Procédures légères

125 chatons vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prises de sang, jusqu'à 4 ml par prélèvement, et des collectes d'urine, pour évaluer l'appétence et la tolérance digestive d'aliments industriels destinés aux chatons en croissance. Le porteur affirme que le protocole n'entraîne "ni douleur, ni souffrance" et que le stress des prises de sang est minimisé, l'objectif restant la formulation de produits commerciaux. Il indique qu'aucun modèle ne peut prédire l'appétence d'un aliment complet chez le chat, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à l'essai sur les animaux.

Objectifs

Pour évaluer la bonne prise alimentaire et la tolérance des aliments destinés aux chatons, il est nécessaire de procéder à des évaluations. Pour être complets, ces tests doivent comprendre le suivi clinique, pondéral et alimentaire des animaux, ainsi qu’une évaluation de la tolérance digestive, des mesures d'odeur de selles, des analyses d'urines et des paramètres sanguins.

Bénéfices attendus

Connaissances sur les besoins nutritionnels et le comportement alimentaire des chatons en croissance. Formulation de produits au plus près des besoin des chatons pour leur garantir une appétence et une tolérance digestive optimales. Identification de nouvelles solutions nutritionnelles.

Procédures

La recolte d'urine et prise de sang seront fait avec les animaux vigiles. Une analyse de la biochimie sanguine au maximum une fois par seamine et par animal. Les paramètres pour les prises de sang incluent les mesures de la fonction rénale et hépatiques (urée, créatinine, phosphatase alcaline, albumine, gamma glutamyl transférase, glutamate-pyruvate transaminase, protéine totale, cholestérol, globuline, et bilirubine totale). L’hématologie incluera la numération des hématies et le dosage de l’hémoglobine, numération des globules blancs et plaquettes. Une analyse d’urines (couleur, turbidité, pH, protéine totale, glucose, cétones, bilirubine et sang, densité spécifique et sédiment) pourra être réalisée à la discrétion du vétérinaire. La collection d’urine se fera par collecte libre (free-catch). Lors de prises de sang, le volume minimum nécessaire (comme spécifié par les laboratoires d’analyses) pour analyse les marqueurs sera prélevé : 4ml/prise (sans exceder 15 % du volume sanguin sur une période de 28 jours). La collection d’urines devra prélever 5ml. La prise de sang sera fait par un vétérinaire et si l’animal ne se débat pas: -sur la phase de prélèvement uniquement : 15 secondes (maximum 30 secondes) -En incluant la phase de contention, de tonte, de désinfection et de prélèvement 2 minutes maximum

Impact sur les animaux

Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. Le stress éventuel lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie et recevront un suivi vétérinaire et des soins adaptés à leur état de santé.

Remplacement

Le protocole et les procédures utilisés sont conformes aux standards AAFCO et suivent le processus normal d’évaluation des projets R&D. De plus, aucune autre étude ne peut être utilisée comme alternative à celle actuellement en place. Le protocole a pour objectif d'évaluer l'appétence et la tolérance digestive d'aliments destinés aux chatons en croissance. A ce jour, il n’existe pas de modèle qui puisse approcher la digestion, absorption et métabolisation d’un aliment complet dans cette espèce. Il est donc nécessaire de passer par des essais in vivo au cours desquels les chats reçoivent la formulation d’aliment à évaluer.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus pour chaque étude est issu de la recommandation américaine lors de la réalisation d’un protocole dit AAFCO utilisé par l’intégralité de la profession, soit 1 lot de 10 chatons issus au minimum de 3 différentes mères. 10 chatons inclus au début de l’étude pour avoir au moins 8 retenus à la fin.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. L'état d'anxiété lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.

Choix des espèces

Chaque espèce animale possède son propre métabolisme, ses propres performances digestives , ainsi que ses propres préférences alimentaires et facteurs d’appétence pour un aliment donné. Il est donc important d’utiliser les espèces auxquelles les aliments sont destinés. Il n’existe pas à ce jour de modèle qui puisse approcher la tolérance digestive ainsi que de prédire l’appétence d’un aliment complet chez le chat. Il faut donc passer par des essais in vivo au cours desquels les chatons reçoivent la formulation de l’aliment à évaluer. Des études in vitro n’apporteraient aucune information pertinente. Les chatons seront âgés de 3 à 12 mois pour évaluer les besoins nutritionnels en croissance. Indépendemment de l'âge, les chatons devront peser plus de 500g pour être inclus dans ce projet.

1 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune anesthésiée pour neuf séances d'imagerie optique après une dose unique de vésicules extracellulaires, injectée ou administrée par gavage, puis tuée pour une étude post-mortem. Ces vésicules n'ont été testées qu'in vitro, et le porteur ne peut exclure ni une toxicité ni des crampes abdominales, des rougeurs, des ulcérations ou une fausse route lors du gavage. Il présente le projet comme "la première étape" d'un futur traitement des fistules digestives et de l'inflammation intestinale, l'efficacité des vésicules étant renvoyée à des travaux ultérieurs. Pour l'effectif, il évoque seulement "des groupes pertinents composés d'un nombre d'animaux suffisant pour arriver à une conclusion claire", sans calcul ni taille de groupe.

Objectifs

Les vésicules extracellulaires, particules sécrétées par les cellules, agissent comme des messagers intercellulaire en libérant leur contenu dans la cellule cible. Cette capacité fait d’elles une nouvelle voie thérapeutique importante. Les vésicules extracellulaires sont donc présentes dans le corps humain. Ainsi le risque qu'elles entraînent une réaction immunitaire est faible, ce qui facilite leur application en médecine humaine en comparaison de la thérapie cellulaire et génique. Elles offrent ainsi de nouvelles perspectives d’application dans les champs du diagnostic et de la thérapie. Avant d’évaluer leur propriétés anti-inflammatoire et régénérative dans un contexte pathologique de maladies digestives, il est indispensable de déterminer la biodistribution, la cinétique, l’élimination, et la tolérance de ces vésicules. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer dans un organisme vivant l'ensemble de ces paramètres.

Bénéfices attendus

Ce projet est la première étape du développement d’un nouveau traitement des fistules digestives et de l'inflammation gastro-intestinale améliorant la prise en charge et la qualité de vie des patients. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes d’intégration des vésicules extracellulaires et d’avoir les premiers éléments permettant par la suite d’évaluer leur propriétés anti-inflammatoires et régénératives ainsi que leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sur animaux vigiles ou geste chirurgical n'est prévu dans ce projet. Les animaux recevront une dose unique de substance par injection ou gavage sur une durée de deux minutes maximum. Par la suite, chaque animal sera examiné par imagerie optique à 9 intervalles de temps différents après l’injection, dont la durée est environ de 5 minutes chacun. L'imagerie sera réalisée sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Cette étude sera menée en imagerie optique, non invasive et non irradiante, sous anesthésie. Cette technique n’induit aucun douleur ou effet indésirable. Les produits administrés ont été testés et validés in-vitro mais ce sera la première étude menée in-vivo. De ce fait, on ne peut exclure ni une toxicité ni des effets indésirables potentiels liés à l’injection : crampes abdominales, rougeur, ulcération, ou fausse route dans le cas du gavage.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de procéder à une étude post-mortem.

Remplacement

Une étude in vitro ne peut se substituer à l’étude in vivo, afin de visualiser la biodistribution des vésicules extracellulaires dans un organisme entier. Des tests in vitro ont été réalisés au préalable, afin d'optimiser la formulation et choisir la plus stable ainsi que pour optimiser certains paramètres d’imagerie.

Réduction

Nous avons fait le choix d’utiliser une technique d’imagerie, non-invasive et non irradiante, permettant le suivi longitudinal et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents composés d’un nombre d’animaux suffisant pour arriver à une conclusion claire. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

L’environnement des animaux est enrichi pour favoriser le bien-être, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort (gel ophtalmique) sont appliquées. Les animaux sont observés quotidiennement. L’imagerie optique, méthode d’exploration choisi pour notre étude, est reconnue pour n’induire ni douleur ni effets secondaires néfastes.

Choix des espèces

La souris est une espèce communément utilisée pour les études d’imagerie optique du fait de leur petite taille, et représente un modèle pertinent pour évaluer au mieux la biodistribution. L'étude de la biodistribution sera ainsi réalisée sur des souris âgées de 8 semaines, afin de travailler avec des animaux possédant un système immunitaire et un système digestif matures. Cette espèce sera également utilisée dans les études ultérieures car favorable au développement de modèle de maladie inflammatoire de l’intestin.

700 bars européens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés pendant deux mois au triphényl phosphate, un plastifiant suspecté d'agir comme perturbateur endocrinien, à concentration environnementale, puis maintenus neuf mois avant d'être tués pour prélèvement d'organes et de tissus. Le porteur décrit un suivi par grille de score, un individu à la nage désordonnée étant mis à mort au point limite, et ne prévoit pas d'intervention sur animal vigile ou anesthésié en dehors de cette fin. Il affirme que les approches in vitro ou in silico ne permettent pas d'évaluer l'impact du produit sur un "organisme entier", ce qui justifierait selon lui le passage par le poisson vivant.

Objectifs

L'immunité est une fonction majeure impliquée dans les défenses contre les agents pathogènes. Chez les vertébrés à mâchoire, les lymphocytes T ont la particularité de se développer dans le thymus lui-même sujet à des variations de taille suivant l'âge ou les taux plasmatiques des hormones sexuelles. Ces variations ont été associée à une altération de l'abondance des sous-types de lymphocytes T périphériques, une diminution de la réponse immunitaire adaptative, une augmentation de l'incidence des maladies infectieuses et une augmentation de la tolérance immunitaire (grossesse). Nous avons montré que les effets des estrogènes sur le thymus et les lymphocytes T étaient conservés entre le bar et les mammifères et que l’exposition à de l’estradiol (E2) modulait chez le bar la plasticité thymique et augmentait sa tolérance immunitaire. Chez le poisson, le thymus subit une involution hivernale puis une reformation en été qui semble avoir lieu chez des juvéniles de l'année mais également des individus matures avec chez ces derniers une involution plus marquée ainsi qu'un dimorphisme sexuel. En plus des hormones sexuelles, celles du métabolisme semblent également être des éléments de premier ordre dans ce phénomène. Ces dernières ont un rôle dans la gestion des réserves énergétiques ou le métabolisme en général, mais également dans la régulation de la reproduction. Ainsi, les fonctions de reproduction, d’immunité et de métabolisme sont étroitement liée. Au sein de ce projet, nous testerons dans un premier temps (1) l’hypothèse selon laquelle l'involution thymique serait influencée par les hormones stéroïdes résultant d’un compromis énergétique (trade-off) entre immunité et reproduction. L’action des perturbateurs endocriniens à activité estrogénique (PEE) sur les téléostéens est bien documentée (reproduction, croissance, immunité…) mais rares sont les études analysant les impacts sur plusieurs fonctions physiologiques à la fois. Le triphényl phosphate (TPP), détecté dans les eaux de surface de nombreux pays, est un plastifiant suspecté PEE, connu pour affecter la reproduction, l’immunité et le métabolisme. Ainsi, dans un second temps, (2) nous évaluerons l’impact du TPP sur ce trade-off établi entre ces trois grandes fonctions.

Bénéfices attendus

- Chez les poissons téléostéens, les connaissances concernant la régulation endocrinienne et environnementale (incluant la contamination environnementale) de la reproduction et de l’immunité par les hormones du métabolisme sont quasiment inexistantes. Or il s’avère que la compréhension de ces mécanismes est à la base de cette demande. Les mécanismes étant très conservés chez les vertébrés, les résultats permettront par ailleurs de mieux comprendre le lien existant entre certaines pathologies humaines métaboliques, l’immunité et la reproduction. - L’étude de l’action du TPP sur un équilibre affectant plusieurs fonctions physiologiques permet une vision plus intégrative et de mieux appréhender les risques environnementaux et sanitaires associés à la présence de ce contaminant largement utilisé dans les produits de la vie quotidienne. Nous pourrons faire une évaluation intégrative de la santé des individus de poissons mais aussi plus largement des populations. - Ce travail aidera, par extrapolation, à élucider l’impact du TPP dans certaines pathologies humaines métaboliques, mais aussi sur l’immunité et la reproduction qui, chez les sujets obèses, sont moins performantes.

Procédures

Les animaux seront exposés à un contaminant à concentration environnementale pendant 2 mois, puis maintenus en condition non contaminée pendant 9 mois (température, luminosité, pH contrôlés). Aucune intervention sur animal vigile ou endormi. Chaque individu sera euthanasié pour prélévement d'organes et tissus.

Impact sur les animaux

Le projet est divisé en deux périodes. Durant la première, les poissons seront maintenus en conditions contrôlées mimant une évolution naturelle des saisons. Durant la seconde, les individus seront exposés à un contaminant à concentration environnementale pendant 2 mois, puis maintenus en condition non contaminée pendant 9 mois (identique à la première période). Un période d'acclimatation de 7 jours sera respectée afin de permettre leur habituation et une meilleure gestion du stress. Des contrôles quotidiens seront effectués afin de s'assurer du bien-être des poissons et du respect des conditions d'hébergement (température, pH, luminosité...). Dans le but de réduire au maximum la douleur, l’angoisse et la souffrance des animaux nous utiliserons durant toute l’expérimentation la grille de score de la Fraunhofer institute. Un animal qui présenterait une nage sur le dos avec des mouvements non coordonnés, nage erratique serait immédiatement euthanasié (point limite) après anesthésie (MS222).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement d'organes et tissus.

Remplacement

Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de ce PEE sur un organisme entier. Afin de comprendre l’impact de ce TPP sur la physiologie du poisson, nous devons obligatoirement passer par un modèle vivant. Cependant, toutes les études préalables de définition de concentrations utiles ont été réalisées par une approche in vitro.

Réduction

- Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux, nous avons calculé l’effectif nécessaire pour pouvoir détecter un effet significatif s’il existe réellement. Pour cela, il est nécessaire de décrire plusieurs paramètres : la puissance statistique souhaitée (habituellement 90%), delta (différence de moyenne attendue), sd (écart-type attendu des données), le risque alpha (habituellement 5%). Les paramètres delta et sd ont été obtenus à partir d’expérimentations précédentes sur des bars matures mâles et femelles. Résultat : - Les concentrations utilisées sont en cours de détermination grâce à des tests in vitro. Ces derniers permettront de cibler les concentrations intéressantes afin de limiter le nombre de conditions et donc d’organismes utilisés. - Plusieurs mesures biologiques et chimiques sur chaque individu

Raffinement

Dans le but de réduire au maximum la douleur, l’angoisse et la souffrance des animaux nous utiliserons durant toute l’expérimentation la grille de score de la Fraunhofer institute qui est un bon guide pour la prise de décision quant à la souffrance animale. Un animal qui présenterait une nage sur le dos avec des mouvements non coordonnés, nage erratique serait immédiatement euthanasié (point limite). Nous souhaitons qu’à la base de cette grille de score nous restions avec des animaux qui sont en code couleur vert.

Choix des espèces

Le bar Européen constitue une espèce à fort intérêt écologique et économique et, du fait de sa production aquacole importante, son système immunitaire et reproductif font l'objet de nombreux articles scientifiques. De plus, suivant nos recherches, chez le bar, le thymus et les lymphocytes T font l'objet d'une régulation fine par les composés oestrogéniques, ce qui suggère que l'immunocompétence du bar pourrait être impactée par des perturbateurs endocriniens oestrogéniques présents dans son environnement. Cette espèce constitue donc un modèle de choix pour notre étude. Ce poisson est par ailleurs soumis à des restrictions croissantes de pêche en Europe de l’Ouest (850/98/EU ; 2018/120/UE) car les stocks de celui-ci sont actuellement en déclin et cela ne résulte probablement pas uniquement d’une activité de surpêche. Les individus seront pris à un âge où ils sont encore sexuellement immatures mais immunitairement matures (dès 180 dph, cohortes 1b et 2b) et matures à la fois sexuellement et immunitairement (dès 450 dph, cohorte 1a et 2a). Nous sommes intéressés par l’étude des étapes clés correspondant au basculement d’une immunité « entière » à une immunité moins complexe et en fonction de la saison et de la mise en place d’une stratégie de reproduction. Chez les bars, en termes de reproduction, les mâles développent leurs gonades dès 310 dph et les femelles en condition contrôlée dès 240 dph. Pour ce qui attrait à l’immunité, les bars sont matures dès 180 dph.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des gavages de tamoxifène et des injections de cellules et de fingolimod, quelques-unes une prise de sang, avant mise à mort pour la recherche fondamentale. Le porteur étudie l'entrée et la sortie des lymphocytes dans le ganglion lymphatique et le rôle de deux récepteurs, avec des retombées cliniques présentées comme à moyen terme. Il affirme qu'il n'est "pas possible" de remplacer les animaux, ces mécanismes n'étant pas reproductibles de façon fiable en culture cellulaire.

Objectifs

Les cellules immunitaires circulantes, comme les lymphocytes B ou T, circulent à travers des organes lymphatiques en franchissant les portes d’entrée et de sortie qui sont gardées par les cellules endothéliales lymphatiques. C’est uniquement à l’intérieur de ces organes que les lymphocytes sont activés pour lutter contre des pathogènes ou le cancer. L’objectif du projet est de mieux comprendre les mécanismes d’ouverture et de fermeture des portes en analysant la fonction de deux molécules appelées RANK et LTbR. Ce sont des récepteurs qui activent la cellule endothéliale et qui sont déjà connus pour leur fonction dans le développement des organes lymphatiques.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est utilisé en clinique, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’autoimmunité, l’infection et le cancer.

Procédures

Deux gavages (durée 2 minutes) sont réalisés sur animal vigile, 2 ou 3 injections (durée 1 minute chacune) sont réalisées sur animal anesthésié pendant une période qui varie entre 7 jours et 3 semaines. Sur quelques animaux anesthésiés une prise de sang et effectuée (durée 2-3 minutes).

Impact sur les animaux

Le gavage au tamoxifène dans l’huile de colza, l’injection de cellules et du fingolimod dans la cavité abdominale et le prélèvement sanguin nécessite une contention source d’inconfort pour l’animal pendant quelques secondes. Les injections de cellules par voie intraveineuse, intradermique et souscutanée se font sous anesthésie générale gazeuse, ce qui nécessite également une contention de courte durée. Aucun geste n’est répétitif. Il n’y pas de phénotypes dommageable des modifications génétiques. Les produits administrés n’ont pas un effet de nuisance (irritation, douleurs autres, changement de comportement.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet à des fins de recherche fondamentale.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant l’entrée des cellules immunitaires dans le ganglion lymphatique et leur sortie sont complexes et ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Nous avons identifié des données dans la littérature scientifique (par exemple la quantité des produits à administrer) permettent une meilleure réussite de l’expérience et ainsi de réduire le nombre de souris. Les sites d’injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car leur drainage se fait de façon quasi exclusive par les ganglions lymphatiques précisément identifiés. Les données entre les différents groupes sont analysées par la méthode statistique adaptés.

Raffinement

Les animaux adultes sont habitués à la contention ce qui contribue à réduire le stress lié aux gavages et aux injections dans la cavité abdominales des gestes réalisés sur animal vigil. Les injections intraveineuses, intradermiques et sous-cutanées et le prélèvement sanguin sur animal âgé d’en mois 2 semaines sont effectuées sur l’animal endormi par une anesthésie gazeuse et placé sur une plaque chauffante thermostatée pour assurer le maitien de sa température corporelle tout au long de la procédure. . L’injection intraveineuse est suivie par un analgésique local, appliqué sur l’œil, pour limiter la souffrance suite au réveil de l’animal. Un temps de récupération de l’animal entre les gestes réalisés sur l’animal est accordé (minimum 18h). Le bien-être de l’animal est évaluée par un personnel expérimenté, prenant en compte une surveillance des lieux de d’injection, le poids, l’apparence, le comportement, hydratation, respiration et l’aspect des fèces. Les critères sont notés. Lorsque qu’une anomalie est observée l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. A l’aggravation, la structure en charge du Bien-Être des Animaux est contacté et des mesures conseillées appliquées. Des points limites spécifiques ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les souris seront hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. L’hébergement bénéficie d’un enrichissement des cages : tunnel et abris, matériel de nidification et buches à ranger. Les souriceaux sont rapidement retournés à la mère après gavage.

Choix des espèces

La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques chez l’homme et la souris. Il existe des moyens chez la souris d’invalider des gènes de manière spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques ce qui permet d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires régulant l’entrée et la sortie les lymphocytes du ganglion lymphatique. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) afin de garantir un système immunitaire mature. Des nouveaux nées seront également utilisées, puisque le développement du ganglion lymphatique est lié à l’entrée et la sortie des lymphocytes ce qui apportera des connaissances sur organisation de l’organe.

Déjà utilisés dans un projet de niveau modéré sur la menstruation humaine, un ouistiti commun et un singe écureuil subissent une injection dans chaque œil sous anesthésie, une intervention de deux heures. Ces 2 primates sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis tués sept jours après les injections pour prélever leurs yeux, leur chiasma optique et leur cerveau. Le porteur reconnaît qu'une douleur peut accompagner l'injection oculaire et cite l'inflammation, l'infection et l'ulcération de la cornée parmi les complications possibles, pour une étude "pilote" sur l'évolution de la vision binoculaire. Il affirme qu'il est "impossible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants par des méthodes alternatives", et présente le primate non-humain comme "le plus prédictif et le plus pertinent".

Objectifs

La perception visuelle de la profondeur est possible par le chevauchement de ce qui est perçu par l’œil gauche et l’œil droit. Cette visualisation de la profondeur est rendue possible par la position frontale des yeux au niveau de la tête. Les neurones ganglionnaires situés dans la rétine et recevant les informations visuelles se projettent des deux côtés (hémisphères droit et gauche) du cerveau vers les noyaux visuels dont la zone du thalamus (corps genouillé latéral) qui joue un rôle de relais et est connecté au cortex visuel primaire (zone située à l’arrière du cerveau dans le lobe occipital). Ces projections entre la rétine et le thalamus se retrouvent chez la plupart des vertébrés. Cependant, la proportion des projections qui sont connectées au même côté du cerveau est très minoritaire chez les rongeurs (2-3%) tandis qu’elles représentent une part importante chez les primates (40%). Certaines études portant sur la latéralité des projections visuelles chez le primate présentent des résultats contradictoires sur la présence des projections visuelles bilatérales notamment chez le singe écureuil et leur présence semble éphémère chez le ouistiti. Les différences observées montrent les difficultés de mettre en évidence la présence ou non de ces projections chez le singe écureuil et le ouistiti commun. Ces deux espèces montrent des caractéristiques cérébrales intermédiaires, entre le macaque et le rongeur, ce qui en fait des modèles très importants pour étudier l’évolution de l’apparition de la vision binoculaire par l’intermédiaire de l’existence des projections visuelles bilatérales. Ce projet est une étude préliminaire afin de caractériser les connections permettant la stabilisation de l’image et la coordination des mouvements de la tête et des yeux ainsi que les connections impliquées dans la perception visuelle consciente chez les primates originaires d’Amérique (par exemple : singe écureuil et ouistiti commun) en comparaison avec ceux originaires d’Afrique et d’Asie (par exemple : macaque).

Bénéfices attendus

Savoir comment les neurones ganglionnaires se projettent de la rétine aux centres visuels cérébraux, dont le thalamus, nous permettrait de mieux comprendre l’organisation de la vision binoculaire des primates et de mieux comprendre son évolution chez les vertébrés.

Procédures

Pour chaque individu, deux injections intraoculaires (1 pour chaque œil) seront réalisées sous anesthésie. La durée de l’intervention est estimée à 2h par individu. Les animaux seront ensuite euthanasiés, 7 jours après les injections. La durée de l’intervention est estimée à 30 minutes par individu.

Impact sur les animaux

L’ensemble des injections sera réalisé sous anesthésie. Lors de l’anesthésie, les animaux pourraient présenter une instabilité de leurs constantes physiologiques (rythmes cardiaque et respiratoire…). Une douleur peut être induite lors de l’injection oculaire. Même si rarement, plusieurs complications post-injection peuvent survenir avec des degrés de gravités différents (inflammation de la cornée, infection, ulcération de la cornée, dégradation transitoire de la vision).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés 7 jours après l’injection dans les deux yeux afin de récupérer leurs yeux, le chiasma optique (zone dans le cerveau où les nerfs optiques provenant de l’œil gauche et de l’œil droit se croisent) et le cerveau pour des analyses post mortem.

Remplacement

Ce projet a pour objectifs de comprendre et de manipuler l’organisation des connexions entre l'oeil et les zones cérébrales impliquées dans la vision chez le singe écureuil et le ouistiti commun afin d’améliorer nos connaissances sur l’organisation de la vision binoculaire chez les vertébrés. Les processus impliqués dans le développement de la vision binoculaire sont complexes et mettent en jeu de multiples interactions cellulaires entre deux zones éloignées du cerveau. Cette complexité rend difficile/impossible à l’heure actuelle, la modélisation des processus et nécessite des systèmes intégrés. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives. Ainsi, le modèle animal et en particulier l’utilisation du primate non-humain est donc le plus prédictif et le plus pertinent pour espérer une transposition à l’homme la plus fiable possible.

Réduction

Pour cette étude pilote, nous utiliserons un seul individu par espèce. Les individus utilisés sont des individus non naïfs qui ont participé à un autre projet scientifique classé comme modéré portant sur la menstruation humaine.

Raffinement

Les animaux seront manipulés seulement à deux moments, lors de l’injection oculaire puis lors de l’euthanasie pour le prélèvement des organes. En dehors de ce deux procédures les animaux évolueront dans leurs groupes sociaux respectifs. Toutes les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Les deux manipulations se feront sous anesthésie générale . Une fois anesthésiés, les animaux seront placés sur une surface chauffante pour maintenir leur température corporelle et différents paramètres seront surveillées (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire...). Les mesures mises en place (anesthésie, analgésie (méthode pour diminuer ou supprimer la douleur), asepsie (méthode préventive pour limiter les contaminations). Ce genre de procédure n'est habituellement pas douloureux après l'opération et ne nécessite pas de traitement anti-douleur de manière systématique. L'animal est gardé sous surveillance pendant 24h en zone d'isolement avec un autre congénère avant réintroduction dans son groupe et évalué quotidiennement par le personnel et le vétérinaire. En cas de signes de douleurs (immobilité, troubles de l'appétit...), un traitement anti-douleur pourra être donné. La période en zone d'isolement pourra être prolongé (24h supplémentaire) si la récupération de l'animal n'est pas validée par l'équipe vétérinaire. Au bout de 48h, après rétablissement complet validé par l'équipe vétérinaire, l'animal pourra être réintroduit dans son groupe sous surveillance accrue (vétérinaire et équipe responsable du bien-être).

Choix des espèces

Ce projet a pour objectifs de comprendre l’organisation des connexions entre l'oeil et les zones cérébrales impliquées dans la vision chez le singe écureuil et chez le ouistiti commun afin d’améliorer nos connaissances sur le développement de la vision binoculaire chez les vertébrés. Les processus impliqués dans le développement de la vision binoculaire sont complexes et mettent en jeu de multiples interactions cellulaires entre deux zones éloignées du cerveau. Le niveau de complexité anatomique de ces structures ainsi que la volonté d’obtenir un modèle suffisamment proche de l’Homme font du primate non-humain un modèle particulièrement approprié pour notre étude. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives. Des études ont permis de montrer la présence de connexions entre l'oeil et les zones cérébrales visuelles, des deux côtés du cerveau chez le macaque et l’Homme mais leur absence chez les rongeurs. Le choix de modèles pour cette étude s’est porté sur le singe écureuil et le ouistiti commun car ces espèces sont des primates partageant des caractéristiques visuelles et cérébrales communes avec d’autres primates provenant d'Afrique et d'Asie (par exemple : macaques) mais aussi des différences évolutives dues à leur appartenance aux primates originaires d'Amérique.

16 souris immunodéficientes sans poils vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection de vésicules extracellulaires dans la veine de la queue, subissent sept anesthésies gazeuses pour des imageries de fluorescence, puis un prélèvement sanguin terminal avant mise à mort pour l'analyse des organes. Le porteur compare trois modifications chimiques censées stabiliser ces vésicules dans le sang. Il décrit la souche sans poils comme "indispensable" pour éviter l'autofluorescence liée au pelage.

Objectifs

L'intérêt de cette étude est de pouvoir évaluer si des modifications apportées à des vésicules extracellulaires (EVs ou exosomes), issues de cellules souches mésenchymateuses, induisent une meilleure stabilité dans un organisme après une injection intraveineuse via la veine caudale. Les vésicules extracellulaires sont des particules produites naturellement par les cellules de l'organisme. Il est possible d'utiliser ces particules afin de transporter différents éléments biologiques comme des fragments d'anticorps ou de petits acides nucléiques. En effectuant des modifications chimiques à la surface des vésicules nous espérons qu'elles soient plus stables (ou dégradées moins rapidement ?) dans le sang. L'objectif est donc de comparer trois modifications différentes par rapport à des vésicules extracellulaires nues. Les EVs seront suivies dans la souris grâce à un marqueur fluorescent fixé à leurs surfaces.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de déterminer si différentes modifications chimiques réalisées à la surface des vésicules extracellulaires permettent une meilleure stabilité et une meilleure durée dans l'organisme par rapport aux vésicules sans modifications.

Procédures

Chaque animal reçoit deux injections, une par voie intraveineuse au niveau des veines de la queue et contenant les vésicules extracellulaires et une autre en fin de procédure par voie intrapéritonéale pour induire une anesthésie et analgésie. La durée des injections est au maximum de 30 secondes. Une anesthésie gazeuse sera réalisée avant l'administration des vésicules. Un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie et analgésie est réalisé au terme de la procédure. Enfin, pour la réalisation des imageries, les animaux ont 7 anesthésies gazeuses. La durée de chaque imagerie est d'environ 5 minutes. Tous les actes réalisés sur les animaux sont de classe légère n'entraînant que très peu d'effets sur les animaux.

Impact sur les animaux

Un stress de quelques secondes pourra être induit lors de la préhension des animaux pour les mettre dans la boite d'induction de l'anesthésie gazeuse. Une douleur légère pourra être induite lors de l'injection intraveineuse pour l'administration des vésicules extracellulaires et pour l'administration intrapéritonéale de l'anesthésie et analgésie chimique, cette douleur sera d'une durée maximale de 30 secondes. Enfin, un stress de quelques secondes pourra être induit lors de la préhension de l'animal avant l'administration de l'anesthésie et analgésie chimique.

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir faire un prélèvement sanguin d'un volume important et également réaliser des imageries d'organes isolés et de coupes histologiques.

Remplacement

Des études préliminaires sur des lignées cellulaires ont été réalisées afin de n'inclure que les modifications les plus intéressantes. Il s'agit, ici, de réaliser une étude de biodistribution et d'interaction à l'intérieur de l'organisme pour visualiser le comportement des vésicules extracellulaires.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum pour réaliser cette étude. Cela correspond à 16 animaux répartis en 4 lots de 4 animaux. Chaque lot correspond à un type de vésicule extracellulaire. Tous les animaux étant suivis par fluorescence à tous les temps (0, 15 minutes, 30 minutes, 1 heure, 2 heures, 4 heures et 6 heures) cela permet de diminuer drastiquement le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser l'étude. Les résultats feront l'objet d'une analyse statistique.

Raffinement

L'anesthésie gazeuse sera privilégiée à l'anesthésie chimique car elle permet une récupération plus rapide des animaux. Les animaux seront anesthésiés le temps de réaliser chaque image soit environ 5 minutes par image puis remis dans leur cage afin qu'ils puissent récupérer. Les animaux seront surveillés tout le long de la procédure à l'aide d'une grille de soin spécifique.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris immunodéficiente sans poil car elle permet de s'affranchir des problèmes immunofluorescence lié au poil de l'animal. Il s'agit d'une espèce de référence au sein de notre laboratoire. Ce type de souris est indispensable car elle permet de s'affranchir des problèmes d'autofluorescence. Les animaux seront réceptionnés à l'âge de 6 semaines à l'animalerie. A la suite d'une semaine d'acclimatation, ils pourront intégrer le projet. Les animaux des études précédentes étaient agés de 7 semaines, afin de pouvoir comparer les études entre elles, nous devons garder le même âge pour les animaux.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des candidats-médicaments par gavage et injections pendant quinze jours, des injections de BrdU, puis un test de mémoire à court terme avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur rattache l'étude au développement de traitements des démences, de la dépression et de la schizophrénie, sans détailler les molécules testées. Sa justification du nombre d'animaux renvoie à un modèle de la maladie de Parkinson et à la motricité fine, sans rapport avec l'objectif de mémoire annoncé.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d’évaluer les effets de plusieurs candidats médicaments sur la mémoire à court terme et sur la neurogénèse dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Cette étude s'inscrit dans un projet de développement pré-clinique de composés pour le traitement de maladies du système nerveux central, telles que les démences, la dépression et la schizophrénie. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.

Procédures

Les interventions incluent des traitements chroniques de candidats médicaments (quotidiens, sur 15 jours au maximum, soit 15 administrations au total) par gavage, injections sous-cutanées ou injections intra-péritonéales, et l'administration de BrdU par injections intra-péritonéales (5 injections au total, sur 5 jours). Les traitements durent moins d'une minute. Les fonctions cognitives seront évaluées grâce à un test de mémoire (une fois, sur 15 minutes). Les animaux subiront une perfusion intra-cardiaque sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Le traitement quotidien (sur 15 jours au maximum) des souris ainsi que les injections de BrdU (sur 5 jours au maximum) peuvent induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Les tests de comportements peuvent également induire un stress chez les souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (ex. histologie).

Remplacement

La neurogénèse et l'étude de la mémoire impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales (hippocampe, cortex enthorinal). Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

Le nombre de souris (n par groupe) a été déterminé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. La motricité fine des souris sera évaluée, des études publiées dans la littérature scientifique suggèrent qu'un nombre de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs . Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuel effets significatifs de candidats médicaments dans modèle animal de la maladie de Parkinson.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement, (ii) le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (alimentation, contrôle de la température, hygrométrie) (iii) un hébergement par deux au minimum et 4 au maximum, en cages ventilées, avec accès ad libidum à l'eau et à la nourriture. En cas d’agressivité au sein d’une même cage, nous isolerons la souris blessée dans une nouvelle cage. Cette cage sera placée dans la salle de stabulation pour préserver les contacts entre souris (visuels, sonores, olfactifs). La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrance. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

L'objectif du projet est de déterminer si des candidats-médicaments peuvent stimuler la neurogénèse et promouvoir la mémoire des souris. La souris possède un système cérébral complexe, qui présente de fortes similitudes avec le système nerveux humain. Nous utiliserons des animaux âgés de 12 semaines (jeunes souris adultes avec un fort potentiel de plasticité neuronale) ou alternativement des souris agées de 16 mois (souris avancant vers la senescence, et avec un faible potentiel de plasticité neuronale). La neurogénèse est plus important chez des souris jeunes par rapport à des souris agées. L'age des souris sera orienté par la finalité du projet (orientation vers les maladies de types démences liées à l'age ou maladies non liées à l'age). Nous disposons des équipements requis aux études impliquant des souris.