Procédures légères
Travaux pratiques : 4ème année d’études pharmaceutiques, Master 1 (UE Expérimentation animale, UE Rotations en laboratoire et UE Ethologie), Formation à l’expérimentation animale niveau Applicateur de procédures.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 50
840 souris et 50 rats vont être utilisé·es dans des travaux pratiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour les souris et léger pour les rats. Les étudiants et personnels en formation leur infligent des manipulations, des tests comportementaux et des injections répétées de substances psychotropes (amphétamine, caféine, chlorpromazine, diazépam, pentobarbital), pour apprendre les gestes de l'expérimentation. Le porteur indique que tous les animaux seront proposés à l'adoption via le GRAAL, sans garantie qu'ils soient tous adoptés, et que ceux dont l'état se dégrade plus de deux jours seront mis à mort. Sur le remplacement, il décrit l'usage de séquences vidéo et de mannequins pour réduire le nombre d'animaux, tout en maintenant l'usage d'animaux vivants pour l'entraînement.
Objectifs
Ce projet comprend 3 procédures distinctes qui ont pour objectif non seulement de former les étudiants à la manipulation des rongeurs de laboratoires et à pratiquer des méthodes peu invasives, mais aussi, selon leurs cursus de leur apporter des notions spécifiques à la pharmacologie (pour les étudiants de Pharmacie) et au comportement (pour les étudiants de master MEP et Neurosciences). Ces travaux pratiques permettent d’aborder des notions liées à l’éthique et au bien-être animal sur le rat et la souris, d’apprendre à manipuler ces animaux, et à réaliser des injections de substances pharmacologiques et d’en observer les effets (effets psychotropes, anesthésiants etc.). Ces travaux pratiques entrent dans le cadre des maquettes règlementaires de plusieurs formations. Il s’agit tout d’abord de formations universitaires de niveau Master (i. 4ème années de cursus pharmaceutique, ii. Master 1 Biologie Santé – parcours Physiologie systémique et Physiopathologie intégratives, biothérapies, iii. Master 1 Biologie intégrative et physiologie - parcours management de l’expérimentation préclinique et éthique animale, iv. Master 1 Neuroscience – parcours Neurosciences moléculaires, cellulaires et intégrées et parcours Sciences des comportements). Il s’agit également d’une formation qualifiante spécifique destinée aux personnes appliquant des procédures expérimentales (formation FELASA niveau B, ex niveau II) qui concerne les personnels.
Bénéfices attendus
Les enseignements présentés dans ce projet apporteront des bénéfices pédagogiques à différents niveaux. Tout d’abord, les étudiants de pharmacie auront pu appréhender non seulement le monde de la recherche chez l’animal, qui pourra éventuellement faire partie de la suite deleur formation s’ils choisissent la filière Industrie/Recherche, mais surtout ils auront découvert l’une des étape-clefs de la mise au point des nouveaux médicaments, la pharmacologie, qui se situe à l’interface entre la recherche en chimie et la recherche galénique. Concernant le master MEP, il s’agit ici de permettre aux étudiants d’appliquer les enseignements théoriques d’éthologie qu’ils reçoivent sous forme de cours magistraux et de TD. Ils apprennent à observer le comportement des rongeurs, compétence essentielle qu’ils pourront ensuite utiliser en stage ou en milieu professionnel. Enfin, pour la formation expérimentale Applicateur de procédures expérimentales, il s’agit de former les étudiants et personnels à apprendre à manipuler les animaux dans le cadre de recherche scientifique (laboratoires publics ou privés) dans le respect des règles d’éthique et du bien-être des animaux.
Procédures
Les animaux seront soumis à des manipulations et des tests comportementaux (1h30 par semaine durant 3 mois ; puis 2 x 3h au total durant 4 semaines, soit 16), à des injections intra-péritonéales (1 injection par semaine durant 3 mois, soit 12, à raison de 10s par injection) et sous cutanées (1 seule fois pour seulement 8 souris au total, , à raison de 10s par injection), à une seule anesthésie sans intervention chirurgicale (juste pour en étudier sa durée).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à 3 aspects : le fait d’être manipulés par des personnes non-formées (le but de la formation), le fait d’être réutilisés plusieurs fois (que nous avons privilégié afin d’utiliser un nombre minimal d’animaux, que nous compensons en laissant aux animaux une période inter-manipulation d’une semaine), le fait de recevoir des substances psychotropes à dose active (amphétamine, caféine, chlorpromazine, diazepam, pentobarbital, dont les effets durent environ 2-3h).
Devenir
Les souris seront réutilisés d'une procédure à l'autre. Tous les animaux (rats et suris) seront proposés à l'adoption via le GRAAL après accord du vétérinaire référent et de la DDPP. Nous ne pouvons pas savoir à l'heure actuelle s'ils seront tous adoptés, mais ils seront tous proposés à l'adoption.
Remplacement
Les travaux pratiques présentés ici ont été modifiés de manière à diminuer drastiquement le nombre d’animaux. Pour cela nous avons choisi de remplacer les expérimentations réelles par des analyses de séquences video. Pour cela un grand nombre de séquences identiques aux expérimentations que faisaient les étudiants ont été filmés et implémentées au sein d’une plateforme dédiée à l’enseignement supérieur. Les étudiants analysent donc maintenant des vidéos et collectent des paramètres identiques à ceux qu’il leur était demandé de collecter. Par ailleurs, concernant les enseignements de la formation « Applicateur de procédures », nous utilisons des vidéos et des photos pour les Travaux Dirigés sur la souffrance et la douleur et non pas des animaux vivants. Enfin, nous utiliserons également des modèles d’imitation de rats qui permettent de réaliser des pratiques de routine sans nécessité d’utiliser des rats vivants.
Réduction
L’utilisation de séquences vidéo permet de diminuer drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, la réutilisation des animaux entre les séances permet également d’utiliser un nombre minimal d’animaux. Nous répartissons également les animaux par bi- ou trinômes (et non pas par monôme), lesquels sont chargés de travaillés sur un petit groupe d’animaux. Ensuite, les données obtenues sont regroupées de manière à montrer aux étudiants l’importance de la démarche statistique dans le calcul des effectifs nécessaires pour une expérimentation sur la base de données préliminaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages comprenant des objets d’enrichissement (lanières de carton, igloo cartonné) afin d’améliorer leur bien-être et qui permet également d’aborder la question avec les étudiants pour les sensibiliser à la question du bien-être animal. Par ailleurs, nous utiliserons seulement des femelles qui sont plus faciles à héberger sur le long terme car elles présentent moins de risques de conflit dus à un stress éventuel ou une hiérarchie instable. Enfin les étudiants seront formés et encouragés à manipuler les animaux (handling) avec douceur et patience de façon à habituer les animaux à être manipulés et à diminuer le stress des étudiants. Si toutefois un animal se trouvait en situation de détresse (perte de poids supérieur à 15%, comportement anormal, stéréotypies, poils hérissés, dos voûté, hypothermie), des mesures correctrices seraient appliquées selon la situation (augmentation du niveau d'enrichissement, apport de croquettes humidifiées, éventuellement injection de sérum physiologique si l'animal est déshydraté). Cependant, si cela perdurait au-delà de 2 jours sans amélioration notable (atteinte d’un point limite : 2 jours consécutifs de signes de mal-être avec perte de poids), l'animal serait mis à mort immédiatement : soit, pour les souris, par dislocation cervicale, soit, pour les rats par injection létale d'euthasol suivie par une dislocation du cou (dose de 150mg/kg pour les rats d’un poids supérieur à 150g).
Choix des espèces
Concernant les travaux pratiques de pharmacologie qui consistent à mettre en évidence les effets de molécules sur un organisme vivant, la souris est l’animal qui se prête le mieux à ce type d’expérimentation. On connait ses réactions comportementales et on sait les mesurer grâce à des dispositifs expérimentaux. Par ailleurs, c’est une espèce facile à maintenir en captivité. Concernant les travaux pratiques de la Formation à l’expérimentation animale, nous utiliserons des rats et des souris afin de montrer aux étudiants des différences comportementales et de manipulation entre des deux espèces. De plus, les rats et les souris étant les principaux animaux concernés par la recherche scientifique (75%), nous avons choisi d’utiliser seulement ces deux espèces et de présenter sous forme de vidéos didactiques les manipulations adaptées aux lagomorphes. Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte (2 mois au début des expérimentations).
Elevage d’un modèle murin de spondyloarthrite
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour développer une spondyloarthrite, elles expriment dès trois à quatre semaines un gonflement des articulations, une déformation des membres et de la queue, une perte de poids d'environ 20 % et des difficultés à se mouvoir et à s'alimenter, la seule intervention décrite étant un prélèvement d'oreille pour génotypage. Les souris non retenues pour les expériences sont tuées. Le porteur indique qu'aucun modèle animal ne reproduit fidèlement la maladie humaine et présente l'élevage de cette lignée comme la base des recherches à venir.
Objectifs
La spondyloarthrites (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique des articulations qui touche 0,30 à 1,90 % de la population caucasienne. Les traitements actuellement disponibles visent principalement à soulager la douleur et ne sont pas entièrement satisfaisants (recours notamment aux anti-inflammatoires qui peuvent entrainer un certain nombre d'effets secondaires en cas de traitement de longue durée). Le but de ce projet est de produire trois lots de souris expriment la SpA pour étudier la maladie.
Bénéfices attendus
Les études menées sur ces lots de souris permettront à court terme d'améliorer la compréhension de la SpA et de ses mécanismes et pourraient à long terme fournir des pistes pour améliorer la prise en charge médicamenteuse des patients..
Procédures
Les souris d’intérêt seront détectées par génotypage à partir d’une biopsie d'oreille prélevée avant le sevrage des animaux. Chaque souris produite sera génotypée et ne subira donc qu'un prélèvement unique (2 prélèvements pourront être effectués maximum par animal en cas de problème de génotypage).
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans ce projet expriment des symptômes de type arthrite (inflammation des articulations). Ces symptômes apparaissent dès l'âge de 3/4 semaines puis s'aggravent graduellement jusqu’à la semaine 12/16 semaines , où un plateau est atteint. Les signes cliniques sont développés dans les quatre membres et la queue, sans distinction de sexe. Les signes cliniques des membres périphériques consistent en un gonflement articulaire et une déformation généralisée des membres et des doigts. D'autres atteintes plus sévères, sont caractérisées par une queue courbée et, plus tardivement, par un raidissement des articulations. Ces souris présentent un poids corporel et une longueur de corps significativement réduits par rapport aux souris normales (environ -20% et -10% à 15 semaines, respectivement). Au vu des signes cliniques périphériques et vertébrales exprimés chez les souris HE, des difficultés de locomotion sont attendues avec difficultés à se mouvoir et donc à s'alimenter.
Devenir
les animaux de ce projet seront utilisés pour les expériences. Les animaux non utilisés pour les expériences seront sacrifiés.
Remplacement
Des études in vitro ont déjà été menées en amont afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la SpA. Les données recueillies laissent supposer une bonne transférabilité de ces résultats chez la souris. L'objectif est donc à présent de valider les hypothèses en in vivo.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins finaux. Le nombre d’animaux est calculé selon les protocoles expérimentaux de manière à obtenir le minimum d’animaux par groupe permettant des résultats significatifs et homogènes. De plus, et afin de répondre à ces besoins, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux avec la garantie d’un rendement maximum et de résultats homogènes.
Raffinement
Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille interne d’évaluation. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant un enrichissement minimum (bâtons de bois et matériel de nidification). Les animaux pouvant développer des problèmes de locomotion, un supplément hydrique ainsi que des croquettes mouillées seront ajoutés dans les cages.
Choix des espèces
Actuellement, aucun modèle animal ne permet de reproduire fidèlement les SpA humaines, mais une dizaine de modèles de rat et souris sont disponibles pour étudier certaines de leurs manifestations. Le modèle retenu est donc une souris transgénique qui exprime une pathologie articulaire qui permet de répondre au mieux aux besoins du projet. De plus ce modèle et la pathologie qu'il développe ont déjà̀ été́ finement caractérisés. Les animaux seront utilisés entre 3-4 semaines d'âge pour permettre de suivre l'apparition de la maladie qui survient sur ce modèle dès 4 semaines.
Exposition maternelle à un mélange de contaminants alimentaires et effets sur la descendance-chez les lapines- Site N°1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
476 lapins, femelles reproductrices et leur descendance, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les lapines sont exposées par voie orale pendant la gestation à un mélange de contaminants alimentaires, avec suivi par prises de sang et échographies, tandis que la descendance subit des tests de tolérance au glucose, des mesures de composition corporelle et des collectes de sperme. Adultes et petits sont tués à différents âges, dès quatre jours pour certains, afin d'analyser organes et tissus. Le porteur affirme le recours à l'animal "indispensable" pour étudier les effets d'une exposition maternelle sur toute une vie.
Objectifs
La population générale est exposée à de nombreux contaminants alimentaires qui entrent dans la composition d’un grand nombre de produits de consommation courante. La population, dont les femmes enceintes, est exposée quotidiennement à ce mélange de substances par ingestion, inhalation et/ou voie cutanée. Or, cette exposition représente un risque élevé pour la santé de la mère et de sa descendance. Ce risque est mal caractérisé car les études prennent rarement en compte les effets d’une exposition multiple à plusieurs contaminants (effet cocktail). De plus, le pas de temps entre les générations humaines est trop long pour permettre d’identifier les risques de pathologies développés à l’âge adulte. Il apparait donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour explorer ces effets qui peuvent être spécifiques au sexe de la descendance. Les objectifs du projet sont d'évaluer les effets de l’ingestion maternelle d’un mélange de contaminants alimentaires, fréquemment retrouvé dans les prélèvements humains et suspecté d'affecter le poids placentaire et le poids du nouveau-né chez l’humain. Ces effets seront étudiés, chez des lapines, sur le développement et la croissance du fœtus au cours de la gestation, la fonction du placenta, la santé de la descendance en termes de maladies cardiovasculaires, d’obésité, de diabète et de troubles de la fertilité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des effets d'un mélange de contaminants alimentaires sur la santé des mères et de leurs enfants en termes de maladies cardiovasculaires, d’obésité, de diabète et de troubles de la reproduction/fertilité. Les résultats obtenus aideront au suivi clinique des enfants dont les mères ont été exposées à ce cocktail de contaminants au cours de la conception, la grossesse et l’allaitement maternel. De plus, ce projet va générer des informations sur la toxicité de l'exposition des mères aux contaminants alimentaires et sur leurs effets sur la descendance, ce qui représente un défi pour les autorités publiques en termes de recommandations et d'évaluation des risques, pour les femmes enceintes, les nourrissons, les enfants et les adultes.
Procédures
1ère étape sur le lot N°1 de 24 animaux : Sur 10 animaux, collecte de sang pour évaluer le niveau de base des contaminants chez les animaux. 15 jours après, injection du mélange de contaminants alimentaires sous anesthésie locale (12 animaux) ou exposition orale aux contaminants alimentaires (12 animaux), prises de sang sous anesthésie locale de 3 min sur animaux vigiles (3 prélèvements maximum par animal). 2nde étape sur le lot N°2 de 40 animaux : exposition orale aux contaminants alimentaires (une fois par jour) pendant 90 jours, prises de sang de 3 min sur animaux vigiles (une fois sur 10 animaux contrôles et 10 exposées), suivi échographique de la gestation à 4 stades de gestation sur des animaux vigiles, 40 min maximum d’échographie par session, 4 sessions par animal à une semaine d’intervalle. 3ème étape sur le lot N°3: exposition orale aux contaminants alimentaires de 40 animaux, une exposition par jour pendant 120 jours. Sur les descendants, 20 mâles et 20 femelles par groupe : - prises de sang avec anesthésie locale sur animaux vigiles à 5 et 8 mois (durée 3 min par prélèvement) - mesure de la pression artèrielle à 5 et 8 mois sur animaux vigiles (durée totale par stade 30 min) - test de tolérance au glucose pour rechercher le développement d’un éventuel diabète sur animaux vigiles (prise de sang à 6 temps différents, durée quelques secondes car pose d’un cathéter pour une durée de 120 min pour ne pas avoir à réintroduire une aiguille) - mesure de la répartition de la masse maigre, masse grasse et densité osseuse à 7 mois (acquisition d’images sur animaux anesthésiés pendant 15 min) - collecte de sperme à 6, 7 et 8 mois Sur les descendants, 10 mâles et 10 femelles par groupe : Mise à la reproduction des descendants âgés de 9 mois, suivi échographique de la gestation à 4 stades de gestation sur des animaux vigiles, 40 min maximum d’échographie par session, 4 sessions par animal à une semaine d’intervalle.et évaluation des effets sur les ovaires et testicules de la seconde génération.
Impact sur les animaux
- Risques de stress liés à la manipulation pour l’exposition par voie orale ou à la contention pour les prélèvements de sang et les approches physiologiques - Le sevrage peut être une étape délicate chez le lapin car il peut parfois causer un risque de diarrhée - Une douleur peut apparaître au point de prélèvement de sang
Devenir
-Mise à mort des animaux adultes afin de collecter un important volume de sang, ce qui est nécessaire pour mettre les dosages des contaminants et de leurs dérivés -Mise à mort des femelles non gestantes et des femelles après sevrage des descendants. Etape nécessaire pour évaluer les effets des contaminants sur les différents tissus par des approches d’histologie et de biologie moléculaire. -Mise à mort des animaux en fin de gestation : cette étape est nécessaire pour déterminer le poids des organes et conditionner les tissus pour de l’histologie et des approches de biologie moléculaire permettant de caractériser les effets des contaminants et de rechercher déjà à cette étape des signatures prédictives de certaines maladies développées à l’âge adulte. -Mise à mort des descendants à différents stades (4 jours, sevrage, 3 mois, 9 mois) : nécessaire pour suivre le développement des ovaires et des testicules et/ou l’apparition de troubles métaboliques mais aussi corréler des effets physiologiques observés chez l’animal aux données histologiques, aux profils en lipides et aux approches de biologie moléculaire.
Remplacement
Le recours à l’animal est indispensable puisqu'il s'agit d’étudier les effets de l’exposition maternelle aux contaminants sur la vie fœtale et au stade adulte. Il n'est donc pas possible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou une simulation informatique.
Réduction
- Pour étudier la distribution des contaminants dans le sang et les urines, le nombre d’animaux a été défini selon un modèle de distribution des contaminants décrit dans la littérature scientifique et qui permet de limiter le nombre d’animaux à chaque temps de collecte de sang. -,Les animaux adultes seront exposés pendant une période de 90 jours qui inclut la période gestationnelle. Comme les contaminants sont connus pour affecter la fertilité, 40 lapines seront mises en protocole afin d’obtenir 12 lapines gestantes par groupe et 96 animaux dans le groupe témoin et 96 animaux dans le groupe exposé au stade fœtal. Ces effectifs ont été déterminés en nous basant sur nos précédents protocoles et publications scientifiques. - Pour le suivi de la descendance après la naissance, sur les 96 descendants attendus par groupe et de manière à prendre en compte les effets sexe et à avoir des résultats scientifiques robustes : 5 mâles et 5 femelles/groupe seront mise à mort à 4 jours afin d’évaluer les effets sur le développement des ovaires et des testicules ; 10 mâles et 10 femelles/groupe seront euthanasiés au sevrage et à 3 mois afin d’évaluer les effets sur le développement des ovaires et des testicules. Ces effectifs ont été calculés afin d’obtenir des résultats robustes en histologie et en biologie moléculaire. - Pour l’étude de la fréquence cardiaque, la pression sanguine, la composition corporelle (masse maigre, masse grasse et densité osseuse), la qualité du sperme et la recherche d’un diabète, 20 mâles et 20 femelles/groupe seront suivis afin d’obtenir des résultats robustes prenant en compte le sexe. Parmi ces animaux, 10 mâles et 10 femelles/groupe seront euthanasiés à 9 mois pour une exploration de la fonction hépatique et gonadique. -, Pour calculer le taux de reproduction, 10 mâles et 10 femelles/groupe issus de lapines exposées ou non aux contaminants pendant la gestation et la lactation seront mis à la reproduction, il s’agit d’un nombre nécessaire et suffisant pour évaluer ce paramètre. - Tous les tissus maternels et de la descendance seront collectés et stockés afin de pouvoir être utilisés dans le projet lui-même mais aussi ultérieurement dans d’autres projets collaboratifs.
Raffinement
- Les cages d’hébergement des animaux seront enrichies avec une chaînette, des mobiles suspendus, une plateforme et des blocs à ronger composés de foin compressé. De plus, pour le confort de l’animal, les cages disposent de repose-pattes. Les animaux seront en cage individuelle mais les cages sont positionnées les unes à côté des autres ce qui permet aux animaux d’être en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Au moment de la reproduction et de l’élevage, les salles d’hébergement disposent de blocs de phéromones maternelles qui diminuent les sources de stress et apaisent les animaux. - L'état de santé des animaux sera surveillé tous les jours et tout au long de l'expérience, incluant le niveau d’activité, le comportement, la posture au repos, l’apparence (pelage), l’alimentation, les mouvements à la sollicitation. Si un animal présentait une altération de ces critères alors une évaluation de la douleur serait réalisée avec la grille dédiée à l’établissement d’un score. Selon le score, une analgésie serait mise en place. Si la douleur persistait, après concertation avec le vétérinaire, l’euthanasie pourrait être envisagée. - Une phase d’habituation à la manipulation, à l’exposition par voie orale et à la contention sera mise en place 4 semaines avant l’entrée en protocole des animaux. - Avant la mise à mort, les lapines gestantes seront pré-médiquées avec un analgésique de type morphinique qui traverse la barrière placentaire et qui assurera l’analgésie de la mère et des fœtus.
Choix des espèces
Pour ce projet, l’espèce lapin a été choisie pour plusieurs raisons : i/ son type de placentation est plus proche de celle de l’humain que celle des rongeurs ii/ sa taille permet de réaliser un suivi de la gestation en utilisant des appareils d’échographie utilisés en clinique humaine iii/ il n’est pas nécessaire d’anesthésier les lapines pour réaliser les échographies iv/ cette espèce est pertinente pour étudier la toxicité sur le développement du fœtus et offre la possibilité d'évaluer les effets à long terme v/ le lapin est une espèce plus appropriée pour suivre la distribution des contaminants car, chez le lapin comme chez l’humain, l'élimination urinaire prédomine vi/ cette espèce est pertinente car la production d’hormones par les ovaires et testicules pendant la vie fœtale est similaire à celle de l'homme. Stades de développement choisi : - Animaux adultes : nécessaire à l’étude de la distribution des contaminants dans le sang et les urines mais également à l’exposition des femelles pour évaluer les effets sur la santé des descendants aux stades de développement décrits ci-dessous - Stade fœtal (28 jours de gestation) : nécessaire pour étudier les effets des contaminants sur la croissance et le développement fœto-placentaire, les paramètres biochimiques, la biologie moléculaire de différents tissus, dont le placenta, ceci afin de relier la santé des fœtus à la santé à l’âge adulte. - Stade de la naissance au sevrage et à l’âge de 3 mois : nécessaire à l’étude des effets de l’exposition sur le développement de l’ovaire et du testicule. - De l’âge de 5 à 9 mois : nécessaire pour évaluer si l’exposition des mères aux contaminants alimentaires au cours de la gestation et de la lactation altère la santé de la descendance et augmente le risque de troubles cardio-métaboliques (augmentation du risque d’obésité, de diabète, de maladies cardiovasculaires, composition corporelle) et de la fertilité.
Le lapin, le pommier et les bénéfices écosystémiques interspécifiques (1/2)
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
145 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans mise à mort prévue par le protocole. Ils subissent des prélèvements de poil pour doser le cortisol et des prises de sang à l'oreille, et sont répartis entre un élevage en plein air sous verger de pommiers et un élevage en cage, dont le porteur reconnaît qu'il "restreint fortement l'expression des comportements naturels". À l'issue, les reproducteurs sont vendus à des éleveurs ou à l'abattoir et les jeunes commercialisés à quatre-vingts jours. Le projet, classé sous la finalité "bien-être animal", vise à évaluer un système d'élevage associant lapins et pommiers en agriculture biologique.
Objectifs
Il s'agit projet transdisciplinaire qui ambitionne de démontrer la faisabilité et la plus-value de l’association arboriculture-élevage « lapins en verger de pommiers » en agriculture biologique. L’hypothèse générale est que l’association entre arbres et animaux pourrait induire des bénéfices réciproques pour les différentes composantes du système (désherbage, fertilité des sols, bien-être des animaux, etc.), mais également un impact négatif de l'association lapins-pommiers : dégâts de lapin sur les pommiers, attraction de prédateurs ou maladies pour les lapins. L'objectif est de concevoir un système d'élevage de lapins au verger. Les animaux vont donc tester des conditions d'hébergement et avoir un suivi de leur comportement, bien-être, santé, croissance. Un groupe de lapins sera élevé en bâtiment pour avoir un élément de comparaison et mieux apprécier les effets de l'accès à l'extérieur.
Bénéfices attendus
Le projet doit permettre de déterminer les conditions d'hébergement au verger optimales pour les lapins et les pommiers : respect du bien-être animal, expression des comportements, vie en groupe, valorisation et entretien de l'herbe, fertilisation des arbres, protection des lapins par le couvert du verger. La comparaison avec les lapins élevés en bâtiment permettra d'objectiver les effets de l'accès à l'extérieur sur la croissance, la santé, le bien-être des lapins.
Procédures
Certains animaux vont être exposés à la vie en extérieur avec une moindre maîtrise des conditions d'ambiance (aléats climatiques, température). Ils vont tester différents types de logements de façon à déterminer les hébergements optimaux. Ils vont subir un petit prélèvement de poil (carré de 5 cm de côté) au niveau du dos à l'aide d'une tondeuse pour doser le cortisol (hormone du stress). Ils subiront une prise de sang à la veine de l'oreille pour réaliser des analyses sanguines pour évaluer leur santé. Des observations de comportement seront réalisées : observations à distance ou réalisation de séquences vidéos.
Impact sur les animaux
Les prélèvements de poil ont peu d'incidence (pas de douleur, très peu de stress) pour les animaux. Le prélèvement sanguin fait à la veine de l'oreille est peu douloureux et de faible volume (maximum 1 ml). Une compression de la veine sera réalisée pour arrêter le saignement et éviter la formation d'un petit hématome. La vie à l'extérieur peut exposer les lapins à des maladies et des aléats climatiques. La vie en cage restreint fortement l'expression des comportements naturels.
Devenir
Aucune procédure ne nécessite une mise à mort. Les reproducteurs seront vendus à des éleveurs ou à l'abattoir. Les jeunes lapins en croissance seront vendus à 80 jours (âge de la commercialisation).
Remplacement
Le projet a pour ambition de tester la compatibilité et le caractère éventuellement cumulatif des vertus de deux élevages alternatifs : l’agriculture biologique et l’intégration culture-élevage. L’agroforesterie et en particulier l’association arboriculture-élevage est très prometteuse en termes de bénéfices réciproques, mais très peu étudiée en zone tempérée. L’association entre l'arboriculture fruitière et l'élevage de lapins est novatrice. Le projet porte donc sur l’évolution des systèmes de production d’aliment nécessaire à la transition écologique. Vu le caractère en rupture du projet et l’absence d’information scientifique sur ce sujet, il n’est pas possible de répondre aux ambitions du projet sans le recours aux animaux. La modélisation n’est pas possible à ce stade par manque de données permettant la construction des modèles.
Réduction
Le projet est structuré avec une phase de prototypage impliquant un petit nombre d'animaux (une vingtaine) de façon à optimiser le schéma expérimental de l'essai final et de raffiner les conditions de vie des lapins. Les tests statistiques varient en fonction de la variable étudiée. Pour l'essai final, nous utiliserons plusieurs lots pour avoir suffisament d'unités statistiques pour réaliser les comparaisons entre les differentes conditions de vie (avec et sans arbres ou élevage en cage).
Raffinement
Le projet est structuré avec des phases de prototypage de façon à raffiner les conditions d'hébergement avant de déployer l'essai final. Seuls les animaux en parfaite santé seront engagés dans l'essai en extérieur. Les animaux plus faibles ou malades au cours des essais seront hébergés dans une infirmerie chauffée, le temps d'être soignés et guéris selon les problèmes relevés. Le sevrage sera réalisé à 6 semaines afin d'améliorer la santé digestive des animaux. Les fratries seront préservées pour éviter des stress de séparation. La santé des lapereaux sera controlée quotidiennement. Chaque semaine, les animaux seront pesés et auront un examen clinique complet ainsi qu'un controle du niveau de parasitisme (examen des crottes au microscope). Toutes les manipulations des animaux seront faites avec calme et bienveillance. Lors de la prise de sang à l'oreille, une petite compression sera réalisée sur le lieu de la ponction pour arrêter le saignement et éviter la formation d'un hématome. Lors des traitements des arbres, les animaux seront déplacés sur une autre parcelle.
Choix des espèces
L’hypothèse générale est que l'accès à l'extérieur peut apporter une amélioration du bien-être des lapins et être utile pour la culture des arbres (désherbage, fertilisation). Les reproducteurs permettent de faire naître les lapereaux qui vont tester un élevage au champ sous verger de pommier : 53 reproducteurs 20 lapereaux vont permettre de proposer un logement prototypique de lapins à l'extérieur. 72 lapereaux vont être élevés en cage dans les conditions conventionnelles pour permettre de comparer leur croissance, leur santé, leur bien-être à des lapins d'un même type génétique élevés au champ. Soit un total de 145 lapins.
Evaluation du potentiel effet perturbateur endocrinien de substances et d’effluents sur des poissons sexuellement matures
- Protection de l’environnement
Autres poissons : 8320
11 880 poissons, poissons zèbres et autres espèces, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Ils sont maintenus vingt et un jours dans une eau contenant des substances chimiques ou des effluents, avec des effets que le porteur décrit comme irréversibles, changement de sexe, baisse de la fécondité et modification du comportement. Les poissons exposés sont tués à la fin de l'essai, ceux des groupes témoins pouvant être réutilisés. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'absence de test alternatif validé par l'OCDE et par la conformité réglementaire de son activité.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer l’impact des substances chimiques sur le système endocrinien des groupes de poisson exposés, composés de mâles et de femelles sexuellement mâtures, sur une durée limitée de leur cycle biologique (21 jours).
Bénéfices attendus
Le projet visant à évaluer l’effet néfaste des substances et effluents testés sur la santé des organismes aquatiques, il participe activement à la protection et la préservation de l’environnement.
Procédures
Pas de prélèvements prévus sur animaux vigiles. L'exposition se fait via le milieu d'essai, les animaux baignants dans des concentrations en substance maintenues constantes durant 21 jours tout au long des procédures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont les suivants : - Changement de sexe des organismes exposés (par exemple : les femelles peuvent développer des caractères sexuels masculins, les mâles peuvent produire de la vitéllogénine,…) ; - Diminution du nombre d’œufs pondu par la femelle et/ou diminution de la qualité du sperme chez le mâle ; - Diminution du taux de fécondité ; - Changement du comportement pouvant impacter l’ensemble des activités métaboliques des poissons exposés (par exemple : diminution de l’appétit, aggresivité,…) ; L’ensemble de ces nuisances seraient irréverssibles, même si les poissons ne sont plus exposés.
Devenir
Les poissons issus du contrôle et du contrôle solvant pourront être réutilisés. Les poissons exposés à des substances chimiques seront mis à mort à la fin de la procédure. Lorsque des prélèvements terminaux sont réalisés sur les organismes, tous les organismes sont mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives non animales comprennent : les méthodes in sillico (références croisées, modèle mathématique prédictif tel que le modèle « Quantitative Structure-Activity Relationship ») ; les méthodes in vitro (comprenant les tests sur lignées cellulaires ou sur organoïdes) ; et les recherches bibliographiques (partage de données entre industriels, Fiches de Données de Sécurité). Malheureusement les méthodes ci-dessus ne peuvent être appliquées pour plusieurs raisons : Premièrement, l’insuffisance de données disponibles pour les molécules testées. Les méthodes in sillico ont une forte dépendance aux bases de données disponibles concernant la substance d’essai (notamment aux fiches de données de sécurité). Néanmoins dans le cadre de notre activité, ces données sont absentes ou insuffisantes pour permettre d’établir des modèles robustes. De plus certains processus, comme les effets sur le comportement ou les effets à long termes, sont difficiles à paramétrer dans ces modèles. Deuxièmement, le manque de concordance entre les lignées cellulaires seules et les organismes complets. Les méthodes in vitro ne peuvent prendre en compte l’ensemble des interactions complexes tissus-organes ce qui empêche de connaitre l’effet global d’une molécule sur un organisme. Troisièmement : les limites expérimentales. Dans le cas d’utilisation de culture cellulaire, le milieu de culture peut en lui-même constituer un biais. En effet, il peut potentiellement interagir avec les xénobiotiques et empêcher, ou aggraver, leur toxicité ce qui ne permet pas de statuer sur son danger réel en cas de rejet dans l’environnement. Dernièrement, la validité réglementaire des méthodes alternatives. La mise sur le marché européen des produits de consommations s’appuie sur des règlements adoptés au sein des pays membres de l’Union Européenne. Malheureusement à ce jour, aucun test alternatif n’a été standardisé et intégré aux normes de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economique) concernant les perturbateurs endocriniens. L’activité de l’établissement s’appuyant sur les normes de l’OCDE, et les Bonnes Pratiques de Laboratoires, l’utilisation de méthodes alternatives non standardisés peut conduire à une invalidité des études auprès des instances réglementaires. Par conséquent, pour les raisons citées, il n’est pas encore possible de remplacer l’expérimentation animale au sein de notre établissement.
Réduction
Comme cité plus haut, l’établissement utilisateur suit les normes de l’OCDE dans le cadre de son activité. Ces normes intègrent les règles des 3R et définissent un nombre d’organisme le plus réduit possible tout en garantissant la robustesse des tests statistiques. Concernant la partie statistique, celle-ci est détaillée dans deux documents : 1) la norme relatif au projet (par exemple, pour le présent projet, il s’agit de l’annexe 8 de la norme OCDE 229 montré en Figure 1), et 2) le guide « Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OCDE Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54 ». De plus, avant de démarrer l’essai préliminaire, une veille bibliographique est réalisée. Si cette veille permet de déterminer la Concentration Maximale Tolérée, et donc la gamme de concentration de l’essai définitif, alors l’essai préliminaire n’est pas réalisé. Dans le cas contraire, les organismes témoins de l’essai préliminaire peuvent être réutilisés dans l’essai définitif.
Raffinement
Les mesures visant à réduire les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure sont les suivantes : 1) Les organismes sont acclimatés pendant deux semaines avant le début de la procédure afin de réduire le stress lié au changement de conditions de maintien (passage des conditions d’élevage aux conditions expérimentales) ; 2) Les conditions environnementales (température, luminosité, paramètres physico-chimiques de l’eau) sont réglées de manière optimales. Elles sont strictement maintenues et sont contrôlées régulièrement afin d’éviter toutes variations environnementales pouvant impacter le bien-être des organismes ; 3) Une ronde quotidienne est mise en place et permet d’observer quotidiennement les organismes afin d’évaluer leur état de santé ; 4) Une feuille de points limites a été établie afin de détecter le plus précocement possible d’éventuels signes de souffrance. Si l’organisme dépasse un certain seuil, ce dernier est retiré du test et mis à mort .
Choix des espèces
Danio rerio, Oryzias latipes et Pimephales promelas sont des espèces recommandées par l’OCDE. En effet, elles sont reconnues comme étant des espèces modèles en biologie, c’est-à-dire qu’elles possèdent des qualités importantes pour la recherche dont : 1) une biologie bien connue (dimorphisme sexuel bien documenté, génétique maîtrisée) ; 2) elles sont faciles à maintenir en élevage et à faire se reproduire (descendance nombreuse, développement rapide) ; 3) elles sont économiquement accessibles et faciles à manipuler en expérimentation (petite taille) ; 4) elles sont robustes (résistance à la consanguinité, aux maladies et aux stress environmentaux) ; et 5) les résultats expérimentaux obtenus avec ces espèces sont transposables à d’autres poissons d’eau douce. L’ensemble de ces critères montre que ces espèces sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisant compte tenu de l’activité de l’établissement utilisateur. Des poissons adultes, sexuellement mâtures et identifiables doivent être utilisés pour la procédure. En effet la procédure vise a étudier la reproduction et le développement de caractères sexuels secondaires.
Etude de pharmacologie (biodistribution, élimination) de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par voie intraveineuse un composé radiomarqué à l'indium 111 sous anesthésie, puis une séance d'imagerie de quarante-cinq minutes avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de suivre la distribution et l'élimination de nouveaux agents de diagnostic ou de thérapie. Le porteur indique que les composés ont déjà été testés sans effet secondaire chez la souris et sur cultures cellulaires. Il affirme que l'absence de circulation sanguine et de système excréteur in vitro fait de l'animal la "seule alternative".
Objectifs
Lors du développement de nouveaux médicaments et/ou sondes d’imagerie, il est nécessaire d’étudier la façon dont la molécule d’intérêt se distribue et est éliminée de l’organisme. Cette étape permettra de valider qu’un agent diagnostic sera éliminé rapidement de l’organisme sans causer de toxicité ou qu’un composé thérapeutique restera suffisamment longtemps dans l’organisme pour exercer son action. Pour cela, nous avons d’abord vérifié sur culture cellulaire que les composés à étudier ne sont pas toxiques. Les composés à étudier ont, d’autre part, déjà été injectés à la souris sans causer d’effets secondaires. Nous avons ensuite procédé au radiomarquage de la molécule (ajout d’une molécule radioactive pour pouvoir la détecter : l’Indium111 dans le cas présent) puis au contrôle sur culture cellulaire que le composé modifié est toujours actif. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative est l’utilisation d’animaux. L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. Des études préliminaires ont montrés que certains composés de la même pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris. De plus certains modèles pathologiques de rat sont plus représentatifs de la maladie cancéreuse humaine que la souris. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat (d’autres travaux menés conjointement seront réalisés chez la souris pour identifier des différences de comportement selon les espèces et permettre ainsi une meilleure prédiction du comportement des composés chez l’homme). L’objectif de notre projet vise donc à suivre 2 composés, chez des rats sains, après administration par voie intraveineuse grâce à l’utilisation de l’imagerie et du comptage de la radioactivité.
Bénéfices attendus
Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de caractériser précisément le comportement de 2 composés dans l’organisme afin d’orienter les développements ultérieurs vers le diagnostic ou la thérapie, ou d’écarter des composés à risque pour la suite des développements.
Procédures
- Observation quotidienne et change des cages (10 jours maximum) - Préhension et mise sous anesthésie (2 fois maximum : injection et imagerie – quelques secondes) - Injection d'un agent d’imagerie seul ou avec compétiteur sous anesthésie (1 fois, quelques minutes) - Imagerie (1 fois, 45 minutes maximum) suivie de l’euthanasie et du prélèvement des différents organes
Impact sur les animaux
La préhension pour induction de l’anesthésie pourrait causer un certain stress aux animaux. Les injections, imageries et euthanasies seront réalisées sous anesthésie par du personnel expérimenté et ne devraient pas provoquer de nuisances supplémentaires. Les composés à tester ont déjà été injectés à l’animal et n’ont pas provoqué d’effet secondaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.
Remplacement
Les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été, au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, les composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum (n=4 par groupe).
Raffinement
Les gestes de ce projet (injection, imagerie, euthanasie) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude
Choix des espèces
L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. Des études préliminaires ont montrés que certains composés de la même pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris. De plus certains modèles pathologiques de rat sont plus représentatifs de la maladie cancéreuse humaine que la souris. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 8 semaines d’âge), puisque les études prévues par la suite seront réalisées sur des animaux adultes présentant un cancer.
Rôle des cellules immunitaires des méninges dans le développement et la physiopathologie du Système Nerveux Central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
11 232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, une partie sous anesthésie sans réveil. Adultes et nouveau-nés reçoivent des injections sous-cutanées, intra-péritonéales ou intracérébrales de vecteurs viraux, certains souriceaux subissant une imagerie sous anesthésie dont ils ne se réveillent pas, pour étudier le rôle des cellules immunitaires des méninges dans le développement du cerveau. Le porteur mentionne des études comportementales vers trente jours sans en préciser la nature. Il affirme qu'on "ne peut pas se passer" du modèle animal, tout en évoquant des cultures de neurosphères qui pourraient réduire le nombre de souris.
Objectifs
La surface du système nerveux central (SNC) est protégée par des membranes : les méninges. La découverte récente de la diversité des populations immunes y résidant et leur capacité à interagir avec le cerveau (influence sur le comportement, migraine, méningites, sclérose en plaque, …) ouvre de nouvelles perspectives en termes de recherche fondamentale et thérapeutique. Les cellules immunitaires les plus représentées dans les méninges sont les macrophages. D’autre part les méninges pénètrent profondément dans le cerveau entre les sous structures majeures du cerveau dont l’hippocampe, le siège de la neurogénèse. Dans ce contexte, mon projet a plusieurs objectifs : -1 : étude de l’implication des Macrophages Méningés (MM) et autres cellules immunitaires méningées au cours de la neurogénèse cérébrale physiologique- 2 : étude de leur implication dans la coordination de la croissance cerveau/crâne (rôle d’interface très important) -3 : étude de leur implication dans les troubles cognitifs postnataux dus à une inflammation au cours du développement cérébral (correspondante au troisième trimestre de gestation chez l’homme). Notre première stratégie sera de supprimer les macrophages méningés (MM) : soit par injection sous cutanée locale dde drogue dans des souris de type sauvage (déplétion chimique) ; soit par une approche génétique utilisant différents modèles de souris transgéniques. La seconde stratégie sera d’inactiver localement les gènes trophiques exprimés spécifiquement par les macrophages. Ces deux stratégies seront réalisées d’une part chez des souris adultes stimulées par activité physique, et d’autre part à des stades développementaux clés dans la maturation du système nerveux central. Nous évaluerons les conséquences de l’absence ou du dysfonctionnement des macrophages sur la neurogenèse cérébrale et le comportement.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce travail est de comprendre comment les cellules immunitaires des méninges interagissent avec le développement du cerveau. Du fait de la complexité des interactions cellulaires ainsi que du rôle de la vascularisation dans ce procédé (pour l’apport des cellules immunes), il n’est pas possible de se passer d’un modèle animal, et les études in vitro et in silico, bien qu’intéressantes, ne suffiront pas à comprendre la réponse immune du système nerveux central (SNC) dans son ensemble. L’organisation physique des tissus entre eux est cruciale et ne peut pas être modélisée in vitro. Les retombées de ces recherches au niveau fondamental mais aussi appliqué (découverte de thérapies ciblant les maladies inflammatoires et neurodégénératives) pour l’Homme constituent une justification éthique importante pour faire valoir notre projet impliquant des expériences sur animaux in vivo. Concrètement, nous espérons que ce projet nous apportera les bénéfices suivants : - A court/moyen terme, une meilleure compréhension du rôle physiologique des macrophages méningés (MM) dans 1) le neurodéveloppement, 2) la formation biomécanique du crâne et des méninges, 3) le comportement. - A moyen/long terme : permettre l’identification de candidats exprimés/sécrétés par les macrophages méningés (MM) impliqués dans la neurogénèse afin de pouvoir développer des stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des MM dans les troubles neurodéveloppementaux ou dans des maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous cutanées, intrapéritonéales, de molécules non toxiques à des volumes et des doses en accord avec l'âge et le poids des souris. Une minorité d’animaux seront soumis à des injection intracérébrales. Chez les adultes de 6 à 8 semaines : i) Injection sous cutanée sous la peau du crâne (acte de 30s sur animal vigile) d’un composé non toxique permettant de dépléter uniquement les macrophages des méninges tous les 2 jours pendant 15 jours soit 7 injections chez les animaux de type sauvage, ou 2 injections à 24 h d’intervalle juste avant la fin de l’expérience chez les animaux transgéniques. ii ) Injection unique intra- péritonéale (acte de 30s sur animal vigile) d’un composé non toxique permettant de tracer la formation des nouveaux neurones. iii) Injection intracérébrale de vecteurs viraux (virus inactivé transporteur de molécules) chez certains animaux de type sauvage : injection unique avec analgésie préventive sous anesthésie générale (durée 1h). iiii) prélèvement sanguin unique au coin de l’œil : sous anesthésie générale gazeuse en un geste de 30s juste avant la mise à mort de l’animal. Chez les souriceaux 0 à 10 jours : i) Injection sous la peau de la nuque (acte de 30s sur animal vigile) 3 injections maximum (une injection tous les 2 jours) chez les animaux de type sauvage et 2 injections chez les animaux transgéniques) dans le cas d’un composé non toxique permettant de dépléter uniquement les macrophages des méninges. 2 injections à 8 jours d’intervalle dans le cas de l’injection d’un marqueur de calcification. ii) Injections intra- péritonéales (acte de 30s sur animal vigile) : une injection unique dans le cas d’un composé non toxique permettant de tracer la formation des nouveaux neurones, 2 injections à 24h d’intervalle dans le cas d’un composé activant le système transgénique (uniquement pour certains modèles), une injection unique de toxine bactérienne ou alternativement 2 injections par jour à 6 h d’intervalle pendant 5 jours soit 10 injections totales d’une cytokine pour les animaux rentrant dans l’étude sur l’inflammation périnatale. iiii) Injection intracérébrale de vecteurs viraux (virus inactivé transporteur de molécules) chez certains animaux de type sauvage : injection unique avec analgésie préventive sous anesthésie générale (durée 20mn). V) Imagerie intra-vitale dans une procédure : pendant 1h sous anesthésie générale sur des souriceaux de 15 jours qui ne seront pas réveillés.
Impact sur les animaux
Les différents effets indésirables pouvant intervenir sont : une douleur au site d’injection en particulier pour les injections sous cutanées sous la peau du crâne ou sous la peau de la nuque, une mauvaise réaction à la molécule injectée ou un impact sur la croissance, du stress en particulier au moment des études comportementales à 30 jours, du stress pour la mère et pour les souriceaux, de la douleur au réveil lors des injections intracérébrales. Un contrôle quotidien de l’état de santé des souris, avec une grille de score pour chaque procédure permettra la détection d’anomalies. Si nous détectons une douleur, souffrance ou détresse, que nous n’arrivons pas à réduire par analgésie, l’animal sera euthanasié immédiatement. Dans le cas particulier des souriceaux, nous vérifierons également le comportement maternel, l’allaitement et la croissance des souriceaux. A la fin de chaque procédure les souris seront euthanasiées selon les méthodes réglementaires pour prélever méninges et cerveau.
Devenir
Chaque procédure nécessite l'euthanasie de tous les animaux selon les méthodes réglementaires pour prélever méninges et cerveau afin de les analyser.
Remplacement
L’objectif de ce travail est de comprendre comment les cellules immunitaires des méninges interagissent avec le développement du cerveau. Du fait de la complexité des interactions cellulaires ainsi que du rôle de la vascularisation dans ce procédé (pour l’apport de cellules immunes), il n’est pas possible de se passer d’un animal modèle, et les études in vitro et in silico, bien qu’intéressantes, ne suffiront pas à comprendre la réponse immune du SNC dans son ensemble. L’organisation physique des tissus entre eux est cruciale et ne peut pas être modélisée in vitro. Les retombées de ces recherches au niveau fondamental mais aussi appliqué (découverte de thérapies ciblant les maladies inflammatoires et neurodégénératives) pour l’Homme constituent une justification éthique importante pour faire valoir notre projet impliquant des expériences sur animaux in vivo. Puisque nous ne pouvons pas nous affranchir du modèle animal, nous réduirons au maximum le nombre d’animaux utilisés en suivant la règle des 3R. Certains axes du projet seront développés en utilisant en parallèle une approche de culture de neurosphères afin d’évaluer l’effet sur la neurogenèse de certains facteurs protéiques sécrétés par les macrophages présélectionnés par notre étude in vivo. Ceci nous permettra, nous l’espérons, de réduire encore le nombre de souris et les remplacer par un modèle in vitro.
Réduction
Nous tenterons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en effectuant des expériences pertinentes et complètes. Nous utiliserons des tests statistiques adéquats pour planifier nos expériences en fonction de la littérature et des données internes de l’équipe. Nous utiliserons plusieurs tissus du même animal (méninges, cerveau, crâne et sang). Les données quantitatives générées seront analysées statistiquement par le test de t de Student. Pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, le nombre d’individus nécessaire est de 20 animaux par groupe dans chaque procédure et 40 animaux par groupe pour les études comportementales. Nous utiliserons donc 11232 souris pour l’ensemble de ce projet sur cinq ans. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les études comportementales seront réalisées avant l'euthanasie de l'animal et le prélèvement des structures cérébrales. Les souriceaux utilisés pour l’étude de la neurogénèse (déplétion génique ou chimique des macrophages et mastocytes des méninges) se verront prélever les méninges et le crâne dans le cadre de l’étude sur la formation du crâne. Les souris proviendront d’établissements éleveurs, fournisseurs localisés et de collaborateurs.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, concues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. Les conditions de l’animalerie sont contrôlées (température, hygrométrie, photopériode). Les cages de 530cm2 seront utilisées pour limiter le stress des animaux (100cm2 de surface par animal au minimum, dômes protecteurs et matériel pour la confection de nids). Des précautions supplémentaires seront prises sur les souriceaux : après manipulation l’utilisateur se frottera les mains avec la sciure en provenance de la cage de la mère, ce qui limitera les dépôts d’odeur et favorisera la réintégration au sein du nid. Les souriceaux seront réchauffés grâce à une lampe à infra-rouge, avant d’être replacés. Les injections seront réalisées par des personnes formées à la manipulation des nouveaux nés avec du matériel adapté aux nouveaux nés. L’état de santé des animaux sera évalué quotidiennement selon 5 grands critères : 1-apparence globale (apparence physique et grimace), 2- Respiration et oxygénation (fréquence respiratoire et/ou coloration des extrémités), 3- évolution pondérale individuelle 4 – comportement (provoqué ou non) et continuité de l'accouplement, 5- autres observations (saignement ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté). Une grille de score spécifique à l'âge avec évaluation de la douleur sera complétée. Les points limites nécessitant l’observation accrue, soulagement de l’animal (buprénorphine sous cutanée 0,1mg/kg qui sera répétée toutes les 12 heures) ou l'arrêt de la procédure avec euthanasie seront détaillés dans chaque procédure. Ce sont : poils hirsutes, dos arrondi, fréquence respiratoire augmentée et rythme instable, pâleur ou cyanose, perte de poids individuelle >20%, comportement anormal, hypo-mobilité, isolement, défaut d’alimentation ou d’hydratation, diarrhées, saignements, et en particulier pour les souriceaux, abandon par la mère, décoloration.
Choix des espèces
De nombreux modèles physiopathologiques étant partagés entre l’homme et la souris, nous utiliserons des souches de souris consanguines ainsi que des lignées génétiquement modifiées. De plus, le vaste développement de modèles transgéniques (pour cibler et visualiser des populations cellulaires précises) et l’utilisation d’une grande variété de drogues déjà testées chez la souris permet de tester plus rapidement et plus efficacement nos hypothèses. Enfin, nos modèles d'étude sont fréquemment utilisés chez la souris et leur physiopathologie est donc bien décrite. Pour toutes ces raisons, le modèle murin représente le modèle le plus prometteur pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris de 6 à 8 semaines (J42 à J56) mâles et femelles afin d’évaluer l’impact des macrophages méningés sur la neurogénèse adulte avec ou sans activité physique. Nous utiliserons également des souriceaux à des âges clés du développement neuronal. Ainsi pour les études de neurogenèse et de croissance cerveau-méninges- crâne, les gestes techniques seront réalisés entre J0 et J9 avec analyse à J3 ou J7 ou J10 en fonction des questions posées. Pour les études cognitives, les gestes techniques seront réalisés de J1 à J5 (correspondant au 3ème trimestre de gestation chez l'homme) avec analyse à J8 ou J30.
Utilisation de la souris Ascl1CreERT2 pour marquer et manipuler les neurones granulaires du gyrus denté
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé, 467 souris de la lignée Ascl1CreERT2, adultes, juvéniles, souriceaux ou femelles gestantes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les injections de tamoxifène, répétées jusqu'à cinq jours de suite, peuvent faire perdre du poids aux adultes et provoquer des avortements chez les femelles gestantes, que le porteur fait tuer elles aussi en raison d'effets secondaires "non compatibles avec la réutilisation". Une partie des souris est opérée puis hébergée seule une semaine avant des tests et jusqu'à la fin de la procédure, un isolement qu'il dit pouvoir être "source d'ennui". Ces tests, de 5 à 30 minutes, doivent évaluer "le comportement social et l'anxiété", et le porteur n'en nomme aucun.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'utiliser une souris particulière permettant de marquer une population spécifique de neurones dans l'hippocampe et ceci afin d'étudier leurs caractéristiques.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les propriétes d'une population spécifique de neurones dans l'hippocampe . Ces connaissances devraient donc permettre à terme de mieux comprendre la contribution de cette population de neurones à l'activité et aux fonctions cérébrales.
Procédures
Les animaux seront soumis soit 1) à des injections (1 injection ou 5 injections sur 5 jours concécutifs pour les souris adultes et 2 injections sur 2 jours consécutifs pour les souris agées de 3 semaines; moins d'une minute par injection); soit 2) à une procédure chirurgicale (30 min) + injections (5 injections sur 5 jours concécutifs, moins d'une minute chaque injection)+hébergement indivuel 1 semaine avant les tests comportements (et jusqu'à la fin de la procédure) + tests comportementaux pour évaluer le comportement social et l'anxiété (durées des différents tests: 30 min-10 min - 10 min - 5 min- 5 min); soit 3) à un hébergement individuel (souris gestantes) après une injection (5j) ou 4) à une procédure chirurgicale (5 min) + injection (5 injections sur 5 jours concécutifs).
Impact sur les animaux
Les injections chez les souris gestantes peuvent conduire à des avortements et les injections répétées chez la souris adulte peuvent conduire à des pertes de poids. L'hébergement individuel peut être source d'ennui.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car les cerveaux des animaux sont récupérés pour les différentes analyses. De plus les mères gestantes utilisées seront également euthanasiées car elles auront reçu l'injection d'une substance pendant la gestation qui peut engendrer des effets secondaires non compatibles avec la réutilisation de ces femelles quel que soit le protocole expérimental (reproduction ou autre).
Remplacement
Le dévéloppement des neurones étudiés dans ce projet se fait dans un environnement complexe qui ne peut pas être à l'heure actuelle remplacé par un modèle in vitro ou in silico.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes, nombre dépendant de la technique utilisé. Les tests comportemenatux utilisés étant non invasifs, nous effectuerons tous les tests sur les mêmes groupes d'animaux. Enfin mâles et femelles seront utilisés.
Raffinement
Un soin particulier sera accordé à l’observation des animaux, en particulier lors des périodes post injection de Tamoxifène et après chirurgie mais aussi à leurs conditions d’hébergement. De plus, des traitements appropriés (anesthésie, anti-douleur) seront utilisés pour pallier la douleur associée aux opérations chirurgicales.
Choix des espèces
La formation de nouveaux neurones dans l'hippocampe a été étudiée principalement chez le rongeur. De plus, le modèle utilisé dans ce projet est la souris car 1) ce projet fait suite à des premières études réalisées chez la souris et 2) il fait appel à une lignée particulière développée chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes et juvéniles, des souriceaux ou des souris gestantes. Ces âges ont été choisi en accord avec nos études et analyses précédentes. De même en accord avec ces études, la plupart des analyses seront réalisées quand les neurones d'intérêt seront matures c'est à dire agés de 12 semaines. Nous avons tout de même ajouté deux autres temps d'analyse pour certaines procédures (5 semaines et 24 semaines) afin d'effectué l'analyse à différents stades de maturité.
Rôle de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans le contrôle de la prise alimentaire, étude genetique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une partie porte des mutations d'obésité génétique, décrite par le porteur comme un "phénotype dommageable", et l'ensemble est soumis à des cycles de jeûne de deux heures puis à des régimes standard ou enrichis en gras, pour étudier une réaction inflammatoire cérébrale après les repas. Les souris sont ensuite euthanasiées afin de prélever le cerveau et de disséquer l'hypothalamus. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier le comportement alimentaire de façon intégrée et revendique la souris comme "modèle de référence".
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs pro-inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Au niveau cellulaire, les nutriments activent un senseur moléculaire intracellulaire sui active une cascade de réactions intracellulaires faisant intervenir un facteur F pro-inflammatoire. Tant qu’elle n’est pas chronique, la production du facteur F semble exercer un rôle positif sur le métabolisme, en stimulant la sécrétion d’insuline et favorisant l’utilisation de glucose, améliorant in fine le contrôle glycémique périphérique. Récemment, l’équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, en particulier dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. La PIR cérébrale se caractérise par une activation des cellules spécifiques chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Encore maintenant le rôle de la PIR cérébrale est totalement inconnu. Afin de compléter nos connaissances, dans ce projet nous étudierons : - la PIR à l’échelle moléculaire dans les cellules activées, - la PIR dans un contexte d’obésité génétique. Pour cela, nous devons héberger des colonies d’animaux porteurs de mutations affectant notamment le facteur F. Les cerveaux de ces animaux seront étudiés post-mortem dans différentes conditions prandiales. L’étude prévoit 300 individus.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les caractéristiques de la PIR cérébrale et donnera des informations nouvelles sur l’intégration cérébrale de l’état métabolique chez l’individu obèse. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
La procédure implique une mise en cage individuelle pendant 3 jours afin de mesurer la prise alimentaire de chaque individu. Afin de synchroniser la prise alimentaire, les animaux seront mis à jeun pendant 2 heures en fin de période de jour durant 3 jours, à la fin du jeûne la nourriture sera mise à disposition ad libitum. A la fin de cette période de synchronisation, les animaux seront à nouveau mis à jeun durant deux heures, puis seront répartis en 3 groupes : préprandial, postprandial soumis pendant 3 heures aux régimes standard ou enrichi en gras.
Impact sur les animaux
L’obésité génétique inhérente aux modèles ob/ob et MC4R KO peut être considérée comme un phénotype dommageable pour ces animaux. En revanche, le phénotype des souris RiboTag n’est pas dommageable. Le projet en lui-même n’entraine pas de nuisances particulières chez ces animaux. Les animaux seront élevés, et étudiés dans des conditions prandiales définies. Excepté l’injection ip d’anesthésique avant la mise à mort, les animaux ne subiront aucune manipulation. Le projet consiste donc en un élevage d’animaux OGM et en la définition de situations prandiales standardisées.
Devenir
Les 300 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever le cerveau et disséquer l’hypothalamus en vue d’analyses moléculaires.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
La procédure décrite (mise en place de conditions prandiales définies) a été optimisée, standardisée et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier les différences significatives entre les groupes expérimentaux (puissance de 80% avec un risque alpha de 5%), ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Dans le détail, les analyses simultanées des groupes expérimentaux seront réalisées par ANOVA et tests de comparaison a posteriori. Pour cela, les conditions d’application des analyses seront vérifiées (nombre d’individus par lot, tests de normalité, test d’égalité des variances). Les tests de comparaison a posteriori (paramétriques ou non paramétriques) seront réalisés selon ces conditions.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées de 10 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.
Étude du vieillissement précoce dans un modèle de lésions cérébrales associées à la prématurité chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
950 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et quelques-unes transférées vers un autre projet, dont 290 dans des procédures classées sévères. Nouveau-nées, elles reçoivent des injections d'une substance pro-inflammatoire deux fois par jour pendant cinq jours, puis selon les groupes une chirurgie du crâne, une perfusion intracardiaque ou l'implantation d'électrodes suivie d'une crise d'épilepsie provoquée, pour étudier un vieillissement cérébral précoce lié à la prématurité. Le porteur indique une surmortalité inférieure à 10 % pendant les injections et des hématomes douloureux, les crises d'épilepsie étant volontairement déclenchées lors des enregistrements. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit les interactions du système nerveux et que le recours à la souris est "nécessaire".
Objectifs
La prématurité est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons de très faible poids de naissance qui survivent au delà de l’enfance est en hausse. Cependant, le cerveau de ces prématurés reste extrêmement vulnérable et peut ainsi présenter des lésions. L’inflammation périnatale que subissent dans 20 à 40% des cas les enfants prématurés et la grande vulnérabilité des cellules cérébrales en développement à ce stress inflammatoire est à l’origine de l’apparition de la plupart de ces lésions. Elles induisent des handicaps moteurs, des déficits cognitifs et des troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte qui sont regroupées sous le terme d' "Encéphalopathie du Prématuré". Certaines cellules cérébrales, appelées cellules gliales, sont les relais majeurs des modifications environnementales dans le cerveau, dont les réponses inflammatoires. Ces cellules résidentes du système nerveux central, analysent de manière continue leur environnement et participent à la stabilisation de ce dernier. On sait aujourd’hui que les mécanismes qui permettent la maturation cérébrale sont les mêmes que ceux qui sont perturbés au cours du vieillissement. Nous cherchons donc à comprendre l’impact de l’inflammation périnatale sur le vieillissement en émettant l'hypothèse que celle-ci peut être à l'origine d'un vieillissement prématuré.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait la caractérisation des conséquences à long terme des lésions cérébrales du prématuré et ainsi la mise en place d'outils de prévention chez les individus concernés. Par ailleurs, si nos hypothèses sont avérées, nous aboutirions à la mise en place d'un modèle de neurodégénérescence chez des souris issues d'un brassage génétique par opposition aux modèles habituellement consanguins, présentant des modifications génétiques ciblées et à 7 mois de vie.
Procédures
Les souriceaux recevront l’injection d’une substance pro inflammatoire 2 fois/ jour pendant 5 jours (animal vigile, moins de 30s par injection). Après ces injections, un premier groupe de souris subira une procédure chirurgicale sous anesthésie générale pour sectionner une partie de la boite crânienne et réaliser ensuite une échographie doppler pour mesurer le débit sanguin (l'ensemble chirurgie et échographie durera une heure maximum). Une perfusion intra-cardiaque sera réalisée sur un 2e groupe à différents stades et sous anesthésie (3 min en moyenne de perfusion). Au sein de ce groupe, certains animaux auront subi un prélèvement sanguin 2 jours avant l'étape de perfusion (sous anesthésie, durée de moins d'1 minute). Une étude comportementale dans un espace défini sera réalisée sur un 3e groupe à différents temps et d’une durée variable en présence d’autres souris ou non. Et enfin sur le 4e groupe, une intervention chirurgicale sous anesthésie d’une durée de 15 à 25 mn, sera réalisée pour implanter des électrodes au niveau du crâne. Le lendemain de l’intervention il sera injecté un produit provoquant une crise d’épilepsie (trouble neurologique provoquant des convulsions) et il sera ensuite procédé à un électroencéphalogramme pendant une heure.
Impact sur les animaux
Les effets des injections de la substance induisant une inflammation sur les souris sont connus et modérés. On rapporte ainsi une surmortalité estimée à moins de 10% lors de la période d'injection ainsi qu'un retard de croissance chez les animaux recevant de la substance pro-inflammatoire. Cette surmortalité est principalement dûe à un éventuel rejet du souriceau par la mère ainsi que dans quelques cas par l'invasivité même de l'injection pouvant occasionner l'apparition d'un hématome douloureux pour l'animal. Ces deux événements indésirables constituent des points limites entrainant l'euthanasie de l'animal. Aucune nuisance particulière n'est attendue au cours du vieillissement des animaux ni n'ont été observé précédemment lors du vieillissement d'animaux de ce modèle. Ainsi, passé la periode d'injection de 5 jours, les effets indésirables classiques : cyanose, perte de poids, troubles respiratoires ne sont pas attendus de même que des crises d'épilepsie spontanées (elles sont induites lors de l'enregistrement à l'encéphalogramme) et constituent donc des points limites. L'étape d'imagerie cérébrale se déroule entièrement sous anesthésie et analgésie. Pendant cette période,aucun effet indésirable particulier n'a été mis en évidence et l'animal est euthanasié dès la fin de l'acquisition, avant réveil. Aucun effet indésirable n'est dès lors attendu lors de cette procédure. Lors de la procédure d'électroencéphalogramme, les animaux subissent la chirurgie d'implantation des électrodes 24h avant l'acquisition des données pendant laquelle ils sont éveillés. Ainsi, pendant cette période de 24h + temps d'analyse, ceux-ci peuvent montrer des signes de gène du fait du dispositif d'électrodes et sont donc étroitement surveillés. L'arrachage du dispositif ou la présence de saignements post-opératoires sont des évènements indésirables rares mais possibles entrainant l'euthanasie de l'animal. Aucune surmortalité du fait du dispositif n'a été observée du fait de cette chirurgie et l'animal est euthanasié dès la fin de l'acquisition. L'acquisition se fait à la suite de l'injection d'une molécule induisant des crises d'épilepsie. Leur survenue est donc attendue.
Devenir
L'euthanasie des animaux en fin des procédures d'échographie cérébrale fonctionnelle et d'électroencéphalogramme répond à une nécessitée d'ordre éthique puisque celles-ci imposent une chirurgie au niveau du crane de l'animal. Par ailleurs, à la fin des autres procédures, les animaux seront euthanasiés et les cerveaux prélevés pour analyses.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication de la neuroinflammation dans le développement d'un vieillissement précoce. Cela suppose des interactions complexes entre types cellulaires bien distincts du système nerveux central : les cellules gliales responsables de l'activité immunitaire et de fonctions de nutrition des neurones d'une part, et les neurones d'autre part. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions complexes in vitro ou dans un système de cellules en culture, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal présentant un système nerveux central fonctionnel dont la structure est proche de celle de l'homme pour reproduire ces interactions complexes.
Réduction
Le nombre d'animaux estimé et les tests statistiques utilisés sont basés sur notre expérience pour ce type d'étude. Ce nombre minimum nous permettra d'être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. L'analyse statistique de nos données peut nécessiter un nombre d'animaux différents selon l'hétérogénéité des résultats attendus de chaque procédure. Pour autant, les tests étant organisés en plusieurs séries, s'il advenait que l'accumulation des résultats montre une différence assez importante pour conclure à un résultat avant la réalisation de toutes les séries d'une expérience, alors, les dernières séries (devenues inutiles) seraient annulées. Quelques animaux de ce projet seront réutilisés dans un autre projet pour approfondir certaines analyses.
Raffinement
Hébèrgement : Les animaux seront hébergés en groupe, en milieu enrichi (sopalin , maisons en pexiglas) pour minimiser leur stress. Suivi quotidien : Pendant la période d'injection les animaux seront remis dans leur nid et on vérifiera quotidiennement que le retour au sein du nid se fait bien. A la fin de l'étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Des grilles de scoring cliniques seront proposées en fonction de l'âge des animaux. Ces grilles définissent des points limites à différents stades. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux sera réalisée par les équipes animalières et le scoring clinique sera effectué tous les jours jusqu'au 10ème jour de vie des animaux, puis 3 fois par semaine jusqu'au jour 21 puis 2 fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude. Si l'un des points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Gestion de la douleur : tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale et un analgésique sera administré après le réveil d’une intervention chirurgicale. Enfin, le transport des animaux est effectué par un transporteur agrée fournissant des cages adaptées ainsi que des géloses nutritives pour les animaux.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre microglie et neurones lors des processus de neurodégénérescence, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition car elle présente un hippocampe (la structure anatomique responsable des processus de mémorisation dans le cerveau et qui est préférentiellement touchée par le vieillissement) dont la circuiterie neuronale est très proche de celle de l'homme. Le modèle d'inflammation périnatale utilisé ici a été développé au sein de notre laboratoire et caractérisé jusqu'à 2 mois de vie des animaux. Notre objectif étant l'étude du vieillissement de l'animal et, notamment, de confronter notre hypothèse d'un vieillissement précoce nous nous intéressons à 3 temps de vie plus tardifs de nos animaux : 7, 12 et 16 mois de vie. Ces temps correspondent, à peu de choses près, respectivement chez l'homme au milieu de vie (40-45 ans), à la fin de phase active (60-65 ans) et à la personne âgée (80 ans).
Elaboration d’un protocole pilote pour alimenter et mesurer le stress de l’exposition nocturne à la lumière artificielle chez le mulet-porc
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
100 mulets-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Capturés en milieu naturel, ils sont exposés sur trois nuits à une lumière artificielle nocturne, puis tués par surdose d'anesthésique pour prélèvement de sang, de muscle et de foie, afin de calibrer un protocole de mesure du stress lié à la pollution lumineuse. Le porteur décrit un stress à la capture et au transport et une perte de poids légère pendant l'acclimatation, sans autre manipulation directe. Il présente l'étude comme pilote, préalable à un dispositif de plus longue durée qui fera l'objet de futures demandes d'autorisation.
Objectifs
Ce projet est une étude pilote destinée à concevoir un protocole d’alimentation et de mesure indirecte du stress chez le mulet-porc, dans le cadre du développement d’un projet expérimental sur un plus long terme. Celui-ci visera à analyser l'effet sur la biodiversité aquatique, d'une forme de stress spécifique aux milieux urbains, à savoir la pollution lumineuse nocturne. Nous avons choisi de réaliser cette étude sur des mulets-porcs juvéniles car il s’agit d’une espèce commune, largement répandue dans les milieux aquatiques urbanisés européens et connue pour se nourrir exclusivement de biofilms (couches de micro-organismes qui se forment sur des surfaces en contact avec l'eau) lorsqu’ils sont juvéniles. Ce comportement alimentaire est recherché car le projet global cherchera à analyser les effets du stress lumineux sur une fonction essentielle au fonctionnement des écosystèmes aquatiques : l’interaction alimentaire plante-poissons. Les poissons seront capturés en milieu naturel par nos soins grâce à des filets spécifiques à la pêche aux civelles donc sans risque de blessure des animaux et transportés dans nos installations. Nous mettrons ensuite à leur disposition des biofilms produits naturellement sur place, et ferons évoluer la lumière de telle façon à simuler les modes d'éclairage urbain les plus répandus. Nous verrons ainsi les effets de cette pollution lumineuse à la fois sur l’alimentation des poissons (quantités ingérées, fréquences des repas) et sur leur niveau de stress. Pour la quantification de celui-ci, de l'eau des aquariums sera régulièrement prélevée et analysée, avant qu'une fois les poissons euthanasiés, on réalise des mesures sur leur sang, muscles et foie. C'est ensuite la recherche de la présence de cortisol dans l'eau et/ou dans le sang qui nous permettra d'évaluer le niveau de stress des poissons exposés aux effets de la lumière. Des prélèvements d’organes et tissus renseigneront en parallèle sur l’évolution de la composition en lipides en fonction du mode d’alimentation, et ce afin d’évaluer l’effet sur l’interaction alimentaire biofilm-poisson.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étude pilote à court terme sont de tester la faisabilité et les paramètres d’un protocole de mesure indirecte du stress du poisson en réponse à un stress lumineux. A moyen terme, l’étude pilote permettra de concevoir un dispositif expérimental réaliste pour étudier les réponses comportementales (en particulier alimentaires) et le stress induit par la pollution lumineuse nocturne chez le mulet-porc. Cette espèce de poisson a été choisie puisqu’elle représente un maillon essentiel au bon fonctionnement des écosystèmes aquatiques soumis à pression urbaine. A long terme, la démarche expérimentale permettra d’apporter des éléments de connaissance scientifique fondamentale robustes sur la réponse de la biodiversité aquatique, et plus généralement du fonctionnement des écosystèmes aquatiques, à divers facteurs de stress urbain. Ils alimenteront des recommandations de gestion des espaces publics urbains, notamment pour ce qui concerne la réduction, la mitigation ou la gestion des effets des éclairages publics sur l'environnement.
Procédures
Les poissons seront capturés en milieu naturel avec des techniques de pêche au filet. Toutes les précautions seront prises pour éviter des blessures aux animaux au cours de cette étape. Ils seront ensuite transportés pendant deux heures dans des sacs de transport adaptés. Les poissons, d’une espèce capable de vivre aussi bien dans l’eau douce que dans l’eau salée, seront ensuite acclimatés à l’eau de l’aquarium, d’une salinité plus basse que celle des milieux de capture, par le respect de seuils d’acclimatation progressifs accompagnés d’observations comportementales continues. Ils resteront ensuite en quarantaine sanitaire pendant 21 jours. Puis, ils seront alimentés avec un aliment naturel, le biofilm (la couche de micro-organismes qui se forme sur des surfaces en contact avec l'eau), dont l’appétence en condition de captivité sera testée. Si ce biofilm venait à être négligé, des granulés commerciaux le remplaceront. Certains poissons seront ensuite soumis à un stress lumineux nocturne d’une durée au total courte (3*12 h maximum d’exposition nocturne). L’ensemble des poissons destinés à l’expérimentation sera euthanasié à diverses étapes pour les besoins des prélèvements indispensables à l’interprétation des résultats : prises de sang pour y mesurer le cortisol qui sera comparé aux mesures réalisées dans l’eau, extraction de muscles et de foie pour analyse des profils en lipides. Ces profils illustrent pertinemment le rôle des plantes dans le fonctionnement des réseaux alimentaires de l’écosystème.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à un stress lors de leur capture et pendant leur transport, qui durera environ deux heures, ainsi que lors du transfert dans l’aquarium. Au cours de la procédure visant à habituer les poissons à se nourrir en captivité de biofilms, une perte de poids des animaux, légère mais sans conséquences sur leur bien-être, est possible. Ensuite, au cours de la procédure destinée à tester un protocole de mesure indirecte du stress, certains individus seront exposés aux effets d'une lumière nocturne, d’intensité légère, pendant 3 nuits, c'est à dire durant 36 heures non consécutives. C’est l’effet de ce stress, mimant une exposition à la pollution lumineuse nocturne, qui est recherché. Les effets attendus sont d’ordre comportemental (mobilité accrue, frénésie alimentaire, stress modéré), et d’ordre physiologique (accumulation de cortisol dans le sang et excrétion de cortisol dans l’eau du milieu). En dehors de ces nuisances légères, aucune manipulation directe n’est prévue sur les animaux. Tous seront néanmoins euthanasiés (selon le mode réglementaire, c’est-à-dire qu’une fois que les poissons auront été anesthésiés par balnéation, une augmentation de la quantité du produit anesthésique dans l’eau produira leur euthanasie) en fin d’expérimentation pour les besoins de prélèvements de sang, muscle et foie nécessaires à l’interprétation des résultats.
Devenir
Les 100 poissons impliqués sont euthanasiés. 10 le sont dès le début du projet, servant ainsi de « témoins », 20 à 30 autres le sont à la fin de la période d’alimentation par le biofilm ou les granulés, ceci pour la détermination du profil lipidique. Enfin, 60 seront euthanasiés après l’exposition à la lumière. Ces euthanasies sont justifiées par le besoins de prélèvements destinés à recueillir les paramètres indispensables aux résultats de l’étude pilote déployée dans le cadre de l‘élaboration d’un dispositif multiannuel. Celui-ci fera l’objet de futurs dépôts de demandes d’autorisation d’expérimenter au fur et à mesure de l’avancée du projet.
Remplacement
Les finalités de l’expérimentation pilote sont de juger de la faisabilité et du calibrage d'un protocole d’alimentation et de mesure du cortisol excrété par des animaux vivants dans l’eau du milieu suite à une exposition à un stress léger. L’expression du stress et les réponses comportementales complexes attendues ne peuvent pas être abordées par l’usage d’un modèle de remplacement simplifié (par exemple, des cultures cellulaires) en l’état actuel des connaissances. De plus, le choix d’une espèce sauvage très répandue dans les écosystèmes aquatiques urbanisés d’Europe, plutôt que d’un modèle biologique expérimental plus standardisé (poissons zèbres ou medaka par exemple) permettra d’optimiser les résultats du projet à large échelle.
Réduction
Le nombre d’animaux intégrés à l’étude pilote est limité au strict minimum requis pour une analyse statistique fiable de l’effet de l’exposition lumineuse sur le comportement alimentaire des animaux. L’expérimentation est constituée de 3 procédures qui s’enchainent sur tout ou partie des mêmes animaux afin d’optimiser leur usage. Ce nombre de 100 inclut un total de 10 surnuméraires capturés pour pallier une mortalité potentielle pendant la capture, le transport et l’acclimatation aux conditions d’hébergement (soit une mortalité estimée à environ 10%).
Raffinement
En dehors des étapes de capture, transport et transfert, les poissons ne seront jamais manipulés. Une fois pêchés, les poissons seront placés dans des viviers de dimensions adaptées à leur nombre et à leur taille, puis placés délicatement dans des sacs de transport gonflés aux 2/3 à l'oxygène pur et hermétiquement fermés. Ces sacs seront déposés dans un contenant assurant leur stabilité pendant le transport jusqu'au site expérimental. Une fois les poissons sur place, des seuils progressifs d'acclimatation leur permettront de s'habituer à l'eau de leur aquarium. Par ailleurs, le seul transfert qui sera réalisé ensuite sera celui du lot de 60 poissons destinés à l’exposition lumineuse ; il sera effectué à l'aide d'épuisettes à mailles fines, entre le bac de quarantaine où auront été accueillis les poissons dès leur arrivée sur site, vers les aquariums où se dérouleront les expositions lumineuses. Les poissons seront nourris pendant l'expérimentation. La qualité, la quantité et la fréquence de l’alimentation seront ajustées en fonction des observations réalisées in situ. Au moins une fois par jour, des animaliers formés de longue date viendront contrôler visuellement l’état des poissons. Des mesures continues des différents paramètres de l’eau (température, pH, …) ainsi que des mesures ponctuelles des produits azotés, garantes de la qualité de l'eau, permettront de maintenir des conditions environnementales optimales tout au long de l’expérimentation. Les bassins seront dimensionnés pour offrir un espace de mobilité confortable aux animaux (bassins de 30 L pour des individus de 8±2 cm de longueur totale). Les poissons ne seront jamais isolés mais placés en groupes de minimum 5 à maximum 100 individus selon les étapes. Toutes les étapes expérimentales auront lieu dans une même salle dédiée afin que les poissons s’habituent à un environnement visuel et sonore unique et constant. Enfin, les aquariums seront nus car un abri serait de peu d’intérêt pour le mulet-porc qui est une espèce mobile se déplaçant dans la colonne d’eau en dehors des activités alimentaires qu'il mène sur le fond. La présence d’une cache pourrait par ailleurs nuire à l’interprétation des résultats. Cependant, une des parois de chaque aquarium sera munie d’un décor mimant un décor de rivière afin potentiellement d’améliorer le confort des animaux.
Choix des espèces
Le mulet-porc est une des rares espèces de poissons connues pour se nourrir de biofilms au stade juvénile, ce comportement alimentaire spécifique étant essentiel pour atteindre les objectifs de long terme envisagés dans le projet global supportant l’étude pilote. Ces objectifs viseront au développement d’une démarche expérimentale multiannuelle intégrant différents représentants de la biodiversité aquatique (poissons et plantes d’espèces diverses). De plus, la capture de mulets-porcs en milieu saumâtre puis leur placement en milieu dulcicole pour l’expérimentation sont possibles puisqu’il s’agit d’une espèce dont le cycle de vie se déroule à la fois en eau salée et en eau douce. Le mulet-porc est par ailleurs largement répandu dans les milieux aquatiques urbanisés mondiaux dont l’étude est ciblée par le projet global, ce qui permettra d’optimiser la portée des résultats dans un contexte international. C’est aussi l’espèce la plus abondante dans les zones où les captures sont envisagées : ainsi, l’impact de celles-ci sur les ressources naturelles sera minimisé. Les poissons impliqués seront des juvéniles de 8±2 cm de longueur totale. Cette taille est en effet celle à laquelle les mulets-porcs sont décrits comme consommateurs exclusifs de biofilms en milieu naturel. Le fait de choisir des juvéniles limitera aussi les effets potentiels des captures sur les ressources naturelles. Enfin, des poissons de petite taille sont recherchés afin d’optimiser le compromis entre confort des animaux et conditions optimales pour la fiabilité des mesures du cortisol dans l'eau.
Infections nosocomiales : Détermination du profil de biodistribution de nouveaux candidats antibactériens et évaluation de leurs efficacités
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
288 souris en gravité légère et 1 050 en gravité modérée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Immunodéprimées, elles sont infectées par des bactéries responsables d'infections urinaires et pulmonaires, puis tuées par exsanguination de l'aorte abdominale pour prélèvement d'organes, afin de tester de nouveaux candidats antibactériens. Le porteur décrit pourtant une infection pouvant être sévère, avec perte de poids, difficultés respiratoires et hypothermie. Il affirme qu'en l'absence de modèle in vitro reproduisant l'interaction entre pathogène et système immunitaire, le recours au modèle animal s'impose.
Objectifs
L’objectif est d’évaluer dans un modèle murin l’efficacité de nouveaux candidats antibactériens vis-à-vis des pathogènes majeurs responsables des infections nosocomiales
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont : (1) Mise au point/caractérisation d’un modèle de d’infection bactérienne mimant les infections cliniques majeures (Infections urinaires et infections pulmonaires) induites respectivement par E coli et P aeruginosa (2) Evaluer la biodistribution et l’efficacité des nouveaux candidats antibactériens, (3) Etablir Un suivi longitudinal aux moyens des systèmes d’imagerie du petit animal sera mis en place. Les résultats de cette étude pourraient être ainsi prédictifs de l’approche thérapeutique à déployer chez les patients.
Procédures
(1) Prélèvements réalisés sur animaux vigiles a. Urines : 1 seule fois par animal (point terminal) (1-2 min) (2) Prélèvements réalisés sur animaux sous anesthésies : a. Prélèvements sanguins : 1 seule fois par animal (point terminal) ; ils seront réalisés par exsanguination, en ponctionnant l’aorte abdominale. Pour cela, les souris auront préalablement une (i) anesthésie générale par exposition à l’isolflurane (5% dans 95% d’O2) et (ii) une anesthésie locale administrée par voie SC al (Lidocaine) (5-7min).
Impact sur les animaux
Les infections bactériennes des souris immunodéprimées peuvent entrainer une infection sévère entrainant une perte de poids potentielle, des difficultés respiratoires (dyspnée), problème de miction (dysurie, hématurie) ou une baisse de la température corporelle (hypothermie).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements d’organes sont nécessaires.
Remplacement
L’absence de modèles in vitro relevant permettant de reproduire la majorité des interactions entre agent pathogène et/ou agent antimicrobien et système immunitaire (réponse inflammatoire) nous oriente vers l’utilisation de modèles animaux
Réduction
L’évaluation du nombre minimal d’animaux à inclure pour pouvoir observer l’effet escompté a été déterminé avec des tests statistiques pour petits échantillons a été déterminé en collaboration avec des biostatisticiens en utilisant ANOVA test. Par ailleurs, l’utilisation de l’imagerie permettra de réduire le nombre de souris, chaque animal étant son propre contrôle
Raffinement
Afin de prendre en compte la souffrance des animaux, un suivi par imagerie ainsi qu’un suivi clinique seront mis en place, basé sur des observations quotidiennes des souris. Un score clinique sera établi en fonction de différents critères (apparence générale, posture, activité, poids…). Des scores seront définis pour les points limites pour mettre à mort les souris immédiatement dès qu’ils sont atteints.
Choix des espèces
Dans la recherche préclinique, les modèles murins permettent d’intégrer un grand nombre des caractéristiques de la pathologie humaine. Par ailleurs, l’ensemble des technologies d’imagerie pré-clinique est conçu pour des rongeurs de petite taille, principalement des souris Des souris adultes (8 à 12 semaines), femelles, immunodéprimées chimiquement (pour mimer l’état d’immunodépression des personnes ayant contractées des infections nosocomiales, seront utilisées pour ce projet