une biopsie de lymphome humain ou de cellules tumorales humaines, injection réalisée après anesthésie et d’une durée totale de moins de 5 minutes. Certaines autres greffes nécessitent une étape de chirurgie. Les souris recevront donc les médicaments nécessaires pour obtenir une anesthésie et une analgésie préopératoire (médicaments aux propriétés antalgique, antipyrétique et anti-inflammatoire). Il sera fait une toute petite incision de la peau puis du péritoine au niveau de la rate ou du rein afin de réaliser une petite ouverture permettant l’injection des cellules tumorales ou l’introduction d’une biopsie tumorale. Les sutures sont réalisées au niveau du péritoine puis de la peau (durée totale de 10 minutes environ pour l'ensemble de l'intervention). Dans tous les cas, 1 mois post-greffe et ensuite toutes les 2 semaines, il sera réalisé un prélèvement sanguin non invasif (2 gouttes de sang) au niveau de la joue afin de vérifier la présence des cellules tumorales humaines (durée d'une à deux minutes environ pour ce prélèvement).

Impact sur les animaux

Nuisances légères attendues dues au stress de la contention et des piqures réalisées lors des greffes ou des analgésies, durant quelques secondes ou quelques minutes (temps requis pour effectuer les injections). Nuisances modérées attendues dues au stress et à une légère douleur, du fait d'un cumul des piqures, des étapes de petite chirugie et dues au développement du lymphome lui-même.

Devenir

L'ensemble des souris utilisées dans ces différentes procédures seront mises à mort car elles auront été soit remplacées en élevage après 6 mois de vie, soit car elles auront été greffées avec des lymphomes humains. En cas de non prise des greffes, les souris seront quand même mises à mort après 1 an post-greffe car au delà elles développent généralement de façon spontanée des pathologies diverses dues à leur âge avancé.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant de maintenir à long terme un lymphome primaire humain en culture. Quelques modèles de PDX de lymphome ont été générés aux USA mais ces modèles restent rares et ne sont pas représentatifs des différentes entitées de lymphome. La demande pour ces modèles pertinents afin de tester l'efficacité de nouvelles thérapies est de plus en plus grande. Il est donc indispensable de générer ces nouveaux modèles précliniques afin d'améliorer la prise en charge clinique des patients atteints de lymphome.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisé dans ce projet : 1/ il a été estimé que la greffe de 3 souris pour chaque voie est suffisante pour permettre l’obtention d’une prise de greffe à T0. De même que la greffe de 2 souris pour les T1 et T2 suffit ; 2/ la génération effective de PDX sera limitée à 10 patients par type de lymphome et donc pour 8 entités différentes ; 3/ quand cela sera possible en fonction du type de lymphome à greffer, la ou les voies utilisées pour réaliser les greffes et générer un PDX seront toujours les voies les moins invasives, avec le moins d'effet indésirables, afin de réduire à son minimum la souffrance ou le stess des animaux ; 4/ les ressources cellulaires post-mortem seront mutualisées au sein de l’équipe de recherche afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris.

Raffinement

Élevées dans des conditions d'hygiène strictes, les souris immunodéficientes NSG ne présentent pas de signes de souffrance particuliers (classe légère). Les différentes injections médicamenteuses ainsi que les greffes de lymphome de patients chez ces souris par voie intraveineuse ou par voie sous-cutanée n’induisent pas de souffrance particulière (classe légère). Les souris avec une petite chirurgie pour les greffes par voie S.C.R. et I.S. seront anesthésiées avant l'intervention. L'endormissement sera contrôlé avant l'intervention et surveillé tout au long de la chirurgie. Pendant l'intervention chirurgicale et ensuite, les souris seront laissées sur plaque chauffante pour qu'elles ne se refroidissent pas pendant l’endormissement et surveillées jusqu’aux premiers signes de réveil, puis replacées dans leur cage. Une goutte de gel hydratant sera également appliquée sur chaque œil avant et après l'étape de chirurgie afin d'éviter un dessèchement. Les sutures seront surveillées pendant les deux jours suivant afin de prévenir tout risque d’infection. S'il est constaté une infection cutanée, la plaie sera désinfectée deux fois par jour pendant deux jours jusqu’à disparition des signes d’infection ou l’animal sera mis à mort si l'infection persiste. A ce jour, aucune infection cutanée n'a été observée lors de projets précédents. Ces animaux seront observés trois fois par semaine pendant toute la durée du développement du PDX avec la mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés. Si après 1 an post-greffe aucune prise tumorale n’est observée l'expérience de sera pas poursuivi, les animaux seront alors mis à mort afin d'éviter aux animaux des souffrances dues au vieillissement. Les souris qui développeront un lymphome seront mise à mort rapidement selon une grille de score et les points limites définis.

Choix des espèces

Nous avons accès à des modèles de souris très immunodéficientes, présentant des déficits complets en cellules immunitaires de type lymphocytes T, B et NK. Ces souris sont donc un modèle de choix pour greffer des tumeurs humaines telles que des lymphomes chez la souris (xénogreffes) et donc éviter le rejet de greffe des cellules humaines. Les souris immunodéficientes seront utilisées à partir de l'âge de 8 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte de ces animaux. La greffe sur des animaux adultes permet d’avoir un taux idéal de greffe d’après les données de la littérature et d'après nos résultats expériences réalisées précédemment dans le cadre d’un autre projet de recherche.

200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 160 d'entre elles tuées à l'issue pour prélever organes et tissus, les 40 autres, utilisées comme compagnes, gardées vivantes pour de futures mises au point. Elles subissent une biopsie de l'oreille, la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie, puis cinq semaines de tests comportementaux mesurant apprentissage, mémoire, prise de décision et coordination motrice dans un modèle de trisomie, les souris compagnes subissant en plus des frottis vaginaux. Le porteur situe les retombées pour les patients dans des études ultérieures, l'objectif immédiat étant de sélectionner les tests les plus pertinents pour tester plus tard des molécules. Sur le remplacement, il affirme que comprendre ces maladies génétiques exige l'étude d'un "organisme vivant dans son intégrité" et conclut à la "nécessité" de recourir à la souris.

Objectifs

Le projet consiste à comprendre les mécanismes des déficiences intellectuelles associées à des trisomies. Nous nous intéressons plus spécifiquement dans cette étude à la caractérisation de déficits cognitifs (apprentissage, mémoire, prise de décision et organisation du comportement) et de coordination motrice dans un modèle de trisomie. Sa caractérisation permettra de compléter les descriptions précédentes par l’étude de fonctions cognitives encore non explorées et ainsi de décrire précisément la perturbation des fonctions cognitives et exécutives dans un modèle de trisomie. Cette caractérisation constitue donc la base d’un projet général qui vise à comprendre les mécanismes de la trisomie. Elle va permettre de sélectionner les tests les plus pertinents pour évaluer les effets de traitements potentiels dans une étude ultérieure. Elle est donc primordiale pour bien identifier les niveaux de référence dans les études futures. C’est pourquoi nous répétons certains tests qui ont été conduits précédemment pour nous servir de référence et nous complétons cette caractérisation par de nouveaux tests comportementaux qui permettront de préciser la nature et l’amplitude des déficits.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux caractériser les défauts cognitifs d’un modèle animal de trisomie. Elle permettra de sélectionner les tests comportementaux les plus pertinents afin de tester des molécules à effets thérapeutiques visant à réduire ces défauts dans des études futures. Cette étude constitue donc la base pour des études ultérieures pour la recherche de voie d’amélioration pour les patients.

Procédures

Tous les animaux seront évalués lors d’un ensemble de tests comportementaux visant à observer leurs performances cognitives. Ces tests seront réalisés pendant une durée totale de 5 semaines, chaque test durant entre 3 min et une heure. Les animaux subissent uniquement une biopsie à l'oreille pour permettre le génotypage (2 s), et l'insertion en sous-cutanée d'une puce d'identification par radio-fréquence à l'âge de 6 semaines. Cette intervention sous anesthésie gazeuse est très rapide (2 min) et est réalisée après injection d'un analgésique local en sous-cutané (5 s, pendant l’anesthésie gazeuse). Les souris utilisées comme compagnons pour l'interaction sociale subissent un frottis vaginal (rinçage du vagin pendant 20 s) pour suivre leur cycle sexuel.

Impact sur les animaux

Aucun phénotype dommagable n’a été rapporté lors d’études précédentes de la lignée de souris étudiée. Une légère douleur très ponctuelle lors de l’injection sous cutanée d’une puce RFID sera contrôlée par l’utilisation d’un anti-douleur local. Une surveillance de la cicatrisation est réalisée et si un suintement est observé, un antispetique local et/ou pommade cicatrisante est/seront appliqué(s). Les souris seront soumises à un stress léger ou modéré lors des tests comportementaux (stimuli lumineux et changement ponctuel du pH de l’eau (acidification de l’eau de boisson en cage d’hébergement, qui rend plus appétente l’eau lors des tests d’apprentissage réalisés en dehors de la cage d’hébergement)) afin de favoriser l’apprentissage et ainsi réduire la durée des tests. Cela permet d’optimiser la durée de la procédure globale. L’apparence des animaux (état du pelage qui doit rester brillant et propre, perte de poids visible par saillie des hanches) sera surveillée au cours des manipulations quotidiennes des animaux pendant les tests comportementaux.

Devenir

Tous les animaux de la lignée transgénique étudiée seront mis à morts car nous allons faire des prélèvements (organes, tissus…) pour faire des études approfondies des tissus et des processus moléculaires. Les animaux utilisés comme nouvel arrivant dans l’interaction sociale ne subissent que l’insertion de puce RFID et l’interaction sociale. Ils seront donc conservés pour une réutilisation dans les mises au point de tests comportementaux non invasifs.

Remplacement

La compréhension des mécanismes de maladies génétiques associées à des retards mentaux requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus cognitifs et moteurs. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines.

Réduction

Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes. Nous analyserons les résultats de chaque test avec des tests statistiques adaptés. Nous prélèverons un maximum d’échantillons (organes, tissus…) sur chaque animal afin de pouvoir créer une banque pouvant être utilisée dans d’autres études.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables. Pour l’identification, la douleur lors de l’injection sous-cutanée de la puce est gérée par une injection sous-cutanée préalable d’un anti-douleur local. Une partie des animaux aura une eau de boisson quotidienne légèrement aversive afin de faciliter l’apprentissage du test par renforcement positif (la récompense dans le test d’apprentissage est constituée par de l’eau mélangée à du sirop de fraise) sans à avoir subir de privation ou de renforcement négatif. L’eau sucrée présentée dans le test devient d’autant plus appétente que l’eau de boisson quotidienne est acide ; cela renforce donc l’apprentissage des animaux, sans les priver. Des études précédentes ont montré que les souris ne perdent pas de poids malgré l’acidité de l’eau quotidienne. Des points limites sont mis en place pour surveiller le maintien de l'état de santé des animaux pendant toute la durée des procédures.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la pathologie humaine étudiée (trisomie). Les souris seront testées une fois adultes (8 semaines). Nous avons choisi cet âge car il correspond à une période hors développement. Les patients porteurs de trisomie montrent des défauts cognitifs à l’âge adulte.

70 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour dix d'entre eux et modéré pour soixante, soixante étant tués et autopsiés et dix témoins réutilisés. Chaque animal est infesté par voie orale par un ver hématophage, puis subit des prélèvements de fèces et de sang hebdomadaires et des pesées, l'infestation provoquant une anémie modérée. Le porteur compare des souches du nématode Haemonchus contortus résistantes et sensibles à un antiparasitaire, pour adapter les recommandations de traitement aux éleveurs. Les moutons infestés sont tués pour dénombrer les vers adultes dans la caillette et comparer les souches entre elles.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de comparer les fitness (capacité à survivre et à se reproduire) et les pathogénicités (capacité du parasite à induire des signes cliniques chez son hote) de souches résistantes et sensibles aux avermectines et d’évaluer ainsi le coût éventuel de la résistance des nématodes à ces anthelminthiques. En effet, la résistance des strongles gastro-intestinaux aux anthelminthiques est une problématique croissante actuellement. Certains élevages ne disposent plus de molécules efficaces pour traiter contre les strongles pendant la période de lactation des brebis. Il est admis que la capacité d’un parasite à resister induit un coût pour celui-ci, donc une faiblesse sur d’autres traits de vie (par exemple la capacité à se reproduire). Cette question du fitness et du coût de la résistance est importante car une des recommandations pour limiter l’apparition et la diffusion des résistances est basée sur la notion de refuge qui consiste à maintenir des animaux parasités par des populations de parasites sensible, snon soumises à la pression de sélection. Pour cela, on fait appel au traitement ciblé sélectif (TCS). Cependant, l’efficacité du TCS repose notamment sur l’hypothèse qu’il y a une différence de fitness entre les souches sensibles et résistantes et donc un coût de la résistance pour les nématodes. Ce projet a permis de récolter des isolats de terrain, matériel biologique d’un grand intérêt. Nous disposons à ce jour de 6 isolats purifiés, 3 sensibles et 3 résistants à l’éprinomectine. Ces 6 isolats sont contemporains et proviennent d’un même bassin de production et peuvent ainsi servir de base à une comparaison de phénotypes incluant le « fitness ». Le fitness d’une souche correspond à sa capacité à survivre et à se reproduire. On pourra également comparer la différence de pathogénicité entre ces isolats, autre question d’un grand intérêt dans le domaine. Ce type d’expérimentation est d’autant plus originale que ce sont les premiers isolats d’Haemonchus contortus résistants à l’éprinomectine disponibles. De plus, ces isolats sont d’un grand intérêt pour la comparaison de fitness car ils proviennent de la même zone géographique et sont contemporains.

Bénéfices attendus

L’intérêt de ce travail est d’évaluer le comportement des souches en conditions expérimentales en faisant varier les conditions de développement des stades libres (température et hygrométrie) et d’observer s’il existe des différences de comportements des souches dans les stades parasitaires (taux d’implantation, ponte d’œufs, durée de la période prépatente…). Cela permettra de mimer les évolutions climatiques et voir si une catégorie de souches a des faiblesses dans certaines conditions mais pas dans les autres. L’objectif est d’observer s’il existe une différence de fitness entre les souches et si celle-ci est commune pour les souches résistantes. Cela permettra de pouvoir adapter les recommandations de gestion aux éleveurs. On observera également s’il existe une différence de pathogénicité entre les souches. C’est une information importante pour les éleveurs, notamment s’il s’avère que les souches résistantes sont également les plus pathogènes ou en termes d’impact et de gestion s’il s’avère que les souches résistantes sont moins pathogènes que les sensibles.

Procédures

Infestation par voie orale (volume administré = 10 mL) : n =1/animal, 2 minutes maximum par drogage, contention comprise. Prélèvements rectaux de fèces : n = 14/animal (un par semaine de J0 à J18 post-infestation puis 2 fois par semaine de J18 jusqu’à l’euthanasie des animaux), 3 minutes maximum par prélèvement, contention comprise. Prises de sang (volume maximal = 5 mL) : n = 9/ animal (une à J0, puis une par semaine), 3 minutes maximum par prélèvement, contention comprise. Pesées : n =9/animal (une à J0 puis une par semaine), 3 minutes maximum par pesée.

Impact sur les animaux

H. contortus étant un nématode hématophage, la dose infestante administrée va induire une anémie modérée chez son hôte, bien tolérée par l'animal. Stress modéré lors de l'infestation par voie orale, des prélèvements fécaux et sanguins et des pesées. Douleur légère lors des prises de sang et des prélèvements fécaux.

Devenir

Les animaux des lots infestés seront euthanasiés et autopsiés afin de pouvoir étudier la population de vers adultes présents dans la caillette et comparer les souches entre elles. Les animaux du lot témoins pourront être réutilisés.

Remplacement

Le cycle biologique d’H. contortus passe obligatoirement par le mouton qui est l’hôte définitif au sein duquel la reproduction sexuée s’effectue ; le petit ruminant ne peut donc pas être remplacé.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus dans cette expérimentation est limité au maximum pour avoir un effectif permettant d’observer une différence de fitness et de pathogénicité entre les souches de parasite, grâce à des tests statistiques. Il faut prendre en compte les interactions complexes entre l’hote et le parasite, variables d’un individu à l’autre, ce qui nécessite d’avoir des lots suffisamment étoffés afin aussi de ne pas avoir à renouveller l’expérimentation. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux necessaires, nous avons homogénéisé certains facteurs liés à l’hote et connus pour influer sur le cycle du parasite tel que le sexe, l’age, la race et l’historique de contact avec les strongles gastro-intestinaux.

Raffinement

Les agnelles seront hébergées sur une litière paillée et en lots d’infestation, de manière à pouvoir exprimer leurs comportements sociaux, et leur environnement sera enrichi avec des ballons et des brosses. Progressivement, elles s’habitueront à être manipulées et les prélèvements seront toujours réalisés par du personnel expérimenté. Elles feront l'objet d'une surveillance clinique quotidienne, complétée par une mesure hebdomadaire de l'hématocrite, de manière à détecter précocément les points limites associés aux conséquences de l'infestation parasitaire ou à d'éventuelles maladies intercurrentes.

Choix des espèces

L’espèce ovine est l’espèce cible d’H. contortus (application ensuite en élevage). Il n'existe pas d'autre espèce modèle ni de système alternatif que le mouton pour permettre au parasite H. contortus d’effectuer son cycle biologique. Le choix de l’espèce parasitaire repose à la fois sur sa fréquence, sa pathogénicité et sa capacité à développer rapidement une réponse immune chez son hôte mais aussi des multirésistances aux anthelminthiques. C’est pourquoi, l’espèce Haemonchus contortus a été choisie. Agnelles âgées de 3 mois. A cet âge, elles seront déjà sevrées, naïves vis-à vis d'Haemonchus contortus et donc pleinement réceptives à une infestation par ce parasite. En outre, elles auront atteint un poids leur permettant de supporter une infestation avec 5000 larves du parasite et l'anémie modérée en résultant, sans que cela ait un impact majeur sur leur santé et leur développement.

2 670 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 638 d'entre elles et modéré pour 2 032. Chaque souris subit un pincement du nerf optique qui provoque la cécité d'un œil, puis des injections dans l'œil de biomolécules censées protéger et régénérer les neurones, avant la mise à mort pour prélever rétines et nerfs optiques. Le porteur reconnaît que le pincement et les injections causent une douleur, mais la rubrique censée détailler l'anesthésie et les analgésiques reste occupée par une consigne de rédaction non remplie. Il indique tester ces molécules d'abord sur cultures et explants de rétine et vise à terme un médicament du glaucome amené en essai clinique.

Objectifs

Le glaucome est une des principales causes de déficit visuel. Les neurones présents dans la rétine (RGC, Cellules Ganglionnaires Rétiniennes) transmettent les informations captées par les photorécepteurs sous forme de signal électrique par via leur fibre nerveuse (axone) qui parcourt le nerf optique (NO) jusqu’au cerveau. Dans le glaucome, ces axones et les RGC dégénèrent, provoquant une cécité irréversible. Un modèle robuste de cette pathologie est obtenu chez la souris par un pincement maitrisé du NO provoquant la dégénérescence des axones qui le composent. Nous souhaitons tester dans ce modèle les propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices de biomolécules « NV » Sur des cultures de neurones, les NV favorisent la survie des cellules, l’élongation des prolongements cellulaires qui permettent les connections entre neurones et leur repousse après lésion. Ces résultats suggèrent que les NV pourraient être utilisés pour protéger les RGC de la mort cellulaire (effet neuroprotecteur) dans le glaucome et favoriser la repousse de leurs axones dans le NO (effet neurorégénérateur). Nos études ont montré que l’injection intraoculaire de vecteurs AAV2 (virus adéno-associé 2) codant pour le peptide NV de première génération (AAV2-NV1) favorise la survie des RGC et la repousse de leur axone, efficacité renforcée en présence de CNTF (ciliary-derived neurotrophic factor), un facteur de croissance neuroprotecteur et neurorégénérateur (effet synergique d’AAV2-NV1 et AAV2-CNTF). De plus, ces travaux ont permis de montrer l’absence de toxicité ou d’effets secondaires lors de l’injection intraoculaire d’AAV2-NV1. Nous avons développé de nouvelles générations de NV, modifiées pour augmenter leur affinité pour leur cible et donc leur efficacité, et conjuguées à des CPM (Cell Penetrating Molecules) tels que les VHH (molécules dérivées de chaines lourdes d’immunoglobulines de lama capables de franchir les membranes cellulaires) ou des peptides étiquettes (ciblage préférentiel des neurones en fixant le récepteur de l’acétylcholine) afin d’augmenter leur stabilité et leur adressage aux neurones. Nous souhaitons tester ces nouvelles générations de NV dans le modèle souris de glaucome afin d’identifier la molécule ayant l’efficacité maximale avec une toxicité minimale pour ensuite développer ce candidat comme médicament pour le glaucome en l’amenant à l’essai clinique.

Bénéfices attendus

Les biomolécules NV développées dans notre laboratoire possèdent des propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices susceptibles d’apporter une réponse à de nombreuses pathologies dégénératives. Dans le glaucome, l’augmentation de la pression intraoculaire cause une dégénérescence des axones dans le nerf optique, une mort des cellules ganglionnaires rétiniennes et à terme la cécité. Dans le cadre de ce projet, l’administration de ces molécules a pour but d’induire la régénération des fibres axonales dans le nerf optique après lésion, ce qui aura pour bénéfice de reconnecter l’œil au cerveau et donc d’éviter la cécité causée par cette lésion. Leur effet neuroprotecteur devrait quant à lui permettre la survie des cellules ganglionnaires rétiniennes dans la rétine, dont les axones forment le nerf optique.

Procédures

Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur de nos biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes) et est réalisé sous anesthésie profonde et analgésie. L’injection intravitréenne de nos biomolécules NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes). L’injection intraveineuse de NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes).

Impact sur les animaux

Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur des biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Il est attendu que le pincement du nerf optique et l’injection des biomolécules NV dans l’œil causent une douleur chez la souris. Il est approprié d’écrire ici si une anesthésie et des analgésiques post-opératoires sont prévus, et leur dosage La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 3 jours suivant les pincements/injections, puis bihebdomadaire. Les animaux seront mis à mort en cas de dépassement des points limites fixés pour les différentes procédures. Une administration d’analgésique sera réalisée dès l’apparition de signes de douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, toutes les procédures requièrent la récupération de tissus (rétines, nerfs optiques) destinés à être analysés en vue de démontrer l’effet thérapeutique de notre molécule NV.

Remplacement

Les biomolécules NV utilisées dans ce projet sont préalablement validées in vitro pour leur efficacité et leur absence de toxicité sur des cultures de cellules neuronales, des cellules épithéliales rétiniennes et des explants de rétines. Les cellules neuronales et épithéliales rétiniennes ne nécessitent pas l’utilisation d’animaux (lignées cellulaires). Les explants de rétine, réalisés à partir de rétines de souris, permettent de tester plusieurs constructions et concentrations de NV avec un nombre réduit de souris, ce qui permet par la suite de ne tester in vivo que les molécules NV efficaces in vitro. Les explants de rétine constituent un modèle in vitro très proche du modèle in vivo (même espèce, même tissu) et facilite l’extrapolation.

Réduction

Le nombre d’animaux requis pour établir l’efficacité des biomolécules dans ce modèle a été calculé par un test de puissance statistique à partir de nos résultats antérieurs. La mise à mort des animaux pour la récupération des yeux et des nerfs optiques étant nécessaire au projet, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable. Les deux yeux des souris seront valorisés quand cela sera possible afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les techniques de chirurgie de l’œil nécessaires à la réalisation du projet ont été acquises auprès d’un laboratoire de référence. La maîtrise des bons gestes chirurgicaux limitera les risques d’altération de la lentille lors des injections intraoculaires et augmentera la probabilité de créer des lésions du nerf optique bien calibrées et donc exploitables. Les animaux recevront des antalgiques avant et après lésion ainsi qu’une anesthésie locale juste avant le pincement du nerf optique. Les gestes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 3 jours suivant les pincements/injections, puis bihebdomadaire. Les animaux seront mis à mort en cas de dépassement des points limites fixés pour les différentes procédures. Après le réveil des animaux, les animaux sont remis dans leur cage et gardés pour une durée variable dépendante de la procédure (entre 1 heure et 44 jours pour la procédure la plus longue).

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle souris pour sa taille et son anatomie, particulièrement adaptées à la chirurgie ophtalmique. De plus, certains de nos tests seront réalisés avec des souris génétiquement modifiées existantes. Souris adultes âgées de 8 semaines. Les expériences sont réalisées à un stade où les rétines sont matures et dans lesquelles les neurones ont une capacité régénératrice minime afin de reproduire des conditions semblables à celles de la pathologie chez l’homme.