Procédures légères

2 macaques crabiers vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Ils reçoivent des injections hebdomadaires d'un oligonucléotide antisens et de très nombreux prélèvements sanguins sous anesthésie, avant leur mise à mort au vingt-huitième jour pour prélèvement des tissus. Le porteur mène une étude pilote sur deux individus juvéniles pour évaluer un candidat traitement de la myopathie de Duchenne. Il justifie le recours au primate par sa proximité anatomique avec l'humain et par le fait qu'une étude chez le rongeur ne serait pas transposable.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est la maladie musculaire la plus fréquente chez l'enfant avec une prévalence d’environ 1 garçon sur 5 000 à la naissance. Elle est due à une mutation sur le gène DMD situé sur le chromosome X qui poduit la protéine Dystrophine, indispensable au maintien de l’intégrité du tissu musculaire. L’absence de Dystrophine entraîne une fragilisation des muscles à chaque contraction et donc une dégénérescence musculaire progressive, qui atteint l'ensemble des muscles squelettiques (dont le diaphragme), mais aussi le coeur. La DMD se traduit dans un premier temps par une faiblesse musculaire des membres inférieurs, puis, la faiblesse musculaire atteint les membres supérieurs. L’atteinte du diaphragme entraine également une défaillance respiratoire. Avec le progrès de la prise en charge multidisciplinaire, l’espérance de vie des patients s’est considérablement allongée, mais elle ne dépasse pas l’âge de 30/40 ans. Il n'existe à ce jour aucun traitement disponible pour cette pathologie. Une approche thérapeutique particulièrement prometteuse repose sur la technique de saut d'exon. Elle consiste à corriger le messager DMD muté, en amenant dans les muscles touchés une molécule appelée "oligonucléotide antisens" qui va permettre de corriger le défaut génétique pour rétablir la production d'une protéine Dystrophine correcte. Dans ce projet, l’objectif général est de réaliser une étude pilote chez 2 primates nonhumains, afin d’évaluer le profil de sécurité et l'efficacité d'un "oligonucléotide antisens" susceptible d’être utilisée dans des futurs essais cliniques pour le traitement de la maladie de DMD pour les garçons porteurs de mutations pouvant êtres spécifiquement corrigées par cet "oligonucléotide antisens". L'évaluation de ce candidat thérapeutique sera réalisée après une injection par semaine pendant une durée totale de 4 semaines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet pilote sont de pouvoir sélectionner un "oligonucléotide antisens" candidat non toxique et présentant un fort potentiel thérapeutique pour le traitement de la Dystrophie Musculaire de Duchenne. En cas de succès, le produit sera évalué dans une étude de toxicologie réglementaire, afin de pouvoir ensuite prétendre à réaliser un essai clinique chez des patients DMD.

Procédures

Chaque animal de cette étude sera soumis aux interventions suivantes: - Dans les 2 semaines avant injection: un prélèvement sanguins, sous anesthésie (maximum 20min). - A J0, J7, J14 et J21 : injection intraveineuse du produit thérapeutique. - A J0 +10min, +30min, +1h, + 2h, +4h, +8h, J2, J3, J4, J7, J14, J14+4h, J15, J21, J21 +10min, +30min, +1h, + 2h, +4h, +8h, J22, J23, J24: un prélèvement sanguin sous anesthésie (maximum 20min). L'animal sera maintenu sous anesthésie gazeuse jusqu'au point T+2h. Pour les points T+4h et T+8h les prélèvements seront faits soit sur animaux vigiles s'ils se montrent coopératifs. Si ce n'est pas le cas, les 2 poinst (T+4h et T+8h) seront reunis en un T+6h qui sera effectué sous une anesthésie flash. - A J28: un prélèvement sanguin sous anesthésie (maximum 30min), avant mise à mort par injection intraveineuse d’une dose léthale de pentobarbital sodique.

Impact sur les animaux

L'ensemble des gestes réalisés sur ces animaux seront non invasifs (injection du produit thérapeutiques par voie intraveineuse et prélèvements sanguins par ponction veineuse). L’injection systémique de l'"oligonucléotide antisens" pourrait potentiellement induire, dans les minutes, heures ou jours après son injection une réaction inflammatoire (activation du complément, activation de cytokines inflammatoires) et une dérégulation du processus de coagulation. Cependant, selon les études précédentes réalisées avec ce genre de produit, ces réactions sont asymptomatiques chez les animaux. Malgré tout, un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie, chimie clinique et paramètres de coagulation) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute anomalie.

Devenir

A l'issu de la procédure décrite dans ce projet (à J28 de l'étude), les 2 animaux inclus seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus pour prélèvements de tissus post mortem, et réalisation des analyses moléculaires, biochimiques et histologiques rnécessaires pour analyser l'efficacité et la biosécurité du traitement. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Compte tenu des objectifs du protocole expérimental portant sur l'évaluation de l'efficacité d'un produit thérapeutique dans l'ensemble des muscles de l'organisme ainsi que de son profil de sécurité après injection systémique, il est nécessaire de l’administrer à un organisme entier. Cette étude n’est ainsi pas réalisable sur un modèle in vitro. D’autre part, compte tenu des différences phylogéniques et anatomiques majeures entre les rongeurs et l’Homme, la réalisation d’une étude préclinique relative au mode d’administration systémique ne peut s’envisager chez la rat ou la souris, communément utilisés en laboratoire. Les études préalables menées avec le produit thérapeutique chez la souris et in vitro sur cellules humaines ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une anatomie comparable à celle de l’homme comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le primate non humain est l’espèce qui apporter les données les plus pertinentes et les plus transposables en termes de biodistribution et de tolérance. Il est une espèce d'intérêt ici car particulièrement sensible aux réactions adverses pouvant potentiellement être entraînées par ce type de molécule.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus dans cette étude (2) a été évalué pour être un nombre minimal permettant des données d'évaluation du produit thérapeutique au niveau de son efficacité moléculaire et au niveau de sa potentielle toxicité systémique. Ce nombre est basé sur notre expérience précedente avec de type de molécule. Cette étude est considérée comme une étude pilote, et les animaux seront comparés en predose et post-traitement afin de minimiser le nombre d’animaux. Seulement si les molécules ne présentent pas de toxicité à ce stade et leur évaluation d’efficacité est satisfaisante, des études toxicologiques réglementaires avec un nombre d’animaux statistiquement suffisante seront engagés.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale, une 15aine de minutes pour effectuer un examen clinique complet et des prélèvements sanguins et environ 2H30 au moment de l'administration du candidat médicament. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences afin d’éviter l'apparition éventuelle d'une souffrance. Les conditions d'hébergement seront conformes à la réglementation et les animaux disposent de nourriture et d'eau ad libitum. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant de enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie anticipée.

Choix des espèces

Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par la proximité phylogénétique et anatomique (bipédie notamment) des macaques fascicularis avec l'Homme, qui les rendent les plus pertinents à l’évaluation de l'efficacité d'un produit après injection systémique. Finalement, le système immunitaire des macaques fascicularis comparable à celui de l'Homme en fait également l'espèce de choix pour évaluer la tolérance immunitaire au produit de thérapie génique testé. Les animaux seront inclus à un stade juvénile (entre 2 et 3 ans), afin de mimer le stade auquel les patients seront injectés dans le futur essai clinique.

51 grenouilles vont être utilisées, gardées en vie et réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Nées en captivité, elles sont déplacées entre terrariums et mises en présence d'autres individus pour observer leur comportement de reproduction, sans intervention invasive selon le porteur. Le stress possible se traduirait par une perte de poids et une léthargie, l'expérience étant arrêtée le cas échéant. Le projet relève de la recherche fondamentale sur l'évolution des colorations, le porteur y adjoignant un argument de conservation de cette espèce protégée.

Objectifs

Nous étudions l’adaptation chez la grenouille Dendrobates tinctorius de Guyane afin de mettre en évidence les mécanismes écologiques et évolutifs menant à la grande diversité de patrons de coloration. Chez cette espèce toxique d’amphibien, les motifs de coloration vifs sont une adaptation permettant d’avertir les prédateurs que l’attaquer représente un risque. Les nombreuses populations sont chacune caractérisées par combinaisons de colorations vives uniquement efficaces contre les prédateurs avec laquelle elles cohabitent. Le maintien d’une telle diversité morphologique dont les fonctions de répulsion des prédateurs sont bien comprises fournit une opportunité exceptionnelle de mieux comprendre comment les populations d’une même espèce prennent des directions évolutives distinctes. Dans le cadre de ce projet, nous cherchons à déterminer si Dendrobates tinctorius se reproduit préférentiellement avec des individus ayant la même coloration. Un tel comportement de reproduction expliquerait pourquoi le métissage entre populations de couleurs distinctes n’est pas observé et comment ces populations distinctes parviennent à se maintenir. Chez de nombreuses espèces présentant colorations anti-prédateurs, un tel mode de reproduction se met en place rapidement suite à la divergence des patrons de colorations entre les populations. Il est supposé qu’une préférence sexuelle pour des individus ayant le même patron de coloration (homogamie) est une stratégie permettant de prévenir l’apparition d’une progéniture ayant une coloration intermédiaire, non reconnue par les prédateurs comme étant toxique, et donc fortement éliminé par les prédateurs.

Bénéfices attendus

Deux bénéfices sont attendus de ce projet : Science fondamentale -> Ce projet permettra de documenter et de mieux comprendre les mécanismes microévolutifs ayant permis des évènements de diversification massifs chez les vertébrés terrestres. Gestion de la faune et conservation -> Dendrobates tinctorius est inscrit sur la liste des espèces protégées en France. Bien que sa distribution et ses caractéristiques d’histoires de vie soient très hétérogènes, cette espèce est considérée comme une unique entité de conservation. Parvenir à décrire les différences entre populations et la présence de barrières reproductives procurerait les arguments afin que chacune des populations soit considérée comme étant une ‘’Évolutionary Significant Unit’’ ayant chacune un plan de gestion approprié.

Procédures

Nous quantifions le comportement de reproduction de Dendrobates tinctorius. Aucune intervention invasive n'est éffectué.

Impact sur les animaux

Il est possible que certains individus démontrent du stress suite aux changements de terrarium ou au fait de rencontrer un individu inconnu. Le fait d’utiliser des individus nés en captivité permet de considérablement diminuer ce facteur (comparativement aux individus sauvages qui sont beaucoup plus sensible au stress). Les individus sont observés plusieurs fois par jour et si un individu semble stresser (perte de poids, inactivité, comportement anormaux), l’expérience sera arrêtée et l’individu sera rapidement remis dans son terrarium d’élevage et ne sera pas réutilisé. Un autre individu provenant de nos colonies prendra sa place. Dendrobates tinctorius est une espèce naturellement « « bien arrondie’’. Vus de haut, les individus démontrent de belles courbes ventrales lorsqu’en santé. Par contre, lorsque stressé ou malade, les individus vont rapidement perdre du poids (en 2-3 jours) ce qui se traduit dans un premier temps par la perte des courbes ventrales et don un aspect plus rectiligne et anguleux. Dès la détection de cette caractéristique morphologique, l’expérience est arrêtée. Parmi les comportements anormaux diagnostiques de stress chez D. tinctorius; 1) la perte d’appétit caractérisé entre autres par les individus ne sortant pas de découvert pour chasser les proies offertes, 2) la léthargie caractérisée par l’individu restant immobile et bougeant très peu (D. tinctorius est normalement très active) et 3) une posture au sol caractérisé par l’individu étant aplatis contre le sol plutôt que bien droit sur ces pattes. De plus, les animaux sont attrapés et déplacés à l’obscurité afin de limité le stress. Nous utilisons un contenant de 1L opaque que nous posons devant l’individu à attraper. Une fois que l’individu saute dans le contenant, nous le refermons et le déplaçons (vers le terrarium expérimental ou de résidence).

Devenir

Après la procédure (10 jours), les individus sont retournés à leurs terrariums de résidence. Ceux-ci seront maintenus sur la plateforme et réutilisés dans les autres projets à venir (e.g. acquisition des toxines de défenses, détermination de la présence de barrières post-zygotiques, disséquer en détail les modalités d’un choix de partenaires, etc).

Remplacement

Nous étudions spécifiquement les traits d’histoire de vie de Dendrobates tinctorius. Il est essentiel de travailler sur des individus vivant de cette espèce.

Réduction

Les animaux utilisés font partie d’un stock maintenu en vie et sur lequel de nombreux travaux sont et seront réalisés. Cette réutilisation des individus au sein de la plateforme expérimentale permet de diminuer considérablement le nombre d’individus à tester. Également, le design expérimental et statistique a été optimiser afin diminuer de près de moitié le nombre d’individus.

Raffinement

Le raffinement est essentiel au succès du projet. Nous cherchons à maximiser le bien-être des animaux afin que ceux-ci puissent mener leurs comportements de reproduction habituelle. Ces amphibiens n’initieront pas de parades nuptiales ni reproductions s’ils ne se sentent pas en sécurité ou si l’environnement n’est pas adéquat. En se basant sur nos techniques d’élevage qui ont fait leurs preuves, les conditions expérimentales sont mises en place afin de reproduire le mieux possible l’habitat naturel. Ceci implique que chaque terrarium est en soi un petit écosystème rempli de végétaux vivants et de décor tel des racines, souches, pierres générant un habitat hétérogène ou l’animal peut se cacher ou encore parader lorsqu’il le veut. Nous laissons ainsi, de façon passive, les animaux exprimer leurs comportements naturels.

Choix des espèces

Dendrobates tinctorius a été choisis spécifiquement pour son très haut ecotypisme adaptatif. L’écotypisme de patrons de coloration chez cette espèce est très impressionnant et rivalise sans difficulté avec la diversité retrouvée lors de radiations adaptatives en situation insulaire (Pinson de Darwin, Anoles, etc). Mais ici, il ne s’agit pas d’îles, mais bien de populations adjacentes sans barrières géographiques à la migration. Cette espèce est donc idéale pour parvenir à expliquer le maintien de cette diversité adaptative. Nous travaillons sur des individus sexuellement matures, car l’objectif du projet est de documenter les préférences sexuelles

440 génisses vont être utilisées, toutes gardées en vie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Quarante donneuses subissent environ cinq sessions de ponctions ovocytaires sous anesthésie épidurale après traitement hormonal de superovulation, et quatre cents receveuses reçoivent un transfert d'embryon, dont deux cents avec prélèvement sanguin. À l'issue, les donneuses sont recyclées vers d'autres projets ou vendues en élevage commercial et les receveuses restent dans leur exploitation. Le porteur décrit un objectif d'amélioration des taux de gestation au service de la sélection génétique bovine, et affirme qu'aucune autre espèce ne peut être choisie.

Objectifs

Actuellement, les biotechnologies de la reproduction et de l’embryon sont utilisées par les entreprises de sélection bovines afin d’accroitre le progrès génétique par la réduction de l’intervalle entre générations et l’augmentation de l’intensité de sélection. Cependant, les taux de gestation obtenus depuis le développement de ces techniques n’ont pas progressé. Pire, des taux de gestation atteignant seulement 35 à 40% sont obtenus dès lors que l’embryon utilisé a été produit in vitro, biopsié et congelé, conduisant à d’importantes pertes économiques et génétiques. Ces échecs peuvent en partie être attribués à une mauvaise évaluation de la qualité des embryons transférés qui ne sont, à ce jour, évalués que d’un point de vue morphologique selon les critères de l’International Embryo Technologies Society qui restent relativement subjectifs et donc variable d’un opérateur à l’autre. Le développement de marqueurs embryonnaires prédictifs de la réussite au transfert permettrait d’améliorer l’efficience de ces techniques par un tri plus sévère et objectif des embryons à transférer. Ce type d’indicateurs n’existe pas à ce jour mais des résultats préliminaires intéressants ont été obtenus par l’utilisation de systèmes de time-lapse permettant de suivre en continu les 1ères étapes du développement embryonnaire. Des embryons de qualité morphologique similaire, atteignant le même stade au même moment, affichent parfois une cinétique de développement totalement différente. Au cours d’un projet antérieur, des taux de gestation contrastés ont été obtenus après transfert d’embryons possédant un profil de développement différent (de 38 à 65% de gestation selon les classes d’embryons transférés). Ces premiers résultats, obtenus sur des effectifs trop faibles, nécessitent d’être confirmés à plus large échelle pour confirmer l’intérêt de ces approches de plus en plus utilisées en médecine humaine. Le projet présenté dans ce document vise donc à déterminer si la classification établie sur ces paramètres (4 classes d’embryons selon leur profil morphocinétique) conduit à des différences significatives de réussite au transfert. De plus, le projet vise également à étudier l'autre facteur de réussite indispensable à l'établissement d'une gestation qui est la réceptivité de la femelle receveuse d'embryons. De la même façon, des biomarqueurs sanguins intéressants ont été identifiés dans un projet antérieur et il convient aujourd'hui de les valider sur un effectif plus large.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider ou d’infirmer un nouvel indicateur non invasif de qualité embryonnaire chez les bovins. Ce projet permettra également de progresser dans les connaissances sur la réceptivité des femelles receveuses d'embryons et de valider ou d'infirmer les biomarqueurs sanguins candidats. In fine, l'amélioration des taux de gestation via ces deux approches conduira à une meilleure efficacité des schémas de sélection, notamment par la diminution du nombre d'animaux donneurs et receveurs nécessaires à la procréation des futurs taureaux d'insémination (gains économique, réduction de l'impact environnemental, impact social positif sur les acteurs du schéma).

Procédures

Les 40 génisses donneuses hébergées en conditions expérimentales seront soumises à environ 5 sessions de ponctions ovocytaires après anesthésie épidurale et traitement hormonal de synchronisation et de superovulation (durée de 30 minutes). Les 400 génisses receveuses hébergées en fermes commerciales seront soumises à 1 transfert embryonnaire après anesthésie épidurale et traitement hormonal de synchronisation des chaleurs (durée de 5 minutes). Pour 200 d'entre elles, elles subiront un prélèvement sanguin (durée de 1 à 2 minutes) à la veine caudale juste avant la réalisation du transfert embryonnaire.

Impact sur les animaux

Peu de nuisances sont attendues sur les animaux de ce projet. Les procédures expérimentales mises en oeuvre sont des pratiques couramment utilisées par les professionnels chez les bovins depuis de nombreuses années et ne semblent pas impacter la santé et le bien-être des animaux. En effet, la ponction ovarienne sous contrôle échographique et le transfert d'embryons sont deux techniques de reproduction couramment utilisées par les entreprises de sélection dans le cadre des schémas d'amélioration génétique et sont réalisées sous anesthésie épidurale. De ce fait, le projet présenté n'est susceptible d'engendrer qu'une douleur légère et très ponctuelle chez les animaux. De plus, les prélèvements sanguins, même si ils peuvent générer du stress de façon transitoire, ne devraient pas conduirent à des nuisances importantes (hématome de façon exceptionnelle) pour les animaux puisque ceux-ci sont peu nombreux et de faible volume.

Devenir

Les interventions réalisées sur les animaux étant des procédures d'élevage classiques qui n'induiront, à priori, que peu de nuisances, toutes les génisses seront normalement gardées en vie à la fin de ce projet sauf avis contraire du responsable scientifique, du vétérinaire sanitaire et des éleveurs impliqués. Les génisses donneuses seront éventuellement recyclées pour un autre projet de recherche ou de formation mais pourront également être mises à la reproduction hors expérimentation et vendues en élevage commerciaux pour poursuivre leur carrière. Les génisses receveuses, quel que soit l'issue du transfert seront conservées dans leur exploitation d'origine.

Remplacement

Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo.

Réduction

L’étude est mise en place dans les installations de la station de phénotypage ELIANCE sur un total de 40 génisses donneuses pour la production des embryons et sur 400 femelles receveuses en fermes commerciales. Afin de comparer les taux de gestation et les taux de vêlages entre les différentes catégories d’embryons, une régression logistique (PROC GLIMMIX sous SAS) sera effectuée. A priori, elle inclura l’effet fixe du groupe morphocinétique (A, B, C, D) ainsi qu’un effet aléatoire de l’élevage. D’autres effets pourront être intégrés au modèle après analyse des différents facteurs de variation de la base de données. Les effectifs prévus dans l’étude permettront, en considérant un risque alpha de 5% et une puissance de test de 80%, de mettre en évidence de façon significative une différence minimale de 20% entre les groupes. Des modèles de régressions linéaires pourront également être effectués pour étudier d’autres variables quantitatives (intervalle de temps entre le transfert d’embryons et les échecs de gestation…). Selon les résultats obtenus, d’autres approches statistiques de type random forest pourront aussi être menées (prédiction des taux de gestation à partir des paramètres morphocinétiques bruts) afin d’optimiser l’arbre de classification morphocinétique des embryons. L'analyse des paramètres sanguins des 200 femelles receveuses sera également effectuée par des approches multivariées (ACP, PLS-DA, régressions linéaires intégrant les effets fixes de la gestation et de la classe d'embryons) intégrant les mêmes niveaux de risques statistiques mais également des analyses de type randon forest pour la prédiction de gestation à partir des différents marqueurs mesurés.

Raffinement

Les génisses donneuses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, rumination) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales...). En dehors de l'enrichissement du milieux, le raffinement des procédures sera également recherché par la réalisation d'une anesthésie épidurale préalablement à chaque ponction ovocytaire. Compte-tenu de ces précautions, le projet présenté n'est susceptible d'engendrer qu'une douleur légère et très ponctuelle chez les génisses. En cas d’atteinte du point limite (posture de compensation, station prolongée debout ou couché, difficulté pour manger et boire, chute importante de rumination ou de l'activité, modification comportementale induite par stimulation de la zone douloureuse, lésions, modifications neurovégétatives ou physiologiques), les procédures expérimentales seront stoppées et les solutions thérapeutiques à apporter seront définies par le vétérinaire sanitaire de l'élevage. Dans un objectif de renforcement positif, une récompense alimentaire (concentrés, seau de mélasse à lécher,....) sera donnée aux femelles après chaque passage dans la cage de contention. Les femelles receveuses seront conduites selon les pratiques en place dans les élevages concernés. Une anesthésie épidurale sera également réalisée avant chaque transfert embryonnaire. Une attention particulière sera apportée juste après le retrait de l'aiguille en réalisant un point de compression suffisamment long pour réduire au maximum le risque d'hématome et préserver l'intégrité des tissus entre chaque prise de sang.

Choix des espèces

Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon. Les animaux donneurs utilisés dans ce projet seront des génisses, toutes pubères. Le modèle génisse a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….). Sur le terrain, les transferts sont également majoritairement réalisés sur des génisses car les taux de réussite sont supérieurs à ceux obtenus sur vaches.

60 chevaux vont être utilisés, gardés en vie et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils servent à entraîner le personnel aux prélèvements sanguins et gastriques, non pour produire des connaissances, chaque cheval pouvant subir un prélèvement une à quinze fois sur les cinq ans du projet. Le sondage gastrique passe par le naseau sous anesthésie locale, avec administration d'un tranquillisant si l'animal montre des signes de nervosité. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer le cheval vivant pour ces gestes.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de former le personnel de l'établissement aux prélèvements couramment réalisés sur les chevaux(sanguins et gastriques). Cette formation permettra d’assurer des prélèvements de qualité pour les études tout en réduisant le stress pouvant éventuellement être ressenti par les animaux. De plus, les séances d’entrainement permettront aux chevaux de s’accoutumer aux prélèvements ce qui facilitera leur manipulation ultérieure.

Bénéfices attendus

La montée en compétence du personnel engendrera des gestes plus précis et plus sûrs lors des prélèvements ce qui permettra de diminuer le stress éventuel ressenti par les animaux. De plus, les prélèvements seront de meilleures qualités ce qui pourra permettre de diminuer leur durée.

Procédures

Les chevaux seront soumis à des prélèvements sanguins et gastriques puisqu'il s'agit de l'objectif de la formation. Ils seront vigiles durant ces prélèvements. Il n'y aura qu'un prélèvement par session de formation par cheval. Les prélèvements sanguins dureront 5 minutes chacun et pourront être répétés au bout de deux jours et les prélèvements gastriques, d'une durée maximale de 30 minutes pourront être répétés au bout d'une semaine. Chaque prélèvement sera réalisé entre une et quinze fois par cheval sur la durée totale du projet, soit 5 ans.

Impact sur les animaux

L’introduction de la sonde pour les prélèvements gastrique peut induire une gêne légère de courte durée. Afin de limiter cette gêne, l’embout de la sonde est recouverte d’huile de paraffine pour faciliter son passage et elle est placée dans de l’eau chaude 10 min avant intubation pour l’assouplir et éviter de surprendre le cheval avec un matériel trop froid. Pour réduire le stress et la gêne, une anesthésie locale du naseau est systématiquement réalisée et si l’animal présente des signes de nervosité, un tranquillisant lui est administré. En outre la sonde utilisée est adaptée au diamètre de l’œsophage et sa longueur permet d’atteindre l’estomac en laissant une partie assez longue à l’extérieur pour suivre les mouvements éventuels de la tête du cheval sans le contraindre. L'introduction de l'aiguille pour le prélèvement sanguin peut entrainer une gêne légère qui n'est que passagère et cesse au retrait de l'aiguille.

Devenir

Il n'est pas attendu de dommage pour les animaux utilisés dans ces formations avec des procédures de classe légère, ils pourront donc être réutilisés.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de s'entrainer aux techniques de prélèvements sanguins et gastriques sur cheval, et aucun modèle in vitro ne permet actuellement de remplacer le comportement du cheval lors de ces prélèvements.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été réduit au maximum pour qu’un utilisateur puisse maitriser une technique. Il est considéré que pour être formé, un manipulateur a besoin de s’entrainer sur trois chevaux pour chacune des deux procédures. Les deux procédures étant de classe légère, un animal pourra être utilisé successivement pour les deux procédures. Enfin, un animal pourra être réutilisé pour la même procédure, sous réserve qu’un temps de récupération suffisant (un jour pour les prélèvements sanguins et trois jours pour les prélèvements gastriques) ait été observé entre les deux procédures, afin de diminuer le nombre total d’animaux utilisés pour ces formations.

Raffinement

Les chevaux étant des animaux grégaires, ils sont sortis tous les jours au paddock en groupe. Ceci permet de respecter leur bien-être. Ils sont hébergés dans des boxes séparés par des barreaux leur permettant de se voir et de se sentir. De plus, le personnel animalier observe quotidiennement le comportement de chaque cheval au moment de la distribution des repas afin de repérer les signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels sont immédiatement signalés au responsable de la mise en œuvre du projet. Les prélèvements ont lieu dans un travail adapté à la manipulation des chevaux pour éviter tout risque de blessure, et les manipulateurs sont préalablement formés à la manipulation des chevaux. Pour les prélèvements de contenu gastrique, une anesthésie locale par pulvérisation est systématiquement réalisée afin de limiter la gêne au moment de l’intubation. De plus, l’embout de la sonde est recouvert d’huile de paraffine pour faciliter son passage et elle est placée dans de l’eau chaude 10 min avant intubation pour l’assouplir et éviter de surprendre le cheval avec un matériel trop froid. En outre la sonde utilisée est adaptée au diamètre de l’œsophage et sa longueur permet d’atteindre l’estomac en laissant une partie assez longue à l’extérieur pour suivre les mouvements éventuels de la tête du cheval sans le contraindre. Enfin, si l’animal présente des signes de nervosité, un tranquillisant lui est administré. La durée de cette procédure est limitée à une demi-heure et le comportement des chevaux est surveillé durant celle-ci.

Choix des espèces

L'espèce cible de ces manipulations étant les chevaux, les manipulateurs ne peuvent pas être autrement formés à la pratique de ces gestes que sur des chevaux vivants. Les chevaux utilisés seront tous adultes (entre 4 et 15 ans) car c'est le stade physiologique utilisé dans les études nécessitant ces prélèvements et ils sont plus calmes que de jeunes animaux.

2 500 animaux, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une injection de tacrine qui déclenche des tremblements de la mâchoire, un modèle des tremblements de la maladie de Parkinson, puis des candidats médicaments et des prélèvements de sang. Le porteur indique que les tremblements disparaissent une fois la substance éliminée et que les animaux seront tués pour prélèvements. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut reproduire ce "phénotype comportemental".

Objectifs

La maladie de Parkinson découle d'une perte progressive des neurones dopaminergiques. Le déficit en dopamine induit de graves troubles moteurs chez le patient. Les tremblements de repos constituent l'un des symptômes de cette maladie. On peut reproduire chez l’animal ces tremblements par l’injection d’une substance médicamenteuse : la tacrine. On observera alors des tremblements au niveau de la mâchoire. Ces tremblements peuvent être diminués ou arrêtés par des composés qui augmentent la quantité de dopamine dans le cerveau.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les tremblements induits par la maladie de Parkinson, une pathologie humaine touchant 14 personnes sur 100000 dans la population globale. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la maladie de Parkinson. Pour l'animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l'espèce utilisée au travers du développement d'outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l'espèce la plus prédictive en fonction des objectifs scientifiques.

Procédures

Durant la procédure, les animaux sont principalement soumis à des injections (du candidat médicament, de la substance induisant les tremblements, moins de 30s par administration), seront placés dans un cylindre pour une période d'observation et pourront éventuellement être sujet à des prélèvements de sang vigiles ou anesthésiés (2 minutes).

Impact sur les animaux

Du fait du mécanisme d'action de la substance chimique active (tacrine), on s'attend à observer des tremblements (objectif du projet) qui disparaitront une fois que cette dernière sera éliminée par l'organisme (après quelques heures). Les animaux receveront une injection des différents composés (candidats médicaments et tacrine) à tester.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés. Dans ce cas, celle-ci peut survenir à des fins de prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux.

Remplacement

D’après une recherche bibliographique approfondie, il n’existe pas de méthode alternative (in vitro ou in silico) qui n’utiliserait pas d’animaux puisque les tremblements représentent un phénotype comportemental observable uniquement chez des animaux. Il est donc nécessaire de modéliser certains aspects de la maladie de Parkinson sur un organisme entier pour pouvoir réaliser une évaluation comportementale avec des tests fiables, reproductibles, validés et reconnus par la communauté scientifique. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation des différentes propriétés d’un candidat médicament.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats obtenus lors des expériences et d'effectuer des tests statistiques pertinents. En général, 10 animaux/groupe sont utilisés. L'analyse statistique sera adaptée au modèle

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : -La mise au point de procédures rigoureuses, -la formation du personnel à ces dernières, - un suivi quotidien de l'état de santé des animaux, -le recours à des procédures les moins invasives possibles, -le suivi d'éventuels signes cliniques, -le recours aux techniques d'anesthésie et d'analgésie dès que nécessaire, -la détermination des points limites, -le recours aux procédures d'euthanasie dès que nécessaire, -la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l'amélioration de la sensibilité des méthodes d'analyse, -la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les tremblements car ils présentent une similarité de l’organisation fonctionnelle des régions cérébrales avec l’homme, et il est possible de confronter les résultats avec une littérature abondante Animaux adultes : ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

15 450 animaux, lapins, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit une injection dans l'oeil pour provoquer une fuite des vaisseaux de la rétine, puis des examens ophtalmologiques et des prélèvements sanguins, certains subissant plusieurs inductions successives espacées d'une semaine. Le porteur indique que l'atteinte est transitoire et que les animaux seront tués pour des analyses des tissus. Il justifie le recours à trois espèces par leurs différences de taille d'oeil et l'absence de modèle reproduisant l'oeil dans sa globalité.

Objectifs

Les atteintes vasculaires de la rétine sont communes à plusieurs maladies telles que le diabète, les uvéites, les occlusions veineuses ou l’hypertension, ce qui les rendent responsables de la majorité des pertes de vision dans les pays industrialisés. Ces pathologies entrainent une détérioration des capillaires sanguins de la rétine qui perdent leur étanchéité. L’augmentation de la perméabilité vasculaire et la rupture de la barrière hémato-rétinienne est une étape clé dans l’installation de la maladie qui peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec une production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un oedème au niveau de la macula, zone de la rétine responsable de la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. L'objectif de ce projet est d’obtenir un modèle de perméabilité vasculaire afin de tester des traitements potentiels chez le lapin et le rongeur. Le modèle est développé chez plusieurs espèces pour offrir un choix plus étendu de possibilités de traitements, la taille réduite des yeux des rongeurs permet l'utilisation de quantités moindres de traitement, au contraire la taille plus importante de l'oeil de lapin permet de tester des traitements plus proches de ceux appliqués à l'homme comme la pose d'implant.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements luttant contre la perméabilité vasculaire au niveau de la rétine. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et préserver au mieux la vision des patients.

Procédures

Le déclenchement du modèle expérimental est dû à une injection intravitréenne. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur les recommandations du Gircor et durent moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Ces modèles expérimentaux induisent une augmentation de perméabilité vasculaire transitoire, le retour à la normale se fait en quelques jours.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance (placé à 0,8) avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux. L'induction est transitoire, les animaux peuvent avoir une nouvelle induction après une période de repos d'une semaine dans un souci de réduction du nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’oeil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dans les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les lapins 8 semaines, âge minimum pour la maturation de la rétine comme il convient au modèle.