Procédures légères

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections répétées d’antigènes pendant plusieurs semaines pour déclencher une réponse immunitaire, puis sont tuées pour prélever leur rate et produire des anticorps monoclonaux destinés au diagnostic de la maladie d’Alzheimer. Le porteur attend une inflammation minimale aux points d’injection et prévoit d’arrêter le protocole en cas de perte de poids. Il affirme que cette production ne peut se faire sans animaux et la présente comme "indispensable".

Objectifs

L’objectif de nos travaux consiste à étudier les mécanismes pathologiques impliqués dans maladie d’Alzheimer (MA). Le but est de caractériser des marqueurs permettant la compréhension de la pathologie et son diagnostic. Le laboratoire a identifié de nouvelles formes protéiques, les outils nécessaires à leur validation et à leur caractérisation n’existent pas à ce jour. Notre objectif est de développer un panel d’anticorps monoclonaux afin de les détecter et ainsi confirmer ces résultats. Ce protocole va nous aider à mettre à disposition les outils indispensables pour améliorer le diagnostic dans le sang et le liquide céphalo-rachidien et la prise en charge des patients atteints de MA. Ces outils seront également utilisés dans des protocoles thérapeutiques chez la souris (Immunothérapie). Lors de notre dernière évaluation, ce projet de recherche publique a été validé par nos tutelles, il répond aux exigences des différentes instances finançant nos projets de recherche.

Bénéfices attendus

A courts terme, le développement de nouveaux anticorps vont permettre une meilleure caractérisation de nouvelles formes de protéines identifiées par le laboratoire. Ils vont être utilisés sur des échantillons provenant de diverses Tauopathies et aider à la compréhension des mécanismes conduisant au déclenchement et à l’évolution de la maladie dans le cerveau.

Procédures

Etude de recherche fondamentale sur le système nerveux appliquée dans les Troubles nerveaux et mentaux chez l’homme. Injections répétées d’antigènes par voie intra-péritonéales (2), sous-cutanées (2 à 4 selon la réponse obtenue) sur l’ensemble des animaux vigiles afin d’induire une réponse immunitaire. Les injections seront espacées de 3 semaines. L'efficacité de l'immunisation sera contrôlée après prélévement sanguin au niveau de la veine caudale . L’animal ayant la plus forte réponse immunitairesera immunisé une dernière fois par voie intra-veineuse. A la fin du protocole, les souris seront mis à mort pour prélever la rate afin d’isoler les lymphocytes et ainsi produire les anticorps monoclonaux.

Impact sur les animaux

Dans nos expériences, pas de nuisance/effet indésirable majeur espéré. Nous nous attendons à une inflammation minimale au niveau du point d’injection. Le côté des injections intrapéritonéales sera alterné d’un jour à l’autre. Dans le cas où les animaux présenteraient un comportement anormal tels que la perte de poids ou piloéréction, le protocole sera arrêté.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort suite à la procédure.

Remplacement

Les anticorps que nous développons n’ont pas d’équivalent dans le commerce. Il n’existe pas de banque de séquence pour les antigènes visés. Les banques synthétiques disponibles pour d’autres types d’anticorps ne sont pas adaptées aux anticorps monoclonaux développés à des fins diagnostics. La production des anticorps monoclonaux ne peut se faire qu’à partir de cellules issues d’organes lymphoïdes prélévés sur des animaux immunisés. Cette étape ne peut pas être remplacées par des méthodes sans animaux.Afin de répondre à notre besoin, il est donc indispensable de procéder à leur production. Lorsqu’il existe des hybridomes produisant l’anticorps d’interêt, nous privilégions l’achat à la production des anticorps in vivo

Réduction

Les études bibliographiques et les précédentes expériences réalisées par le laboratoire nous ont permis de définir le nombre minimal de souris nécessaires pour l’obtention d’un résultat positif. Nous réaliserons les expériences sur 5 animaux par anticorps à developper. Afin de réduire le nombre d’animaux, les animaux non utilisés dans la procédure d’immunisation du fait de la faible réponse immunitaire seront réutilisés pour des protocoles de lavements intrapéritonéaux.

Raffinement

Nous serons attentifs à la prise en charge de la douleur. Lors des prélèvements de sang, de la lidocaine sera utilisée pour anesthésier la queue de la souris à prélever. Si les souris présentent des signes de douleur, le protocole sera suspendu et les souris mises à mort.

Choix des espèces

Les lapins pourraient être utilisés pour la production d’anticorps polyclonaux. Mais la disponibilité de l’anticorps est limitée au stock de sérum pouvant être prélevés. Lorsque ce stock est épuisé, de nouveaux lapins doivent être immunisés. La technique des anticorps monoclonaux permet une seule utilisation de l’animal, une fois la rate prélevée, les cellules sont immortalisées et conservées en azote liquide ce qui nous procure un stock d’anticorps illimité. La technique des anticorps monoclonaux consiste à isoler les cellules, l’utilisation de souris plutôt que de rats permet d’isoler plus facilement les cellules de la rate et augmentent la probilité d’obtenir un résultat positif. Suite à nos recherches bibliographiques et de part notre expérience sur la production des anticorps monoclonaux, les expériences seront réalisées sur des souris Balb/cbyJ adultes agées de 2 mois. La réponse immunitaire est plus forte à 2mois que sur des soris plus agées, cela permet d’optimiser les chances d’obtenir le résultat espéré et de réduire le nombre d’animaux.

585 larves de poisson zèbre vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Âgées de sept jours, elles sont surnourries par un bain enrichi en graisses et exposées à onze extraits de plantes, puis tuées pour mesurer l'accumulation de lipides et l'inflammation, afin d'évaluer ces extraits contre les désordres métaboliques. Le porteur indique que les procédures ne comportent aucun geste invasif, la seule contrainte tenant à la dégradation possible des solutions. Il affirme que les modèles in vitro n'ont pas la complexité suffisante et justifie le recours au poisson vivant.

Objectifs

Le projet consiste à évaluer les propriétés de 11 extraits de plantes issues de la biodiversité de La Réunion sur les pertubations métaboliques chez le poisson-zèbre au stade larvaire, suite à un régime enrichi. Dans le cas de maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète, différents processus sont dérégulés. Les données de la littérature décrivent la mise en place d'une inflammation chronique, d'un stress oxydant, d'une dyslipidémie ou d'une insulino-résistance pouvant entrainer des effets délétères sur l'ensemble des systèmes de l'organisme tels que le foie, le coeur, les reins ou le système nerveux. Dans le cadre de notre projet, les larves sont surnourries avec un régime riche en lipides et traitées avec les extraits de plantes aux concentrations maximales non toxiques afin d'évaluer leurs effets sur différents paramètres métaboliques, notamment l'accumulation lipidique, le stress oxydant et l'inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet participera au développement d'approches thérapeutiques innovantes reposant sur la biodiversité végétale, permettant d'évaluer leurs impacts dans un contexte de pathologies métaboliques et des complications associées (dyslipidémie).

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucun intervention invasive. Ils seront incubés pendant 5 jours (avec renouvellement des solutions toutes les 24h) dans une solution à base de nourriture sèche (Contrôle) pour 45 larves, une solution à base de jaunes d'oeuf (HFD) pour 45 larves et des solutions à base de jaune d'oeuf + extrait de plante (HFD traités) pour 495 larves.

Impact sur les animaux

La qualité des solutions à base de jaunes d'oeuf et extraits de plantes (à des concentrations non toxiques déterminées au préalable) dans lesquelles les larves sont incubées (balnéation) peut se dégrader au cours du temps et induire un stress aux animaux. Les solutions seront donc re-préparées, renouvelées toutes les 24h et les animaux seront examinées chaque jour de l'expérimentation.

Devenir

A la fin de l’expérimentation, après mise à mort des animaux, l'accumulation lipidique sera analysée par coloration Oil Red O. Des larves seront conservées et d'autres analyses au niveau de l'expression génique ou protéique pourront être effectuées afin d’évaluer les effets sur l’inflammation ou le stress oxydant, par exemple.

Remplacement

Les modèles in vitro ne présentent pas une complexité suffisante capable de prendre en considération l'ensemble des signaux intrinsèques et extrinsèques qui se mettent en place à la suite d'un régime riche en graisses. Seul le modèle animal permet de prendre en considération une telle complexité et de réellement tester l'impact de ces extraits sur l'ensemble des processus métaboliques.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible. 3 expérimentations indépendantes seront réalisées afin de permettre la réalisation d'études statistiques. Les expériences seront réalisées en triplicat : 3 x 15 larves pour chaque condition.

Raffinement

Les larves seront placées dans des conditions optimales (température : 26.5°C ; oxygénation ; pH). Notre protocole a été développé afin que les larves bénificient d'un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal. Chaque solution sera fraichement préparée et renouvelée toutes les 24h. Les larves seront nourries suffisamment avec de la nourriture spécialisée et adaptée. Les larves seront examinées chaque jour de l'expérimentation et tout signe de souffrance selon des points limites adaptés sera étudié afin de prendre les mesures adéquates.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle solidement reconnu pour l’étude de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Il existe une forte conservation de ces processus au cours de l’évolution. C'est un modèle d’étude de l’immunité, d’oncologie, de réparation cellulaire, de neurogenèse et depuis quelques années, des maladies métaboliques. Il est en effet très utilisé dans l’étude de l'obésité et du diabète puisque les gènes intervenant dans ces processus physiopathologiques sont très conservés chez le poisson-zèbre. Les animaux utilisés seront des larves âgées de 7 jours. A ce stade de développement, les larves sont capables de se nourrir de manière autonome et disposent déjà d'un tractus gastroinstestinal fonctionnel.

80 chiens atteints d'une parodontite vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés ou adoptés sans être tués. Ils subissent des prises de sang jusqu'à sept fois par jour, des prélèvements de salive et d'urine, des biopsies et une anesthésie mensuelle, sur un traitement quotidien de trois mois, pour évaluer des candidats médicaments contre la maladie parodontale du chien. Le porteur indique qu'un groupe reste sans traitement et que la maladie peut alors évoluer vers une inflammation douloureuse et une atteinte osseuse. Il affirme que l'efficacité doit être démontrée sur l'espèce cible et qu'aucune méthode de substitution n'existe.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de produits candidats sélectionnés sur des chiens présentant des signes de parodontite. Les produits candidats peuvent être des principes actifs identifiés, formulés et sélectionnés en interne ou des médicaments vétérinaires déjà commercialisés mais n’ayant pas comme indication initiale la maladie parodontale canine.

Bénéfices attendus

L’intérêt d’un traitement contre la maladie parodontale serait de pouvoir réduire et/ou reculer les soins chirurgicaux associés à des cas sévères. D’autre part, il a été démontré que la parodontite canine est un modèle fiable pour la compréhension et le soin de la maladie parodontale chez l’Homme. La recherche d’un traitement contre la parodontite canine pourrait donc profiter également à l’avancée des traitements chez l’Homme.

Procédures

Pour tous les animaux : - Prises de sang pour profil pharmacocinétique : sur animal vigile, jusqu’à 7 fois / jour le premier jour puis régulièrement 1 fois/jour. Acte inférieur à 1 minute - Prises de sang pour bilans biochimiques et hématologiques : sur animal vigile, 1 à 4 fois dans l’étude. Acte inférieur à 1 minute - Ecouvillons buccaux ou gingivaux : 1 à 4 fois dans l’étude (1 mois d’intervalle environ). Acte inférieur à 1 minute - Prélèvements de salive : sur animal vigile ou tranquilisé, 1 à 4 prélèvements dans l’étude. Acte inférieur à 1 minute - Prélèvements d’urine éventuels par cystocentèse : sur animal vigile ou sédaté, 1 à 3 fois dans l’étude. L'acte peut durer 1 minute si la vessie est pleine et jusqu'à 5 minutes maximum si la vessie est petite - Bandelettes dentaires : sur animal anesthésié, 1 à 4 fois dans l’étude. Acte inférieur à 1 minute - Biopsies (punch) : sur animal anesthésié, 1 à 2 fois dans l’étude. L'acte peut durer 1 minute pour le prélèvement et 1 minute de compression pour arrêter le saignement local -> Par animal : 1 anesthésie générale par mois d’étude environ sera mise en œuvre.

Impact sur les animaux

Comme il n’existe pas de traitement curatif contre la parodontite canine, le design des études d’efficacité devra comporter un groupe contrôle sans traitement (ou placebo). Pour ces chiens appartenant au groupe contrôle et pour les chiens traités (dans le cas où l’efficacité du candidat ne serait pas suffisante), l’évolution de la maladie pourrait conduire à une inflammation douloureuse, une infection bactérienne et/ou une atteinte osseuse. Ceci peut entrainer un inconfort à la prise alimentaire avec une baisse d’appétit. L’efficacité du candidat sera évaluée à partir de paramètres prédéfinis. Ces derniers impliquent des prélèvements (buccaux, salivaires et prises de sang) et des examens dont certains nécessiteront une anesthésie ou une tranquilisation. Les prélèvements buccaux seront réalisés avec des écouvillons et/ou des brossettes adéquates et peuvent générer de l’inconfort au moment du geste surtout si les zones écouvillonées sont inflammatoires. Les prises de sang peuvent générer un stress et de l’inconfort au moment du geste. L’anesthésie peut générer : un stress au moment de l’induction, de l’inconfort, de la nausée et du stress au moment du réveil (qui peut durer jusqu’à plusieurs heures). Les contentions liées à ces gestes peuvent générer du stress chez les animaux Les composés utilisés ont déjà été testés en étude d’innocuité. Les effets indésirables possibles sont : vomissement, diarrhée, anorexie et léthargie. Ils sont peu fréquents et reversibles à l’arret du traitement. Ces effets peuvent survenir une à plusieurs fois au long de la prise du traitement qui sera quotidien pendant trois mois.

Devenir

Les animaux ne sont pas euthanasiés en fin d’étude mais réutilisés ou adoptés.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives afin d’étudier la maladie parodontale canine et de démontrer l’efficacité d’un composé sur cette pathologie. Le recours à des études in vivo sur espèce concernée/cible est nécessaire. En effet, l’efficacité d’un produit doit être démontrée sur l’espèce de destination.

Réduction

En phase de recherche le nombre d’animaux inclus est évalué avec recherche bibliographique et analyse statistique, afin de minimiser le nombre de chiens utilisés et le risque d’études non conclusives. Pour ce projet, des animaux âgés provenant de projets antérieurs (avec degré de sévérité léger ou modéré) pourront être réutilisés. En effet, comme il n’existe pas de modèle, la ré-utilisation de chiens âgés (>2 ans) sera privilégiée. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par un vétérinaire, seront réutilisés.

Raffinement

Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique dont la durée minimale est de 7 jours. Si cette durée n’est pas suffisante elle sera rallongée jusqu’à ce que les animaux soient aptes à entrer dans la procédure. Les chiens hébergés dans nos locaux font l’objet d’un soin de qualité avec respect de leur bien-être. Les chiens seront hébergés en groupe sur litière. Ils bénéficieront de zones de jeu avec interaction avec l’Homme. Les jouets présents dans les zones d’hébergement et dans les zones de jeu sont régulièrement changés pour favoriser la curiosité. Afin de limiter le stress lié aux actes (contention, observations buccales, administrations orales, prélèvements) ces derniers seront travaillés en renforcement positif avec friandises et caresses lors de training pendant l’acclimatation puis pendant toute la durée de l’étude. Les examens buccaux complets et les prélèvements tels que des biopsies buccales seront réalisés sous anesthésie avec analgésie adaptée. Le protocole anesthésique sera évalué au plus juste pour limiter les effets secondaires indésirables (les molécules et doses seront adaptées pour favoriser un réveil rapide). Les animaux anesthésiés seront individuellement placés sous surveillance, au calme et au chaud si besoin et ce jusqu’à leur réveil complet. Le personnel intervenant dans l’étude sera formé aux examens et prélèvements bucco-dentaires afin de travailler avec le plus d’expertise possible. L’intervention d’un expert (docteur vétérinaire dentiste) est prévue. Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal (spontané ou provoqué) et/ou toute anomalie physique non attendue. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le responsable de l’étude, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal et/ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. Des points limites seront définis pour apporter des soins adaptés ou une exclusion de l’étude avec d’autres soins ou une euthanasie si nécessaire. Une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de dégradation de l’état buccal. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Espèce cible de la pathologie investiguée. Les animaux utilisés sont des adultes de plus de 2 ans atteints naturellement de maladie parodontale.

18 cailles japonaises vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour générer une lignée transgénique. Des embryons reçoivent une injection de particules virales, puis les animaux sont croisés sur deux générations, les femelles de deuxième génération étant tuées dès l'apparition du dimorphisme sexuel pour ne garder que des mâles. Le porteur indique que les cailles seront euthanasiées lorsqu'elles ne seront plus aptes à la reproduction. Il affirme que l'étude de la formation de l'embryon exige des embryons vivants et ne peut être remplacée par des méthodes sans animaux.

Objectifs

L'embryon de poulet a connu une longue et illustre carrière en sciences. De nombreux aspects cellulaires et moléculaires de son développement embryonnaire sont virtuellement identiques aux mammifères. Sa facilité d'observation (y compris en temps réel) et de manipulation a permis l'étude d'un large éventail de sujets, établissant une grande partie des concepts de base de la biologie du développement. Un domaine où les souris avaient toutefois un avantage crucial sur les oiseaux, est la possibilité de modifier leur génome, une technologie qui a été largement utilisée, conduisant ainsi à de nombreuses percées dans le domaine biomédical. L'embryon de souris est néanmoins inaccessible à l'imagerie intra-vitale, limitant de facto l'étude dynamique de processus développementaux. Bien que la transgenèse du poulet soit techniquement possible, le cycle de vie extrêmement long de cet organisme (maturité sexuelle à 6 mois) rend ces approches fastidieuses. La caille japonaise (Coturnix coturnix japonica), à l'inverse, atteint la maturité sexuelle à environ 6 semaines, ce qui est beaucoup plus rapide que le poulet et comparable à la souris. Nous avons développé une technologie originale, utilisant une méthode de transfection directe des cellules primordiales germinales (PGCs) , pour générer des lignées de cailles transgéniques. Nous avons obtenu plusieurs lignées de caille transgéniques, décrites dans plusieurs publications de haut impact. Une technique différente, utilisant des lentivirus pour transduire les PGCs d'embryons précoces de cailles, est également utilisée pour générer des lignées de cailles transgéniques. Le projet consiste en l'élaboration d'une plateforme de transgenèse caille dans laquelle des lignées seront créées non seulement pour notre propre recherche, mais aussi à façon pour la communauté de chercheurs français et européens.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mettre en place une animalerie oiseaux destinée à générer, maintenir et amplifier des lignées de cailles transgéniques. Les constructions utilisées pour générer ces lignées serviront à analyser différents aspects du développement embryonnaire précoce des oiseaux. Ceux-ci montrent un développement embryonnaire en tous points semblables au développement des mammifères et ils représentent donc un modèle expérimental parfaitement adapté pour l'étude du développement de l'embryon humain. Le but de ce projet est donc la recherche fondamentale. Il y a beaucoup de choses que l'on ne sait pas sur les maladies humaines et il n'est pas possible de répondre à toutes les questions que les scientifiques doivent se poser en étudiant des patients humains. Il peut y avoir des raisons éthiques, pratiques ou scientifiques pour lesquelles un objectif scientifique ne peut être atteint en utilisant des sujets humains, et dans ces situations, un modèle animal peut être approprié. Il existe de nombreux types de modèles animaux utilisés dans la recherche. Ils ne reflètent pas nécessairement la condition humaine, mais peuvent néanmoins fournir des informations importantes sur la biologie. Par exemple, un modèle animal peut être utilisé pour prédire l'efficacité probable d'un nouveau traitement avant qu'il ne soit étudié sur des patients. En biologie fondamentale, un modèle animal peut être utilisé pour mieux comprendre les mécanismes à l'origine de la maladie afin d'identifier de nouveaux moyens de la traiter à l'avenir. Toutefois, il est important de reconnaître que tous les modèles animaux ont certaines limites.

Procédures

pas d'intervention autre que l'injection d'un plasmique avant le dernier tiers de developpement pour la genération de colonnie ogm.

Impact sur les animaux

La generation d'aniamux exprimant une ou plusieurs protéines fluorescentes ne génère pas au vu de la litterature de phenotype dommageable. neanmoins la transgénèse pourrait avoir des nuisances comme la perte de poids, un comportement agressif envers les congénères etc. Si une perte de poids de plus de 20% est observée, si l'animal perd son plumage ou presente des alterations de la peau l'animal sera euthanasié. De la même manière si le comportement alimentaire est altéré (ne cherche plus de nourriture) ou si l'animale est aggressif il sera euthanasie.

Devenir

Lorsque les aniamux ne seront plus aptes à la reproduction ils seront euthanasiés.

Remplacement

En raison de la nature des questions biologiques soulevées dans les études proposées, visant à comprendre les événements cellulaires et moléculaires associés à la formation d’un embryon, l'utilisation d'embryons vivants (par exemple pour réaliser de l'imagerie in vivo) est une exigence absolue et ne peut donc pas être remplacée par d'autres méthodes non-animales

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour la génération d’une ligné transgénique est le suivant: il faut 6 cailles (5 femelles et 1 male) pour générer des animaux dont le patrimoine génétique est modifié à au moins 50% (génération numero 1). Ces aniamux sont alors croisés entre eux pour obtenir des aimaux transgénique à 75% (génération numero 2). il en faut au moins 12 dans le but d’obtenir 6 males (les femelles étant mises à mort, dès l’apparition du dimorphisme sexuel). Les 6 males, arborant chacun une insertion lentivirale différente, seront croisés chacun avec 4 femelles normale. Une seule lignée montrant l’expression la plus forte sera gardée et utilisée pour la génération d’individus en troisième génération. Les animaux des générations 1 et 2 seront suivis pour vérifier que l’insertion du vecteur lentiviral dans le génome n’ a pas créé de phénotype dommageable, évènement hautement improbable mais pas impossible. Si les animaux ne montrent aucun phénotype dommageable, la procédure est terminée, puisque le simple élevage de caille génétiquement modifiées, une fois passée la 2eme génération ne constitue pas une procédure en soi. Soit Nombre d’animaux= 6+12= 18 animaux par lignée dans une procédure.

Raffinement

Afin de réduire le stress et douleur lors de la mise à mort, l’euthanasie est réalisée dans une autre pièce à l’aide d’une chambre à CO2. Pour le bien-être des animaux, des enrichissements seront réalisés : de la litière dans les cages afin que les animaux puissent gratter, du sable pour qu’ils puissent se laver, la nourriture (graines et légumes) sera également disséminée afin que les animaux la cherchent comme ils le feraient dans la nature, des abris seront également disposés dans les cages afin que les animaux puissent se reposer. La répartition des animaux dans les cages se fera de la manière suivante : un mâle pour 4-5 femelles. La température, la nourriture et la lumière seront monitorées selon les directives nationale et européenne. En ce qui concerne la gestion des déchets biologiques, nous suivrons les directives nationale et européenne. L’utilisation des lignées transgéniques se fera uniquement dans le cadre de la recherche scientifique. Les cailles transgéniques générées ne seront en aucun cas utilisées dans l’agriculture ou en tant qu’animal de compagnie

Choix des espèces

La caille japonaise (Coturnix japonica). Les embryons d’oiseaux par leur accessibilité et leur développement externe, se prêtent remarquablement aux études dynamiques (par vidéo-microscopie) et aux perturbations mécaniques contrairement aux mammifères dont le développement intra-utérin limite la réalisation de telles approches. Sa petite taille et son temps de génération très court font de la caille un modèle génétique idéal parmi les oiseaux. -la procédure d’injection de particule lentivirale s’effectue sur des oeufs fécondés mais non incubés, donc avant le 1ier tiers de gestation. A ce stade il est possible de cibler de manière efficace les cellules précurseurs des gamètes et donc d’obtenir une transmission germinale. -La procédure génération de lignée (évaluation de la présence de phénotype dommageable) s’étend sur 2 générations de l’éclosion jusqu’à la transmission germinale. Les adultes sont uniquement utilisés pour générer les oeufs embryonnés nécessaires à la recherche. les oeufs embryonnés sont utilisés pour la recherche avant le dernier tiers de developpement.

180 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun n'étant tué à l'issue. Chaque animal sert à un prélèvement de sang et à une administration par les voies courantes, parfois à un électrocardiogramme, pour entraîner des personnels à manipuler des chiens dans le cadre d'une offre de formation ouverte à d'autres établissements. Le porteur indique que deux tiers des chiens seront adoptés et que le tiers restant demeure dans la colonie avant vente ou adoption. Il affirme qu'il n'existe pas de remplacement possible pour former le personnel sans recourir à des chiens.

Objectifs

Ce projet répond à différents besoins de formation, autant internes qu’externes. En effet notre personnel a régulièrement besoin de suivre des formations au poste de travail suite à une évolution dans ses missions et tâches, ou à une évolution dans les pratiques du site. , ou encore après une longue période sans pratique. Certaines manipulations nécessitent une phase d’apprentissage, sur des chiens sains, dans un environnement sans stress afin que le geste soit acquis avant de le réaliser en routine le moment voulu. De plus, nous avons l’obligation de faire suivre les formations réglementaires à nos nouvelles recrues, or les offres ne sont pas suffisament développées en France ou ne sont pas adaptées à nos besoins. Nous avons donc décidé de nous associer à un centre de formation professionnel pour mettre à disposition des utilisateurs de chiens une formation d’applicateur de procédures chez les carnivores dont la partie pratique se fera sur notre site. Cette formation sera également ouverte au personnel d’autres sites Français ou francophones.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont que cela offre des possibilités supplémentaires de former du personnel, que ce soit au cours des formations réglementaires initiales ou lors des formations ou re formations au poste de nos collaborateurs. Une bonne formation pratique permet au personnel de prendre conscience de ses capacités et de ses limites, de la difficulté liée à la variabilité des individus et des circonstances. Du personnel bien formé permet de limiter au mieux les manipulations stressantes ou douloureuses pour les animaux comme pour les personnes, donc les risques d’accident. Cela permet de réaliser les procédures rapidement, dans de bonnes conditions et selon les bonnes pratiques ce qui favorise la coopération des animaux et la qualité globale des résultats.

Procédures

Une séance de manipulations pour les administrations et prélèvements sur animaux vigiles durera moins de 30 minutes par animal, et chaque chien ne sera utilisé que pour un prélèvement sanguin et une administration par les voies standards avec des volumes mimant des actes vétérinaires. Les chiens qui serviront en plus à réaliser des ECG seront utilisés environ 15 minutes de plus, le même jour.

Impact sur les animaux

Les apprenants risquent de manipuler les chiens de manière hésitante. Cela peut donc entrainer une lenteur dans la réalisation des procédures, un stress voire une douleur plus importantes que lorsqu’elles sont réalisées par une personne expérimentée. Vues les actes techniques réalisés sur les différents sites et les manipulations prévues lors des formations réglementaires, les dommages seront limités à la durée de l’acte lui-même (contention, administration, prélèvement) ou à quelques jours. Les effets indésirables prévus sont des hématomes, de petits saignements, et majoritairement seulement l’effet de l’introduction d’une aiguille par voie intraveineuse, sous cutanée ou intra musculaire qui impliquera une sensibilité/inconfort transitoire ou point d’injection.

Devenir

Environ les 2/3 des chiens seront des chiens qui ne sont pas adaptés aux besoins de la recherche (défaut de croissance, mâles qui n’ont qu’un seul testicule etc ) ou des anciens reproducteurs: ils seront donc tous adoptés après leur utilisation. 1/3 seront des chiens de stock ou des reproducteurs actifs, qui resteront dans la colonie jusqu’à leur vente ou jusqu’à leur mise à la retraite puis adoption. Les chiens ne seront pas euthanasiés après leur utilisation dans ce projet.

Remplacement

Il n’y a pas de remplacement possible, à moins de former le personnel directement sur les animaux utilisés en étude, ce qui n’est pas pertinent si l’on souhaite que ces derniers soient utilisés dans des conditions assurant le bien-être des animaux et que les résultats de l’étude ne soient pas impactés.

Réduction

Ce projet utilise le nombre minimal de chien par personne et par formation. Il permet aussi d’optimiser l’utilisation de chiens déjà présents sur le site qui présentent des défauts de croissance ou autre anomalie mineure (exemple : présence d’un seul testicule) ne leur permettant pas d’être des modèles animaux en recherche, ou qui sont d’anciens reproducteurs. Ces utilisations se feront avant leur replacement.

Raffinement

Les manipulations des chiens seront limitées à des administrations et prélèvements classiques. Lors des formations pour les applicateurs de procédures : un seul chien sera utilisé par personne, pour réaliser une prise de sang et une administration de sérum physiologique par les voies standards. Lors des formations au poste de travail, le nombre de séances et de chiens utilisés au total par personne dépendra de la technique à acquérir et de la technicité de la personne à former. Les chiens sont tous habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés pour les procédures standards, ce qui rend toute manipulation facile. Si un chien était plus stressé qu’un autre, il serait facile de le remplacer vu le nombre de chiens disponibles sur le site. Les animaux utilisés pour une séance de formation seront examinés attentivement dans les jours suivant leur utilisation et le vétérinaire sera informé dès l’observation d’un signe clinique quelconque pour procéder à un examen vétérinaire et mettre en place des soins appropriés le cas échéant. Lors des formations réglementaires, un vétérinaire sera présent en permanence.

Choix des espèces

Il s’agit de la seule espèce manipulée par le personnel des 2 sites Marshall en France et de l’espèce principale intéressant les autres personnels qui doivent suivre une formation d’applicateurs de procédure chez les carnivores. Elle est donc particulièrement bien adaptée aux besoins. Les chiens seront en génral soit de jeunes chiens en fin de croissance soit des adultes, donc typiquement âgés de 6 mois à 5 ans. Si un collaborateur doit être formé à un geste appliqué à des animaux particuliers (exemple prises de sang sur de jeunes chiots), alors des chiens ayant les caractéristiques requises seront utilisés pour la formation

750 souris, dont des lignées transgéniques, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un gavage au tamoxifène, une immunisation puis des injections répétées d'anticorps bloquants ou de cytokines jusqu'à une tous les deux jours, avant l'ablation de leurs ganglions lymphatiques, pour étudier la différenciation des lymphocytes B lors d'une réponse de type vaccinal. Les retombées annoncées pour la vaccination, les maladies auto-immunes et certains cancers restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que l'organisation des centres germinatifs n'est pas reproduite dans les cultures in vitro et conclut que l'étude requiert le recours à la souris.

Objectifs

Notre projet vise à comprendre la dynamique des lymphocytes B au cours du processus de maturation d'affinité impliqué dans la production d'anticorps spécifiques lors de réponses vaccinales. Nous étudions plus particulièrement les lymphocytes B du centre germinatif et leur capacité à se différencier en cellules productrices d'anticorps (plasmocytes) ou en cellules à longue durée de vie (lymphocytes B mémoire). Nous utiliserons des approches de cytométrie en flux, de microscopie, et de génomique sur cellules uniques pour analyser les lymphocytes B du centre germinatif à différents stades de leur maturation et de leur différenciation en plasmocytes et lymphocytes B mémoires. Dans des conditions de réponses immunitaires à une immunisation (modèle de vaccin), nous testerons l'implication de voies de signalisation biologiques et d'interactions cellulaires grâce à l'injection, in vivo, d'anticorps bloquants ou de cytokines / chimiokines recombinantes.

Bénéfices attendus

Nous espérons apporter une connaissance plus précise des étapes de différenciation des cellules spécialisées dans la production d'anticorps, les plasmocytes. Cette connaissance devrait à terme permettre de proposer des modifications visant à augmenter ou diminuer la production d'anticorps dans les stratégies de vaccination (augmenter) ou les maladies autoimmunes (diminuer). En outre, cette connaissance pourrait avoir un impact dans la compréhension des mécanismes de développement de certains cancers (lymphomes et myélome multiple).

Procédures

Les animaux seront soumis à trois types d'intervention. 1) Le gavage au tamoxifène, sur animal vigile, sera réalisé sur 500 animaux transgéniques Aicda-CreERT2+/- x Rosa26-LSL-eYFP+/-. Cette procédure dure environ une minute, et est réalisée une seule fois par animal. 2) L'immunisation, sur animal vigile, sera réalisée sur 750 animaux (500 animaux transgéniques Aicda-CreERT2+/- x Rosa26-LSL-eYFP+/-, et 250 animaux C57BL/6 J). Cette procédure dure environ une minute, et est réalisée une seule fois par animal. 3) Le traitement par injection par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée, sur animal vigile, sera réalisé sur 600 animaux (450 animaux transgéniques Aicda-CreERT2+/- x Rosa26-LSL-eYFP+/-, et 150 animaux C57BL/6 J). Cette procédure dure environ une minute, et sera réalisée au maximum tous les deux jours pendant une période de traitement n'excédant pas 10 jours.

Impact sur les animaux

Le projet implique des procédures expérimentales de classe légère qui pourront générer les nuisances et effets indésirables suivants: stress, rougeurs et désquamation locales au site d'immunisation ou d'injection.

Devenir

Tous les animaux concernés par ces procédures seront mis à mort entre 1 et 2 jours après la dernière injection réalisée. Les analyses des lymphocytes B du centre germinatif que nous prévoyons requièrent le prélèvement des ganglions lymphatiques drainant le site d'immunisation (ganglions inguinaux, péri-aortiques, axillaires, brachiaux, cervicaux) qui sont prélevés par dissection après la mise à mort.

Remplacement

Les centres germinatifs sont des structures complexes où cohabitent un grand nombre de cellules immunitaires, et dont l'organisation spatio-temporelle n'est pas fidèlement reconstituée dans des modèles de culture in vitro. La survie des lymphocytes B du centre germinatif dépend d'interactions avec différents types cellulaires de cet environnement qui ne sont pas présents dans les modèles de culture cellulaire in vitro. De ce fait, l'étude mécanistique de la différenciation des lymphocytes B du centre germinatif requiert d'avoir recours à des modèles animaux dans lesquels les centres germinatifs sont induits par vaccination, et accessibles pour des études en microscopie, cytométrie en flux, génomique.

Réduction

La plupart des analyses réalisées dans ce projet font appel à des techniques réalisées à l'échelle de la cellule unique. Les analyses sur cellules uniques permettent d'obtenir des informations robustes et quantitatives sur les lymphocytes B du GC à partir d'un faible nombre d'animaux. De plus, nous congèlerons les suspensions cellulaires préparées à partir des organes lymphoïdes qui ne seront pas utilisées directement pour nos analyses le jour de la mise à mort, afin de les réutiliser pour la calibration et la mise au point d'analyses futures.

Raffinement

Nous utiliserons des conditions de transport, d'élevage et d'hébergement des animaux respectueuses, autant que possible de leur bien-être, et utiliserons des pratiques de manipulation et mise à mort des animaux appropriées. Nous avons mis en place une grille de suivi des observations comportementales et physiologiques lors de nos procédures expérimentales. Cette grille nous sert à évaluer 5 types de paramètres: apparence, abreuvement et alimentation, comportement naturel, réponse à un stimulus, signes clinique spécifiques au site d'immunisation. Un système de score gradué de 0 à 4 pour chaque type de paramètres est utilisé pour décrire l'état de l'animal au cours des procédures expériementales. Un score supérieur à 5/20 nous invite à renforcer la surveillance de l'animal. Un score global supérieur à 10/20 nous invite à prévoir un mode de soulagement de la douleur (traitement local des effets inflammatoires au site d'immunisation par application d'une crème cicatrisante et antiseptique). Un score supérieur à 15/20 nous invite à mettre à mort l'animal. En outre, nous exploiterons au mieux les résultats par des analyses statistiques adéquates.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix utilisé dans la recherche en immunologie. Le modèle transgénique nous permettant de suivre les lymphocytes B issus des centres germinatifs est un modèle murin. Les animaux seront utilisés à un âge compris entre 8 et 15 semaines.

Neuf babouins olive juvéniles vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrés à la colonie de l'établissement pour la reproduction ou d'autres expériences. Chaque animal est capturé, anesthésié, perfusé puis soumis à six biopsies musculaires sur trois muscles d'un même membre, pour tester chez un primate un oligonucléotide destiné à moduler un gène impliqué dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur présente ces gestes comme "peu invasifs et non terminaux". Il indique que la réglementation impose l'essai sur une espèce non rongeuse proche de l'humain avant tout passage clinique.

Objectifs

Les oligonucléotides (ONs) thérapeutiques, dont les siARN (petits duplexes d’ARN interférant avec la production des protéines), présentent un potentiel révolutionnaire dans les approches thérapeutiques par leur capacité à moduler l’expression génique, ouvrant la porte au traitement de nombreuses pathologies jusque-là sans traitement. Néanmoins, la délivrance de ces agents thérapeutiques dans les différents tissus et organes, notamment dans les tissus musculaires ou le système nerveux central, reste un défi majeur. La superoxide dismutase 1 (SOD1) est une protéine exprimée dans tous les organes du corps qui nous protégé du stress oxydatif (e.g. lors d’un épisode ischémique) et qui joue aussi un rôle protecteur en empêchant les processus de mort cellulaire. Cette protéine est fortement impliqué dans le développement des maladies humaines comme la sclérose latérale amyotrophique (cf. SLA ou maladie de Charcot), maladie neuromusculaire la plus fréquente touchant le SNC et les muscles et caractérisée par une perte progressive des neurones moteurs. L'objectif de la présente étude est de confirmer l'efficacité d’une molécule conjuguée crée par notre équipe, la C5-siSOD1, à moduler la production de SOD1 à niveau intracellulaire chez une espèce animal proche de l’Homme.

Bénéfices attendus

Les oligonucléotides (ONs) thérapeutiques sont de plus en plus reconnus comme ayant un potentiel révolutionnaire dans les approches thérapeutiques par leur capacité à moduler l’expression génique, ouvrant la porte au traitement de nombreuses pathologies jusque-là sans traitement. Grâce à des designs spécifiques leur conférant différents modes d’action sur l’ADN ou l’ARN, les limites des applications et des cibles des ONs thérapeutiques vont bien au-delà des molécules jusque-là développées par le secteur pharmaceutique. En théorie, les ONs thérapeutiques pourraient permettre de corriger toute pathologie trouvant son origine dans un défaut d’expression génique. Malgré ce potentiel, es ONs thérapeutiques souffrent d’un handicap majeur pour permettre leur développement thérapeutique : leur difficulté à traverser les membranes cellulaires et accéder au matériel génétique. Il est attendu de ce projet la validation chez une espèce non-rongeur proche de l’homme du potentiel de délivrance d’ONs thérapeutiques grâce à leur couplage à des molécules « vecteurs ». Cette validation préliminaire doit permettre à notre équipe de proposer cette technologie pour une application thérapeutiques à grande échelle. A terme, ce projet vise à apporter et valider une solution innovante pour traiter de façon ciblée et efficace l’origine génétique de nombreuses pathologies, notamment neuromusculaires.

Procédures

Les 9 animaux seront soumis aux mêmes manipulations : - 2 Captures dans leur groupe sociale à l’aide des tunnels de capture et des techniques de renforcement positif. Durée totale de l’intervention 1h/animal/capture. Les perfusions et les biopsies se feront sous anesthésie générale. Après intubation orotrachéale, l’animal sera mis sous Sévoflurane. Durée totale de l’intervention 25’/animal. - Une perfusion pendant 30 minutes. Durée totale de l’intervention 1h/animal - 6 biopsies musculaires sur trois muscles différents (2 par muscle) sur le même membre pelvien : gastrocnémien, quadriceps et tibial antérieur. Durée totale de l’intervention 1h/animal/pour les 3 biopsies

Impact sur les animaux

La perfusion et les biopsies se feront sous anesthésie générale. Des complications lors de l’anesthésie des animaux sont rares mais possibles (ex. : arrêt cardiaque ou respiratoire). Aucun effet délétère est attendu à l’issue de la perfusion intraveineuse des différents produits. Aucune toxicité d’origine pharmacologique (liée à l’inhibition de l’expression de SOD1) n’est à attendre d’une administration unique, compte tenue du mode d’action transitoire des molécules administrées et de leur élimination progressive. Le volume de perfusion (5mL/Kg) est en accord avec la littérature existante pour éviter tout risque d’hypervolémie. Les prélèvements de tissu musculaire se feront sous anesthésie générale. Le risque d’infection est réduit mais possible. Dans ce genre d’intervention le risque d’hémorragie est minime mais possible. Après la perfusion et les biopsies, les individus resteront pendant 24h et 48h sous surveillance en infirmerie avec un congénère de leur groupe social (e.g. la mère) pour réduire au maximum le stress potentielle liée à la séparation de son groupe d’origine.

Devenir

Une fois la procédure finie, les animaux intégreront la colonie de babouins olive de notre établissement et seront inclus dans des programmes de reproduction ou expérimentaux selon la demande de la communauté scientifique.

Remplacement

L’évaluation de l’efficacité et de la sécurité des produits de santé destinés à l’Homme doit être réalisée chez une espèce rongeur et une espèce non rongeur avant de faire une demande d’investigation chez l’Homme en clinique. La capacité du conjugué vectorisé C5-siSOD1 à éteindre l’expression du gène SOD1 a déjà été démontrée sur différents modèles cellulaires in vitro puis confirmée in vivo chez le rongeur. Afin de pouvoir proposer à l'industrie pharmaceutique cette technologie de vectorisation d’ONs thérapeutique, le Sponsor doit maintenant établir la preuve de son efficacité et innocuité chez une espèce non rongeur proche de l’Homme. Ce projet s’inscrit donc dans une démarche de développement préclinique, en confirmant chez une espèce de primate la capacité du conjugué vectorisé C5-siSOD1h à éteindre l’expression du gène SOD1 après administration systémique.

Réduction

La conception de ce projet a non seulement visé à réduire au maximum l’utilisation des primates, mais aussi de limiter les interventions à des manipulations transitoires, peu invasives et non terminales. L’expérience acquise chez la souris permet de réduire le nombre de primates dans chaque groupe à trois, car des grands effets du traitement sont attendus. Pour réduire le nombre d’individus seuls des mâles seront utilisés pour ce projet (pour éviter tout éffet potentiel du sexe sur la variable étudiée). Un nombre minimal de 3 groupes a été retenu, soit un total limité à 9 animaux: - 1er groupe recevant une perfusion d’un siARN non vectorisé, le N6-siSOD1h. - 2ème groupe recevant une perfusion d’un siARN vectorisé, le C5-siSOD1h. - 3ème groupe «contrôle» recevant une solution tampon phosphate (PBS).

Raffinement

Les animaux seront manipulés seulement à trois moments : lors de la perfusion et au moment des deux biopsies. Les trois manipulations se feront sous anesthésie générale et placés sur une surface chauffante. Après intubation orotrachéale, l’animal sera mis sous Sévoflurane. Toutes les interventions seront réalisées par l’équipe de vétérinaires de l’établissement utilisateur. Aucun effet négatif n’est attendu concernant les produits perfusés. Les zones d’incision seront tout d’abord tondues, nettoyées et désinfectées. Seulement 100 mg de muscle squelettique seront preleves a chaque biopsie après avoir réalisé une petite incision cutanée pour accéder au muscle. En début de chaque intervention, une analgésie sera assurée. Ce genre de biopsie n’est habituellement pas douloureux en post-opératoire et ne nécessite pas de traitement antalgique de manière systématique. L’animal sera gardé, toutefois, sous surveillance 48h en zone d’isolement avec un congénère, et évalué quotidiennement par l’équipe de zootechnie et l’équipe vétérinaire. En cas de signes de douleurs, un traitement antalgique pourra être initié. Au bout de 48h, si la récupération est validée par l’équipe vétérinaire, l’animal pourra être réintroduit dans son groupe. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires. Concernant la perfusion, les individus resteront sous surveillance 24h avec un congénère (e.g. la mère) avant d’être réintégrés dans leur groupe d’origine. Ils seront réintroduits dans leurs groupes sociaux suivant la procédure validée par la Structure en charge du Bien-Être Animal de l’établissement utilisateur et sous surveillance accrue du vétérinaire. Les captures des individus dans leurs groupes sociaux se feront à l‘aide d’un système de tunnels et des techniques de renforcement positif. Les individus ciblés seront transférés à l’aide d’un nid de capture en infirmerie où ils seront induits dans des cages à fond amovible.

Choix des espèces

Le babouin olive est un modèle bien connu dans la recherche biomédicale. Cette espèce de primate reste au jour d’aujourd’hui l’espèce la plus accessible dans notre établissement. Par sa grande taille elle permet facilement la réalisation de plusieurs biopsies des muscles squelettiques sur un même individu. Les animaux utilisés dans cette étude seront tous des individus juvéniles entre 3-4 kg. Les produits perfusés le sont à une concentration 5 mg/kg. Cette concentration a été calculée par rapport à des études précédentes chez la souris. Ces produits doivent être synthétisés au laboratoire, donc nous sommes limités par la quantité de produit. L’utilisation des jeunes babouins olive s’explique par le compromis entre poids de l’animal (capacité de synthétiser les molécules à perfuser) et leur volume musculaire (capacité de faire 3 biopsies sur le même membre pelvien).