Procédures légères
Etude des effets de l’absence de PiT2 dans les tissus adipeux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le protocole prévoit l'ablation d'une phalange sur les pattes arrière des souriceaux pour les identifier, geste que le porteur qualifie lui-même d'acte douloureux, puis des pesées hebdomadaires jusqu'à seize semaines avant la mise à mort pour prélever les tissus adipeux. Le projet croise deux lignées génétiquement modifiées pour supprimer une protéine, PiT2, dans le gras, afin d'en comprendre le rôle dans l'obésité. Le porteur affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent jamais les anomalies observées chez l'animal vivant et conclut que l'étude chez la souris est "nécessaire".
Objectifs
la protéine Slc20a2/PiT2 est un transporteur de phosphate présent à la surface de la plupart des cellules de mammifères. Nos travaux montrent qu’elle joue un rôle important pour la qualité et la solidité osseuse sans pour autant agir directement sur les cellules responsables de la minéralisation du squelette. Nos résultats suggèrent que des défauts de communication entre le squelette et d'autres organes, comme les tissus adipeux, pourraient avoir un impact sur l’intégrité du tissu squelettique. Nous savons déjà que l'absence de la protéine SLC20A2/PiT2 dans tout l'organisme aboutit à une diminution de la masse des tissus adipeux chez la souris. Cette diminution est associée à une augmentation de la dépense énergétique. Nous savons également que ces souris mutantes résistent à la prise de poids et à l'accumulation de gras dans le foie lorsqu'elles sont soumises à un régime riche en gras. Ces résultats, non publiés, laissent penser que PiT2 puisse jouer un rôle dans la régulation des tissus adipeux. L'objectif de ce projet est de générer une nouvelle souris mutante chez laquelle le gène Slc20a2 sera invalidé seulement dans les tissus adipeux. Grâce à ce modèle, nous pourrons comparer les effets de l'absence de SLC20A2/PiT2 dans les tissus adipeux à ceux observés chez les souris invalidées pour Slc20a2 dans tous les tissus de l'organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de PiT2 dans la régulation des tissus adipeux, et permettra de proposer cette protéine comme cible potentielle pour de nouvelles stratégies thérapeutiques de maladies métaboliques, comme l'obésité.
Procédures
L'identification par ablation de phalanges des souriceaux 10 jours postpartum est un acte douloureux. Nous limiterons l'ablation à la phalange la plus distale du doigt (pouce non concerné, limité à une seule phalange par patte) et seulement sur les pattes postérieures pour ne pas compromettre la préhension fine par les pattes antérieures (pour manger, se toiletter, grimper). La cicatrisation de la phalange est très rapide chez le souriceau (maximum 24h). Les souris seront pesées toutes les semaines jusqu'à 16 semaines.
Impact sur les animaux
Les souris chez lesquelle le gène Slc20a2 est invalidé dans tous les tissus de l'organisme (Slc20a2-/-) n'ont pas de phénotype dommageable. Elles présentent une diminution du volume des tissus adipeux sans aller jusqu'à la lipodystrophie et sans anomalie de tolérance au glucose et à l'insuline, et une diminution de la masse osseuse sans observation de fractures ou d'anomalies de la locomotion. Les souris mutantes AdipoQ-Cre/+;Slc20a2lox/lox de cette procédure ne seront pas différentes des souris contrôles ou présenteront le même phénotype adipeux que les souris Slc20a2-/- décrites ci-dessus. Il n'y aura donc pas de phénotype dommageable lié à la perte de Slc20a2 dans les tissus adipeux.
Devenir
La mise à mort des animaux est nécessaire pour analyser les conséquences de l'absence de PiT2 sur les tissus adipeux.
Remplacement
Ce projet concerne l'analyse du phénotype des tissus adipeux dans un organisme dépourvu de la protéine Slc20a2/PiT2 spécifiquement dans les tissus adipeux. Pour cela, nous croisons deux lignées de souris génétiquement modifiées : les souris Slc20a2lox et les souris AdipoQ-Cre/+ qui expriment une protéine permettant l'invalidation de Slc20a2 spécifiquement dans les tissus adipeux. Nos travaux antérieurs montrent que l'invalidation de Slc20a2 sur des cellules en culture ne reproduise jamais les anomalies que nous observons chez l'animal entier. Il est très probable que les effets de l'absence de PiT2 dans l'organisme entier résultent d'anomalies de communication entre les organes. Les études chez l'animal sont donc nécessaires pour identifier le rôles de la protéines PiT2 dans les tissus d'intérêt.
Réduction
Nous savons déjà que l'absence de PiT2 dans tout l'organisme aboutit à une réduction de la masse des tissus adipeux chez les mâles et les femelles. Cette étude sera donc réalisée chez les animaux mutants des deux sexes, ce qui permet de générer un nombre minimum de portées. Grâce à nos travaux antérieurs, nous savons que 24 animaux par groupe (12 mâles et 12 femelles) sont suffisants pour mettre en évidence une diminution de la masse des tissus adipeux par rapport aux souris contrôles. Si aucune tendance n'est observée entre les souris mutantes et les souris contrôles avec n=12 animaux par groupe, nous ne poursuivrons pas les expérimentations.
Raffinement
La gestion du bien-être animal sera assurée par un habitat optimisé, en groupes de 3 à 5 individus, avec des objets de stimulation dans la cage et par une surveillance hebdomadaire
Choix des espèces
Les animaux géniteurs seront utilisés au moment de leur fertilité (8 semaines). Les deux lots expérimentaux seront utilisés à partir de 10 jours (identification et génotypage) jusqu'au moment des prélèvements terminaux (16 semaines). Nous savons que les souris totalement invalidées pour Slc20a2 sont plus petites et plus légères dès la naissance. Nous savons que la masse des tissus adipeux est inférieure à celle des souris contrôles dès le plus jeune âge. Le phénotype est parfaitement installé chez la souris adulte à 16 semaines. Pour comparer le phénotype de nos souris mutantes AdipoQ-Cre/+;Slc20a2lox/lox avec celui des souris totalement invalidées pour Slc20a2, nous mesurerons le poids des souris à partir de 15 jours après la naissance jusqu'à l'âge adulte (16 semaines).
Etude de l’efficacité d’une nouvelle thérapie dans un modèle expérimental d’anémie hémolytique auto-immune chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 8
36 souris et 8 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour les souris et léger pour les rats. Les souris reçoivent chaque semaine, pendant dix semaines, des injections de globules rouges de rat pour déclencher une anémie hémolytique auto-immune qui provoque fatigue et perte de poids, avant de recevoir un traitement expérimental, puis elles sont tuées. Les rats sont ponctionnés chaque semaine pour fournir les globules rouges injectés aux souris, et le porteur indique qu'il s'efforcera de les reclasser, faute de quoi ils seront tués eux aussi. Il affirme que la complexité de cette maladie "ne peut pas être modélisée in vitro", ce qui justifierait selon lui le modèle animal.
Objectifs
L’anémie hémolytique auto-immune (AHAI) est caractérisée par un dysfonctionnement du système immunitaire. Les patients atteints de cette maladie produisent des auto-anticorps qui attaquent leurs globules rouges. Ils présentent également une forte activité des lymphocytes T et une diminution de la quantité de lymphocytes T régulateurs. Les thérapeutiques actuellement utilisées dans sont d’une part insuffisante pour un nombre non négligeable de patients qui ne répondent pas ou incomplètement à ces traitements et d’autre part engendrent des effets indésirables potentiellement graves. L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité d’une nouvelle thérapie à l’étude pour une utilisation clinique, le surnageant de cellules immunosuppressives généré au sein de notre équipe pour traiter l’AHAI. Cette nouvelle thérapie permettrait une régulation de la réponse immunitaire notamment via l’inhibition des lymphocytes activés et l’augmentation des lymphocytes T régulateurs.
Bénéfices attendus
L’AHAI n’est pas une maladie orpheline ; cependant le nombre de traitements est restreint et à ce jour de nombreux patients présentent des rechutes fréquentes ou restent réfractaires aux thérapeutiques actuellement proposées qui sont parfois responsables de complications graves. Les travaux de l’équipe ont montré que les cellules immunosuppressives ou leur surnageant permettent de réguler la réponse immunitaire auto ou allo-immune in vitro et in vivo tout en évitant une immunodépression prolongée à haut risque infectieux. A notre connaissance il s’agit du seul essai utilisant une thérapie cellulaire ou de leur surnageant dans un modèle expérimental d’AHAI. Nous espérons pouvoir démontrer que notre surnageant peut réduire l’anémie.
Procédures
1 fois par semaine, nous prélèverons du sang d’un rat. Sur les 10 semaines du modèle, 4 rats seront utilisés en alternance. Pour induire le modèle d’AHAI, les souris recevront 1 injection intrapéritonéale, 1 fois par semaine pendant 10 semaines. A partir de la 6ème semaine, les souris recevront un traitement administré sous la forme de 2 injections intrapéritonéales par semaine. Au cours du modèle, du sang sera prélevé 4 fois au total chez les souris pour surveiller l’évolution de la maladie. Aucun prélèvement sur animaux vigiles et aucune procédure chirurgicale ne sont prévus dans cette étude. 1 fois par semaine, nous prélèverons du sang d’un rat. Sur les 10 semaines du modèle, 4 rats seront utilisés en alternance. Pour induire le modèle d’AHAI, les souris recevront 1 injection intrapéritonéale, 1 fois par semaine pendant 10 semaines. A partir de la 6ème semaine, les souris recevront un traitement administré sous la forme de 2 injections intrapéritonéales par semaine. Au cours du modèle, du sang sera prélevé 4 fois au total chez les souris pour surveiller l’évolution de la maladie. Aucun prélèvement sur animaux vigiles et aucune procédure chirurgicale ne sont prévus dans cette étude.
Impact sur les animaux
Les souris développeront une anémie, responsable d’une fatigue qui se traduira par une réduction de l’activité et possiblement une perte de poids.
Devenir
Les souris seront mises à mort 10 semaines après le début du modèle à la suite d’une anesthésie à l’isoflurane suivie d’une dislocation cervicale. Nous nous efforcerons de reclasser les rats mais si ils ne trouvent pas preneurs, ces rats seront mis à mort à la fin de l’expérience (10 semaines) grâce à une surdose de barbiturique suivi d’une dislocation cervicale.
Remplacement
Nous avons déjà montré que le surnageant de HuMoSC régulait la réponse immunitaire in vitro et in vivo. La complexité des réactions immunitaires au cours de l’anémie hémolytique auto-immune ne pouvant pas être modélisée in vitro, nous n’avons pas de moyen de remplacement du modèle animal et nous devons donc effectuer nos études sur des animaux vivants.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables (les analyses seront faites en utilisant le test de Student du fait de la petite taille des effectifs). Cependant, à cause des variabilités inter‐animales et inter-groupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. En effet dans ce modèle, seules 60 à 80% des souris présentent une anémie hémolytique auto-immune. Il est donc nécessaire d’injecter 18 souris pour avoir 2 groupes de 6 souris qui présenteront une AHAI pour l’étude. Nous prévoyons de faire cette expérience une seconde fois si les résultats sont encourageants.
Raffinement
La réduction de l’angoisse et de la souffrance des animaux sera notre priorité. Une période d’acclimations d’une semaine sera respectée à l’arrivée des animaux afin de réduire leur stress. Le personnel technique de l’animalerie se chargera de la surveillance quotidienne et de l’entretien des cages dans le respect des bonnes pratiques liées à l’expérimentation animale. Les cages disposeront d’enrichissement (nids, tunnels) afin d’améliorer le bien-être des animaux et ces derniers bénéficieront d’un libre accès à la nourriture et à la boisson. Pour préserver les contacts sociaux entre les individus, les souris seront hébergées en groupe avec 6 individus par cage. De même, les rats seront hébergés en groupe avec 2 individus par cage. Un score mesurant l’état général sera établi pour chaque souris et sera réalisé 2 fois par semaine. Si besoin, de l’alimentation humidifiée sera déposée au fond de la cage et une surveillance biquotidienne sera effectuée par l’expérimentateur. Si l’anémie est trop sévère, les souris seront sacrifiées pour éviter toute souffrance supplémentaire. Concernant la mise à mort des souris, celles-ci seront anesthésiées par voie gazeuse (oxygène et isoflurane) et une dislocation cervicale sera réalisée, ce qui entrainera la mort de la souris
Choix des espèces
Les souris C57BL/6J sont utilisées dans ce modèle expérimental d’anémie hémolytique auto-immune. L’AHAI dans ce modèle est induite par des injections hebdomadaires de globules rouges de rat Sprague Dawley et provoquent des effets similaires à ceux présents chez les patients atteints de cette maladie. Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7-8 semaines, les plus fréquemment utilisées pour l’étude de cette maladie. Nous utiliserons des rats de 12 semaines, c’est-à-dire des rats ayant atteint leur poids adulte afin de ne pas créer de risque pour l’animal lors des prélèvements de sang.
Caractérisation des composés pro addictogènes dans la nourriture
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 100 d'entre elles et modérés pour 70. Elles sont soumises pendant deux à trois mois à un régime gras et sucré pour induire l'obésité, puis à des croquettes contenant une substance opioïde destinée à provoquer un comportement addictif, avant des tests de comportement motivationnel. Le porteur reconnaît que ces croquettes peuvent générer un état de stress ou de manque et revendique un "besoin de stratégies innovantes" contre les troubles métaboliques. Il conclut au recours aux souris car les invertébrés n'ont pas les structures cérébrales équivalentes aux mammifères, et toutes les souris sont tuées pour prélever des tissus.
Objectifs
Ce projet fait partie d’un groupe de projets qui visent à identifier, si et comment certains composés alimentaires agissent directement ou indirectement sur le système de récompense pour modifier le plaisir associé à l’alimentation mais aussi les troubles compulsifs et addictifs qui leur sont associés.
Bénéfices attendus
Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes des maladaptations physiopathologiques. Malgré les progrès et les efforts, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. Des recherches approfondies sur l'obésité et la prise excessive de certains aliments, décrivent l’existence, dans un nombre important des cas, d’un composant de type addictif qui pourrait partager des mécanismes neurobiologiques communs. Ce travail permettra d’identifier formellement si une ou plusieurs composés alimentaires sont responsable de la mise en place de consommation compulsive.
Procédures
Les animaux ne subiront aucune procédure invasive, ils seront soumis à un régime riche en gras et sucre (2-3 mois) pour induire l’obésité et des régimes spécifiques (1-2 semaines) pour induire un comportement addictif. Ils seront aussi soumis à des tests de comportement motivationnel (1-2 semaines).
Impact sur les animaux
L’exposition à des croquettes contenant une drogue pour induire le comportement addictif peut générer des situations de stress chez les rongeurs ou une situation de manque. Nous surveillerons de près tous les jours le comportement de chaque souris pour détecter des signes de détresse ou une perte de poids importante( >15% du poids d'une souris contrôle). Le cas échéant, nous arrêterons le traitement et nous écarterons la souris qui montre un état de santé dégradé, pour qu’elle récupère. Basée sur notre expertise et sur la littérature nous prédisons que l’exposition relativement courte aux substances opioïdes devrait augmenter l’appétence pour la nourriture mais ne devrait pas créer de situation de manque trop rapide ni trop aigue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.
Réduction
Les groupes expérimentaux et le nombre d'animaux ont été déterminés par une approche statistique en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Selon les dessins expérimentaux et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nous utiliserons des tests paramétriques et si nécessaire des tests non paramétriques.
Raffinement
Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs ont pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, bâtons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris. Toutes les souris seront utilisées à l’âge adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.
Identification des gènes bactériens essentiels à la colonisation du tractus digestif
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un antibiotique dans l'eau de boisson pendant deux jours, puis un gavage unique avec une banque de mutants d'Escherichia coli multirésistants, avant que leurs fèces soient séquencées pour repérer les gènes utiles à la colonisation intestinale. Le porteur affirme ne pas s'attendre à une gêne pour les animaux et prévoit leur mise à mort dès une perte de poids supérieure à 10 %. Il conclut que cette question "ne peut être réalisée que sur un modèle animal", sans détailler d'alternative testée.
Objectifs
Les bactéries Escherichia coli sont des bactéries retrouvées naturellement au sein du microbiote intestinal, c’està-dire les microorganismes hébergés dans notre intestin. La grande majorité des E. coli sont non pathogènes. Cependant, ces bactéries ont une grande capacité d’échange de matériel génétique et peuvent au fil de leur évolution acquérir de nombreux gènes. Parmi ceux-ci, les gènes responsables de la résistance aux antibiotiques sont ceux qui attirent le plus l’attention de la communauté hospitalière. En effet, de plus en plus d’E. coli résistent à plusieurs antibiotiques (on parle alors de souches multi-résistantes) les rendant extrêmement difficiles à traiter et pouvant conduire à des infections fatales chez les patients notamment immunodéprimés. Au sein des E. coli multi-résistants, un clade (un regroupement de plusieurs souches ayant une organisation génomique et une origine commune) est particulièrement scruté car sa fréquence est en constante augmentation aussi bien chez les Hommes que chez les animaux, suggérant une très forte capacité à coloniser le tractus digestif. Le but de notre étude est de comprendre les mécanismes adaptatifs qu’ont développés ces souches de manière à coloniser si efficacement le tractus digestif. Pour cela, nous disposons de souches multi-résistantes présentes chez l’Homme et retrouvées en clinique depuis plusieurs années, ainsi que des souches multi-résistantes apparues récemment chez l’Homme et dont la fréquence de détection et donc le portage augmentent rapidement. Nous disposons pour chacune des souches d’une banque de mutants. Une banque de mutants correspond à plusieurs dizaines de milliers de clones de la bactérie initiale dans lesquelles, à l’aide d’une approche moléculaire, un élément mobile appelé transposon a été inséré aléatoirement dans le chromosome bactérien. Le transposon en s’intégrant de façon aléatoire dans le génome bactérien va inactiver le gène dans lequel il s’est intégré. Nous gaverons de souris avec les banques de mutants puis par séquençage, des bactéries présentes dans les fèces, nous déterminerons pour chaque souche les gènes importants pour l’implantation intestinale. La découverte de protéines cruciales pour l’implantation intestinale des E. coli multi-résistants pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques visant à limiter la colonisation intestinale de ces souches.
Bénéfices attendus
Le projet permettra du point de vue scientifique une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux pour faciliter la colonisation intestinale des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques. Nous espérons mettreen lumière des protéines clefs impliquées dans la colonisation bactérienne et ainsi proposer de nouvelles stratégies permettant de limiter cette colonisation intestinale.
Procédures
Les animaux recevront via l'eau de boisson un antibiotique pendant 2 jours. C'est une procédure classique qui n'induit aucun stress/douleur chez l'animal. Les animaux seront ensuite gavés avec un volume de 200μl (1 seul gavage). Le gavage se fera sur animal vigile par du personnel expérimenté habitué à cet acte qui hormis la contention n'induit aucune douleur à l'animal (le temps moyen de l'acte entre la prise de l'animal dans sa cage, la contention, le gavage ne dépasse jamais les 20 secondes).
Impact sur les animaux
Nous ne pensons pas que les manipulations proposées induisent une quelconque gène chez l’animal étant donné que les souches utilisées ne sont pas pathogènes et les animaux immunocompétents. Cependant, un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à repérer toute détresse animale. Si un animal présente un des critères suivant : perte de poids supérieure à 10%, un dos vouté, le poil dru, ou une démarche traduisant une souffrance, il sera immédiatement mis à mort. Pour faciliter le suivi des animaux, un système de score intégrant différents paramètres (apparence, comportement, signes cliniques…) sera utilisé de manière à nous assurer qu’aucun animal n’est en souffrance.
Devenir
Les animaux auront été traités avec des antibiotiques et gavés par des bactéries rendant leur réutilisation dans un autre protocole impossible.
Remplacement
Le but du travail est comprendre comment les bactéries multi-résistantes aux antibiotiques colonisent le tractus digestif. Ceci ne peut être réalisé que sur un modèle animal.
Réduction
Des expériences préliminaires menées au laboratoire nous ont permis grâce au séquençage du génome de nombreuses souches d'intérêt, de sélectionner les clones les plus représentés chez les patients. Ainsi nous réduirons le nombre d'animaux en limitant le nombre de souches et en ne testant que les plus relevantes (c'est-à-dire les plus fréquentes chez les patients).
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans une salle climatisée (22 ± 2°C) avec un cycle 12/12h (jour/nuit, 7h00 à 19h00) et un taux d'humidité maintenu à 55%. Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en carton. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. Le poids des souris sera également suivi avec attention (pesées 2 fois par semaine) car c’est un très bon marqueur de l’inflammation intestinale et de la sévérité d’une diarrhée. Une perte de plus de 10% du poids avant le gavage constituera un critère d’arrêt et l’animal en question sera mis à mort. De plus, nous utilisons un système de score (présenté en annexe) dont les paramètres sont : l'apparence, le comportement naturel, l'hydratation, les signes cliniques, et le comportement provoqué.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des souris de fond génétique C57BL/6 wild-type. Ces dernières sont particulièrement utilisées dans les expériences de colonisation du tractus digestif par des bactéries notamment les E. coli. Les animaux utilisés seront tous des jeunes adultes (6 à 8 semaines) au début de la procédure expérimentale. Au sein de la communauté scientifique, c'est à cet âge là que les expériences de colonisation intestinale se font.
Troubles endocriniens et métaboliques : diabète et obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 1100
Jusqu'à huit prises de sang en quatre à huit heures, un jeûne pouvant atteindre 16 heures, un isolement jusqu'à 24 heures pour recueillir urines et fèces : 1 100 souris et 1 100 rats, soit 2 200 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chez une partie d'entre eux, l'équipe provoque des troubles métaboliques par l'administration unique d'un réactif que le résumé ne nomme pas, par un régime riche en graisse ou par les deux. Les rongeurs reçoivent des substances par la bouche, en injection ou en perfusion veineuse de plusieurs heures, pendant des jours ou des semaines, pour tester des candidats médicaments contre le diabète et l'obésité, ou les effets d'autres molécules sur le système hormonal. Le porteur écrit que l'impact de ces substances sur le métabolisme des rongeurs "est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique". Le champ structuré du devenir ne déclare aucun rongeur réutilisé, alors que le texte prévoit de réutiliser, après accord vétérinaire, ceux qui sortent de procédures légères ou modérées, et de tuer ceux dont les organes sont prélevés.
Objectifs
La prévalence mondiale du diabète et de l’obésité n’a cessé d’augmenter au cours de ces dernières décennies et a atteint des proportions pandémiques (463 millions de personnes atteintes en 2019). Ces troubles métaboliques exposent les personnes atteintes à un risque de pathologie bien plus grave, en effet une glycémie constamment élevée provoque des lésions vasculaires généralisées affectant le cœur, les yeux, les reins et les nerfs. Elle expose les personnes atteintes à une incidence accrue de maladies athérosclérotiques cardiovasculaires. A l’heure actuelle, toutes les thérapies disponibles traitent les conséquences du diabète de type 2 en se focalisant principalement sur la régulation glycémique, mais ne ciblent pas le mécanisme biologique sous-jacent qui cause la maladie. Par ailleurs, certaines molécules médicamenteuses en cours de développement peuvent avoir des effets secondaires sur le système endocrinien et favoriser l’apparition d’hyperglycémie et de diabète. Ainsi le présent projet aura pour objectif d’une part d'évaluer l’efficacité préclinique de nouvelles substances susceptibles de lutter contre les troubles métaboliques et endocriniens (diabète, obésité, syndrome métabolique), d’autre part, de déterminer si de nouvelles substances en développement peuvent avoir une répercussion sur le système endocrinien. Quel que soit le contexte de l’étude, l’effet des substances pharmacologiques est évalué sur des modèles biologiques suffisamment sensibles et prédictifs, capables de mimer la physiologie endocrinienne humaine et sa complexité, afin de garantir la pertinence et la validité des résultats expérimentaux obtenus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer l’activité pharmacologique de substances en développement sur le métabolisme glucidique et lipidique. Ce projet permettra également d’étudier les effets secondaires possibles d’autres substances bioactives sur le système endocrinien.
Procédures
Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute), ou par un régime riche en graisse, ou la combinaison des deux. Les substances-test peuvent être administrées par bolus (voie orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire), durée de quelques secondes ou par perfusion lente (intraveineuse) de quelques minutes à quelques heures. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline nécessitent une administration unique (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 8 maximum, sur 4 ou 8h de test). Par ailleurs, des prélèvements de sang (8 maximum, sur 4 ou 8h) peuvent être réalisés, chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. Enfin, un hébergement individuel (durée max 24 h) peut être réalisé au cours de l'étude pour prélèvement d'urines ou de fèces.
Impact sur les animaux
Bien qu’un certain nombre de procédures appliquées dans ce projet n’induisent pas de nuisance ou d’effets indésirables sur les animaux, quelques procédures peuvent induire un stress lié à un isolement (
Devenir
Pour les procédures légères et modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour procédures nécessitant des prélèvement d’organes les animaux sont euthanasiés.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments testés de nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) ont déjà eux lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substance à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système endocrinien chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle négatif permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Par ailleurs et dans la mesure du possible (en fonction de la durée d'action de la substance-test), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal et à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nos données historiques ainsi que celles de la littérature indiquent qu’un effectif 8-10 animaux ( rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L' analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude. Dans le but de réduire le nombre d’animaux, certains animaux issus des procédures réalisées sur l’animal éveillé sont également réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subi de procédure sévère et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du diabète, il presente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs adultes sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence).
Etude du mode d’action et de l’efficacité du Fitusiran dans des modèles murins d’hémophilie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
467 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Rendues déficientes en facteurs de coagulation pour reproduire l'hémophilie humaine, elles reçoivent une à trois injections de Fitusiran, deux prélèvements sanguins dont un terminal, et pour une partie un test de saignement où une veine de la queue ou de la cuisse est blessée sous anesthésie et la perte de sang mesurée pendant trente minutes. Le porteur indique que ces pertes de sang importantes empêchent toute réutilisation et justifie le recours aux souris par le fait que les tests sans animaux ne reproduisent pas l'intégralité de la coagulation. Le projet vise à préciser le mode d'action et les risques thrombotiques d'un traitement déjà en essai clinique.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare affectant principalement les hommes. Il en existe deux types : l’hémophilie A (1 naissance de garçons sur 5000) et l’hémophilie B (1 naissance de garçons sur 30000). Une troisième maladie hémorragique apparentée est la maladie de Stuart-Prower (1 cas sur 1 million). Ces trois maladies surviennent lorsqu'il y a un déficit en protéines importantes pour assurer la coagulation sanguine. Pour l'hémophilie A, il manque le facteur VIII. Pour l'hémophilie B, il manque le facteur IX et pour la maladie de Stuart-Prower, il manque le facteur X. La coagulation sanguine est le processus qui permet l'arrêt du saignement lors d'une blessure. Sans traitement, l'espérance de vie des patients hémophiles est d'environ une quinzaine d'années. Il existe un traitement standard de l'hémophilie qui consiste à donner aux patients la protéine qui leur manque. Par contre, ce traitement est assez lourd car il ne s'agit pas d'un comprimé à avaler mais d'injections par voie intraveineuse, injections qui doivent être faites plusieurs fois/semaine. Actuellement de nouveaux traitements cherchent à faciliter la prise en charge de ces maladies en diminuant la fréquence des injections. L'un de ces traitements est très original puisqu'il ne cherche pas à redonner aux patients la protéine qui leur manque mais il vise à bloquer une autre protéine, l'antithrombine, dont le rôle normal est de réduire le processus de coagulation. Lors des essais cliniques chez les patients hémophiles, cette thérapie, appelée Fitusiran semble être efficace mais des questions demeurent d'une part sur son mode d'action précis et d'autre part sur les risques potentiels associés à son utilisation. En effet, de nombreux professionnels de santé sont réticents à l'idée d'utiliser ce traitement qui pourrait potentiellement induire un effet pro-thrombotique, c'est-à-dire induire une coagulation sanguine indésirable qui interviendrait même en absence de blessure. L'objectif de notre projet est donc de mieux comprendre le mécanisme d'action du Fitusiran ainsi que l'évaluation des risques associés dans des modèles de souris déficientes en Facteur VIII (hémophiles A), en Facteur IX (hémophiles B) ou en Facteur X.
Bénéfices attendus
A court-terme, les résultats de cette étude permettront 1) d'établir un effet dose-réponse du Fitusiran pour corriger les saignements incontrôlés chez des souris reproduisant des maladies hémorragiques humaines 2) de surveiller le risque thrombotique associé. A plus long terme, le projet contribuera à mieux établir le profil de sécurité du Fitusiran afin de favoriser son déploiement à plus grande échelle dans la population hémophile.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période de 21 jours maximum. Selon les groupes, les souris recevront 1, 2 ou 3 injections de Fitusiran à raison d'une injection/semaine. Deux prélèvements sanguins seront effectués au maximum par souris, l'un avant le traitement et le second à différents temps après le traitement. Pour certaines souris, ce second prélèvement sanguin sera terminal puisque toutes les mesures seront ensuite effectuées sur le sang recueilli. Ces prélèvements sanguins se feront sur souris anesthésiées. Pour un autre groupe de souris, un test de saignement sera réalisé le lendemain du second prélèvement sanguin Dans ce test, les souris seront anesthésiées et une blessure sera induite sur une veine de la queue ou de la cuisse et la quantité de sang perdu sera mesurée pendant une durée de 30 minutes. Au terme des 30 minutes, les animaux toujours sous anesthésie seront euthanasiés par les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Douleur légère lors des injections sous-cutanées et après les prélèvements sanguins. Stress lors de la préhension des animaux
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. En effet, lors des tests de saignement, les souris peuvent perdre beaucoup de sang, ce qui provoquerait un impact trop important sur une ré-utilisation potentielle.
Remplacement
La coagulation sanguine est un processus complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.
Réduction
Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience des modèles expérimentaux et de la variabilité qui leur est associée. Les doses de Fitusiran que nous avons choisies de tester ont déjà été suggérées dans la publication scientifique décrivant cette approche, ce qui nous permet de ne pas partir en aveugle et de limiter les doses à étudier.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les points limites susceptibles d'entraîner l'euthanasie immédiate de l'animal seront les suivants: Hyperalgésie après les injections et les prélèvements, visible par une agitation importante de la souris ou manifestation hémorragique qui serait visible par un écoulement de sang au niveau oculaire/nasal. Pendant les 14 jours de la procédure, observation quotidienne des animaux (1 fois pendant le week-end): Décision d'euthanasie si un des critères suivants est noté: 1) perte de 20% du poids par rapport à la veille, 2) poils hérissés ou 3) état apathique.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui reproduisent les pathologies étudiées (hémophilie et maladie de Stuart-Prower). Il s'agit de souris déficientes en Facteur VIII (modèle d'hémophilie A) en Facteur IX (modèle d'hémophilie B) et en Facteur X (modèle de maladie de Stuart-Prower). Ces modèles ont d’ores et déjà montré leur pertinence en tant que modèles de ces pathologies humaines. Pour l'intégralité des procédures, des souris adultes (8-16 semaines environ) des deux sexes seront utilisées.
Efficacité d’un nouvel antibiotique contre Mycobactérium avium
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 30 d'entre elles et sévères pour 180. Elles sont infectées par Mycobacterium avium au moyen d'un aérosol de deux heures, puis reçoivent des antibiotiques par gavage et par injection dans le ventre cinq jours par semaine pendant un à quatre mois. Le porteur reconnaît que les gavages réalisés par des personnes novices peuvent provoquer des saignements, une inhalation ou la mort, et prévoit un entraînement préalable sur une fausse souris. Il affirme qu'il n'existe à ce jour aucune solution alternative satisfaisante et met à mort tous les animaux en fin de traitement pour mettre leurs poumons en culture.
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer l'efficacité d'un nouvel antibiotique, contre les infections respiratoires à Mycobacterium avium, une bactérie particulièrement difficile à traiter. Les objectifs secondaires sont de déterminer les meilleures combinaisons de traitements avec cet antibiotiques et de décrire la réaction des tissus de l'organisme sous ce(s) traitement(s).
Bénéfices attendus
Cet antibiotique a déjà montré une efficacité in vitro (en laboratoire) sur Mycobacterium avium, mais l'efficacité in vivo (chez l'être vivant) reste à démontrer. Si notre hypothèse de travail est correcte, notre projet permettra de mettre en évidence l'efficacité de ce nouvel antibiotique seule et en combinaison avec d'autres antibiotiques spécifiques. Cette efficacité permettra d'informer à court terme d'autres études expérimentales sur des combinaisons à tester et leur durée de traitement, mais également à moyen terme les essais cliniques thérapeutiques pour des patients en grand besoin de traitements plus efficaces et mieux tolérés dans cette indication.
Procédures
Il n'est pas prévu de prélèvement sanguin ou d'intervention chirurgicale. En revanche les souris seront infectées par des aérosols de mycobactérie (durée 120mn) et seront par la suite traitée par différents antibiotiques afin de déterminer leur efficacité. Si l'infection par aérosol est indolore, l'administration des antibiotiques se fait par voie orale (à la seringue) et/ou par voie injectable (dans le ventre). Ces administrations sont répétés tous les jours (durée 5 à 10 secondes), cinq jours par semaine pendant 1 mois, 2, 3 ou 4 mois pour certaines souris.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale du gavage et de l'injection, bien qu'en soit peu délétère, est répétée quotidiennement, pouvant provoquer un stress sur les animaux. C'est pourquoi il est prévu un rapport écrit de la surveillance quotidienne avec évaluation a posteriori du projet. Des points limites spécifiques ont été établis pour la surveillance. Les effets indésirables attendus, surviennet essentiellement lorsque les gavages sont faits par des novices. Ce sont : des saignements, un stress, une inhalation, le décès. Lors des injections, ce sont des douleurs, des hématomes, des troubles cutanés. Toutefois, le personnel novice sera dans un premier temps entraîné sur une souris d'entrainement fictive (Mimicky mouse, Dorset, UK) jusqu'à ce qu'ils acquièrent la dextérité et l'aisance nécessaire pour ne pas faire subir d'effet indésirable inutile aux souris.
Devenir
Afin de pouvoir tester l'efficacité des antibiotiques les animaux doivent être infectés puis traités. Après la durée de traitement prévue dans le protocole il est nécessaire de mettre en culture les poumons afin de mesurer l'efficacité des antibiotiques. Tous les animaux sont donc mis à mort à la fin de la durée de traitement.
Remplacement
La procédure de préhension et de gavage sera apprise sur une souris fictive jusqu'à ce que les personnes formées soient à l'aise avec ces procédure. Des analyses in vitro ont été réalisées en amont pour sélectionner les candidats, mais à ce jour, il n'existe pas de solution alternative satisfaisante pour remplacer les animaux dans cette indication.
Réduction
Le nombre de souris est calculé au plus proche de ce qui est nécessaire pour voir une différence significative entre les groupes de traitement.
Raffinement
Les mesures de raffinement suivantes seront prises pour diminuer la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Les souris seront suivies quotidiennement. Dans la cas où une douleur serait observée, les souris auront une injection d'analgésique une fois par jour jusqu'à normalisation de l'échelle de la douleur. Dans le cas d'une aggravation des signes de douleur, les souris concernées seront euthanasiées. Nous avons défini des points limites spécifiques au gavage. Les souris seront gardées dans des cages collectives (en respectant la limite de souris par cage) et enrichies (litières foisonnantes et absorbantes, tunnels, …). Nourriture et boisson seront ad libitum.
Choix des espèces
Dans notre étude précédente la souris BALB/c était le modèle animal répondant le mieux à l’antibiothérapie semblant le plus se rapprocher des données humaines. Il n'est pas justifié d'utiliser des modèles de souris immunodéprimées (ou d'autres espèces animales) moins semblables aux données cliniques
Hébergement de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 25000
250000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie expédiée aux scientifiques qui les ont commandés et le reste tué. Ce projet d'élevage industriel de lignées génétiquement modifiées prévoit identification, jusqu'à quatre biopsies à l'oreille ou à la queue et des prélèvements sanguins par animal, certaines lignées exprimant un phénotype dommageable comme un diabète, une hémophilie ou une immunodéficience. Le porteur indique que les animaux "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. Il présente l'élevage sur mesure de rongeurs "à fournir aux scientifiques" comme un service rendu à la communauté de recherche.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la création, caractérisation et/ou l’élevage de lignée transgéniques à phénotypes dommageables ainsi que la réalisation d'une biopsie par méthode invasive séparément du geste d'identification sur des lignées transgéniques dans le but d'héberger ou de maintenir des lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique comme par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées transgéniques, si la présence d’un phénotype dommageable n’a pas été analysée, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre la gestion optimale des possibles expressions cliniques du phénotype dommageable, leur prévention ou leur traitement adéquat. Lorsque le phénotype dommageable est avéré et connu, la gestion de cette lignée sera adaptée à ce dernier par la définition / surveillance des possibles signes cliniques associés à l'expression de ce phénotype ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique hébergée/élevée, il est important de connaitre le génotype des animaux, ainsi, en plus de l’identification, une biopsie avec une méthode invasive sera réalisée. Le but de cette biopsie est donc d’analyser le génotype de chaque animal afin de sélectionner celui d'intérêt. En 2022, sur 505 projets transgéniques au total (225 000 animaux), seulement 95 lignées étaient signalées avec un phénotype dommageable (19%, soit 43 000 animaux). Parmi ces 19%, moins de 1% ont réellement exprimé un phénotype dommageable. Ces phénotypes peuvent être catégorisés en tant qu’immunodéficient ; hémophile ; maladie métabolique ; trouble neurologique ; pathologie musculaire et articulaire ou cancer, mais nous ne pouvons prévoir précisément le nombre de lignées par catégories, cela dépend des sujets de recherche des scientifiques. Pour ce projet, nous comptons 250 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets d’élevage de lignées transgéniques différentes. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes dommageables.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A une identification unique, acte d’une durée maximale de 20 secondes, à maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire en cas d’animal fragile ou d’animal agressif. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Expression possible d’un phénotype dommageable due à la mutation génétique (immunodépression, arthrite, diabète, hémophilie, …). Chaque effet indésirable est notifié si connu à l’arrivée des animaux ou estimé lors de l’hébergement. Un suivi adapté et des mesures de raffinement spécifiques sur avis vétérinaire sont mis en place en fonction de l’impact observé / attendu chez l’animal. Sur la base du suivi rapproché effectué sur ces souches et des raffinements mis en place, la nuisance sur l’animal est légère à modérée. Stress suite à la contention pour identification Douleur et stress dus aux biopsies (nombre maximum de 4) si besoin d’identifier le génotype d’intérêt. La biopsie à l’oreille est privilégiée (environ 3mm x 3mm ou languette de 5mm de large maximum, plusieurs biopsies peuvent être faite si nécessaire et justification, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone (oreille peu sensible), la nuisance sur l’animal est légère. Les biopsies à la queue sont possibles sur justification scientifique (biopsies de queue de 5mm maximum, une 2eme biopsie peut être réalisée sous justification du scientifique, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone, la nuisance sur l’animal est légère pour les animaux de moins de 3 semaines (queue peu sensible) et modérée pour les animaux de plus de 3 semaines. Douleur et stress dus aux prélèvements de sang (volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur et les bonnes pratiques et raffinements internes). Une anesthésie pourra être appliquée en fonction du lieu du prélèvement. Hébergement isolé la période de récupération post opératoire pour les femelles réimplantées ou en cas d’agressivité au sein du groupe social afin de limiter la douleur et le stress liés à cette agressivité. Mise en place d’enrichissements supplémentaires et adaptés en cas d’hébergement isolé.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).
Raffinement
Les observations par le personnel permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en contactant les techniciens qualifiés, compétents et le vétérinaire. Si un point limite est atteint, le technicien met en place des soins particuliers, un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place et géré par des techniciens qualifiés, compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les règles éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s'assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont les plus développées, les mieux maitrisées et pour lesquelles les données scientifiques sont nombreuses. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d’études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Lors de la caractérisation des lignées, l’observation détaillée et l’analyse de la présence du phénotype dommageable sont réalisées à la naissance, au sevrage et 8 semaines d'âge. Il est également possible de prolonger sur l'âge adulte si les animaux sont conservés plus longtemps. - Hébergement des lignées à phénotypes dommageables fait à tout âge. -Biopsies réalisées le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une recoupe à l’âge adulte peut être demandé par le client. - Prélèvement de sang dans la plupart des cas fait en submandibulaire après 4 semaines d’âge minimum (adulte).
Etude de l’impact d’un traitement à l’érythropoïétine sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
400 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'érythropoïétine, pour une partie une greffe de cellules de cancer mammaire triple négatif et des injections rétro-orbitaires, ainsi que des prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever un maximum d'organes. L'objet du projet est de comprendre comment l'érythropoïétine, donnée aux patients cancéreux anémiques, altère la réponse immunitaire anti-tumorale. Le porteur affirme qu'aucun système ne reflète la complexité des interactions entre cellules immunitaires et tumorales.
Objectifs
Chez les patients atteints de cancer et traités ou non par chimiothérapie, une anémie peut se développer. Afin de pallier cet effet secondaire, les patients reçoivent de l'érythropoïétine (EPO) améliorant ainsi leur qualité de vie. Cependant, plusieurs méta-analyses récentes ont montré qu’à la suite du traitement à l’EPO, certains patients pouvaient présenter une réduction de survie globale indépendamment du type de cancer ou du protocole de chimiothérapie. Nous savons maintenant qu’en plus de l’augmentation de la production de globules rouges, l’EPO agit sur de nombreuses autres cellules et notamment les cellules immunitaires. L’EPO affecte négativement la réponse immunitaire de souris greffées avec des cellules de carcinome mammaire triple négative, les plus difficiles à traiter et a notamment un effet systémique sur les lymphocytes T qui ont un role central dans la réponse immunitaire anti-cancéreuse. Nous souhaitons maintenant caractériser, dans ce modèle murin, les altérations induites par le traitement à l’EPO sur un autre type de cellules immunitaires importantes dans la réponse anti-tumorale : les cellules Natural Killer.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de caractériser l’impact de l’EPO sur les cellules NK. Cela nous permettra de mieux comprendre les effets secondaires indésirables que certains patients atteints de cancer peuvent développer suite au traitement de leur anémie par l’EPO et par la suite donc de traiter seulement les patients qui ne développeront pas ces effets indésirables.
Procédures
pro40 femelles C57BL/6J subiront tous les deux jours une injection sous cutanée pendant 14 jours (moins de 20 secondes) et 1 prélèvement sanguin caudal (J13) (moins d'une minute). 200 femelles C57BL/6J subiront trois fois par semaine (lundi mercredi et vendredi) une injection sous cutanée pendant 14 jours (moins de 20 secondes), une injection intrapéritonéale d'un adjuvant (J13) (moins de 20 secondes) et 1 prélèvement sanguin caudal (J13) (environ 30 secondes). 80 femelles C57BL/6J subiront une injection sous cutanée trois fois par semaine pendant 15 jours (moins de 20 secondes), une injection intrapéritonéale d'un adjuvant (J13) (moins de 20 secondes), 1 prélèvement sanguin caudal (J13) (environ 30 secondes) et une injection rétro-orbitaire de cellules cibles sous anesthésie gazeuse (J14) (environ 3 min). 80 femelles C57BL/6J subiront une injection sous cutanée trois fois par semaine pendant 35 (moins de 20 secondes), une injection de cellules tumorales (J14) (moins de 20 secondes) et deux prélèvements sanguins (J13 et J34) (environ 30 secondes)
Impact sur les animaux
Lors des premières injections, les souris peuvent être légèrement stressées au moment de la contention. Les injections sous cutanées, intrapéritonéales et intradermiques engendrent une douleur légère et de très courte durée. L’injection rétro-orbitaire s’effectuant sur animal anesthésié, la douleur après réveil due à ce geste est légère et de courte durée. La croissance tumorale peut être dans certains cas, gênante mais nous n’avons jamais observé chez ces souris de douleurs importantes. Les prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale induisent une douleur légère et de très courte durée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever le maximum d'organes pour l'étude des cellules natural Killer qui représentent une population minoritaire.
Remplacement
Notre projet vise à évaluer l’effet de l’Erythropoïétine sur la réponse immunitaire anti-tumorale. A ce jour, il n’existe pas de modèle et de système permettant de refléter la complexité des interactions entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales. L’expérimentation animale s’avère donc nécessaire.
Réduction
Dans notre étude, chaque souris sera utilisée pour analyser un maximum de tissus. Le premier type d'expérimentation qui s’effectue dans un contexte non pathologique, nous permettra dans un premier d’étudier l’effet de l’Erythropoïétine sur le développement des cellules Natural Killer dans la moelle osseuse mais également dans les organes lymphoïdes secondaires (ganglions lymphatiques et rate) et dans le sang. Dans un deuxième temps, nous analyserons l’effet de l’Erythropoïétine sur leurs fonctionalités grâce à des tests in vitro d’activation en présence d’anticorps activateurs ou de cellules cibles. La rate et le sang seront prélevés afin d’obtenir le maximum de cellules Natural Killer qui représentent une population cellulaire minoritaire. Enfin, nous analyserons l’impact de l’Erythropoïétine sur leurs fonctionalités in vivo grâce à des tests de réjection de cellules cibles obtenues à partir de souris non hébergées dans notre animalerie. Lors de la mise à mort des souris, la rate et le sang seront prélevés également afin de mesurer l’activation des cellules Natural Killer dans ce test in vivo. Nous analyserons ensuite dans un contexte tumoral, l'impact de l'Erythropoïétine sur le développement des cellules Natural Killer dans la moelle osseuse, ainsi que les fonctionalités des ces cellules matures dans les organes lymphoïdes secondaires, dans le sang et dans les tumeurs. Ces analyses multiparamétriques nous permettront de réduire le nombre d’animaux employés tout en conservant une validité statistique appropriée. Etant donné que nous travaillons sur des populations cellulaires minoritaires (les cellules NK représentent environ 3% des cellules présentes dans la rate des souris et 5% des globules blancs du sang), et que certaines souris sont réfractaires au traitement à l’EPO ou à la pousse tumorale (environ 20%), ces études nécessitent 20 souris par groupe et par type d'expérimentation. Ce nombre d’animaux a été calculé selon notre expérience acquise en tenant compte de la variabilité interindividuelle et afin d’obtenir des résultats statistiquement représentatifs.
Raffinement
Toutes les souris du projet bénéficient des conditions d’hébergement, conformes à la réglementation et contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. L’expérience acquise sur ce type d’expérience nous a permis d’établir que l’injection d’EPO n’induit pas de phénotype dommageable chez la souris. De plus nous avons mis en place une grille de points limites adaptée afin d’évaluer le bien être de l’animal et de limiter sa souffrance.
Choix des espèces
La souris Mus musculus est l’espèce la plus utilisée en expérimentation pour étudier l’immunité anti-cancéreuse. De nombreuses bases de données sont disponibles dans la littérature et nos propres résultats servent de base expérimentale pour nos protocoles. Les souris adultes que nous utilisons sont âgées de 7 à 12 semaines, âge auquel le système immuntaire est mature.
Etude de l’efficacité de la Méfloquine et de ses enanthiomères contre M. avium sur un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie atteint un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par aérosol avec la mycobactérie M. avium puis gavées d'antibiotiques cinq jours par semaine pendant un à quatre mois, la répétition quotidienne des gavages justifiant à elle seule la gravité sévère. Elles sont tuées à la fin du traitement pour mettre leurs poumons en culture et mesurer l'efficacité des molécules. Le porteur affirme n'avoir pas observé de nuisance liée à l'infection et juge qu'il n'existe "pas de solution alternative satisfaisante".
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer l'efficacité de la méfloquine et de ses énanthiomères contre les infections respiratoires à Mycobacterium avium (M. avium). Les objectifs secondaires sont de déterminer les meilleures combinaisons de traitements avec l'omadacycline et de décrire l'anatomie pathologique sous ce(s) traitement(s).
Bénéfices attendus
La méfloquine et ses dérivés ont déjà montré une efficacité in vivo sur M. avium, mais l'efficacité en combinaison avec les antimycobactériens de références reste à démontrer. Si notre hypothèse de travail est correcte, notre projet permettra de mettre en évidence une combinaison plus efficace que le traitement de référence, ce qui permettra d'informer à court terme d'autres études expérimentales sur des combinaisons à tester et leur durée de traitement, mais également à moyen terme les essais cliniques thérapeutiques pour des patients en grand besoin de traitements plus efficaces et mieux tolérés dans cette indication.
Procédures
Il n'est pas prévu de prélèvement sanguin ou d'intervention chirurgicale. En revanche les souris seront infectées par des aérosols de mycobactérie (durée 120mn) et seront par la suite traitée par différents antibiotiques afin de déterminer leur efficacité. Si l'infection par aérosol est indolore, l'administration des antibiotiques se fait par voie orale (à la seringue). Ces administrations sont répétés tous les jours (durée 5 à 10 secondes), cinq jours par semaine pendant 1 mois, 2, 3 ou 4 mois pour certaines souris.
Impact sur les animaux
Les gavages et injections étant répétés quotidiennement amènent la procédure à être classée sévère. Lors de nos précédentes expérimentations, nous n'avons pas observé de nuisance dûe à l'exposition à M. avium. Des points limites spécifiques sont mis en place en fonction de nos précédentes observations sur ce type de protocole.
Devenir
Afin de pouvoir tester l'efficacité des antibiotiques les animaux doivent être infectés puis traités. Après la durée de traitement prévue dans le protocole il est nécessaire de mettre en culture les poumons afin de mesurer l'efficacité des antibiotiques. Tous les animaux sont donc mis à mort à la fin de la durée de traitement.
Remplacement
La procédure de préhension et de gavage sera apprise sur une souris fictive jusqu'à ce que les personnes formées soient à l'aise avec ces procédure. Des analyses in vitro ont été réalisées en amont pour sélectionner les candidats, mais à ce jour, il n'existe pas de solution alternative satisfaisante pour remplacer les animaux dans cette indication.
Réduction
Le nombre de souris est calculé au plus proche de ce qui est nécessaire pour voir une différence significative entre les groupes de traitement.
Raffinement
Les mesures de raffinement suivantes seront prises pour diminuer la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Les souris seront suivies quotidiennement. Dans la cas où une douleur serait observée, les souris auront une injection d'analgésique une fois par jour jusqu'à normalisation de l'échelle de la douleur. Dans le cas d'une aggravation des signes de douleur, les souris concernées seront euthanasiées. Nous avons défini des points limites spécifiques au gavage. Les souris seront gardées dans des cages collectives (en respectant la limite de souris par cage) et enrichies (litières foisonnantes et absorbantes, tunnels, …). Nourriture et boisson seront ad libitum.
Choix des espèces
Dans notre étude précédente la souris BALB/c était le modèle animal répondant le mieux à l’antibiothérapie semblant le plus se rapprocher des données humaines. Il n'est pas justifié d'utiliser des modèles de souris immunodéprimées (ou d'autres espèces animales) moins semblables aux données cliniques.
Fonction du gene ASB2 dans la réponse immunitaire anti-tumorale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement invalidées pour le gène ASB2, elles reçoivent des injections répétées et le développement de tumeurs ou de métastases sous-cutanées pouvant gêner leurs mouvements, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. L'objet du projet est fondamental, comprendre le rôle d'un régulateur des cellules immunitaires NK dans la réponse anti-tumorale. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne convient et met en avant les "faibles coûts" et la "facilité de manipulation" de la souris.
Objectifs
Augmenter le portefeuille des approches thérapeutiques est crucial pour répondre aux besoins cliniques et proposer des traitements personnalisés aux patients atteints de cancer. Les cellules tueuses naturelles (appelées aussi lymphocytes NK) ont de multi-facettes fonctionnelles en contribuant notamment à l’élimination de cellules cancéreuses, ce qui en fait une arme idéale en immunothérapie. Leur avantage est qu’elles sont faciles à isoler, à amplifier ex vivo et à manipuler. Les thérapies actuelles utilisent différentes stratégies pour augmenter l’efficacité de ces cellules basées sur l’utilisation d’anticorps thérapeutiques, de drogues modulant la réponse immunitaire ou encore de la thérapie génique. Il est néanmoins important d’ajuster très finement ces thérapies pour éviter des effets secondaires indésirables. Il apparait donc essentiel de comprendre de façon précise la diversité fonctionnelle des cellules NK pour élaborer des traitements efficaces. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet qui vise à élucider le rôle d’un nouveau régulateur de l’activité anti-tumorale des lymphocytes NK que nous avons identifié et à faire la preuve de concept que moduler l’activité de ce régulateur est bénéfique pour éradiquer certains types de tumeurs. Nos données montrent en effet que ce régulateur est exprimé dans des sous-populations spécifiques de cellules NK en particulier celles jouant un rôle majeur dans la réponse anti-tumorale et régule la migration de ces cellules. Le rôle de ce régulateur des cellules immunitaires NK in vivo en conditions de développement tumoral n’a jamais été étudié. Le projet proposé constitue une étape clé de notre étude du rôle de ce régulateur dans le cancer grâce au modèle d’invalidation de ce gène par recombinaison homologue chez la souris précédemment développé. Enfin, il est important de mentionner que les modèles expérimentaux proposés miment des situations physiologiques, pathologiques ou physiopathologiques de l’Homme.
Bénéfices attendus
Ce projet qui allie des approches in vitro et de l’expérimentation in vivo caractérisera pour la première fois une nouvelle voie contrôlant les fonctions des cellules NK dans le contexte de l’immunité anti-tumorale. Le bénéfice attendu est que cette nouvelle voie régule des processus liés à la motilité cellulaire et réorganisation du cytosquelette d’actine des cellules NK mais aussi liés aux fonctions pro-inflammatoires et anti-tumorales de ces cellules. Le rôle des cellules NK dans l’immunité innée et leur fonction de production de cytokines et cytotoxique indépendante de la présence d’un antigène par rapport aux cellules tumorales en font une des premières lignes de défense de l’organisme contre les cellules tumorales. En utilisant différents modèles de développement tumoraux chez la souris, nous appréhendons que cette nouvelle voie joue un rôle actif et positif dans la réponse anti-tumorale que çà soit dans des modèles métastatiques ou de tumeurs solides en recrutant de façon optimale des cellules NK vers les cellules cibles tumorales. Les avancées remarquables récentes sur la biologie des cellules NK permettent dorénavant de proposer des thérapies innovantes et combinées impliquant des processus spécifiques. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires dans les sous-populations de cellules NK et leurs propriétés fonctionnelles respectives pourrait apporter des clés dans des applications thérapeutiques chez les patients atteints de cancer. En effet, la connaissance générée par nos travaux pourrait être exploitée en santé humaine puisque la voie identifiée peut être ciblée d’un point de vue pharmacologique. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans l’immunothérapie anti-tumorale et en particulier dans des situations de métastases qui constituent une des premières causes de mortalité lié au cancer.
Procédures
Ce projet inclut des injections intraveineuses (durée d’intervention : 5 min/animal), sous-cutanées (durée d’intervention : 10 min/animal) ou intra-péritonéales (durée d’intervention : 1 min/animal). Un premier groupe de souris recevra uniquement une injection en intraveineux (veine caudale) ou une injection sous-cutanée pendant l’anesthésie. Un deuxième groupe de souris recevra une injection intraveineuse (veine caudale) ou une injection sous-cutanée pendant l’anesthésie, suivie de 2 injections intrapéritonéales sur 2 jours consécutifs, suivie d'une injection intraveineuse (sinus rétro-orbital) pendant l’anesthésie soit au total 4 injections par souris sur la totalité du protocole. Enfin, un troisième groupe de souris recevra une injection intrapéritonéale ou une injection intraveineuse (sinus rétro-orbital) pendant l’anesthésie.
Impact sur les animaux
Les protocoles de développement tumoraux et de métastases mis en place dans ce projet pourraient conduire à une légère perte de poids des animaux ainsi qu'une baisse d’activité. Le développement de tumeurs sous-cutanées pourrait également géner les animaux pour leur toilettage ou leur mouvement ou engendrer des lésions au niveau cutané. Ces effets indésirables ou nuisances ne dépasseront pas 4 jours correspondant à la fin du protocole total entre 10 et 14 jours. Les procédures d’injection en intrapéritonéale n’engendreront pas de nuisances particulières et pour les procédures nécessitant des injections en intraveineux, les animaux seront anesthésiés et surveillés jusqu'à leur réveil.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans les procédures expérimentales seront euthanasiés en fin d'étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Remplacement
L'étude des mécanismes physiologiques reliés à l'immunité anti-tumorale nécessite des modèles in vivo capables d’intégrer différents processus cellulaires intégrés telles que l'activation et la différenciation et l’activation des cellules immunitaires in vivo, la migration cellulaire et l'infiltration dans le tissu tumoral. Il n'existe pas actuellement de méthodes alternatives à ces études in vivo pour l'obtention de résultats scientifiques exploitables, pertinents pour la pathologie humaine. Le remplacement par substitution n’est actuellement pas envisageable, aucun modèle cellulaire in vitro ne permet de mener les études proposées, puisque ces mécanismes impliquent des micro- et macro-environnements cellulaires, incluant de nombreux types cellulaires notamment dans des modèles de métastases. Cependant, ce projet est basé sur une étude de preuve de concept réalisée in vitro. D’autre part, ce projet utilise un modèle d’invalidation de gène chez la souris. C’est pourquoi ce projet de recherche ne peut se faire qu’en utilisant la souris comme modèle d’étude afin de comprendre les mécanismes d’activation des cellules immunitaires en absence du gène d’intérêt en condition de développement tumoral. Les résultats de ces travaux devraient contribuer à optimiser les traitements chez les patients.
Réduction
Dans les différentes expérimentations et pour réduire la variabilité expérimentale, la détermination sexuelle étant importante, les souris des 2 sexes pourront être utilisés, mais indépendamment. Nous privilégierons des lots de souris issues de mêmes portées avec le fond génétique le plus proche possible en vu de diminuer également la variabilité expérimentale. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux. D’autre part, nous optimiserons l’utilisation de chaque animal et maximiserons le nombre de données à partir d’un seul animal. Nous mettrons également en banque des données utilisables à postériori par d’autres utilisateurs notamment des blocs de tissus, des analyses de large base de données. Analyse statistique : Les niveaux de significativités permettant la comparaison entre les échantillons seront déterminés par un test statistique. Nous utiliserons pour chaque procédure le nombre minimal d’individus permettant la réalisation de ce test statistique, tout en assurant la fiabilité des résultats (reproductibilité et significativité).
Raffinement
Les points limites ont été anticipés mais toute souris ayant atteint le point limite sera euthanasiée. Tout traitement anti-inflammatoire n’est pas compatible avec les études menées (perturbation de la réponse immunitaire et inflammatoire) cependant un traitement visant à réduire ou supprimer la douleur (par exemple, par traitement avec des analgésiques) sera proposé. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Le design expérimental a été établi en vue de limiter au maximum toute douleur ou souffrance de l’animal, notamment le nombre de cellules tumorales injectées, la taille maximale des tumeurs ainsi que la durée des traitements. D’autres part, les conditions d’hébergement permettent l’utilisation de méthodes d’enrichissement adaptées et les animaux seront suivis régulièrement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle adapté à la complexité de la physiologie humaine, elle a de grandes similitudes génétiques avec l’homme. La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines comme le développement tumoral. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. La souris est aussi le modèle de choix pour réaliser l’invalidation de gènes spécifiques afin d’en étudier la fonction. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux comme les anticorps qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. L’ensemble de ces critères font que la souris est le modèle le mieux adapté à notre activité d’expérimentation animale. Des souris de 8-16 semaines seront utilisées pour réaliser les différents traitements proposés dans ces procédures expérimentales correspondant au stade optimal de développement pour étudier la fonction des cellules immunitaires et leurs réponses anti-tumorales.
Comprendre les maladies autoimmunes affectant les nerfs périphériques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections d'autoanticorps et, pour une partie, une chirurgie d'implantation d'une canule pour injections répétées, afin de reproduire une neuropathie inflammatoire, puis sont tuées pour prélever les nerfs périphériques. Le porteur indique attendre une faiblesse musculaire et des difficultés à se mouvoir, tout en affirmant l'absence de douleur. Il conclut qu'il n'existe "pas d'autre stratégie" que le modèle animal, trop complexe selon lui pour être reproduit in vitro.
Objectifs
La neuropathie inflammatoire est une maladie rare affectant les nerfs périphériques et pouvant entraîner des paralysies importantes allant jusqu’à une hospitalisation en soins intensifs. Au cours des dernières années, nous avons identifié chez certains patients la présence d'autoanticorps (anticorps ciblant le soi). Ces autoanticorps sont associés à des formes très sévères de la maladie pouvant nécessiter un séjour en unité de réanimation. A l'aide de modèles animaux, nous avons montré au cours des cinq dernières années que certains anticorps sont responsables de la pathologie. Ces modèles ont été très importants et ont permis de motiver l'utilisation de traitement spécifique qui se sont avérés très efficaces chez les patients. Les mécanismes par lesquels ces anticorps entraînent les paralysies n'ont par contre pas encore été identifiés. L'objectif de ce projet sera d’utiliser des modèles murins afin d’élucider comment ces anticorps agissent et trouver des traitements ciblés. Un deuxième objectif de ce projet sera de créer un nouveau modèle plus proche de l’homme qui permettra de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques à l’aide de souris transgéniques. Nous testerons ici l’importance de ce modèle.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes responsables des paralysies chez les patients est indispensable pour permettre la sélection des traitements chez les patients. Aujourd’hui de nombreux médicaments sont disponibles, par contre il est difficile de savoir quel médicament est le plus efficace pour un type de pathologie. Nos travaux auront pour but de montrer comment les autoanticorps agissent et d’identifier les thérapies ciblant ces mécanismes d’action. Ensemble, ces données feront avancer les connaissances sur les maladies rares invalidantes et permettront de faire émerger de nouvelles thérapies.
Procédures
Tous les prélèvements seront réalisés post-mortem. Les animaux recevront trois types différents d'intervention. 1) Une à deux injections intrapéritonéales espacées d'une semaine et qui dureront moins de trente secondes). 2) Une immunisation réalisée grâce à une injection sous-cutanée. La procédure dure 15 minutes et est réalisée une fois sous anesthésie. 3) Une procédure chirurgicale qui consistera à permettre des injections journalières d'anticorps sans douleur. La procédure dure 1 heure et n'est réalisée qu'une seule fois. Elle n'entraîne pas de gênes par la suite.
Impact sur les animaux
Les modèles que nous développerons sont censés mimer une maladie neuromusculaire invalidante. Les patients ne présentent pas de signes de douleur, et les anticorps utilisés n'entraînent pas d'inflammation. Donc nous ne nous attendons pas à voir des signes de douleur chez les animaux. Par contre, les animaux devraient développer une faiblesse musculaire et donc des difficultés à se mouvoir. Pendant cette période, l'environnement sera adapté à l'état de l'animal et les nuisances seront prises en charge. Les animaux seront observés et manipulés tous les jours afin d'éviter un stress ou une détresse des animaux lors des procédures. Pour les procédures 1 et 2, les nuisances seront légères. Les procédures entraîneront une douleur lors de la piqûre et un stress lié à cette procédure, mais de courte durée. Pour la procédure 3, la procédure chirurgicale va entraîner une nuisance modérée pouvant durer deux jours après l'opération. Pendant cette période, les animaux peuvent présenter des gênes qui seront prises en charge avec des anti-douleurs et une adaptation de l'environnement à l'état de l'animal.
Devenir
Les animaux impliqués dans les procédures seront tous euthanasiés à l'issue de chaque procédure car notre étude porte sur les nerfs périphériques.
Remplacement
Malheureusement, il n'existe pas d'autres stratégies permettant de remplacer ce modèle. Il n'existe que des modèles animaux pour cette pathologie soit chez la souris soit chez le rat. Ces modèles de pathologies neuroimmunes sont trop complexes pour pouvoir être recréés in vitro.
Réduction
Nous avons déjà mis en place une étude semblable dans le passé. Notre expertise nous permet d'utiliser le minimum d'animaux possibles. Grâce à nos études précédentes, nous connaissons la taille des effets attendus et nous pouvons estimer la taille minimale de la cohorte d'animaux dont nous aurons besoin. Notre cohorte contient déjà le moins d'animaux possible. Si nous obtenons les résultats désirés avec la procédure 1, nous ne réaliserons pas la procédure 3.
Raffinement
Le bien être des animaux sera suivi de façon journalière afin de nous assurer de leur état réel de bien-être et nous avons établi un score pour évaluer les nuisances. Les animaux seront placés dans un environnement enrichi et seront manipulés tous les jours. Le scoring a pour but de suivre les atteintes locomotrices, mais permettra également l'application des points limites. Si un animal présente une paraparésie des membres inférieurs, il sera euthanasié. La douleur sera prise en charge en per-opératoire et post-opératoireLa douleur sera prise en charge en per-opératoire et post-opératoire. Pour éviter que les procédures entrainent un stress, tous nos animaux seront manipulés à la main plusieurs fois par semaine avant les procédures afin qu'ils soient accoutumés aux manipulations. Les animaux seront élevés dans un environnement calme et propice à l’expression des comportements naturels. Si les animaux ont des difficultés temporaires à se nourrir ou boire, nous introduirons de la nourriture sous forme de gel dans les cages. Pour éviter les problèmes de déshydratation lors des procédures chirurgicales, les animaux recevront une ou des injections sous-cutanées de solution saline.
Choix des espèces
Récemment, une étude de GBS a été établie avec succès par transfert passif d'autoanticorps chez la souris C57B/6. Les souris transgéniques exprimant le récepteur humain FcγRIIA ont également été utilisées avec succès pour étudier les maladies autoimmunes. Nous utilisons des animaux adultes uniquement (de 2 à 4 mois) pour trois raisons : 1) La neuropathie inflammatoire est plus difficile à déclencher chez des animaux trop âgés (>6 mois) et trop variables chez des animaux trop jeunes. On préfère donc de jeunes adultes de 2 à 4 mois. 2) Nous nous intéressons à des atteintes des nerfs, il nous faut donc des animaux chez lesquels les nerfs sont bien développés (plus de 2 mois). 3) Pour l’implantation des canules d'injection, il faut des animaux de plus de 2 mois, car les implantations peuvent générer des traumatismes chez des animaux trop jeunes.