Procédures légères
Régulation de paramètres physiologiques et biochimiques au cours d’un entraînement d’intensité modérée chez le rat Wistar dyslipidémique. Évaluation de l’efficacité de compléments alimentaires à base d’extraits de micro-algues
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendus dyslipidémiques par un régime gras et sucré, ils subissent des tests de tolérance au glucose, des gavages et, pour une partie, une course sur tapis roulant où une stimulation électrique les oblige à courir, avant d'être tués par exsanguination sous anesthésie. L'objet du projet est d'évaluer des compléments alimentaires à base de micro-algues destinés à la nutrition humaine et à une "valorisation" commerciale. Le porteur affirme que le modèle rat est "nécessaire", notamment pour disposer d'assez de sang et de tissus.
Objectifs
La sédentarité augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires en association avec des troubles du métabolisme pouvant induire des dyslipidémies voire un diabète. Plusieurs mécanismes cellulaires sont impliqués dans l’installation de ces troubles. Parmi ceux-ci, peuvent être cités, les mécanismes de l’inflammation, le stress oxydant, les troubles hormonaux ou une dérégulation du métabolisme des lipides ou des glucides. De nombreuses études nutritionnelles ont déjà montré l’intérêt d’utiliser des compléments alimentaires contenant des molécules à activité biologique pour prévenir l’installation de ces troubles. Parmi ces compléments alimentaires, des sources animales et végétales d’origine marine, riches en oméga-3, caroténoïdes et phytostérols, sont bien connues pour avoir des effets préventifs sur les risques cardiovasculaires, les dyslipidémies et les troubles du métabolisme des glucides. L’objectif de cette thèse est d’évaluer les effets bénéfiques d’une activité physique modérée, combinée avec la prise de compléments alimentaires d’origine marine sur la prévention de l’installation d’une dyslipidémie.
Bénéfices attendus
Amélioration des paramètres physiologiques et biochimiques associés à une dyslipidémie d'origine nutritionnelle. Effets combinés d'une activité physique d'endurance et de compléments alimentaires. Au-delà du modèle animal, cette étude a pour objectif de valoriser certains compléments alimentaires en nutrition humaine, afin de limiter l'installation d'un syndrome métabolique voire d'une obésité chez des sujets prédisposés à ces pathologies. De façon plus précise, les bénéfices sont les suivants: - observer les potentiels effets des compléments alimentaires sur l’amélioration de la performance physique et sur les adaptations du tissu musculaire. - observer les potentiels effets des compléments alimentaires pour limiter le développement d’une obésité issue d’un régime riche en gras et sucre. - observer les effets des compléments alimentaires couplés à de l’exercice physique pour prévenir l’obésité.
Procédures
Les animaux suivront les différentes procédures comme détaillées et seront manipulés par un personel qualifié, ce qui ne va pas induire de nuisance particulière. En ce qui concerne les différentes interventions sur animaux vigiles, celles-ci sont détaillées ci-après: Pour les rats sédentaires, deux tests sur la résistance à l'insuline (durée de 2 heures) et la réponse à un test d'hyperglycémie orale (durée de 2 heures) permettront d'obtenir des informations sur les mécanismes de régulation de l'utilisation du glucose et donc de la régulation de la glycémie - Un autre test va permettre de suivre la synthèse des protéines, ce marqueur étant d'importance puisqu'il s'agit d'un marqueur étrotiement lié à l'exercie physique (durée 20 minutes). Enfin, l'anesthésie générale est nécessaire afin de pouvoir prélever totalement le sang (environ 10 minutes) pour analyser différents paramètres biochimiques. Une fois l'animal mort, différents organes sont aussi prélevés pour analyses biochimiques et moléculaires. Pour les rats « coureurs », les interventions sont identiques à celles précisées ci-dessus avec en plus, un entrainement de course sur tapis roulant (30 à 90 minutes), afin d'évaluer les capacités physiques des animaux soumis à différents régimes alimentaires contenant des molécules susceptibles d'être efficaces sur les paramètres biochimiques mesurés.
Impact sur les animaux
Cette étude se base sur des expériences antérieures acquises dans notre laboratoire, au cours desquelles, il n'a pas été observé de nuisances ou d'effets indésirables. En effet : 1) le passage d'un régime équilibré à un régime hyperlipidique n'induit pas de modifications comportementales (alimentation, activité, interactions, développement) ou de phénomènes de stress ou d'anxiété 2) en ce qui concerne les animaux devant courir sur un tapis roulant, une semaine d'acclimatation est prévue afin de limiter tout phénomène de stress lié à l'équipement qui sera utilisé et afin de déterminer les animaux coureurs. De plus, des points limites établis et les observations faites durant les protocoles de course permettent d'éviter l'installation d'un stress. En effet, ces points limites adaptés seront établis sur la base des observations faites précédemment dans notre laboratoire. Au cours du protocole d’entrainement (30 à 90 minutes), afin d’obliger les animaux à courir, une stimulation de courte durée peut être appliquée. L'intensité de la stimulation électrique sera adaptée au poids des rats. De plus, il est possible de réduire l’intensité du choc électrique pendant la course individuellement pour chaque rat.
Devenir
Six procédures sont utilisées dans ce projet. Cinq procédures où les animaux sont réintroduits dans les lots expérimentaux avec leurs congénères. En effet, cinq procédures ne nécessitent pas d'anesthésie locale ou générale, ni de chirurgie, ni de geste invasif, ce qui permet de maintenir en vie les animaux,chaque animal étant utilisé dans ces 5 procédures. A l'issue des ces 5 procédures, les animaux sont tous mis à mort: cela est fait sous anesthésie générale de l'animal qui précède son exsanguination. Cette procédure de mise à mort par exsanguination est nécessaire pour le prélèvement de différents tissus: sang, muscles squelettiques, foie, coeur.
Remplacement
La thématique porte sur le suivi et la régulation de paramètres biochimiques et physiologiques du métabolisme musculaire et hépatique au cours de l'exercice physique, ce qui requiert l'utilisation du modèle animal. Etant donné que les analyses portent sur le dosage de plusieurs paramètres plasmatiques, musculaires et hépatiques, le modèle rat est nécessaire afin d'avoir suffisamment de volume de sang et de quantités de tissus. Il ne nous est donc pas possible de remplacer le modèle animal par une méthode alternative in vitro. Le modèle rat est nécessaire par rapport aux objectifs (nutrition humaine et modèle rat proche du modèle humain) et par rapport aux analyses à effectuer (non remplaçable par le modèle souris). De plus, le projet nécessite des séances d'entrainement de course, ce qui oblige l'utilisation d'un modèle animal.
Réduction
Un nombre de 8 animaux par lot testé est un nombre minimum afin de pouvoir valider les résultats par le traitement statistique utilisé. Cette analyse nécessite un nombre minimum de 8 animaux pour avoir un lot homogène expérimental lors d’une étude nutritionnelle. Ce nombre d’animaux permettra de déterminer des moyennes associées à des écarts types.
Raffinement
En ce qui concerne le protocole d'entrainement: les rats seront mis en adaptation sur un tapis roulant équipé de cinq pistes de courses, pendant une semaine. Afin d'obliger les rats à courir, chaque piste de course est munie d'une grille au niveau de laquelle une stimulation de faible intensité électrique peut être administrée. Afin de limiter tout phénomène de stress ou d'angoisse, une grille d'évaluation de la réponse du rat vis-à-vis de cet apprentissage est mise en place. Un suivi de la prise alimentaire est effectué chaque jour et le suivi de la prise de poids est effectué régulièrement. Celai permettra d'avoir un suivi de l'état sanitaire régulier des animaux. Il nous sera possible d’observer le comportement et l’intégrité physique. En cas de problème observé (non prise de poids ou comportement non adapté (agressivité, posture recluse, poil hérissé, absence de réponse à des stimuli) l'animal présentant un de ces signes sera isolé des congénères et sera suivi de façon plus attentive. En cas d'une non reprise d'activité normale, le rat sera exclu du protocole. Les animaux seront hébergés dans une animalerie contrôlée. Quatre animaux sont placés par cage adaptée à leur poids, avec changement de litière régulier. Le milieu sera enrichi en objets permettant aux animaux de créer un environnement propice à leur développement et à leur épanouissement. La nourriture étant changée tous les jours, il n’y aura pas de risque d’avoir une altération de la qualité des régimes mis à disposition. Les injections lors des tests de tolérance à l'insuline et de synthèse protéique sont effectuées en intrapéritonéal, avec une aiguille adaptée au poids et à la taille de l'animal et par du personnel compétent. Le gavage pour le test d'hyperglycémie provoquée oralement est effectué avec une sonde adaptée à la taille et au poids des rats et effectués par du personnel habilité. Durant les temps d'attente précédant les prélèvements, les rats sont remis avec leur congénères. Les rats sont anesthésiés par voie intrapéritonéale, avant exsanguination. La totalité du sang est prélevée par ponction aortique abdominale. Il s'agit d'une procédure classe "sans réveil" avec l'utilisation d'un anesthésique adapté au modèle animal utilisé, ce qui ne génère aucun stress ou aucune douleur.
Choix des espèces
La thématique porte sur le suivi et la régulation de paramètres biochimiques et physiologiques du métabolisme musculaire et hépatique au cours de l'exercice physique, ce qui requiert l'utilisation du modèle animal. Etant donné que les analyses portent sur le dosage de plusieurs paramètres plasmatiques, musculaires et hépatiques, le modèle rat est nécessaire afin d'avoir suffisamment de volume de sang et de quantités de tissus. Il ne nous est donc pas possible de remplacer le modèle animal par une méthode alternative in vitro. Le modèle rat est nécessaire par rapport aux objectifs (nutrition humaine et modèle rat proche du modèle humain) et par rapport aux analyses à effectuer (non remplaçable par le modèle souris). De plus, les rats ont un métabolisme et une structure musculaire proche de l’humain et sont couramment utilisés dans des études pré-cliniques pour tester l’efficacité de compléments alimentaires. Les rats utilisés sont des rats jeunes en cours de développement. L'objectif de l'étude étant de tester l'efficacité de compléments alimentaires lors de l'exercice physique chez le jeune jusqu'à l'âge adulte, et le protocole d'entrainement durant 8 semaines, à terme, les animaux seront toujours à l'âge adulte, sans que le facteur vieillissement vienne interférer dans l'expérience.
Modèles d’ACLF associant CCl4, régime type western et divers évènements précipitants. Application à l’évaluation de l’efficacité de molécules.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 5164
10328 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont une partie atteint un niveau de souffrance sévère. Pendant dix semaines ils reçoivent des injections répétées pour installer une cirrhose, puis un régime gras et sucré et des agents toxiques déclenchent une défaillance hépatique aiguë, avec état de choc et détresse cardio-respiratoire attendus. Le porteur précise que, dans les études de survie, la mort est le point final expérimental et qu'aucun point limite anticipé n'est alors appliqué. Il conclut que l'évaluation des molécules candidates dans un "système biologique complexe et global" reste "nécessaire", après une première sélection in vitro.
Objectifs
Les cirrhoses du foie sont caractérisées par des modifications hémodynamique et structurelles qui conduisent à une insuffisance hépatique majeure. La précipitation de la défaillance hépatique aigue est un syndrome fulminant chez le patient souffrant d’hépatique chronique, qui conduit à la défaillance de multiples organes et entraine une survie à 28 jours de 20% à 70% selon la sévérité. Au cours de cet épisode aigu, les évènements inflammatoires liés à l’infection sont majeurs, des molécules exogènes issues des pathogènes activent l’inflammation et le système inflammatoire. D’autres substances endogènes produites par des cellules en état de stress activent la signalisation immunitaire. Dans la phase d’emballement des réactions immunitaires et inflammatoires soit déterminantes lorsque la défaillance hépatique aigue survient chez le patient cirrhotique dont le foie est lésé. Il présente des facteurs prédisposants comme des taux sanguins de toxines bactériennes (=endotoxémie) et de cytokines inflammatoires élevés. La prise massive d’alcool agit sur le microbiote intestinal et augmente l’endotoxémie et précipite la défaillance hépatique aigue. Notre projet vise à établir un modèle expérimental qui reproduit rapidement un état pathologique du foie susceptible de subir cette perte subite de fonction. Notre défi est d’associer les facteurs prédisposants à l’installation de la cirrhose pour accélérer le processus et d’étudier ensuite les facteurs déclencheurs de la défaillance aigue. Nous envisageons pour cela d’associer l’induction par voie alimentaire (régime riche en gras et sucres) à celle d’un agent chimique toxique pour le foie, puis de précipiter la décompensation par une toxine bactérienne associée ou non à un inhibiteur de synthèse protéique qui va empêcher les cellules de produire les enzymes utiles à leur défense face à l’agression. Le déclanchement peut aussi être initié par une molécule pro-inflammatoires naturellement produite par des cellules de défense de l’organisme ; ou encore à l’aide d’une absorption massive d’alcool. Chacune des nouvelles procédures expérimentales sera dans un premier temps caractérisée puis mise en place dans les conditions permettant l’évaluation de l’efficacité de produits à visée thérapeutique. Ces procédures qui constituent ce projet seront pour certaines basées sur le principe des études de survie, et seront d’une gravité sévère.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible pour préserver le capital hépatocytaire qui subsiste, et qui peut se révéler être vital lors de la survenue d’un second épisode d’ACLF Aujourd’hui les traitements employés agissent sur les symptômes tels que la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples donc sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme).
Procédures
• Pendant la Phase d’induction d’une durée de 10 semaines au maximum : Chaque animal recevra 2 injections dont la durée de 15 secondes chacune par semaine, soit 20 injections au total. A la fin de la période, chaque animal subira un prélèvement sanguin qui durera 1 minute sous anesthésie gazeuse d’une durée de l’ordre de 3 minutes. • Le déclenchement de l’accident hépatique par un agent d’induction sera pratiqué selon les cas soit par : -1 seule injection dont la durée de 15 secondes ou -3 injections dont la durée de 15 secondes c’est-à-dire 1 injection par jour au cours de 3 jours consécutifs, ou -1 seule administration par voie orale (durée de 30 secondes). • Les traitements avec les composés à tester seront réalisés selon la nature physico-chimique du produit par 1 injection (durée 15 secondes) ou par 1 gavage oral (durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
L’ACLF représente un évènement grave chez un patient, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez la souris présente lors de l’induction de l’ACLF des signes cliniques d’inconfort manifestes. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé lorsqu’il sera possible de les appliquer par exemple lors de la mise à mort à un temps fixe précoce pré-déterminé. En revanche, dans les situations d’études de survie où la mort est le point final expérimental, il ne pourra pas y avoir recours à des points limites anticipés. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et poumons) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les pricipes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quelque soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/repression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paire, les souris par trio, l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de ronger (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
La littérature scientifique, est remativement riche sur la cirrhose du foie , les espèces communément employées à ce stade de la recherche sont les rongeurs rats et souris, qui sont pour certaines souches de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, ce qui représente une condition importante dans la pathologie développée dans ce projet. Nos modèles ayant pour objectif d'être des moyens vivants de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie. Les animaux seront employés à l'âge adulte généralement vers 8 semaines d'âge. Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental.
Etudes anatomofonctionnelles et comportementales de trois modèles murins invalidés pour deux gènes.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à sévère. Invalidées pour deux gènes liés au syndrome de Prader-Willi, elles subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes, des privations de sommeil de quatre à six heures et de nourriture de douze heures, ainsi que des tests comportementaux, avant le prélèvement de leur cerveau. Le porteur ramène les atteintes à une douleur postopératoire modérée, un stress d'isolement et une perte de poids, et fixe la mise à mort à 20 % de perte de poids. Il justifie le recours à la souris par l'absence de "système cellulaire pertinent" pour ces gènes exprimés dans les neurones.
Objectifs
Dans le cadre de cette demande, nous souhaitons aborder les conséquences physiologiques de la perte de fonctions de deux gènes in vivo, en utilisant la souris comme modèle d’étude (souris knockout,KO). Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés uniquement dans le cerveau, avec une expression marquée dans les neurones. Chez l'humain, des données cliniques montrent que des anomalies dans l’expression de ces gènes sont liées à une maladie rare, associée à des troubles comportementaux et métaboliques. Les patients présentent aussi des troubles du sommeil et des déficiences cognitives. Comprendre la fonction de ces gènes, très conservés entre humains et souris, représente un réel enjeu conceptuel et devrait contribuer à améliorer notre compréhension de l’étiologie de la pathologie. A ce jour, il n’existe pas de système cellulaire pertinent permettant d’aborder leurs fonctions. Plus précisément, nous souhaitons tester si l’invalidation de ces gènes que nous étudions influence de potentielles perturbations du cycle veille-sommeil, mnésiques et anatomiques qui sont caractéristiques de la pathologie chez l’humain.
Bénéfices attendus
Notre programme de recherche vise à combiner génétique inverse et exploration phénotypique pour parfaire notre compréhension de l’importance physiologique de ces deux gènes. De nature fondamentale, les expériences proposées sont susceptibles d’avoir des retombées dans le domaine biomédical puisque les données cliniques les plus récentes indiquent que la perte d’expression de l'un deux, et aussi probablement de l'autre, joue un rôle déterminant dans la physiopathologie du syndrome. Cette maladie rare s’accompagne de nombreuses altérations métaboliques, hormonales et comportementales. Un trait saillant de ce syndrome est une hyperphagie obsessionnelle accompagnée par une baisse de la dépense énergétique qui, le plus souvent, se traduit par une obésité morbide. Les patients présentent aussi des troubles du sommeil. Comprendre la fonction de ces gènes très conservés entre humains et souris, représente un réel enjeu conceptuel. A court terme, ce travail permettra de mieux définir la contribution de ces gènes dans l’architecture du sommeil. A plus long terme, nos souris knockout pourraient représenter de nouveaux modèles pré-cliniques de la maladie.
Procédures
La chirurgie qui consiste à poser des électrodes pour mesurer l'activité cérébrale du cycle veille-sommeil dure environ 40 min par animal (N=360 souris). L'enregistrement de l’activité cérébrale du cycle veille-sommeil en condition physiologique basale ou bien en condition de privation de sommeil (4-6h) ou de nourriture (12h) dure 72h par animal (N=360 souris). En fonction des tests comportementaux la durée va être de 40 min par animal (N=180 souris) ou bien de 2h10 environ par animal répartie sur 3 jours (N=180 souris).
Impact sur les animaux
Pour la chirurgie, l'incision de la peau peut induire une douleur modérée au stade post opératoire. Pour les enregistrements du cycle veille-sommeil, les souris sont placées dans des cages individuelles, ce qui peut induire un stress durant les premières heures. Les groupes d'animaux soumis à une privation de nourriture peuvent présenter une perte de poids.
Devenir
A l'issue des procédures expérimentales, nous prélèverons les cerveaux et /tissus sur l'ensemble des animaux (soit 720 au total) et nous réaliserons des marquages immunohistochimiques sur coupes de tissus pour poursuivre les investigations anatomiques, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Nous comptons explorer la fonction physiologique du locus SNORD115 et SNORD116. Ces gènes sont retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires et sont exclusivement exprimés dans les neurones post-mitotiques. De fait, ce mode d'expression restreint à des cellules qui ne se répliquent pas et leurs apparitions évolutives tardives limitent considérablement le choix des modèles d'étude pertinents sur le plan biologique. C'est ainsi que toutes les études publiées à ce jour sont réalisées chez la souris, et ce d'autant plus que le modèle murin récapitule certains traits pathologiques retrouvés dans le syndrome de Prader-Willi pour lequel l'absence de SNORD116 joue un rôle un majeur dans la pathophysiologie. A ce jour, il n’existe donc malheureusement pas de modèles alternatifs crédibles permettant d’aborder la fonction de SNORD115 et SNORD116 de manière intégrée, et ce notamment lorsqu'il s'agit d'études comportementales et neurologiques visant à décrire les mécanismes mis en jeu dans l'homéostasie du cycle veille-sommeil chez les mammifères placentaires.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante, d’après nos observations et celles rencontrées dans la littérature.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les normes de bien-être en vigueur (5 individus, présence d'enrichissement). Ils seront observés quotidiennement et des points limites ont été définis. Tous les signes de souffrance détectés lors de l'observation quotidienne tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos vouté, une expression faciale modifiée, une altération de l’état du pelage, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Nous comptons explorer la fonction biologique de nos deux gènes d'intérêts. Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés uniquement dans le cerveau, avec une expression marquée dans les neurones post-mitotiques. Il n’existe pas de modèle cellulaire simple permettant d’aborder la fonction de ces gènes, notamment son rôle dans le cycle veille-sommeil. L'objectif est d'étudier des processus comportementaux chez l'adulte donc les souris seront testées entre 3 et 8 mois.
Formation et validation des compétences spécifiques du personnel appliquant des procédures.
- Formation professionnelle
4095 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère à modérée, non pour produire des connaissances mais pour former du personnel. Elles servent d'entraînement aux gestes courants en oncologie, identification, injections, prélèvements de sang et greffes de tumeurs, avant d'être euthanasiées. Le porteur précise que ce sont des animaux "surnuméraires" des élevages, "de mauvais génotype", et que les produits administrés se limitent souvent à du sérum physiologique. Il affirme que la validation de ces gestes "ne peut se faire autrement que sur animaux vivants".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de former des personnels appliquant des procédures expérimantales à des animaux à des fins scientifiques aux gestes et interventions les plus courants en oncologie préclinique, à savoir le suivi clinique des animaux, leur identification, les modes d'administration les plus courants (sous-cutanée, intrapéritonéale, orale, intraveineuse, intramusculaire), les modes de prélèvements de sang ainsi que toute la réglementation qui entoure ces techniques (volumes, anesthésie). Le but est également leur permettre d'identifier toute douleur ou stress et de connaître les conduites à suivre. Il sera également enseigné les différents types de greffes de tumeur et, le mode de suivi de la croissance tumorale.
Bénéfices attendus
Une fois le stagiaire sensibilisé et formé aux bonnes pratiques et techniques usuelles en cancérologie, celui-ci peut mettre en oeuvre les procédures et interventions indispensables dans le respect des bonnes pratiques et des règles éthiques . Il a en sa possession tous les outils et informations pour une pratique éthique et soigneuse des procédures et interventions.
Procédures
Interventions uniques sous anesthésie locale ou générale (indiqué) sauf les administrations orales.. Identification par puce :1 minute, identification par tatouage : 1 minute. - injection: 1 minute-. - prélèvement de sang : animal anesthésié (anesthésie générale) - mesure de tumeur 1 minute.
Impact sur les animaux
Nuisances liées aux interventions: contentions, prélèvements et injections de courte durée sous anesthésie. Le produit administré aux animaux pour les administrations est du sérum physiologique : aucun effet de ce produit n'est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure du fait des interventions pratiquées.
Remplacement
Pour les interventions décrites dans ce projet, la validation des gestes techniques ne peut se faire autrement que sur animaux vivants, le but étant de valider les compétences techniques aux interventions nécessaires en oncologie préclinique.
Réduction
Les animaux utilisés seront des animaux surnuméraires des élevages de notre établissement. Ce sont des animaux de mauvais génotype, sans phénoype domageable, et présentant un examen clinique normal et tous les signes de bonne santé. Ces animaux ne sont jamais entrés en procédure expérimentale. Plusieurs interventions légères sont pratiquées sur chaque animal pour réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Toutes les administrations sont pratiquées sous anesthésie locale ou générale (sauf le gavage) Les prélèvements de sang sont pratiqués sous anesthésie générale. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux. Un enrichissement adapté (sizzlenest, tunnels) sera présent dans toutes les cages. Des points limites ont été défiinis et seront strictement appliqués. Les sessions sont de courte durée. La surveillance clinique sera quotidienne pour les animaux greffés.
Choix des espèces
Le centre de recherche utilise exclusivement des souris pour ses recherches. Il est donc pertinent de les former sur ce modèle animal. La plupart des expérimentations dans le centre se font sur animal adulte. Les animaux utilisés pour les formations seront donc adultes.
Evaluation de la biodistribution de nanoparticules dans un modèle de souris saines
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
475 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Elles reçoivent des injections de nanoparticules et un agent d'imagerie sous anesthésie, avant d'être tuées pour l'analyse détaillée de leurs organes. L'objectif se limite à mesurer où se distribuent ces nanoparticules chez des animaux sains, étape annoncée avant tout test sur des animaux malades puis chez l'humain. Le porteur affirme que le recours à des "organismes entiers" est "indispensable", l'analyse des organes ne pouvant selon lui se faire sur l'animal vivant.
Objectifs
Les dystrophies musculaire (tel que la myopathie de Duchenne) sont des troubles entrainant un handicap physique qui touche 20 personnes sur 100 000 dans le monde. Malgré une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques des dystrophies, presque aucun traitement n'est disponible. Ce projet vise à améliorer le transport des molécules médicaments en utilisant des nanoparticules vers les zones musculaires cibles pour augmenter leur efficacité.
Bénéfices attendus
Le présent projet permettra de démontrer l'efficacité des nanoparticules pour véhiculer des molécules médicaments dans les muscles d'animaux sains. Ensuite elles pourront être testées chez des animaux avec dystrophie pour pouvoir ensuite être testé chez l'humain.
Procédures
1 injection par animal de nanoparticules sous anésthesie (procédure rapide
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, du stress peut être induit aux animaux lors des anesthésies et des manipulations pour la réalisation des injections. De plus, une légère douleur passagère peut être induite lors des injections (2 injections maximum par animal).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée des différents organes prélevés qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Des études préliminaires ont démontré l'efficacité de nos nanoparticules pour délivrer des molécules thérapeutiques dans des cultures de cellules musculaires. Pour aller plus loin, l'utilisation d'animaux est indispensable pour ce projet car il vise à démontrer l’efficacité thérapeutique de nanoparticules pour traiter préférentiellement les muscles tout en limitant leur impact sur les autres organes. Il est donc nécessaire de pouvoir étudier l'effet de ce traitement sur des organismes entiers.
Réduction
L'utilisation des animaux est réduite au nombre minimal et nécessaire pour l'obtention de données expérimentales statistiquement exploitable. Le projet étant conçu par deux étapes successives, le nombre d'animaux calculé pour la deuxième étape peut être réduit en fonction des résultats obtenus lors de la première étape.
Raffinement
Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage et de bien-être afin d'enrichir l'environnement des souris (incluant boules de coton, dôme et roue). Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Durant toute la durée des protocoles les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bienêtre général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. L'efficacité des nanoparticules ne sera pas uniquement étudié au niveau du muscle mais également pour tous les organes vitaux, ainsi si ces nanoparticules démontraient une possible efficacité dans un organe spécifique autre, cela pourrait conduire à l'établissement de potentielles nouvelles applications.
Choix des espèces
La structure et le fonctionnement du tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme. La souris représente donc un modèle expérimental privilégié pour les investigations des maladies musculaires survenant chez l’homme. Les souris utilisées seront adultes, âgées de 8 à 10 semaines, car à ce stade les souris ont un système nerveux entièrement développé, ce qui permet des études plus précises et plus pertinentes de la progression des maladies et des traitements potentiels.
Optimisation du protocole de marquage par fluorochrome chez l’anguille européenne (Anguilla anguilla) afin d’améliorer la détection externe des marques fluorescentes
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
750 civelles, jeunes anguilles européennes d'une espèce menacée, vont être marquées par immersion dans un colorant fluorescent, 450 tuées pour analyse et 300 relâchées dans le milieu naturel. Le marquage vise à optimiser une détection externe des marques, présentée comme un moyen de "ne plus mettre à mort d'individus" à l'avenir. Le porteur classe les atteintes en souffrance légère et les rattache au transport, au marquage et à une captivité de 180 jours. La mise à mort de 450 civelles se justifie, selon lui, par la mesure précise de la fluorescence dans leurs otolithes, qu'un dispositif portatif ne permet pas encore de lire sur l'animal vivant.
Objectifs
Face au déclin des population d’anguilles européennes, des mesures sont mises en œuvre pour reconstituer les stocks et sauvegarder l’espèce, dans le cadre du plan national de gestion de l’anguille. Des opérations de repeuplement sont réalisées chaque année : des jeunes anguilles (civelles) sont capturées en estuaire et relâchées dans les zones amont des cours d’eau côtiers. Afin d’évaluer le succès de cette pratique de repeuplement, il est nécessaire de pouvoir différencier les individus introduits ; pour cette raison, les civelles capturées sont marquées par immersion dans un colorant avant d’être relâchées. Ce colorant génère une marque fluorescente fixée durablement dans les structures osseuses des jeunes anguilles, et en particulier dans des concrétions de l’oreille interne (otolithes). Par la suite, la contribution et l’efficacité du repeuplement sont évaluées : des anguilles sont capturées dans les secteurs repeuplés puis sont mises à mort pour rechercher la présence d’une marque fluorescente dans leurs otolithes. La possibilité d’une détection externe des marques a été récemment démontrée sur des civelles et des tests réalisés en 2022 ont confirmé la présence de marques dans la mâchoire et les nageoires des civelles, détectable après 60 jours à l’aide d’un dispositif portatif. L’objectif de la présente étude est de poursuivre l’optimisation d’un protocole de marquage, permettant une détection externe des marques fluorescentes sur le long terme (6 mois).
Bénéfices attendus
La lecture externe des marques permettrait en premier lieu une simplification du protocole de détection, et ouvrirait d’autre part des perspectives intéressantes et novatrices vers la détection des marques sur animaux vivants, permettant notamment de ne plus mettre à mort d’individus, réduire le temps de lecture des marques et d’augmenter la taille de l’échantillon analysé.
Procédures
Les animaux seront soumis au marquage par immersion dans une solution de marqueur fluorescent, selon 4 traitements et un contrôle. La durée des interventions sera de 13.5 minutes pour 3 traitements (balnéations "flash") et de 6h pour le dernier traitement (balnéation longue).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables potentiels sur les animaux concernent le transport après capture, le marquage et le maintien en captivité. Toutefois, ces effets peuvent être considérés comme légers au vu de l’expérience des opérateurs dans le transport et le marquage des civelles, qui sont communément réalisés dans le cadre du programme de repeuplement.
Devenir
750 civelles seront capturées, transportées, marquées puis stabulées pendant 180 jours en aquarium puis en bassins (mésocosmes). A l'issue de la stabulation, 450 individus seront mis à mort et le restant des individus encore en vie (300 individus) sera remis en liberté. La mise à mort se justifie pour pouvoir mesurer précisément l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un dispositif de détection portatif.
Remplacement
La civelle est l’objet d’étude et ne peut pas être remplacée pour cette expérience de recherche de fluorescence externe. Les résultats obtenus sur une autre espèce de poisson ne pourraient être transposés à la civelle, du fait de sa singularité morphologique (poisson serpentiforme), anatomique (épiderme translucide) et comportementale (activité nocturne).
Réduction
L’effectif de 750 individus (15 lots de 50 individus) tient compte de la mortalité attendue en milieu contrôlé au stade civelle (maximum 25-30%). A 3 occasions au cours du suivi (60, 120 et 180 jours), un effectif de 10 individus par lot sera analysé. Ainsi, au total 450 individus seront mis à mort et analysés, afin de prendre en compte la variabilité inter-individuelle du niveau de fluorescence, potentiellement importante si l’on se réfère aux résultats des études réalisées en 2022. Les individus non analysés seront relâchés dans le milieu naturel sur les sites de repeuplement (au maximum 300 individus).
Raffinement
Lors du transport et du marquage, la concentration en oxygène sera contrôlée et les densités d'individus dans les contenants seront faibles. Les aquariums seront enrichis à l’aide de caches permettant aux civelles de s’abriter. Les individus seront nourris, la concentration en déchets métaboliques sera surveillée et la concentration en oxygène et la température seront également contrôlées. Des changements d’eau seront réalisés si nécessaire, notamment en période de fort réchauffement estival, et une toile d’ombrage sera alors placée au-dessus des mésocosmes pour limiter le réchauffement. A l'issue de la procédure ou bien en cas d'atteinte de points limites adaptés à l'espèce (critères comportementaux d'arrêt de souffrance), les individus seront mis à mort après une anesthésie préalable.
Choix des espèces
L’anguille est une espèce menacée au niveau européen, qui fait l’objet d’un plan de conservation à l’échelle nationale. L’évaluation des pratiques de repeuplement par une méthode de détection externe non létale représente un fort enjeu pour la gestion future. Les animaux seront utilisés au stade civelle car c'est le stade utilisé en France pour réaliser les opérations de repeuplement d'anguille.
Stimulation de la glycolyse vésiculaire comme approche thérapeutique pour la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
120 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Une injection de virus dans le cerveau leur fait développer la maladie de Huntington, avant qu'elles ne soient envoyées en Belgique pour de l'imagerie puis euthanasiées pour prélever leur cerveau. Le porteur écrit que la maladie "n'est visible qu'en réalisant des tests comportementaux" qu'il ne détaille pas, ce qui minimise une atteinte neurodégénérative laissée se développer jusqu'à un stade avancé. Sur le remplacement, il se borne à indiquer qu'il est "impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques".
Objectifs
Ce projet a pour but de tester in vivo une approche thérapeutique qui a été validée in vitro contre la maladie de Huntington. Cette approche thérapeutique est développée dans le but de restaurer un manque de transport de molécules dans les neurones.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Il a récemment été mis en place un outil permettant de tester cette approche sur des cellules et de valider son effet bénéfique. Ces résultats prometteurs nécessitent désormais une validation sur des animaux en vue de proposer des nouveaux traitements aux patients atteints par cette maladie.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés une seule fois pendant 5 minutes le temps d'injecter le virus (durée de l'injection 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les souris vont développer la maladie de Huntington. Cela n'est visible qu'en réalisant des tests comportementaux.
Devenir
Les souris seront envoyées en Belgique pour des mesures d'imagerie et elles seront ensuite euthanasiés pour prélever leur cerveau pour des études ultérieures.
Remplacement
Le projet traitant de réseaux neuronaux complets, il nous est impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux prévu pour cette étude (une procédure expérimentale) est de 120 mâles. Ce nombre a été déterminé afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé et de manière à en garder suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Nous générerons des lots séquentiels de souris afin de dupliquer les expériences et augmenter la robustesse des résultats. Nous commencerons donc avec un premier lot de 40 mâles répartis dans 4 groupes expérimentaux. Si les résultats n'étaient pas concluants et/ou interprétables, nous générerions alors un second lot de 40 mâles pour répéter les expériences. Nous prévoyons un maximum de 3 lots de 40 souris pour réaliser ces expériences. Le nombre minimal de souris utilisé sera de 40 si possible, sinon de 120 au maximum.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à des grilles codifiant le niveau de bien-être. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance apparaissent.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Le but du projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Les injections se feront à l’âge de 4-8 semaines, un stade précoce avant que la maladie ne se développe. Nous laisserons les souris vieillir et elles seront envoyées en Belgique à l'âge de 10-12 mois (stade avancé de la maladie de Huntington) pour des expériences d’imagerie qui nous permettront d'étudier les effets du traitement sur la progression de la maladie.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
8 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Sous anesthésie générale, ils subissent une ponction de l'artère fémorale, des acquisitions scanner et une dénervation endovasculaire d'une heure destinée à détruire des nerfs, pour tester une technique de traitement de la douleur cancéreuse chez l'humain. Le porteur justifie leur mise à mort par le prélèvement des organes traités, qu'il décrit comme "indispensable" pour confirmer les données d'imagerie. Il retient le porc pour sa taille proche de celle de l'humain, qui permet d'utiliser le même matériel qu'en clinique.
Objectifs
La douleur viscérale chronique est une condition fréquente chez les patients atteints de cancer, qui contribue à une diminution dramatique de la qualité de vie. Son traitement repose largement sur les antalgiques tels que les opioïdes mais est limité par des effets secondaires et/ou des effets insuffisants. En effet, parmi les patients atteints de cancer de l'abdomen, 80% ne répondent pas de manière adéquate à la prise en charge pharmacologique ou présentent des effets secondaires importants. En outre, 10 à 15% des patients souffrant de douleurs accompagnées d'épisodes de douleurs aiguës doivent changer d'opiacé et/ou subir une procédure invasive de gestion de la douleur, notamment une neurolyse. La neurolyse consiste en une destruction intentionnelle sélective du tissu nerveux visant à interrompre la conduction des stimuli douloureux des tissus vers les centres supérieurs, par des moyens chimiques (alcool - phénol) ou physiques (chaleur - congélation). La neurolyse du plexus cœliaque est maintenant considérée comme un moyen efficace qui s'ajoute à l'approche médicale standard pour le traitement de la douleur viscérale chez les patients atteints de cancer. Les options de neurolyse cœliaque actuellement disponibles comprennent la neurolyse du plexus cœliaque avec injection d'alcool ou de phénol, du bloc du plexus cœliaque avec stéroïdes, l'ablation du nerf splanchnique par radiofréquence percutanée et la neurolyse hypogastrique supérieure avec injection d'alcool ou de phénol. La dénervation rénale endovasculaire par ablation aux ultrasons est actuellement une option thérapeutique sûre et efficace de l'hypertension primaire. Étant donné que la taille de l'artère rénale est comparable à celle du tronc cœliaque, de l'artère mésentérique supérieure et des branches principales de l'artère iliaque interne, la technologie développée pour la dénervation rénale devrait être sûre et efficace dans le cadre de la dénervation cœliaque endovasculaire pour le traitement des patients cancéreux souffrant de douleurs viscérales réfractaires. L'objectif de ce projet est de développer une approche endovasculaire de neurolyse utilisant la technologie de dénervation pour les patients cancéreux souffrant de douleurs viscérales réfractaires. Dans le cadre d'un développement par étapes de cette approche, nous proposons d'entreprendre une étude préclinique pour explorer la faisabilité ainsi que la sécurité et l’efficacité de cette technique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de valider une approche endovasculaire de neurolyse utilisant la technologie de dénervation pour les patients cancéreux souffrant de douleurs viscérales réfractaires. Après validation de la faisabilité, de la sécurité et de l'efficacté technique de cette approche, une étude clinique pourra être envisagée.
Procédures
Le jour de l'intervention (J0) et à J7, les animaux seront prémédiqués par piqure intramusculaire du mélange sédatif, cette étape ne dure que 5 minutes (piqure avec une grande tubulure permettant l'injection lente du produit sans contention) puis seront placés sous anesthésie générale et ventilation controlée. Des acquisition scanner seront réalisées à J0 et J7 sous anesthésie générale (durée: 10minutes). La procédure de dénervation endovasculaire par radiologie interventionnelle est une procédure d'une durée d'1h maximum.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront être soumis à un stress, notamment la veille de l'intervention pendant la phase d'isolement en petit groupe (n=2) pour la mise à jeun. Le jour de l'intervention (J0) et à J7, l'anesthésie sera précédée d'un isolement de l'animal dans un box vide afin de réaliser la prémédication par piqure intramusculaire du mélange sédatif. Une voie veineuse périphérique sera mise en place au niveau de l'oreille de l'animal par laquelle une administration d’anesthésie chimique sera réalisée. Après intubation orotrachéale, l'anesthésie générale sera assurée par administration gazeuse. Un introducteur 7F sera mis en place après ponction de l’artère fémorale droite sous repérage échographique. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à de l'imagerie médicale: acquisitions scanner et angiographies.
Devenir
Tous les animaux (n=8) du projet seront mis à mort à la fin de la procédure. Le prélèvement des organes cibles ayant reçus le traitement de dénervation est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par les analyses histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques. Il s’agit d’une étude ayant pour objectif d'évaluer l’efficacité et l’innocuité d'une procédure de dénervation par radiologie interventionnelle. L'ensemble de ces dispostifs ont été testés in vitro, cependant, il est nécessaire d’évaluer l’efficacité et la sécurité de ces dispositifs en réalisant des tests sur organismes vivants pour prendre en compte les éléments qui ne peuvent pas être démontrés par des tests in-vitro (dommages tissulaires dans les artères dénervées ainsi que dans les organes environnants, évaluation des lésions nerveuses dans les artères dénervées). Le projet a pour objectif de valider les aspects d’efficacité et de sécurité dans un modèle in-vivo, ne pouvant être validés lors des tests in-vitro. Le modèle porcin, de par sa taille, présente l'avantage d'avoir des tailles d'organes comparables à l'Homme, et permet la mise en oeuvre de procédures de radiologie interventionnelle.
Réduction
Ce projet est une preuve de concept. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum en veillant toutefois à obtenir un nombre de zones traitées suffisant pour les analyses statistiques. Le nombre d'animaux nécessaires a été défini selon notre expérience et non selon une approche statistique. La plupart des analyses dépendront de données qualitatives, par expérience, un nombre de 8 permettra d'obtenir des résultats interprétables, en tenant compte de la variabilité interindividuelle.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les animaux , issus de la même fratrie, seront hébergés ensemble dans un box de 9m² avec de la fibre de bois au sol et des objets d'enrichissement renouvelés régulièrement (kong, balles, jouets caoutchouc durs masticables...). Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. L'acclimatation des animaux sera d'une semaine avant d'entrer dans le protocole. Des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite). Ces contrôles sont enregistrés et permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Des controles biquotidiens en postopératoire sur une durée de 2 jours seront réalisés par une personne compétente avec évaluation du bien-être et de la douleur. L'évolution du score permet de noter l'amélioration ou l'aggravation de l'état de l'animal et de prendre des mesures appropriées (points limites). Chaque paramètre est ainsi quantifiable, les scores sont additionnés et l'atteinte d'un score supérieur ou égal à 6 définit un point limite et engendre la sortie de l'animal du programme et sa mise à mort après consultation du vétérinaire référent si nécessaire. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondis, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude ayant pour objectifs de vérifier la faisabilité, la sécurité et l'efficacité d'une technique de neurolyse par dénervation. Cette technique utilise des protocoles et du matériel de radiologie interventionnelle qui ne peuvent etre mis en place que sur des animaux de taille conséquente. Le porc est devenu l'animal de taille humaine de référence parce qu'il est très proche de l'homme d'un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, stabilité génétique). Les animaux seront de jeunes adultes âgés de 5 à 6 mois (50+/-5 kg). Les animaux de cet âge présentent des organes de tailles équivalentes à l’humain et offrent l’avantage de travailler avec le même matériel que celui utilisé en pratique clinique humaine.
Elevage de lignées de souris modèles pour l’étude du développement cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Génétiquement modifiées, elles servent à l'élevage de lignées pour l'étude du développement du cortex cérébral, avec une biopsie de la queue et une boucle d'identification posées au sevrage, puis des accouplements répétés. Le porteur indique que les embryons et les souriceaux sont prélevés pour leurs tissus nerveux, que les mâles se battent et vivent isolés, et que certaines lignées présentent un retard de croissance. Il précise que ces souris génétiquement modifiées ne peuvent être ni replacées ni relâchées, et que les reproducteurs âgés sont "réformés" et tués.
Objectifs
Le cortex cérébral est la région du cerveau responsable de fonctions cérébrales importantes comme par exemple la perception sensorielle, le langage, la mémoire, les actions volontaires et la motricité. L’étude de la formation du cortex cérébral pendant le développement embryonnaire, est essentielle pour comprendre le fonctionnement cérébral dans des conditions normales, mais également pour comprendre pourquoi le cerveau dysfonctionne dans un certain nombre de maladies telles que l’épilepsie ou le retard mental, qui touchent presque 1 enfant sur 100 dans les pays industrialisés. Les études récentes en neuroscience montrent que la gestion de la production d’énergie par les cellules du cerveau (les neurones) est essentielle pour la formation des contacts entre les neurones (appelés ‘synapses') et le développement d’un cortex cérébral fonctionnel. Ce projet a pour finalité d’étudier deux gènes qui participent à la régulation de la production d’énergie neuronale. Pour atteindre ce but, il est nécessaire de prélever des tissus neuronaux chez des embryons de souris ou chez des souriceaux. Ces tissus permettent de réaliser des expériences in vitro en manipulant l’expression de gènes liés à la production d’énergie, et d’observer les conséquences de ces perturbations sur la formation de réseaux de neurones.
Bénéfices attendus
L’étude de la fonction des gènes impliqués dans la formation des réseaux neuronaux au cours du développement embryonnaire permettra à terme d’identifier des biomarqueurs ou des stratégies thérapeutiques dans les maladies du neurodéveloppement.
Procédures
Les animaux subiront une seule fois, une biopsie à la queue et la pose d’une boucle d’identification au moment du sevrage (la procédure dure environ une minute). Les animaux seront accouplés et regroupés régulièrement en fonction des besoins de l’élevage.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Les animaux subissent une biopsie à l’extrémité de la queue et la pose d’une boucle d’identification à l’oreille au moment du sevrage. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.
Remplacement
Le développement d’un réseau de neurones fonctionnel repose sur des mécanismes biologiques (cascades d’activation de gènes et de facteurs de croissance…) qui sont pour l’heure impossible à modéliser parfaitement in vitro. Par conséquent l’étude de préparations microscopiques, par prélèvement de tissus, est une modalité indispensable pour comprendre l’organisation d’un tissu complexe tel que le cortex cérébral. En parallèle, les approches réalisées sur des cultures cellulaires seront dans la mesure du possible testées au préalable dans des lignées de cellules. Néanmoins les lignées de cellules sont des lignées d’origine humaine, modifiées car d’origine tumorale, et ne sont pas dérivées du cortex cérébral. Les informations dérivées de ces lignées ne permettront pas de récapituler pleinement les mécanismes cellulaires spécifique aux neurones du cortex cérébral et ne pourront pas être parfaitement comparées aux analyses histologiques et aux travaux précédents. Par conséquent, il n’est pas possible de remplacer totalement les expériences de cultures de neurones par des modèles purement in vitro.
Réduction
Le projet a pour but de prélever des tissus et cellules servant de base pour les expériences réalisées au laboratoire, par conséquent aucune analyse statistique n’est prévue sur les animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Systématiquement, un partage de tissus sera envisagé sur chaque embryon ou chaque animal prélevé, soit entre plusieurs projets de recherche au sein du laboratoire, soit en partageant avec des équipes de recherche qui travaillent sur d’autres tissus.
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur par une routine d’élevage (toujours le même expérimentateur, toujours le même jour d’accouplement, à la même heure) qui permet de diminuer le stress des animaux. Une manipulation régulière, par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement) sera privilégiée comme méthode de manipulation des animaux. La taille de la biopsie, à l’extrémité de la queue, sera limitée au strict nécessaire.
Choix des espèces
Le choix d’un modèle de souris est justifié car il s’agit d’une espèce dont l’architecture cérébrale est proche de l’architecture du cerveau humain (en particulier le cortex cérébral, objet de la présente étude, n’est développé de façon satisfaisante que chez les mammifères et n’existe pas dans les espèces inférieures). Par ailleurs la souris présente un développement embryonnaire rapide (21 jours) et un développement postnatal court (21 jours pour des circuits neuronaux « matures ») et la possibilité de croisement de lignées transgéniques déjà existantes. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines chez les mâles, 7 semaines chez les femelles) et utilisés en reproduction préférentiellement jusqu’à l’âge de 6 mois, après quoi la fertilité diminue et les animaux seront réformés. En cas de besoin les animaux pourront être mis en reproduction après 6 mois et au plus tard jusqu'à 12 mois, en l’absence de reproducteurs plus jeunes disponibles. Les tissus seront prélevés principalement sur des animaux prélevés à des âges standards dans la communauté scientifique : embryon de 15 jours (standard pour les cultures de neurones), à la naissance, entre 10 et 12 jours quand les circuits neuronaux sont en cours de formation, chez le jeune au moment du sevrage, et chez l’adulte. Selon les contraintes expérimentales, et dans le but d’étudier d’autres types de neurones il pourra être réalisé un prélèvement d’embryons à un autre stade embryonnaire, sans que cela n’impacte le bien-être animal.
Effet de la température sur la spermatogénèse du Medaka
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
120 medakas vont être utilisés, quarante tués à l'issue et quatre-vingts réutilisés ensuite, dans des procédures déclarées de gravité légère à modérée. Les mâles sont exposés jusqu'à 32 degrés puis subissent des prélèvements de sperme répétés sous anesthésie, et les femelles sont pêchées pour décrocher à la main leurs grappes d'œufs avant d'être remises à l'eau. Le porteur indique que cette chaleur provoque un stress thermique et altère la spermatogénèse, et tue les mâles exposés qu'il ne peut plus réemployer. Il relie ce travail au réchauffement climatique et à l'aquaculture, et affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier la spermatogénèse à température augmentée.
Objectifs
Les poissons présentent une importante plasticité phénotypique (grande capacité d'adaptation) face aux variations environnementales. A l’interface entre l’environnement et l’ensemble des gènes, des molécules dites « méthyl » constituent un code dit « épigénétique » ou méthylation de l'ADN. Elles sont capables d’interagir avec l’ADN sous l’influence de l’environnement et permettre par exemple, la mise en place d'un métabolisme adapté à un changement de température. Chez la truite arc-en-ciel, une augmentation de 4°C de la température d’élevage durant la spermatogénèse entraîne des modifications de la méthylation de l’ADN des spermatozoïdes produits. Ces spermatozoïdes sont cependant fonctionnels, et donc susceptibles de transmettre leurs modifications épigénétiques à la descendance, et d’en impacter leurs performances, ou au contraire, favoriser leur adaptation à un environnement changeant. Les gènes impactés concernent la spermiogénèse (fonction de reproduction) et de métabolisme lipidique (fonction de croissance). Ces résultats soulignent la nécessité de tester, chez une espèce modèle le permettant, comment des variations épigénétiques induites au niveau des gamètes, notamment par des augmentations de température, peuvent impacter les performances des descendants, et le caractère inter-générationnel de cet effet, dans un contexte de réchauffement climatique. Le medaka est parfaitement adapté, du fait de son court temps de génération, et de l'importance des ressources génétiques disponibles. Cependant, nous devons dans un premier temps déterminer pour cette espèce, la température minimale, les temps et durée d'exposition à partir desquels un phénotype est observé sur le spermatozoïde, ceci afin de calibrer les conditions expérimentales et minimiser le nombre d'animaux utilisés par la suite, voire éviter de dépasser 30°C si cela n'est pas nécessaire. L'objectif de ce projet est donc de déterminer la température et/ou la durée d'exposition à partir desquelles une baisse de fertilité des spermatozoïdes est observée. Trois températures seront testées : 32°C, 29°C, 25°C (contrôle), et deux durées d'exposition : 1 mois et 2 mois, à un temps de la vie des individus : au stade adulte (3.5 mois). Nous testons 2 températures suboptimales car nous souhaitons trouver la plus faible variation de température pouvant créer un effet (au plus près possible de la physiologie). 29°C correspond également au +4°C déjà étudié chez la truite.
Bénéfices attendus
Nous nous intéressons au gamète mâle, comme vecteur intergénérationnel d'information sur les conditions de vie des individus (potentiellement changeantes). L'objectif à long terme du projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse des poissons à une augmentation de température, à l'échelle inter- puis trans-générationnelle, dans un contexte de changement climatique. Il s'agit donc d'évaluer leur aptitude à s'adapter au fil des générations, ou au contraire, mettre en évidence les possibles challenges de performances auxquels ils font face en étudiant plus particulièrement les effets sur les capacités reproductives. Pour les espèces d'aquaculture ces connaissances pourront influencer les pratiques d'élevages. En effet, la température de l’eau est une composante particulièrement difficile à moduler en élevage ouvert classique, et la période estivale coïncide avec des étapes clefs de la gamétogénèse chez de nombreuses espèces domestiques, dont les salmonidés. L’augmentation des températures estivales ces dernières années pose la question de la plasticité de ce processus gamétogénétique et de la façon dont les dernières étapes de la spermatogénèse peuvent être affectées. Le développement récent des élevages en système clos (eau recirculée) permet dans une certaine mesure de contrôler ce paramètre, mais les coûts de réfrigération de l’eau imposent de bien connaitre les limites de température qui permettent de maintenir le bien-être et les performances des animaux. Aborder l’impact des températures d’élevage pendant la gamétogénèse est donc un enjeu important pour l’aquaculture à la fois continentale et marine.
Procédures
Les seules interventions prévues sont des prélèvements réalisés concernant uniquement les gamètes : prélèvements de sperme, et prélèvement d'oeufs (fécondés ou non). Les prélèvements de sperme seront réalisés à 3 moments : au début de la mise en bacs expérimentaux (à 3.5 mois), 1 mois après l'exposition aux températures tests (à 4.5 mois) et 2 mois après l'exposition aux températures tests (à 5.5 mois). Ils seront réalisés sous anesthésie et durent moins d'une minute. Pour cela, après anesthésie, les poissons sont sortis de l'eau et placés sous loupe binoculaire. Grâce à une légère pression exercée sur la partie ventrale, environ 1 à 2 uL de sperme sont émis et collectés dans une pipette. Les poissons sont alors placés en bac de réveil. Les prélèvements d'oeufs auront lieu dans le cadre des tests de fécondité des mâles : à partir de 4.5 mois + 4 jours et ce, chaque jour pendant une semaine, et à partir de 5.5 mois + 4 jours et ce, chaque jour pendant une semaine. Le prélèvement des oeufs est une pratique d'élevage classique qui consiste à pêcher la femelle et à décrocher manuellement la grappe d'oeufs plaquée sur l'abdomen. La femelle est ensuite remise immédiatement dans son bac et les oeufs sont déposés dans une boîte de pétri (remplie d'eau d'élevage) pour observation et comptage. Pour ces deux procédures, les expérimentateurs sont munis de gants en latex et les animaux sont pêchés délicatement à l'aide d'une petite épuisette.
Impact sur les animaux
Un test de température a déjà été réalisé au laboratoire sur les Medaka. Celui-ci a permis de déterminer que les capacités reproductives des animaux était altérée à partir de 33°C. Pour ces raisons, nous souhaitons nous placer à 32°C. Les risques potentiels attendus : stress thermique ; modifications de la prise alimentaire et métabolisme énergéntique ; altération de la spermatogénèse ; stress de capture.
Devenir
Les 40 animaux ayant vécu à température augmentée seront euthanasiés car ils ne pourront plus être réemployés pour d'autres expériences. En revanche, les animaux élevés en conditions contrôle pourront être réutilisés.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous recherchons précisément les mécanismes intervenant pendant une spermatogénèse à température augmentée.
Réduction
Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre des analyses statistiques fiables malgré les fortes variabilités entre les individus.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèce (photopériode, qualité d'eau, densité, conditions sanitaires) à l'exception du lot de mâles exposés à 32°C. Il s'agit cependant précisément de l'objet de l'étude (effet du réchauffement) et la littérature ne montre pas de mortalité chez des médakas élevés à cette température. Les bacs seront enrichis (ajout de plantes artificielles), les animaux toujours manipulés délicatement, avec des gants en latex et pêchés avec une petite épuisette. Les mesures de taille et de poids, ainsi que les prélèvements d’œufs et de spermes sont des gestes doux, très rapides et non invasifs. Les prélèvements de sperme, nécessitant un geste précis, seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Les mesures de taille et poids seront réalisées lors de la même anesthésie et très rapidement (une minute estimée par animal, mesures poids, taille, et prélèvement du sperme compris).
Choix des espèces
Choix de l'espèce medaka Oryzias latipes : - court temps de génération en prévision d'étude d'effets inter- et transgénérationnels - spermatogénèse continue (et non saisonnière) - techniques édition génome et épigénome accessibles - ressource importante pour intégration de données bio-informatiques, bibliographie, outils moléculaires (anticorps par exemple) - spermatozoïde à histones (contrairement au zebrafish), plus proche des modèles mammifères Nous travaillerons avec des adultes de 3.5 mois car nous souhaitons étudier la spermatogénèse qui a lieu chez les mâles adultes, et la capacité des spermatozoïdes à féconder des oeufs (émis par des femelles adultes de 4.5 mois, puis 5.5 mois).
Intérêt du blocage des récepteurs CXCR1 et CXCR2 pour prévenir le développement des calcifications cardiovasculaires associées à l’insuffisance rénale chronique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
242 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. La plupart développent une insuffisance rénale chronique provoquée par un régime enrichi en adénine, reçoivent la ladarixine ou un placebo par gavage cinq jours sur sept, subissent des anesthésies gazeuses répétées et des prises de sang, avant une ponction terminale de tout leur volume sanguin dans l'aorte. Le porteur prévient que l'adénine peut causer une insuffisance rénale très sévère, avec perte de poids, prostration et surmortalité, et restreint les rats témoins à 75 % de leur ration pour les besoins de l'imagerie. Il teste la ladarixine contre les calcifications cardiovasculaires et affirme ces phénomènes "non modélisables in vitro".
Objectifs
Le rétrécissement aortique calcifié (RAC) résulte d’une dégénérescence fibro-calcique de la valve aortique à l’origine de désordres hémodynamiques responsables de complications cardiovasculaires majeures. A ce jour, il n’existe aucun traitement capable de réduire la progression du RAC. Le remplacement de la valve altérée reste aujourd’hui la seule option thérapeutique efficace. Chez les patients souffrant d'insuffisance rénale chronique (IRC), ce remodelage pathologique de la valve est plus fréquent, plus précoce, et progresse plus rapidement, entraînant une mortalité trois fois plus importante qu’en population générale. Dans cette population, le remplacement valvulaire est associé à une mortalité plus importante. Une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant au développement du RAC chez ces patients apparaît donc cruciale afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques sur lesquelles agir afin de ralentir son évolution. Il a été démontré que l’interleukine 8 (IL-8), dont les concentrations sanguines sont élevées chez les patients IRC, favorise in vitro la calcification des cellules de la valve aortique et de l’aorte. Ces travaux suggèrent que l’IL-8 pourrait jouer un rôle clé dans l’évolution rapide de la pathologie dans un contexte d’IRC. Le travail que nous proposons ici vise à vérifier dans un modèle animal d’IRC si l’antagonisme des récepteurs de l'IL-8 (appelés CXCR1 et CXCR2) permet de prévenir le développement du RAC. Notre objectif est de créer une méthodologie d’étude se rapprochant le plus possible de la réalité clinique, afin d’augmenter le potentiel translationnel de nos travaux, en répondant aux critères suivants : 1/ Établir un modèle d’insuffisance rénale progressive associée au développement de calcifications cardiovasculaires chez le rat, 2/ Utiliser un antagoniste pharmacologique de CXCR1 et 2 actuellement en cours d’évaluation clinique (la ladarixine) et 3/ Évaluer les conséquences de ce traitement sur les fonctions valvulaires et cardiaques des rats au moyen d’outils généralement utilisés en routine clinique (microCT, IRM, échocardiographie).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de vérifier si l'antagoniste des recepteurs de l'IL-8, appelé la ladarixine, peut être utilisé pour prévenir efficacement le développement des calcifications cardiovasculaires ainsi que les dysfonctions valvulaires et cardiaques se développant dans un contexte d’insuffisance rénale chronique chez le rat. L’obtention de résultats concluants in vivo pourrait mener à terme à une évaluation de l’usage en clinique de la ladarixine chez les patients souffrant d’insuffisance rénale chronique. Pour rappel, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement médicamenteux efficace pour prévenir ou ralentir la progression des calcifications valvulaires/vasculaires. L’identification d’une approche pharmacologique permettant de prévenir la survenue ou de ralentir la progression du rétrécissement aortique calcifié permettra à terme à une meilleure prise en charge des patients et une diminution du coût pour la société.
Procédures
Une cohorte de 12 rats subira une à trois anesthésies gazeuses de 2h réalisées chacune à une semaine d’intervalle en vue de mettre au point les techniques d’imagerie IRM et d’échocardiographie. Une cohorte de 14 rats subira deux anesthésies gazeuses de 45 minutes réalisées à 2 jours d’intervalle afin comparer les données mesurées par IRM et par échocardiographie. Une cohorte de 36 rats sera soumise à un régime enrichi en adénine et en phosphate sur une durée pouvant aller de 5 à 12 semaines dans le but de mettre en place un modèle d'insuffisance rénale chronique associée au développement de calcifications cardiovasculaires. Une cohorte de 180 rats sera utilisée pour vérifier l’impact de la ladarixine sur le développement des calcifications cardiovasculaires secondaires à l’insuffisance rénale chronique. Les 180 animaux de cette cohorte seront maintenus sous régime contrôle (n=84) ou sous un régime adénine provoquant l'IRC (n=96) et recevront la ladarixine (n=90) ou le placebo (n=90), administrée par gavage 5 jours sur 7 (volume max : 1,5 mL/Kg), durant toute la durée du régime. Au total, 216 animaux subiront deux anesthésies gazeuses de 45 minutes en début, en milieu et en fin de protocole afin d’évaluer l’impact des traitements sur les fonctions cardiaques et vasculaires par imagerie. Ces 216 animaux subiront deux prélèvements de 1 mL de sang, réalisés sous anesthésie générale, au début et au milieu du protocole. Tous les animaux arrivant en fin de procédure seront euthanasiés et leur volume sanguin total sera prélevé. Une chirurgie sera nécessaire au moment de l’euthanasie afin de pouvoir réaliser la ponction sanguine terminale. Cette procédure n’excèdera pas 5 minutes. Les analyses sanguines et tissulaires (aortes, valves, reins, os) permettront de conclure fermement sur les effets de la ladarixine sur le système cardiovasculaire dans ce modèle.
Impact sur les animaux
Les rats des groupes IRC (n=114) développeront progressivement une insuffisance rénale chronique associée à des désordres cardiovasculaires. Ils devraient prendre moins de poids que les rats contrôles (n=102). Il se pourrait que la quantité d’adénine à laquelle seront exposés les animaux des cohortes IRC de l’étude pilote (n=18) provoque des IRC très sévères. Dans ce cas, les rats des groupes IRC pourraient montrer une perte de poids importante, une réduction du comportement exploratoire, des signes de prostration et un risque accru de mortalité en comparaison aux rats des groupes contrôles. L’ajout d’adénine modifie le goût des croquettes et peut provoquer une aversion des animaux envers l’aliment. Les rats des groupes contrôles (n=102) recevront un apport alimentaire correspondant à 75% de leur apport journalier sur toute la durée du protocole afin de ralentir leur prise de poids en vue de leur passage dans les appareils d’IRM et de microCT en fin d’étude. Une partie des rats (n=216) subira un prélèvement sanguin (au niveau de la veine de la langue ou de celle de la queue). Le prélèvement de sang au niveau de la veine de la langue pourrait être associé à l’apparition d’hématomes sublinguaux. Certains animaux (n=180) subiront un gavage journalier 5 jours sur 7 (volume max : 1,5 mL/Kg). Tous les rats du protocole (n=242) seront soumis à plusieurs cycles d’anesthésies gazeuses d’une durée pouvant aller de 45 minutes à deux heures. Les rats ayant subi une anesthésie gazeuse pourraient souffrir de déshydratation. En fin de protocole 216 rats subiront une chirurgie sous anesthésie générale en vue de prélever la totalité de leur volume sanguin par ponction dans l’aorte abdominale.
Devenir
Tous les animaux arrivant en fin de procédure seront euthanasiés et la totalité de leur volume sanguin sera prélevé pour permettre à l'équipe de récupérer assez de sang pour la réalisation des analyses biochimiques et hématologiques nécessaires à l’interprétation des résultats. Les aortes et les valves aortiques de chaque animal seront récupérées post-mortem pour analyses histologiques et quantification de l’expression des principaux marqueurs de calcification (expression protéique et des ARNm).
Remplacement
Les études menées in vitro suggèrent que l’Interleukin 8 pourrait être l'un des éléments clés favorisant le développement des calcifications vasculaires et valvulaires dans l'insuffisance rénale chronique. In vitro, l'antagonisme des recepteurs de l'IL-8, appelés CXCR1 et CXCR2, inhibe les effets procalcifiants de l'IL-8. La présente étude vise à vérifier si l’usage de l’antagoniste des recepteurs de l'IL-8 (la ladarixine) permet de prévenir les dysfonctions valvulaires et cardiovasculaires survenant chez le rat atteint d'insuffisance rénale chronique. Ces phénomènes complexes (modification de la surface de l’orifice valvulaire, de la dimension de la valve, de l’épaisseur et de l’expansion de la paroi de la racine aortique, modulation du flux transvalvulaire aortique, du débit cardiaque, de la vitesse de l’onde de pouls, des dimensions et fonctions systoliques et diastoliques du ventricule gauche) qui apparaissent suite au développement des calcifications, ne sont pas modélisables in vitro et leur évaluation chez l’animal est un prérequis à une éventuelle utilisation de l'antagoniste chez l’homme.
Réduction
Le calcul du nombre d'animaux nécessaire a été effectué en tenant compte du pourcentage de décès lié à l’administration du régime provoquant l'insuffisance rénale chronique et du fait qu'il nous faudra en moyenne 12 animaux par groupe afin de réaliser des statistiques robustes nous permettant de conclure fermement sur notre hypothèse. Nous avons opté pour la mise en place d’une étude pilote « à tiroir » visant à déterminer à partir de petites cohortes la composition optimale du régime à administrer pour induire une insuffisance rénale chronique et des calcifications cardiovasculaires. Ceci permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour les mises au points. Les aortes et les valves aortiques de chaque animal utilisé pour les mises au point des procédures d'imagerie seront récupérées post-mortem pour faire des mises au point d’histologie et de biologie moléculaire, ce qui évitera de commander des animaux de nécropsie spécifiquement à cet effet. Les fonctions valvulaires, vasculaires et cardiaques ainsi que le développement des calcifications cardiovasculaires seront évalués au moment de l'entrée des animaux dans le protocole, en milieu de protocole et avant l’euthanasie des animaux grâce à des techniques d’imagerie non-invasives. Cette approche longitudinale permettra d’obtenir un niveau élevé d’informations à partir du même animal, et de réduire le nombre d’animaux puisque le suivi morphologique du cœur, de la valve et de l’aorte ne nécessitera pas l’euthanasie. En fin d’étude, ces organes pourront être utilisés pour d’autres analyses (histologie, expression protéique et des ANRm). L’application sur un même animal de trois approches d’imagerie non invasives permet de réduire par 3 le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Cette approche permettra aussi de minimiser l'impact de l'hétérogénéité inter-individus au sein d'un même groupe et d’observer de manière longitudinale l’évolution de la pathologie. Pour éviter tout double emploi injustifié des animaux, une partie des os des rats de ce protocole seront récupérés post-mortem et utilisés dans le cadre d’une autre étude.
Raffinement
Une période d'acclimatation de 7 jours sera mise en place à l'arrivée des rats. Les conditions d'élevages seront optimisées afin d'offrir aux rats un maximum d'éléments environnementaux leur permettant de reproduire leurs comportements naturels (enrichissement du milieu de stabulation avec des frisettes pour la confection de nids, des cylindres en carton pour se cacher, et des bûchettes). Les animaux âgés de 8 semaines et pesant environ 350g lors de leur entrée dans le protocole seront hébergés par 2 dans des cages standards (900 cm2). Si leur poids venait à dépasser 600g en cours d’étude, chaque duo sera hébergé en cage de 1800 cm2. Les animaux feront l’objet d’un handling journalier. Les animaux soumis au régime provoquant l'insuffisance rénale feront l’objet d’un suivi quotidien sur toute la durée du protocole grâce à une grille de scoring de la douleur adaptée. Si une souffrance associée au régime est détectée, des périodes de discontinuations seront envisagées (aliment donné 4 jours par semaine en alternance avec des phases de récupération de 3 jours durant lesquelles les rats seront nourris avec l’aliment standard). Nous avons choisi d’utiliser des approches d’imagerie non invasives afin d’évaluer de façon longitudinale la calcification du système cardiovasculaire ainsi que la morphologie du cœur et de la valve plutôt que d’euthanasier des animaux pour l’étude ex-vivo de chacun de ces paramètres. Cette approche nous a permis de réduire par 3 le nombre d'animaux necessaires à l'étude. Concernant la ladarixine, les données publiées dans divers modèles de souris et rats ainsi que les données obtenues lors des phases I et II du développement clinique de la molécule sont en faveur d’une très bonne tolérance.
Choix des espèces
Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle invertébré permettant de reproduire le syndrome le développement des calcifications vasculaires et valvulaires secondaires au développement d'une insuffisance rénale chronique, c’est pourquoi nous nous sommes orientés vers le rongeur. Chez le rongeur, le modèle rat est idéal car la valve aortique est de calibre suffisant pour la réalisation d’analyses d’expression protéiques et d’ARN, contrairement au modèle souris (valve aortique trop petite). Le modèle alimentaire choisi est usuellement utilisé chez des rats mâles âgés de 8 semaines lors de leur entrée dans le protocole. C'est pourquoi nous avons choisi de travailler sur des rats mâles à ce stade de développement.
Rôle des lymphocytes MAIT dans un modèle murin de leishmaniose viscérale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent le parasite de la leishmaniose viscérale par injection dans l'abdomen, un gavage de tamoxifène cinq jours de suite, puis sont tuées à deux mois pour prélever leurs organes. Le porteur indique que l'infection reste asymptomatique jusqu'à cette date et que le tamoxifène fait perdre environ 10 % du poids, repris une semaine plus tard. Il veut établir le rôle des lymphocytes MAIT dans cette maladie et affirme le recours à la souris "inévitable", les données humaines ne permettant pas de trancher in vivo.
Objectifs
Le système immunitaire, et notamment les lymphocytes T, jouent un rôle essentiel dans la défense contre les agents pathogènes. Nous étudions une population de lymphocytes T particulièrement abondante chez l’humain, et capable de tuer les cellules infectées par des bactéries grâce à la reconnaissance d’antigènes bactériens. Ces lymphocytes T sont appelés MAIT (Mucosal Associated Invariant T cells) et représentent des cibles thérapeutiques privilégiées du fait de leur fréquence élevée chez l’humain (1-10% des lymphocytes T du sang, 10-40% dans le foie), leur présence chez tous les individus, leur capacité à répondre très rapidement en cas de stimulation, et la versatilité de leur réponse (production de différents molécules selon le contexte de stimulation). De façon surprenante, une étude a démontré que ces lymphocytes T sont activés chez les patients atteints de leishmaniose viscérale, suggérant que les lymphocytes MAIT pourraient contribuer à la réponse immune anti-parasitaire, une notion non-explorée à ce jour. La leishmaniose est une parasitose vectorielle transmise par la piqûre d’insectes infectés, les phlébotomes. Il existe une vingtaines d’espèces de Leishmania dans le monde, responsables de 1 à 2 millions de cas humains par an dans 98 pays, dont la France. Selon l’espèce, l’infection prend des formes cliniques différentes : leishmaniose cutanée, cutanéo-muqueuse ou viscérale. La leishmaniose viscérale (LV) est mortelle en l’absence de traitement. Après la piqûre infectante, le parasite se multiplie dans les cellules phagocytaires et gagne la moelle osseuse, le foie, la rate, et les ganglions. La LV pose des problèmes thérapeutiques, chez l’homme comme chez le chien. Dans ce projet, nous proposons d’utiliser un modèle murin de LV pour déterminer le rôle des lymphocytes MAIT dans cette pathologie, et pour définir si l’activation des lymphocytes MAIT en cas de LV repose sur la reconnaissance d’antigènes produits par le parasite.
Bénéfices attendus
La leishmaniose viscérale (LV) est mortelle en l’absence de traitement et touche 500 000 personnes chaque année. La LV pose des problèmes thérapeutiques, liés soit au coût des médicaments, soit à leur toxicité ou encore à l’émergence de résistances. Il existe donc un besoin de mieux comprendre les mécanismes de résistance, notamment immunitaires, à ce parasite. Ce projet permettra de déterminer de façon définitive et bien contrôlée le rôle d’une population lymphocytaire clef, récemment décrite comme impliquée dans la réponse anti-leishmania chez des patients. En fonction de nos résultats, des études visant à activer ou inhiber les lymphocytes MAIT chez les patients atteints de LV pourraient être envisagée. Le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.
Procédures
Procédures 1 et 2: 1 injection par voie intrapéritonéale (1 minute) sur animaux vigiles. Procédure 3: 1 gavage (1 minute) par jour sur animaux vigiles pendant 5 jours consécutifs, puis 1 injection intrapéritonéale (1 minute) sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration du parasite par voie intrapéritonéale seront celles liées à l’injection intrapéritonéale. La leishmaniose viscérale est une infection systémique évoluant sur plusieurs mois chez l'homme comme chez la souris, de façon asymptomatique. Le décès survient tardivement (autour de 6 mois post-infection chez la souris). Aux temps d'observation les plus tardifs de cette étude (euthanasie à J60), nos études précédentes ont montré qu’aucun symptome n'est à craindre, ni aucune altération de la qualité de vie chez les animaux. Suite aux administrations de tamoxifène par gavage, une perte de poids d’environ 10% du poids initial peut se produire. Le poids initial est retrouvé une semaine plus tard.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par PCR ou cytométrie en flux.
Remplacement
Une activation des lymphocytes MAIT a été documentée au cours de la leishmaniose viscérale chez l’humain. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces lymphocytes in vivo. Les lymphocytes MAIT ont des propriétés différentes selon le contexte, et peuvent promouvoir ou réduire l’inflammation. A ce stade, il est donc impossible de savoir si l’activation observée chez les patients est associée à un effet clinique bénéfique ou délétère. L’utilisation du modèle Souris, qui est particulièrement bien connu dans le cadre de la leishmaniose viscérale, reste donc inévitable pour établir le rôle des lymphocytes MAIT dans cette pathologie.
Réduction
Nous utiliserons un modèle de LV chez la souris. Le modèle a déjà été mis en place et toutes les souris inclues dans le protocole peuvent être étudiées, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part le nombre d’animaux à utiliser a été réduit au strict minimum nécessaire pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le projet est conçu en 2 phases et la 3ème procédure ne sera mis en place que si nécessaire, selon les résultats des 2 premières procédures, de façon à réduire le nombre d’animaux au minimum.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. A noter qu’aux temps d’observation utilisés dans le protocole, l’infection est asymptomatique et ne génère aucune souffrance physique aux animaux, ni aucun signe visible d’infection. La perte de poids possiblement induite par le traitement au tamixifène sera mesurée. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptées à la perte de poids ont été définis.
Choix des espèces
La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes T (notamment les MAIT) ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour reproduire la leishmaniose viscérale humaine, y compris pour l’étude des mécanismes de réponse immunitaire et de la physiopathologie, du fait de l’existence de modèles bien définis et de la parenté génétique avec l’humain. - Les souris seront utilisées à l’âge adulte. - Nous utiliserons des souris adultes car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire et un microbiote matures.