Procédures légères
Étude de l’application locale d’une cytokine comme adjuvant lors de vaccinations par voie muqueuse
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
- Système urogénital
3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 24 d'entre elles et modéré pour 3 756. Elles reçoivent des administrations intra-trachéales ou intra-vaginales, puis sont infectées par le virus de la grippe ou de l'herpès, avec des lavages vaginaux répétés et une injection rétro-orbitale, pour tester une cytokine comme adjuvant de vaccination muqueuse. Le porteur indique que la grippe provoque une perte de poids importante et que l'herpès peut entraîner des lésions génitales et, dans les cas les plus graves, une paralysie des membres postérieurs. Les retombées annoncées, des essais cliniques humains et des applications vétérinaires, restent conditionnelles, tandis que le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal vivant.
Objectifs
La plupart des agents infectieux (bactéries et virus) pénètrent dans l’individu qu’ils infectent en traversant les muqueuses, barrières naturelles entre le milieu extérieur et l’organisme. Les principales portes d’entrée sont l’appareil respiratoire (muqueuse nasale, bronches et poumons), l’appareil digestif (muqueuse buccale, estomac, intestins), et de l’appareil génital (muqueuse vaginale et du pénis). Induire une immunité muqueuse par vaccination reste un objectif important non encore atteint car les vaccins actuels, administrés par injection dans les muscles ou la peau, ne ciblent pas spécifiquement ces sites d’infection. Or, une immunité robuste aux niveaux des muqueuses devrait permettre de protéger l’organisme de l’infection par les pathogènes dont l’invasion passe par ces muqueuses en induisant la formation d’une barrière immunologique locale capable de bloquer les agents infectieux avant leur entrée dans l’organisme. Néanmoins, les nombreuses tentatives d’induction d’une telle immunité restent, à ce jour, peu satisfaisantes. Il a été montré que l’application d’un médiateur protéique de l’immunité à la surface des muqueuses respiratoires et génitales permet d’attirer rapidement les cellules immunitaires dans ces tissus, préalable indispensable à la mise en place d’une réponse immunitaire locale. Le but de notre projet est donc d’établir la preuve de concept que l'administration de cette molécule à la surface des muqueuses prépare cette muqueuse à répondre plus efficacement à une stimulation antigénique (effet adjuvant), ce qui permettrait la mise en place de réponses immunitaires locales efficaces pour éviter l’infection par ses voies. Cette preuve de concept sera réalisée dans 2 modèles d’infection expérimentale chez la souris : l’infection de l’appareil respiratoire par le virus de la grippe et l’infection vaginale par le virus de l’herpès. En parallèle, nous explorerons les mécanismes immunitaires induits dans les muqueuses suite à cette administration locale et responsables de l’augmentation de la réponse immunitaire locale. Nous évaluerons le recrutement de cellules immunitaires et leur organisation dans les tissus muqueux, ainsi que le développement de la réponse anticorps spécifique dans les muqueuses pulmonaire et vaginale. Cette partie de l’étude permettra d’approfondir nos connaissances sur le développement de l’immunité des muqueuses, encore mal comprise aujourd’hui.
Bénéfices attendus
Par ces études, nous espérons mettre au point des protocoles de vaccination par voie muqueuse qui devraient permettre non seulement de protéger les animaux contre l’effet pathogène d’une infection mais aussi, en stimulant le développement d’une immunité locale spécifique, de protéger les animaux contre l’infection elle-même, ce qui aurait pour conséquence de stopper la transmission à de nouveaux hôtes. Si notre hypothèse est confirmée, cela permettra de proposer l’utilisation de la molécule que nous utilisons comme adjuvant de vaccination muqueuse contre un éventail plus large de pathogènes colonisant l’hôte par voie muqueuse, mais aussi de proposer des essais cliniques chez l’homme, la molécule étant agréée par les agences de santé (AFSAPS et FDA) pour son utilisation dans des protocoles cliniques. La méthode d’immunisation pourrait également être développée dans le domaine vétérinaire, la vaccination des animaux d’élevage étant un facteur important dans la maitrise des épizooties. En outre, quel que soit le succès en termes d’induction d’une immunité muqueuse protectrice, ce projet permettra d’accroitre nos connaissances du système immunitaire muqueux.
Procédures
Dans le protocole, seules les injections sous cutanées et les injections intra-péritonéales seront réalisées sur animaux vigiles. Ces procédures durent moins de 30 secondes. Tous les autres gestes techniques décrits ci-dessous seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse. Pour les expériences de vaccination, les souris seront soumises à 1 à 4 administrations intra-trachéales ou intra-vaginales d’adjuvant et/ou d’immunogènes. Ces administrations seront effectuées soit ensemble, soit à 2 jours d’intervalle. Une administration intratrachéale dure entre 30 secondes et 1 minute. Lorsque les expériences visent à évaluer la protection des animaux vaccinés contre une épreuve virale, les souris seront infectées par voie intra-nasale par des virus de la grippe 1 fois. L’infection par voie intranasale dure environ 1 minute. Les souris immunisées par voie vaginale seront infectées par le virus de l’herpès 1 fois par voie intra-vaginale. L’infection par voie intravaginale dure environ 30 secondes. Dans les procédures qui incluent des administrations vaginales, les souris subiront des lavages de la cavité vaginale avant les infections et entre 1 et 8 fois par animal dans un laps de temps maximum de 49 jours. Cet acte dure environ 1 minute. Dans les procédures de mise au point des immunisations, les souris recevront 1 injection intra-veineuse rétro-orbitale (30 secondes) puis seront maintenues sous anesthésie gazeuse pendant 5 minutes. Pour l’étude des migrations cellulaires induites par les immunisations, les souris recevront 1 injection intra-péritonéale. Cet acte dure moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
La molécule que nous proposons comme adjuvant de vaccination est utilisée en clinique, depuis plusieurs années, dans différents essais thérapeutiques visant à reconstituer les populations lymphocytaires chez les patients. Lors des essais cliniques chez les patients ou d’expérience précédentes chez la souris l’administration de cette molécule n’a pas entrainé d’effet adverse majeur. De même, l’administration de l’antigène que nous utilisons par voie intra-trachéale n’engendre pas d’effet adverse notable. Il est fort probable qu’il en sera de même en administration vaginale. Cependant, il peut arriver que suite aux administrations intra-trachéales, une souris présente des signes de souffrance ou de détresse respiratoire. La vaccination intravaginale est atraumatique et ne présente en tant que tel aucun risque. L’infection par le virus de la grippe est pathogène chez la souris. Aux doses utilisées dans notre protocole, une majorité des souris infectées sans vaccination préalables développe une pathologie principalement marquée par un état grippal et une perte de poids importante. Cependant, même après une perte de poids importante en phase aiguë de l’infection par le virus de la grippe, les souris éliminent généralement l’infection en 10-12 jours et retrouvent leur état initial vers le jour 14. Dans le cas de l’infection par le virus de l’herpès, des signes similaires peuvent être observés. De plus, si l’infection se développe, des lésions vésiculaires peuvent apparaitre au niveau de l’appareil génital. Ces manifestations sont réversibles en quelques jours. Dans les cas les plus graves, on observe des signes de paralysie des membres postérieurs.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort pour nous permettre une étude approfondie des organes cibles de l’immunisation et/ou de l’infection, ainsi que des réponses immunitaires.
Remplacement
Nos expériences concernent la mise en place d’une réponse immunitaire muqueuse suite à une vaccination. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux vivants pour ce type de protocole. En effet, le développement d’une réponse immunitaire muqueuse est un processus complexe qui implique à la fois le tissu muqueux lui-même et le système immunitaire dans son ensemble, combinaison qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro. Au préalable des expériences, nous avons réalisé des dosages in vitro du stock viral infectieux de virus de l’herpès que nous allons utiliser in vivo. Ce dosage en quantité de virus et titre infectieux nous permet de réduire le nombre de doses à utiliser pour établir la meilleure dose infectieuse à administrer aux souris, donc de limiter le nombre de souris. Le virus de la grippe que nous utilisons a déjà été titré in vitro et in vivo et est utilisé en routine, in vivo chez la souris. La dose infectieuse étant déjà établie, nous n’avons pas besoin de la doser ici. Le neuropeptide dont nous testons l’effet inhibiteur sur l’infection vaginale ainsi que ses 2 analogues chimiques ont ont été testés in vivo et dans les modèles cellulaires en culture, sans montrer de toxicité particulière.
Réduction
D’après nos études précédentes, l’impact de l’administration de la protéine que nous utilisons comme adjuvant de vaccination muqueuse sur les muqueuses est suffisamment important pour que des groupes de 12 souris soient suffisants pour observer des différences significatives au seuil de 5% dans les expériences de mesure de réponse immune après immunisation par l’antigène modèle. De même, notre étude préliminaire montre que la protection contre la pathologie induite par l’infection par le virus de la grippe devrait être statistiquement significative avec des groupes de 12 souris. Compte tenu des données de la littérature, nous estimons que des groupes de 12 souris devraient également permettre de conclure sur l’efficacité vaccinale dans le modèle d’infection par le virus de l’herpès génital. Cependant, si des différences significatives sont obtenues avec les premières expériences réalisées sur des groupes de 6 souris, nous réduirons les groupes expérimentaux à 6 individus.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en papier maché ainsi que de coton et d’une nacelle pour faire leur nid. Pour limiter le stress induit par la manipulation des animaux, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale, à l’exception des injections sous cutanées et intra-péritonéales. Pour chaque procédure expérimentale, une grille de score adaptée a été mise en place de manière à évaluer l’apparition éventuelle de toute souffrance ou détresse et pouvoir y remédier. Des points limites ont été fixés pour chaque procédure.
Choix des espèces
Le modèle souris, largement utilisé en laboratoire, est utilisé pour sa praticité et la bonne connaissance de son système immunitaire. Ces animaux sont susceptibles à l’infection par le virus de la grippe et le virus de l’herpès et développent une pathologie suite à l’infection par ces virus et peuvent être immunisés contre eux par vaccination. La souris présente également un système immunitaire muqueux proche de celui de l’Homme, les données obtenues grâce à nos expériences pourront alors ouvrir la voie à de nouvelles recherches chez l’Homme. De plus, dans le modèle souris, des lignées dont certains gènes ont été invalidés sont particulièrement intéressantes et seront utilisées pour notre étude. Animaux adultes âgés de 7-8 semaines, âge à partir duquel le système immunitaire est considéré comme mature chez la souris et les souris suffisamment jeunes pour avoir des réponses immunes de bonne qualité.
Evaluation des capacités d’un aliment enrichi en fibres à diminuer les effets délétères d’un stress chronique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles subissent un stress chronique de sept semaines, des prises de sang à la queue et une série de tests comportementaux dont la suspension par la queue et l'isolement en cage individuelle, pour évaluer si un aliment enrichi en fibres atténue les effets du stress. Le porteur attend des symptômes comme une toilette négligée et une perte de poids, les souris étant tuées pour analyser cerveau et tube digestif. Il présente l'axe microbiote-intestin-cerveau et affirme qu'aucune alternative non animale n'est assez sophistiquée pour cette étude, un bénéfice pour les troubles psychiatriques humains restant annoncé.
Objectifs
Le stress chronique a des effets délétères bien établis sur le cerveau et le comportement ; il favorise notamment l’émergence de symptômes d’anxiété et de dépression. Parallèlement, des études menées ces dernières années par divers groupes montrent que le stress chronique provoque un déséquilibre du microbiote intestinal. L’existence de l’axe microbiote-intestin-cerveau conduit à l’hypothèse qu’une partie au moins des symptômes neuro-comportementaux liés au stress chronique, tels que l’anxiété, la résignation ou l’incapacité à ressentir du plaisir, pourrait résulter du déséquilibre du microbiote intestinal. L’objectif du projet est de tester si une formulation alimentaire enrichie en fibres, connue pour favoriser le maintien de l’équilibre du microbiote intestinal, peut atténuer les conséquences néfastes du stress chronique sur le cerveau et le comportement.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de contribuer à documenter (i) le rôle et les mécanismes d’action du microbiote intestinal dans les perturbations cérébrales et comportementales induites par l’exposition à un stress chronique, (ii) la possibilité d’intervenir à l’échelle du régime alimentaire pour atténuer ces perturbations en préservant l’équilibre du microbiote. La progression des connaissances dans ce domaine peut avoir des bénéfices chez les êtres humains en améliorant la prise en charge des troubles psychologiques / psychiatriques liés au stress chronique. Ces bénéfices ont donc un intérêt dans le domaine de la santé humaine, mais aussi dans le domaine de l’économie de la santé, dans la mesure où des interventions nutritionnelles visant à préserver ou restaurer l’équilibre du microbiote intestinal sont moins coûteuses que le développement de médicaments.
Procédures
- 1 implantation sous-cutanée de transpondeur destinée à identifier les souris de manière unique et pérenne (souris vigiles, toutes les souris) - 2 prises de sang à la veine de la queue à 2 semaines d’intervalle (souris vigiles, toutes les souris) : 2 min maximum ; application préalable d’une crème anesthésique locale - 4 tests comportementaux impliquant une contrainte environnementale de quelques minutes (souris vigiles, toutes les souris, une fois par souris) : test de l’openfield pendant 6 min ; test du nouvel objet pendant 10 min maximum ; test du labyrinthe en croix surélevé pendant 5 min ; test de suspension par la queue pendant 6 min - 2 tests comportementaux impliquant un hébergement en cages individuelles de 6 jours (souris vigiles, toutes les souris, une fois par souris) : test de nidification consistant à fournir à chaque souris un carré de coton le soir et à évaluer le lendemain matin la qualité du nid construit ; test de préférence au sucre consistant à présenter aux souris pendant quelques jours consécutifs un biberon d’eau et un biberon d’eau sucrée ; la consommation des boissons est mesurée chaque jour. Les cages individuelles sont les unes à côté des autres de telle sorte que les souris peuvent se voir et communiquer par vocalisations ; leur environnement est enrichi (buchettes de bois à ronger, tunnels où se cacher, papier à déchiqueter).
Impact sur les animaux
Le projet porte sur le stress chronique. Il est donc attendu que les souris présentent, au fur et à mesure de la durée du stress, des symptômes tels que toilette négligée et perte de poids. Toutefois, il s’agit d’une procédure de stress chronique modéré, dont l’utilisation par de nombreux groupes montre qu’elle conduit à des symptômes modérés. Le test de suspension par la queue constituera un stress de quelques minutes ; les tests destinés à évaluer le comportement de type anxieux, qui durent au plus 10 min, provoqueront une anxiété transitoire légère ; les tests de nidification (une nuit) et de préférence pour le sucre (3 jours) nécessiteront d’héberger les souris en cages individuelles pendant 6 jours. Les prélèvements fécaux n’occasionneront aucune nuisance ou douleur aux animaux puisqu’il s’agit de selles spontanément émises. La prise de sang à la veine de la queue avant et après le test de suspension par la queue occasionnera une douleur transitoire légère.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de la procédure pour étudier différents paramètres biologiques dans les organes cibles de la procédure, à savoir le cerveau et le tube digestif.
Remplacement
A l’heure actuelle, étudier l’effet du stress chronique et d’une intervention nutritionnelle sur le cerveau et le comportement nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative technique non animale suffisamment sophistiquée pour le remplacer.
Réduction
Nous utiliserons 14 souris par groupe. L’expérience de différents groupes de recherche dans l’étude du comportement lors d’une procédure de stress chronique modéré imprévisible indique qu’un effectif de 12-15 souris par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets statistiquement significatifs. En effet il arrive que certaines souris n’effectuent pas les tests comportementaux correctement ; leurs données doivent alors être éliminées, ce qui réduit artificiellement la taille du groupe et peut conduire à un effectif insuffisant pour espérer mettre en évidence un effet statistiquement significatif. Dans ce projet, les données issues des tests comportementaux seront analysées en deux étapes. Dans une première étape, nous comparerons les 3 groupes traités (stress chronique, stress chronique avec aliment enrichi en fibres à deux doses différentes) et le groupe témoin (pas de stress chronique ni d’intervention nutritionnelle) à l’aide à l’aide outils statistiques adaptés et validés pour ce type d’étude. Dans une seconde étape, nous analyserons mathématiquement l’effet dose de l’intervention nutritionnelle à l’aide des 3 groupes soumis au stress chronique : aliment témoin sans fibres (dose 0), aliment témoin avec fibres à la dose 1, aliment témoin avec fibres à la dose 2.
Raffinement
Le projet porte sur le stress chronique. Il est donc attendu que les souris présentent, au fur et à mesure de la durée du stress, des symptômes tels que toilette négligée et perte de poids. Afin de suivre l’intensité de ces symptômes, nous mesurerons le poids corporel et évaluerons l’état du pelage selon une grille de notation pré-établie, une fois par semaine pendant les 7 semaines de stress chronique. La grille de notation de l’état du pelage consiste à examiner 10 endroits du corps et à les noter 0 (pelage bien entretenu) ou 1 (pelage négligé) : les 10 notes sont additionnées pour aboutir à un score global pouvant aller de 0 à 10. Ces mesures permettront de vérifier que la procédure de stress chronique a les effets attendus et d’en ajuster les paramètres de façon à ce que ces effets restent modérés (perte de poids ne dépassant pas 15 %, score d’état du pelage ne dépassant pas 8). En effet, si la perte de poids excède 15 % du poids initial ou si le score d’état du pelage dépasse 8, la procédure de stress chronique sera immédiatement ajustée afin de diminuer ses effets. L’ajustement consistera à interrompre la procédure pendant 2 jours puis à la reprendre en atténuant son intensité. Afin de minimiser le stress subi lors des 2 prises de sang à la veine de la queue, les souris seront entraînées aux manipulations destinées à effectuer ces prises de sang. Toutes les souris disposeront d’un environnement enrichi grâce à des buchettes de bois à ronger, du papier à déchiqueter, des cylindres en plastique où se cacher et sur lesquels grimper.
Choix des espèces
La majorité des études précliniques publiées sur les effets du microbiote sur le cerveau et le comportement, en particulier celles étudiant l’influence de modifications alimentaires, font appel à des rongeurs, dont la souris. Nous pourrons donc comparer aisément nos résultats à ceux publiés dans la littérature sur ce sujet. Par ailleurs, la souris est un modèle très utilisé en neurosciences, pour lequel nous disposons de procédures de stress chronique et de tests comportementaux bien établies et utilisées par la communauté scientifique internationale de manière consensuelle. En particulier, la souris réagit au stress chronique par des comportements tels que l’anxiété, la résignation et l’incapacité à ressentir du plaisir. Elle est donc un bon modèle pour étudier le rôle du microbiote dans ce type de comportement. Nous utiliserons des animaux adultes (≥ 8 semaines), l’objectif étant d’étudier les effets d’une intervention nutritionnelle sur les effets néfastes d’un stress chronique chez des animaux dont le cerveau est complètement développé (donc après l’adolescence) et le microbiote stable (stade de vie adulte).
Essai de traitement de l’acné dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles sensoriels
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une lésion de type acnéique leur est provoquée par injection sous la peau, puis une pommade est appliquée quotidiennement pendant huit jours, pour tester un extrait de propolis contre l'acné. Le porteur n'attend qu'une inflammation localisée et un stress lié à la manipulation, les souris étant tuées pour prélever la peau. Il juge le modèle animal "incontournable" faute de modèle de peau reconstituée réunissant toutes les cellules de l'inflammation.
Objectifs
L’acné est une maladie chronique de la peau qui survient lors de modifications hormonales en particulier au moment de l’adolescence. Elle touche trois adolescents sur quatre et des jeunes adultes des deux sexes. La sécrétion de sébum dont la fonction est de protéger la peau devient excessive dans les follicules pilosébacés : les pores de la peau s'obstruent et des points noirs (comédons ouverts) ou points blancs (comédons fermés ou « microkystes ») apparaissent. Les points blancs peuvent s’enflammer à cause d’une bactérie (Propionibacterium acnes) et devenir des « boutons » rouges non-purulents (les papules), purulents (les pustules) ou des « boutons » de plus grande taille généralement douloureux et ancrés profondément dans la peau (nodules). L’acné peut avoir des répercussions psychologiques (troubles de l’humeur, dépression, altération de l’image de soi) car elle affecte le visage et la partie supérieure du thorax. Des cas sévères montrent des lésions cicatricielles et donnent un aspect grêlé au visage. Le traitement de l'acné repose en fonction de sa gravité sur la combinaison d'un traitement local (antiseptique comme le peroxyde de benzoyle et antibiotique de la famille des macrolides ou des tétracyclines) avec un traitement par voie orale (antibiotique et rétinoïde pour diminuer la sécrétion de sébum). Un traitement hormonal associant oestrogène et progestatif peut être proposé exclusivement aux femmes. Ces traitements ont des effets secondaires : résistances de bactéries aux antibiotiques, sécheresse cutanée, effet contraceptif...Notre projet vise à démontrer l'efficacité de composants naturels extraits de certaines propolis qui ont prouvé in vitro une efficacité sélective sur Propionibacterium acnes et Staphylococcus aureus sans affecter Staphylococcus epidermidis. Le traitement sera proposé sous forme de crème en application topique. Nous chercherons à mettre en évidence un effet curatif et un effet préventif.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à apporter une nouvelle possibilité de traitement de l'acné. Notre composé est un produit naturel extrait de certaines propolis, il n'appartient à aucune famille d'antibiotique connue. Ce composé éviterait les effets secondaires des traitements existants.
Procédures
Les animaux subiront une anesthésie gazeuse de quelques minutes pour pratiquer une injection intradermique. Les animaux subiront une application quotidienne de pommade sur les lésions (durée 1 minute pendant 8 jours).
Impact sur les animaux
Une courte période de stress sera générée au cours du transfert des animaux dans la boite d'induction avec une préhension par la base de la queue. Un stress sera aussi induit pendant le temps nécessaire à l'application des pommades sur les lésions. Une lésion cutanée de type acnéique de quelques millimètres sera formée au site d'inoculation mais en raison du caractère exceptionnellement pathogène de Propionibacterium acnes il est attendu seulement une inflammation localisée au site d'inoculation. Les produits composants les pommades n'ont pas montré d'effets indésirables dans des tests in vitro.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prélever les tissus cutanés au site d'injection pour étude anatomopathologique et numération des micro-organismes.
Remplacement
Le modèle animal est incontournable car il n'existe pas de modèle ex-vivo de peau qui regroupe l'ensemble des cellules qui interviennent dans la réaction inflammatoire lors de la constitution d'une lésion acnéique. Des tests in vitro ont été réalisés pour déterminer les concentrations bactéricides de notre composé et la quantité de pommade à appliquer.
Réduction
Nous avons déterminé une cohorte de 40 individus avec des groupes de 5 animaux de chaque sexe pour étudier notre composé et comparer avec une molécule commercialisée. Ce nombre est suffisant pour démontrer une robustesse des résultats (puissance 80%, risque alpha 5% pour un écart des moyennes supérieur à 20%)
Raffinement
Les animaux seront manipulés après une période d'acclimatation de 1 semaine. L'injection intradermique sera réalisée sous anesthésie gazeuse et l'euthanasie sera pratiquée par inhalation de CO2. Les composés seront appliqués sous forme de pommade sur des animaux vigiles. Les animaux sont hébergés en présence d'enrichissement (igloo et matériel de nidification), la nourriture et l'eau sont ad libitum. La température et l'hygrométrie des salles d'hébergement sont controlées et un cycle jour/nuit 12H est en place. L'injection intradermique sera pratiquée par des personnes habituées à ce geste technique. Les animaux sont surveillés quotidiennement afin de suivre l'évolution du traitement.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi car il présente de grandes similtudes avec l'homme. C'est un animal facile à manipuler dont les deux sexes sont disponibles et dont différentes lignées ont été décrites dans la littérature scientifique (SKH1-hr, BALB/c-nu, RHJ/LeJ) pour l'étude de l'acné. Nous avons choisi la souche SKH1-hr pour sa disponibilité en Europe. De plus cette souche présente la particularité d'être immunocompétente, d'avoir perdu tous ses poils dès la quatrième semaine mais de conserver des pores. Nous utiliserons des animaux des deux sexes de 6 semaines avant la période d'adaptation pour que l'âge corresponde à celui d'un individu jeune chez l'homme.
Etude des effets de produits de la ruche sur le comportement anxieux et dépressif de la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un extrait de propolis par gavage à trois reprises, puis subissent des tests d'anxiété et de dépression comprenant une restriction alimentaire de douze heures et une suspension par la queue. Le porteur annonce un stress léger et prévoit la mise à mort en cas d'immobilité ou de perte de poids, les souris étant tuées en fin de procédure. Il vise à documenter l'efficacité d'un produit de la ruche commercialisé, dont il reconnaît qu'elle n'a pas été démontrée.
Objectifs
L'amélioration de l'arsenal thérapeutique dans le domaine de l’anxiété et de la dépression représente un enjeu de santé publique majeur. Des traitements à base de produits de la ruche sont proposés dans le commerce, mais leur efficacité n’a pas été démontrée. Cette étude porte sur les effets d’un produit de la ruche : propolis concentrée en principes actifs obtenu avec une nouvelle méthode d’extraction innovante. Le but est de tester les effets potentiellement antidépresseurs et anxiolytique de ces extraits à différentes doses dans des tests comportementaux chez la souris. Les effets comportementaux obtenus seront comparés à ceux d’un antidépresseur dans un test de comportement dépressif ou à ceux d’un anxiolytique dans deux tests d’anxiété.
Bénéfices attendus
le projet permettra d’apporter des éléments de preuve concernant l’efficacité d’un produit naturel de la ruche, l’extrait de propolis, comme anxiolytique et antidépresseur
Procédures
Les animaux seront soumis à l'administration de substances par voie orale à trois reprises espacés de sept jours et seront testés dans trois tests comportementaux à la suite de cette administration.
Impact sur les animaux
Les procédures prévues comprennent des administrations par voie orale (gavage) pour l’ingestion des produits à 3 reprises (espacées d’une semaine minimum), un test comportemental avec restriction alimentaire d’une durée limitée (12h), et des tests avec un contexte « aversif » (nouveau contexte). Les tests comportementaux utilisés sont des tests classiques d’évaluation cognitive, sociale ou d’exploration et bien caractérisés dans la littérature. Bien que ces 3 tests comportementaux puissent générer du stress (stress léger de manipulation, nouveauté, restriction alimentaire de 12h)), il est bien établi qu’ils n’induisent pas d’autres types d’effets indésirables. Ils seront en outre utilisés une seule fois par souris et ne durent que quelques minutes. Enfin, le but de l’étude est justement de rechercher si les extraits de produits de la ruche (propolis) permettent de réduire l’anxiété ou les effets de type dépressif, ces tests sont appropriés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à morts en fin de procédure.
Remplacement
Ce modèle s'intéressant au comportement des animaux, aucune méthode de remplacement (par exemple, une étude in vitro) n'est envisageable. De plus, les analyses biologiques requièrent des prélèvements frais qui ne peuvent être réalisés que sur animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les observations nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle sur ce type de tests comportementaux. En effet, l’analyse des résultats comportementaux obtenus dans les études précédentes suggère, en application du principe de réduction, qu’un nombre de 16 animaux par groupe serait suffisant pour obtenir des résultats significatifs avec une puissance statistique acceptable. Ainsi, 16 souris par groupe seront utilisés représentant un total de 224 souris (14 groupes). Tous les groupes de témoins sont justifiés. En effet, si les témoins sont enlevés, rien ne garantit que les effets obtenus dans les autres groupes soient bien des effets des traitements. La dose optimale des extraits de produit de la ruche (propolis) est inconnue ; on ne connait qu’une fenêtre de doses ayant des effets sur le plan biochimique. Il est donc nécessaire de tester les deux doses réévaluées sur leurs effets in vitro par Bee Terapi. En outre, les lots « antidépresseur » ou « anxiolytique » de référence sont nécessaires car ils servent de témoins positifs.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement des cages d'hébergement systématique (cabanes, tubes et smarthomes). Les administrations des composés par voie orale seront réalisés par un personnel expérimenté. Les manipulations des animaux avant et pendant les tests se feront de manière à éviter tout stress supplémentaire pour les animaux. Les procédures de ce projet n’induisent pas de douleurs ou d’inconvenance particulière. Une surveillance quotidienne des animaux est prévue et décrite dans les points limites. Les points limites pour lesquels l'expérimentation sera arrêtée sont soit une immobilité soit une prostration de la souris dans sa cage, soit une perte de poids supérieure à 15%, soit une chute de température (diminution de 2°C ou < 35°C). Une inspection visuelle sera effectuée chaque jour et une pesée une fois par semaine. Dès qu’un problème minime est détecté, on passe à deux évaluations par jour (avec pesée et prise de température) et la souris sera traitée avec un analgesique. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration en 48 heures.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des pathologies psychiatriques. En outre, les traitements de référence ont démontré leur efficacité dans cette espèce. Les souris BALB/c seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).
Évaluation de ligands pour l’imagerie nucléaire des oligomères de Tau présents dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
81 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Saines ou porteuses de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent un radiotraceur par injection intraveineuse puis sont imagées sous anesthésie, pour évaluer des agents ciblant la protéine Tau en vue d'un transfert en clinique. Le porteur annonce un stress bref lié à l'injection et des troubles cognitifs possibles au-delà de six mois chez un modèle, les souris étant tuées pour analyser leur cerveau. Il indique que les modèles in vitro de barrière hémato-encéphalique perdent vite leurs propriétés et juge le recours in vivo "indispensable".
Objectifs
Le projet vise à développer un agent d’imagerie ciblant les formes pathologiques de la protéine Tau, impliquées dans le développement précoce de la maladie d’Alzheimer. Il a pour objectif d'évaluer plusieurs agents chez la souris (saine ou présentant la maladie d’Alzheimer), avec pour finalité un transfert clinique du meilleur.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra aux cliniciens de mieux identifier les patients à haut risque de développer la maladie d'Alzheimer. De plus, cet agent d’imagerie contribuera à mieux comprendre la physiopathologie de la maladie et permettra l’évaluation de thérapeutiques ciblant directement ce mécanisme.
Procédures
Le protocole d’imagerie n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse supplémentaire en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intraveineuse du radiotraceur aux animaux vigiles. L’acquisition des images sera réalisée chez des animaux sous anesthésie volatile pour une durée inférieure à 1h. Un onguent sera appliqué sur la cornée pour éviter toute sécheresse oculaire. Si 2 ou 3 procédures d’imagerie sont envisagées chez une même souris, elles seront réalisées avec un écart au minimum de 3 jours entre les 2 procédures.
Impact sur les animaux
Les deux modèles murins sélectionnés sont des modèles animaux de référence pour la maladie d’Alzheimer, bien décrits dans la littérature. Ces modèles ne s’accompagnent d’aucune douleur, souffrance ou angoisse jusqu’à 6 mois, ensuite des troubles cognitifs peuvent apparaitre pour l’un d’eux en particulier, avec parfois une perte de poids observée. Une observation quotidienne régulière de ces souris permettra d’éviter toute souffrance de l’animal si des troubles du comportement survenaient et une pesée supplémentaire sera également réalisée chez ces souris dès l’âge de 6 mois.
Devenir
A la fin de la procédure d’imagerie, les souris seront euthanasiées. Des analyses post mortem seront effectuées en particulier sur le cerveau afin de caractériser et sélectionner le radiotraceur au potentiel le plus important pour l’imagerie des oligomères de la protéine Tau.
Remplacement
Des modèles in vitro de la Barrière Hémato Encéphalique (BHE) ont été développés à partir de cellules animales ou humaines, primaires ou transformées. Malheureusement, les monocultures primaires de ces cellules démontrent une perte rapide de leurs propriétés de la BHE. Leur utilisation est donc limitée. Néanmoins, ces modèles nous ont permis de réaliser des études préliminaires de sélection, mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des radiotraceurs définitifs en raison de la combinaison de tous les aspects biologiques tels que les barrières physiologiques, les transporteurs et les voies métaboliques.
Réduction
Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total Au total 81 souris (51 saines et 30 transgéniques ) seront utilisées. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu (n=3). L’imagerie permet également de réduire le nombre d’animaux puisqu’une même souris peut être imagée avec au moins 2 radiotraceurs connus.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés aux modèles permettront de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie volatile, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intra veineuse de radiotraceur.
Choix des espèces
Les études précédentes ont toutes été effectuées chez la souris et surtout il existe des modèles de souris transgéniques présentant la cible pathologique étudiée. Le protocole concernera uniquement des souris adultes, à l’âge de 2-4 mois environ, puis à un âge plus avancé (8 mois).
Caractérisation des conséquences d’une alcoolisation foetale sur la vision de la Souris chez le jeune et à l’âge adulte : implications du récepteur NMDA et du tPA
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Des femelles gestantes reçoivent des injections d'alcool pour reproduire une alcoolisation foetale, puis leurs petits subissent imagerie de l'oeil, test de vision et électrophysiologie à 15 jours et à l'âge adulte. Le porteur décrit des mères qui vacillent sous l'effet de l'alcool et prévoit d'écarter les petits atteints de cataracte ou d'inflammation, rétines et cerveaux étant prélevés après mise à mort. Il présente l'examen de la rétine comme une piste de diagnostic précoce chez l'enfant et affirme qu'aucune méthode non animale ne fournit de telles images.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’intérêt diagnostique de la mise en évidence d'anomalies ophtalmiques dans un contexte d’exposition prénatal à l’alcool (EPA). Dans ce projet nous évaluerons les conséquences d’une EPA sur la vision et la structure de la rétine chez des souriceaux âgés de 15 jours et une fois l’âge adulte atteint. Des expériences menées sur des souris sauvages et transgéniques afin de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans les effets d'une EPA sur le système visuel et d’envisager des cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’envisager à l’avenir une surveillance adaptée des enfants ayant été exposés à l’alcool in utero. Chez l'Homme, une exposition prénatale à l'alcool (EPA) peut se traduire par des anomalies neurodéveloppementales souvent sévères. Le syndrome d’alcoolisation foetale (SAF), qui est la forme la plus sévère d'une exposition prénatale à l'alcool, est détectée dès la naissance du fait d’anomalies morphologiques. Cependant, le diagnostic des formes plus modérées (ou TCAF) est posé plus difficilement et plus tardivement avec des troubles cliniques qui apparaissent progressivement au cours du développement. Chez ces enfants, en plus des anomalies cérébrales déjà mises en évidence dans différentes parties du cerveau, il a été montré qu’une grande majorité des enfants SAF présente également des anomalies oculaires pouvant toucher toutes les parties de l’oeil. En effet, 90% des enfants SAF présentent des anomalies oculaires telles qu’une hypoplasie du nerf optique, une baisse de l’acuité visuelle et des troubles de la vision (comme la myopie ou l’astigmatie). Ces enfants présentent également des vaisseaux rétiniens qui apparaissent tortueux à l’imagerie du fond d’oeil. Aujourd’hui une meilleure caractérisation de ces anomalies ophtalmiques est nécessaire afin d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques du SAF et du TCAF. Ainsi des techniques d’imagerie non invasives de l’oeil pourraient devenir une aide au diagnostic de ce syndrome.
Procédures
Afin de mimer une alcoolisation foetale, de l’alcool sera administrée par voie sous cutanée à des souris gestantes du 15ème au 20ème jour embryonnaire. Ce protocole d'alcoolisation répétée par injection est décrit dans des cas d’alcoolisation maternelle et est réalisé chez la souris gestante. La vision des souris issues de ces portées sera analysée chez le jeune (souriceaux âgés de 15 jours- âge d’ouverture des yeux chez la souris) et à l’âge adulte (10 semaines- âge ou le système visuel est mature chez la Souris) par 2 techniques d’imagerie in vivo (Micron IV et OCT- 5 minutes par animal), par une étude de comportement (optocinétique-5 à 10 minutes) et par une technique d’électrophysiologie (30 minutes).
Impact sur les animaux
A la suite de l’injection d’alcool chez les mères gestantes, les souris vacillent reflétant l’alcoolémie mesurée après 30 min comme observé chez l’humain après une alcoolisation. Au cours de l’injection, les souris ne montrent pas de signe de souffrance. Chez les petits nés de ces portées, en cas de détection d’une cataracte ou d’inflammation des yeux, les animaux seront sortis des procédures expérimentales.
Devenir
Les femelles gestantes (n=36) ne seront exposées qu’à la première procédure (alcoolisation). Ces femelles ayant été injectées (avec du NaCl ou de l'alcool), elles ne pourront pas etre réutilisées pour une nouvelle procédure. Une fois les petits sevrés, elles seront alors mises à mort. Les souriceaux âgés de 15 jours et les souris âgées de 10 semaines, tous issus de la procédure 1, seront utilisés pour la procédure 2 (n=216). A la fin de cette procédure, ils seront tous (n=216) mis à mort et les rétines et les cerveaux seront utilisés pour des analyses histologiques complémentaires.
Remplacement
La rétine constitue un miroir des atteintes cérébrales induites par une alcoolisation fœtale. La caractérisation de ces anomalies rétiniennes et le développement d’outils pour leur analyse précise constituent une voie innovante pour le diagnostic précoce des troubles causés par l'alcoolisation fœtale. L’imagerie du fond d’œil constitue par elle-même une technique de remplacement vis-à-vis des approches invasives telles que l’histologie et les analyses moléculaires au niveau cérébral qui nécessitent un nombre important d’animaux. En amont des expérimentations sur l’animal proposées dans ce projet des expériences in vitro (à partir de cultures cellulaires de cellules endothéliales) et des études histologiques ex vivo à partir de rétines étalées ont été menées et ont permis de mettre en évidence des anomalies de l’angiogenèse et de la neurogenèse rétinienne induites par une exposition à l’alcool. Ces anomalies ont également été corrélées aux anomalies cérébrales induites par une alcoolisation fœtale. L’objectif est maintenant i) de faire la démonstration de la valeur diagnostique de l’examen rétinien in vivo dans le dépistage précoce des atteintes neurovasculaires cérébrales chez le nouveau-né exposé in utero à l’alcool ii) de mettre en évidence la transposition possible chez l’humain avec le développement d’outils d’analyse permettant l’interprétation des données d’imagerie rétinienne. Aucune technique de remplacement non animale permettant d’obtenir de telles images de fond d’œil et d’explorer les performances du système visuel ne sont disponibles en préclinique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour atteindre l’objectif scientifique de ce projet avec des résultats statistiquement interprétables. Les procédures comportementales et d'imagerie de l'œil envisagées dans ce projet étant non invasives, un même animal peut être soumis à l'ensemble de ces tets, limitant ainsi le nombre d'animaux requis. Le minimum d’individus à inclure a été évalué d’après des résultats d'analyses du réseau vasculaire rétinien réalisées ex vivo sur des images de rétines étalées ; il convient alors d'inclure au moins 9 individus par groupe.
Raffinement
Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation. Un enrichissement sera mis en place (tunnel en carton, demi-sphère de cellulose et lanières de papier kraft). Ils bénéficieront des mesures préventives (prévention du desséchement de l’oeil par l’application d’un gel aqueux ophtalmologique), anesthésiques et analgésiques (si besoin) adaptées à chaque animal et à chaque procédure expérimentale. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée afin de suivre chaque animal tout au long des différentes procédures. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des expérimentations pour s’assurer de leur bien-être. Si les points limites suivants sont dépassés : les signes de douleurs extérieurs indexés sur le Grimace Scale Souris, manifestations de signes de détresse ou signe d’infection, les animaux seront mis à mort par inhalation de CO2 dans une nécrobox. Pour les procédures, les animaux seront amenés dans la pièce 1 heure avant le début de l’expérimentation pour leur laisser un temps d’habituation. Les animaux seront maintenus dans un environnement stabilisé (température 21°C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux, durée du cycle de lumière 12h/12h) avec nourriture et boisson à volonté. Les animaux seront conservés dans leur cage de stabulation avec nourriture et boisson à volonté avant et après les procédures. La cage sera conservée à l’écart de la table d’expérimentation afin de minimiser le stress de l’animal. Les procédures seront réalisées dans une pièce isolée et calme. Après anesthésie, les animaux seront placés en chambre de réveil thermostatée à 30°C.
Choix des espèces
La Souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes complexes communs aux mammifères comme le système nerveux et le système visuel. En effet, le développement et le fonctionnement du système visuel de la Souris est très proche de celui de l’Homme. De plus, l’utilisation des lignées transgéniques Grin-/-/VeCadCre dont le gène codant la sous unité GluN1 du récepteur NMDA a été invalidé au niveau endothélial permettra de caractériser l’implication de ce récepteur dans les effets d’une exposition prénatale à l’alcool sur le fonctionnement du système visuel. L’utilisation des lignées transgéniques KO-tPA, dont le gène code un facteur impliqué dans les effets toxiques de l’alcool sur l’angiogenèse cérébrale, permettra de vérifier l’implication de ce facteur angiogénique. Ces expériences permettront de mieux comprendre la physiopathologie des effets neurodéveloppementaux d’une exposition prénatale à l’alcool. Pour ce projet, afin de mimer une alcoolisation foetale, de l’alcool sera administré par voie sous cutanée à des souris gestantes et les études seront ensuite menées sur les animaux, nés de ces portées, âgés de 15 jours et à l’âge adulte (10 semaines). Nous avons choisi des animaux âgés de 15 jours car cet âge correspond à l’ouverture des yeux chez la Souris permettant ainsi des techniques d'imagerie du fond d'oeil. Chez les animaux adultes, âgés de 10 semaines, le système visuel est mature chez la Souris. Nous pourrons ainsi vérifier si les anomalies observées à l'âge de 15 jours sont toujours observables à l'âge adulte. Les résultats obtenus nous permettront ainsi de caractériser l’impact d’une alcoolisation foetale sur le développement du système visuel et de vérifier si ces effets persistent jusqu’à l’âge adulte.
Effets d’extraits de la biodiversité sur la prise de poids chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
240 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont suralimentés pendant quatorze jours pour induire un surpoids, traités avec des extraits de plantes puis soumis à une mesure de glycémie, pour évaluer l'efficacité de plantes dites anti-obésité. Le porteur n'attend pas d'effets indésirables mais surveille locomotion, arrêt alimentaire et coloration foncée signalant un stress, les poissons étant tués pour analyser leurs paramètres métaboliques. Il présente le poisson zèbre comme une "alternative" aux modèles mammifères tout en reconnaissant qu'aucune méthode sans animaux ne permet cette étude.
Objectifs
L'objectif du projet est de déterminer si les plantes médicinales étudiées et utilisées traditionnellement pour leurs propriétés dites "anti-diabétiques" / "anti-obésité" ont une réelle efficacité sur la prise de poids et sur les effets délétères au niveau systémique et central de l'obésité
Bénéfices attendus
Si nous démontrons que certaines plantes présentent des propriétés anti-prise de poids, nous pourrons investiguer la ou les molécules responsables de ces activités afin de développer des analogues chimiques et à terme développer des médicaments contre le surpoids/obésité.
Procédures
1) Suralimentation pour les animaux traités. La suralimentation aura lieu pour une durée de 14 jours (11 groupes de 20 animaux) 2) Traitement par les plantes (10 groupes de 20 animaux) 3) Pesée des animaux et mesure de la taille des animaux pour le calcul de l'indice de masse corporelle (12 groupes de 10 animaux) 4) En fin d'expérimentation, mesure de la glycémie (12 groupes de 10 animaux)
Impact sur les animaux
Ces plantes étant enregistrées à la pharmacopée française, elles sont reconnues pour leurs absences d'effets toxiques dans les conditions d'utilisation de la médecine traditionnelle. De plus, nous avons aussi déjà réalisées des études de toxicité chez l'embryon de poisson zèbre selon les recommendations de l'OCDE. Ainsi, les doses utilisées chez le poisson adulte ont déjà été montrées comme non toxique chez l'embryon. Par conséquent, nous n'attendons pas d'effets indésirables. Cependant, nous ne pouvons extrapoler ces informations obtenues chez l'Homme et chez des stades embryonnaires de poissons zèbres adultes. Par conséquent, nous devons être vigilants quant à de possibles effets délétères/toxiques chez l'adulte.
Devenir
Après l'analyse des différentes mesures (poids etc...) les animaux seront remis dans les conditions expérimentales afin de poursuivre l'expérimentation. Néanmoins, à l'issue de l'expérimentation, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir analyser la glycémie et l'impact du traitement sur un certain nombre de paramètres d'intérêts au niveau périphérique et central (notamment inflammatoire et oxydatifs)
Remplacement
Le modèle animal est le seul modèle permettant d'étudier l'impact d'un régime alimentaire déséquilibré au niveau de l'organisme dans son ensemble (poids, perturbation hépatique, glycémique, cérébrale...). De plus, afin de tester l'effet d'extraits de la biodiversité sur les conséquences de ce régime alimentaire, le modèle animal est le seul nous permettant d'appréhender la complexité de cette approche. En effet, elle implique des effets pléiotropes à l'échelle physiologique des molécules issus des extraits de plantes et doit impérativement prendre en compte la métabolisation de ces molécules par un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d'animaux par conditionest de 20 au maximum Nous réaliserons d'abord l'expérience par groupe de 10 et si les résultats sont déjà intéressants d'un point de vue statistique, nous pourrons ainsi éviter de relancer une expérimentation avec 10 autres animaux Néanmoins, l'hétérogénéité des animaux et de la prise alimentaire individuelle ne nous permet pas dès lors de limiter l'expérimentation à 10 animaux/condition.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupe, avec une alimentation en artemia (petits crustacés) représentant une diversification et un enrichissement alimentaire. Les points limites qui seront obéservés seront la locomotion de l'animal (sil reste en bas de l'aquarium ou en haut, l'expérimentation sera arrétée). De même un arrêt de la prise alimentaire nous amènera à arréter l'expérimentation. Une coloration foncée témoignant d'un stress important sera étudiée et rapportée au vétérinaire afin d'arréter ou non la procédure (arrêt obligatoire si le changement de couleur est associé à des troubles du comportement dont la prise alimentaire).
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle solidement reconnu pour l’étude de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Ceci tient au fait d’une forte conservation de ces processus au cours de l’évolution. Ainsi, le poisson zèbre est un modèle bien établi d’étude de l’immunité, de l’oncologie, de la réparation cellulaire et de toxicologie. Il possède toutes les enzymes de détoxification (CYP) tout comme l’Homme. De par des mécanismes physiologiques fortement conservés au cours de l’évolution, le poisson zèbre présente l’avantage d’être un modèle simplifié pour la physiologie humaine et la modélisation de maladies humaines. Il constitue une alternative à l’utilisation de modèles animaux mammifères. C'est un modèle couramment utilisé pour des études d'hyperglycémie (diabète) et de surpoids, ainsi que pour tester des extraits aux propriétés biologiques d'intérêts. Les animaux choisis seront des animaux adultes entre 3 mois et 1 an. Cet âge correspond à de jeunes adultes et la pathologie de surpoids/obésité touche particulièrement les jeunes adultes. Entre 3 mois et 1 an, il n'y a que peu de changements physiologiques. C'est pourquoi nous avons choisi cet âge.
Développement chez la souris d’une nouvelle méthode contraceptive non hormonale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Une souris qui présente démangeaisons, dermatite ou conjonctivite après l'ovule au lyral, un odorant que le porteur sait allergisant, est retirée de l'expérience et mise à mort. 640 souris Swiss CD1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour tester une contraception non hormonale. Avant l'accouplement, l'expérimentateur introduit avec le pouce un ovule de la taille d'un grain de blé dans le vagin de la femelle, geste de deux minutes trente répétable jusqu'à trois fois, accompagné d'un massage destiné, selon le porteur, à "apporter du bien être à l'animal". La souche est retenue pour ses portées de plus de 10 souriceaux, et ces souriceaux sont immédiatement mis à mort. Les femelles retournent ensuite dans le pool pour d'autres accouplements, sans que le résumé dise ce qu'elles deviennent à la fin du projet.
Objectifs
La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Il a été montré qu’un odorant, le bourgeonal, modifiait in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes humains et que le lyral, un autre odorant, modifiait lui aussi in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes de souris. Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif, nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.
Bénéfices attendus
Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.
Procédures
L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement la souris est maintenue, sans contrainte par la base de la queue afin de permettre à l'expérimentateur d'accéder à la région vulvaire. L'ovule est introduit délicatement avec le pouce. L'expérimentateur maintient une légère pression avec son pouce sur la région génitale afin d'éviter une sortie de l'ovule et exerce un massage doux de la zone pour faciliter l'introduction complète de l'ovule et apporter du bien être à l'animal pendant ce geste. Le temps d'introduction complète est d'environ 2m30s et l'animal ne montre aucun signe de douleur ou de stress (pas de morsure, de réaction de fuite...) Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience. Par ailleurs, rappelons que les ovules sont de qualité pharmaceutique, fabriqués par une société pharmaceutique avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris mâles et femelles utilisées auront entre 8 à 48 semaines.
Evaluation des caractères observables de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
425 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 210 d'entre elles et modéré pour 215. Le porteur indique qu'elles ne subissent aucune intervention et sont seulement observées de la naissance à l'âge adulte, la souffrance venant du phénotype dommageable que certaines lignées génétiquement modifiées portent dès la naissance. Les 210 souris sans comportement anormal seront réutilisées dans d'autres projets, les autres seront tuées. Le porteur affirme que ces modèles sont "indispensables" et que la création de lignées est la "seule" voie pour étudier un "organisme entier".
Objectifs
Le phénotype est l'ensemble des caractères observables des souris. En modifiant génétiquement les souris nous cherchons à étudier une maladie ou un phénomène biologique important ou responsable d'une maladie. Mais cela peut provoquer d'autres dommages à l'animal, donc créer un phénotype dommageable que l'animal subira dès sa naissance, mimant ainsi la pathologie humaine. Le but de ce projet est de s'assurer qu'il n'y a pas phénotype dommageable, ou de l'évaluer s'il y en a un, afin de comprendre la maladie. L'objectif est de produire des nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées par croisement avec des lignées déjà existantes ou sur un fond génétique particulier pour répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche de l’Institut sur des maladies humaines.
Bénéfices attendus
Les projets développés dans l'Institut visent à la compréhension des mécanismes responsables de maladies humaines et au développement de traitement pour ces maladies humaines. Une étape indispensable est le développement de modèles de souris génétiquement modifiées pour reproduire la pathologie humaine et tester des approches thérapeuthiques. Le bénéfice de ce projet est donc de développer de tels modèles dans des conditions les plus adaptées au bien être animal.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucune intervention dans le cadre de ce projet, ils seront simplement examinés et surveillés tout au long de leur développement, de la naissance à l'age adulte
Impact sur les animaux
Il n'y aura pas d'intervention sur les animaux, seulement une observation attentive des caractères visibles et du comportement. Les effets indésirables potentiels seraient liés au phénotype dommageable
Devenir
Les animaux ne présentant pas de comportement anormal pourront être réutilisés dans d'autres projets pour répondre aux questions scientifiques ayant conduit au développement de cette lignée.
Remplacement
Ce projet ayant pour but le développement de modèles souris mimant des pathologies humaines en particulier pour la mise au point de thérapies, il n'y a pas de remplacement possible par d'autres modèles.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum en fonction des besoins. Les animaux ne présentant pas de phénotype associé à une douleur non controlée pourront être ré-utilisés dans d'autres projets afin de réduire le nombre d'animaux produits pour ces projets et répondre aux questions scientifiques ayant conduit au développement de cette lignée.
Raffinement
Les animaux présentant le génotype d’intérêt feront l’objet d’une surveillance particulière selon les recommandations de l'Union Européenne afin d’établir si ces créations de nouvelles lignées provoquent l’apparition d’un phénotype dommageable vis-à-vis du bien-être animal, et si c’est le cas, des points limites seront mis en oeuvre et éventuellement réadaptés en fonction du phénotype observé pour limiter toute souffrance chez les animaux. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Ils sont observés quotidiennement et des points limites ont été définis afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus pour lesquels il sera décidé de mettre en place un traitement approprié ou une euthanasie.
Choix des espèces
Le but de ce projet est la création de modèles génétiquement modifiés pour reproduire les pathologies humaines. Le développement de souris génétiquement modifiées est l'approche la plus simple à mettre en oeuvre et la seule permettant d'étudier un organisme entier. Ces modèles vont permettre de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche de l’Institut telles que la compréhension des mécanismes physiopathologiques et le développement d'approches thérapeuthiques pour lesquelles les modèles souris sont indispensables. Ces pathologies pouvant toucher l'homme à tous les stades du développement, tous les stades seront donc analysés dans les lignées créées.
Validation d’un test d’apprentissage spatial préservant le bien-être animal à destination de la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes et transférées vers un autre projet. Elles apprennent à trouver une issue sur un plateau éclairé, le labyrinthe de Barnes, sous l'effet de lumières et de ventilateurs dirigés vers elles pour les forcer à mémoriser le trajet, et une partie reçoit un traitement qui efface la mémoire. Le porteur présente ce test comme un remplacement moins stressant du labyrinthe aquatique de Morris et met en avant le "bien-être animal". Il décrit ces désagréments, lumière et courant d'air, comme volontairement créés pour contraindre l'apprentissage.
Objectifs
L’étude des maladies qui affectent le cerveau et en particulier celles qui réduisent la mémoire nécessite d’évaluer - chez les animaux - le souvenir des trajets que ceux-ci effectuent dans une piscine. Néanmoins, il a été montré que cette façon de procéder comporte quelques désavantages qui peuvent être réduits ou même supprimés si l’utilisation d’une piscine, et donc le placement de l’animal dans l’eau, peut être évité. La solution alternative a été trouvée par l’utilisation d’un grand plateau éclairé où le rongeur se déplace à la recherche d’une issue dont il devra apprendre l’emplacement. Nous souhaitons dans le futur utiliser cette nouvelle façon de faire chez la souris, mais auparavant nous devons valider cette procédure en nos locaux, ce qui représente le but de ce projet. Pour ce faire, nous allons devoir trouver les meilleures conditions pour que les souris se souviennent de leurs trajets et qui seront des conditions d’éclairage ou de ventilation plus ou moins fortes du plateau. Une fois que ces conditions auront été trouvées, il nous faudra ensuite montrer que des souris présentant une mémoire réduite pourront être distinguées - par cette procédure - des souris non malades. Comme il existe de multiples types de souris, nous prendrons des souris avec ou sans une bonne vision et de niveaux de témérité différents. Si la nouvelle procédure confirme bien que, et quelque soit le type de souris évaluées, les animaux sont capables de se souvenir de leurs trajets sur un vaste plateau éclairé, nous remplacerons alors la procédure de la piscine par celle du plateau.
Bénéfices attendus
Il a été montré que la procédure faisant appel à un plateau pour étudier les trajets des souris est beaucoup moins stressante pour les animaux que celle de la piscine, et donc fournit des résultats plus précis. Ainsi, si nous remplaçons la procédure de piscine par celle du plateau, cela représentera un grand bénéfice pour les animaux car cela leur évitera un stress important lorsque nous voudrons évaluer leur mémoire ; et le bénéfice sera également non négligeable pour nous, car les résultats seront plus précis et donc, en conséquence, cette alternative nous permettra d’avoir à utiliser moins d’animaux pour étudier les maladies qui affectent le cerveau.
Procédures
Lorsque nous voudrons montrer que la procédure du plateau est capable de distinguer des souris présentant une mémoire réduite par rapport à des souris non malades (seconde phase du projet), nous devrons injecter une fois par jour, sur un total de 3 jours consécutifs, un traitement qui efface les souvenirs chez les souris considérées comme malades. Les traitements seront réalisés par la personne de notre structure qui a été validée par notre vétérinaire pour les injections. La préhension de l'animal et l'injection prendront environ 10 secondes. En ce qui concerne la détermination des bonnes conditions nécessaires pour le test du plateau, les animaux subiront le même jour 3 fois la procédure sur une durée maximum établie à 180 secondes. Pour la seconde phase du projet, ce schéma sera conservé, et répliqué pendant 3 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Les souris sont des animaux qui n’aiment pas apprendre. Si elles doivent néanmoins apprendre un chemin dans un piscine, elles n’ont pas le choix mais cette façon de faire est stressante et mérite d’être remplacée. L’alternative à cette procédure de la piscine par l’utilisation d’un plateau est beaucoup moins stressante, mais peut n’aboutir à aucun résultat si les souris ne sont pas obligées d’apprendre. Pour faire face à ce problème, il peut être nécessaire d’utiliser des lumières ainsi que des ventilateurs dirigés vers le plateau. Ainsi ces légers désagréments que nous créons volontairement pour les souris seront susceptibles de les forcer à apprendre le chemin vers l’issue sombre et sans courants d’air qui constituera alors leur récompense au terme de ce test de mémoire de trajets.
Devenir
Les souris seront gardées en nos locaux avant leur sortie une fois affiliées à un autre projet.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe pas de technique in vitro ou in silico permettant d’évaluer les effets d’un traitement sur les fonctions cognitives supérieures telles que l’apprentissage ou la mémoire.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux repose sur une démarche d'essais successifs : pour la phase 1 du projet, les 24 souris de chaque souche étudiée seront réparties en 8 sous-groupes de 3 individus. Le trio d’animaux de chaque sous-groupe sera testé aux mêmes conditions expérimentales, conditions qui seront ensuite modulées en fonction des résultats obtenus pour l’évaluation du sous-groupe suivant. Cette démarche devrait aboutir in fine à la détermination des modalités optimales à mettre en œuvre pour aboutir à un apprentissage spatial, en utilisant un nombre le plus faible possible d’animaux. L’expérience acquise par le personnel opérant à la réalisation du test comportemental est suffisante pour interpréter les données issues d’un groupe de 3 individus uniquement. Si les conditions étaient trouvées adéquates avant que la totalité des 8 sous-groupes n’aient été testé, le restant des sous-groupes (animaux non testés) sera alors évalué selon les conditions optimales précédemment déterminées afin d’augmenter la puissance statistique des résultats obtenus via un accroissement des effectifs. Si malgré tout, aucun apprentissage n’était détecté à l’issue de cette première phase, les animaux seront alors gardés en hébergement pendant un mois durant, au terme duquel ils seront alors retestés pour une nouvelle phase de paramétrage. Cette période sera suffisante pour opérer chez les souris une perte de souvenir des 3 tests préalablement réalisés. Concernant les effectifs requis minimum (n=12/groupe) pour la phase 2 du projet ils ont été définis par un programme informatique spécifique.
Raffinement
Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, tunnels en carton, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude. Par ailleurs, le succès de ce projet aura pour conséquence le remplacement - quand cela sera possible - en notre structure de la procédure lu labyrinthe aquatique de Morris par celle du plateau troué de Barnes lorsque l’apprentissage ou la mémoire de rétention devront être testés sur modèle souris, ce qui constituera un raffinement certain de nos pratiques d’études.
Choix des espèces
La validation de la procédure du plateau troué de Barnes sera effectuée chez la souris car ce modèle animal est celui qui est majoritairement utilisé par les utilisateurs de notre structure de recherche. Les animaux seront âgés de 6 semaines à la réception (jeunes adultes)
Modulation de la flore intestinale (microbiote) pour améliorer les réponses anti-cancéreuses de l’hôte
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 1 440. Elles reçoivent des prébiotiques ou des probiotiques par gavage, une greffe de tumeur sous la peau ou une injection de cellules cancéreuses dans le sang, puis une immunothérapie et des prélèvements sanguins, pour tester si la modification du microbiote intestinal renforce les réponses anti-tumorales. Le porteur annonce des essais chez l'humain et des recommandations nutritionnelles dans un second temps. Il affirme que le rôle du microbiote "ne peut être étudié qu'in vivo" et qu'il n'existe "pas d'alternative à ce jour".
Objectifs
Le microbiote intestinal (flore intestinale) comprend l'ensemble des bactéries, champignons et virus contenus dans notre intestin. Il est montré que ces bactéries communiquent avec notre immunité. Les espèces bactériennes qui composent notre microbiote détermine la qualité de notre immunité, donc de nos défenses contre les infections, ou même les cancers. Ainsi certaines bactéries ont été identifiées comme bénéfiques pour la santé, et notamment pour notre immunité. On peut augmenter la présence de ces bactéries dans l'intestin pour améliorer notre immunité notamment via l'alimentation, en consommant des fibres alimentaires qui les nourrissent, c'est ce que l'on appel des prébiotiques. On peut aussi consommer des probiotiques, c'est à dire directement ces bonnes bactéries. Le but de ce projet est d'améliorer la composition du microbiote intestinal de souris soit par prébiotiques, soit par probiotiques dans le but d'augmenter les réponses anti-tumorales et ainsi prévenir l'apparition de cancers ou le développement de métastases ou enfin, d'améliorer la réponse à l'immunothérapie. Nous avons pour objectif de tester 10 prébiotiques et 10 probiotiques différents dans les 5 ans à venir.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en évidence des propriétés immunostimulantes de composés alimentaires (fibres) et/ou de compléments alimentaires (probiotiques) qui pourraient être utiles dans un contexte de cancer. Les découvertes quien découlerons, permettrons d'évaluer dans un second temps ces composés chez l'Homme, à travers des essais cliniques. In fine, ce travail permettra de rationaliser des interventions nutritionnelles qui favoriserons la prévention des cancers dans la population générale, et permettront de favoriser la réponse aux immunothérapies et/ou prévenir le phénomène de métastases chez les patients atteints de cancer.
Procédures
Une partie des animaux sera nourrie avec un régime prébiotique administré dans l'eau de boisson ou de probiotiques administrés par gavage oral 5 fois par semaine durant 1 mois (1 minute / gavage). Une partie des animaux recevra une implantation tumorale par injection sous-cutanée (1 minute / souris sur souris vigile), ou une injection de cellules cancéreuses par voie intra-veineuse (5 minutes / souris sur souris vigile). Les prélèvements sanguins (2 minutes / souris) seront réalisés principalement en fin d'expérience (ou lors d'atteinte de point limite), sous anesthésie volatile, et sans réveil. Sinon, un prélèvement après 15 jours de régime enrichi pourra être effectué sous anesthésie volatile avec suivi de réveil. Ainsi les animaux auront au maximum 2 prélèvements sanguins, dont un sans réveil. Le trateiement par immunothérapie consistera à 6 injections maximum en intra péritonéale ou intraveineuse, sur souris vigiles.
Impact sur les animaux
Les animaux, hébergés en groupe sociaux dans un environnement enrichi adapté, seront abreuvés et nourris sans restriction. Le régime alimentaire n'induit aucune nuisance et représente un enrichissement en termes de bien-être nutritionnel. L’administration par gavage oral nécessite une habituation de l’animal soumis à un léger stress. Les animaux recevront jusqu'à 6 injections sans anesthésie induisant une contrainte de niveau léger. Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale induisant une contrainte de niveau léger ou sans réveil. Enfin, la tumeur implantée pourra évoluer en taille (maladie au stade léger), et dans de rare cas nécroser (lésion de niveau modéré) représentant un point limite pour l’arrêt de la procédure expérimentale.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés, à la fin des expériences ou dès atteinte des points limites. Des prélèvements seront effectués pour des analyses immunologiques complémentaires.
Remplacement
Le rôle du microbiote (flore) intestinal ne peut être étudié qu'in vivo. En effet, les interactions hôte/microbes et notamment système immunitaire de l'hôte/microbes et les réponses anti-tumorales induites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n'existe donc pas d'alternative à ce jour.
Réduction
Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse aux différents traitements, des groupes de 12 animaux seront constitués. Ainsi, malgré la variabilité, ce nombre d'animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique. Pour renforcer nos observations, et réduire au maximum le nombre d'animaux, nous prévoyons de réaliser une première expérience avec 6 animaux par groupe et de confirmer tout effet anti-tumoral observé (ou tendance encourageante) en dupliquant l'expérience afin d'obtenir au final 12 animaux par groupes en 2 expériences indépendantes, plutôt qu'en une seule avec des groupes de 12 animaux d'emblée. De plus, dans les procédure 2 et 3, nous testerons 2 conditions expérimentales en parallèle, lorsque nous disposerons de 2 composés en simultané, afin de mutualiser les groupes contrôles, et donc de réduire le nombre d'animaux contrôles utilisés.
Raffinement
Afin d'assurer le bien-être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire (fibres) sera administré dans l'eau de boisson ou par gavage, et les probiotiques (bactéries) seront administrées par gavage. L'injection sous-cutanée des cellules tumorales ou l'injection IP des immunothérapies n'induisent qu'une brève légère souffrance des animaux. . Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés à la suite des implantations tumorales. Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin de l'expérience ou dès lors qu'un point limite est atteint. L'euthanasie par dislocation cervicale se fera sous anesthésie à l'isoflurane (3 %) quand il y aura prélèvement sanguin terminal.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d'étude. La manipulation de leur flore est acquise. De plus, les modèles tumoraux ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développées pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique l'ont été avec ce même modèle murin. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d'âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées et le système immunitaire est pleinement mature et permet donc son étude.
Effet d’huiles essentielles seules et en combinaison de molécules bioactives sur la colonisation de Salmonella chez le poulet de chair.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
405 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les poussins sont inoculés par voie orale avec la bactérie Salmonella dès leur premier jour, élevés jusqu'à trente-cinq jours puis tués, par dislocation cervicale pour les plus jeunes et par saignée à la jugulaire après étourdissement pour les autres, afin de prélever leur intestin. L'étude teste l'effet d'huiles essentielles sur la colonisation par Salmonella dans la filière avicole, dans une perspective de santé publique. Le porteur indique aussi vouloir valider un modèle sur le nématode Caenorhabditis elegans qui pourrait "réduire l'utilisation d'animaux", tout en jugeant "nécessaire" l'essai sur le poulet.
Objectifs
Le projet vise au déploiement d’une stratégie de gestion de bactéries zoonotiques chez les animaux d’élevages, grâce à des alternatives naturelles telles que les huiles essentielles. La recherche d’activités biologiques sera liée à la prévention de la colonisation digestive chez la volaille par Salmonella, une des principales bactéries responsables de zoonoses et largement répandues dans les élevages. L’objectif premier de ce projet s’inscrit dans une problématique de santé publique avec le développement d’une gamme de solutions adaptées pour réduire la colonisation chez la volaille de ces deux principaux pathogènes impliqués dans les zoonoses. Le second objectif permettra de tester un nouveau modèle prédictif in vitro reposant sur le modèle de colonisation digestive du modèle nématode Caenorhabditis elegans. Le développement de cette méthode alternative à l’expérimentation animale, pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques et ainsi de satisfaire à la règle des 3R : Réduire, Remplacer, Raffiner. Au cours de ce projet, cette procédure visera à étudier l’effet d’huiles essentielles seules et en combinaison avec d’autres moyens de lutte (traitement de l’aliment et de la litière) sur la colonisation de Salmonella Typhimurium en poulet de chair.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de valider les effets bénéfiques des huiles essentielles sur la colonisation du poulet de chair par Salmonella. En parallèle la combinaison de statégie de lutte sera étudiée pour proposer un moyen de lutte plus efficace contre la contamination à Salmonella dans les élevages. Par ailleurs, les résultats obtenus sur l’effet anti-colonisateur des huiles essentielles sur le modèle poulet et le modèle nématodes seront comparés pour confirmer l’effet prédictif du modèle nématode et ainsi valider son utilisation comme modèle alternatif à l’expérimentation animale.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation par voie orale de Salmonella Typhimurium ou de Tryptone Sel. Le prélèvement de caeca aura lieu après mise à mort des animaux. Dès la mise en place (J1), les poussins tout venant de 1 jour de l’espèce Gallus gallus de souche commerciale de chair ROSS 308, seront pesés. A J1, tous les animaux seront inoculés avec 100 µL de Salmonella Typhimurium (Lot 1, Lot 3, Lot 5 et Lot 7) ou 100 µL de de Tryptone Sel (Lot 2, Lot 4, Lot 6 et Lot 8), et l’inverse sera réalisé à J7.
Impact sur les animaux
Les infections à Salmonella chez les volailles passent généralement inaperçues et les molécules testées sont normalement inoffensives : les huiles essentielles, les probiotiques et acides organiques ainsi que l’asséchant pour litière utilisés dans cette étude sont des produits commercialisés et utilisés en élevage de volailles.
Devenir
Les prélèvements de caeca nécessitent la mise à mort des animaux. C’est pourquoi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, par dislocation cervicale les jeunes poussins (poids < 250 g) et pour les poussins plus âgés et les poulets adultes après une anesthésie par électronarcose suivie d’une saignée à la veine jugulaire.
Remplacement
La volaille et notamment le poulet de chair représente une source importante de salmonellose pour l’Homme. Ainsi, il est nécessaire de contribuer au développement d’un moyen de lutte contre Salmonella dans la filière avicole afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Salmonella. Des résultats préliminaires utilisant un modèle d'infection du nématode Caenorhabditis elegans permettant un suivi de la colonisation digestive par Salmonella Typhimurium, ont mis en évidence les activités anticolonisatrices des huiles essentielles qui seront utilisées pour ce projet. Il est necessaire de valider ces résultats lors d’un essai sur le poulet de chair. Cette validation nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo afin de réduire par la suite le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Cette étude s’interesse à l’effet d’huiles essentielles seules et en combinaison avec d’autres moyen de lutte sur la colonisation de Salmonella chez le poulet de chair. La réalisation de 8 lots distincts permettra de différencier l’effet des huiles essentielles seules ou en combinaison afin de maximiser l’efficacité d’un traitement en elevage. En raison de la variabilité interindividuelle importante des niveaux de colonisation par les bactéries étudiées, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe était nécessaire pour chaque temps donné afin d’assurer la robustesse des tests statistiques. Ainsi, 8 lots x 5 temps x 10 animaux = 400 animaux. En supplément 5 animaux seront utilisés au début de l’étude pour vérifier l’absence de contamination par Salmonella. Soit un total de 405 animaux.
Raffinement
Dans des expériences précédentes d’inoculation avec la souche de S. Typhimurium choisie pour cette étude, aucun symptôme ou effet indésirable n’a été détecté chez les animaux étudiés. L’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Le protocole a été établi pour limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux. Les animaux seront observés quotidiennement. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter. Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Quatre animaleries de type A2 seront utilisées en dépression (moyenne). Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol de 3,4 m² entourés par des panneaux en bois. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge.
Choix des espèces
Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. Ce projet à pour objectif de développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage afin de réduire la charge qui arrive sur la chaine alimentaire. Par conséquent, le poulet de chair est l’espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 35 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre l’effet de l’ajout des huiles essentielles et en combinaison d’autres moyen de lutte sur la colonisation de Salmonella.