Procédures légères

13 800 animaux non-humains vont être utilisés, dont des chiens, des chats, des furets, des souris, des cobayes et des hamsters, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des vaccins en cours de développement puis subissent prises de sang, biopsies de peau, ponctions d'organes lymphoïdes et écouvillonnages nasaux, buccaux, rectaux, vaginaux et oculaires, pour des tests d'efficacité et d'innocuité. Une partie sera tuée pour des prélèvements terminaux, la majorité étant réutilisée dans un autre projet d'épreuve virulente, une minorité de carnivores et de cobayes pouvant être adoptée. Le porteur qualifie la procédure de "stricte nécessité" imposée par la réglementation.

Objectifs

De nos jours, les animaux domestiques comme les animaux d’élevages sont de plus en plus nombreux à être exposés à des agents pathogènes en perpétuelle évolution. Face à l’essor des résistances aux antibiotiques et la volonté d’en réduire leurs utilisations, le développement de produits immunologiques comme les vaccins sont indispensables. Pour cela, la réglementation impose d’évaluer l’efficacité et l’innocuité (qualité) des produits sur l’espèce de destination (pour lequel le produit est destiné). Ce projet consiste à évaluer la réponse immunitaire (autrement dit l’efficacité) et l’innocuité de différents produits immunologiques (nouveaux produits ou mise à jour de produits déjà sur le marché). Il s’agira donc de mieux connaître et comprendre les produits en évaluant différentes voies d’administration, doses et/ou avec différentes formulations (ex: adjuvants/excipient). Cette procédure permettra de mieux définir et caractériser le produit.

Bénéfices attendus

Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits immunologiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les requis pour la mise sur le marché de ces produits. Ce projet s’inscrit dans la prévention de maladies pouvant être graves et causer de la souffrance animale. A long terme, les produits immunologiques ainsi développés permettent de protéger les espèces de carnivores domestiques contre un agent pathogène par la réduction des signes cliniques de maladie voire la mortalité ainsi que par la réduction de sa propagation auprès de ses congénères et de l’Homme (dans le cas de zoonoses). Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de cette procédure seront la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, innocuité, efficacité, mécanisme d’action) ainsi que la réalisation des études réglementaires permettant la mise sur le marché de ces produit.

Procédures

Le nombre d’interventions dépend de la durée de l’étude et leur fréquence est conforme aux procédures internes. La durée des études vaccinales peut aller de 1 jour (cinétique de suivi de la réponse immunitaire précoce qui nécessite l’analyse de facteurs tels que les cytokines) à 2 ans (étude de la durée d’immunité après boost vaccinal), la durée moyenne et la plus fréquente étant de 49 jours. Concernant la durée des interventions sur animaux : les seules administrations prévues sont les vaccinations, qui concernent toutes les espèces, qui se font sans anesthésie et qui durent entre 3 et 30 secondes, les prélèvements de sang (toutes espèces), sans anesthésie chez le chien, avec anesthésie chez le chat et le furet (durée anesthésie 5 min) et qui durent de 10 à 30 secondes, les biopsies dermiques (toutes espèces, avec anesthésie de 5 minutes), durée de la biopsie 5 minutes, chez les chiens, chats et furets : biopsies et ponctions d’organes lymphoïdes, 30 minutes d’anesthésie, durée 5 minutes pour la biopsie, 3 minutes pour la ponction, chez les chiens, chats et furets : prélèvements nasaux, par écouvillonnage (chien sans sédation sauf si animal agité, chat et furet sous anesthésie de 5 min), durée de l’écouvillonnage 10 secondes ; ou par lavage (sous anesthésie 5 minutes) de durée 1 minute, chez les chiens, chats et furets : prélèvements buccaux (sans anesthésie) par écouvillonnage (durée 10 secondes) ou par prélèvement salivaire (durée 30 secondes), chez les chiens, chats et furets : prélèvements rectaux (sans anesthésie) par écouvillonnage (durée 10 secondes), chez les chiens, chats et furets : prélèvements vaginaux (avec anesthésie chez le furet, 5 minutes) par écouvillonnage (durée 10 secondes), chez les chiens, chats et furets : prélèvements oculaires par écouvillonnage de la muqueuse oculaire (sans anesthésie, durée 10 secondes) ou par lavage de la muqueuse oculaire (sous anesthésie, 5 minutes), durée 10 secondes, chez les chiens et les chats : prélèvements urinaires par sondage (sans anesthésie chez le chien mâle, avec anesthésie 5 minutes dans les autres cas (durée du sondage 1 minute chez le chien mâle, 2 minutes chez le chien femelle et chez les chats) ; ou prélèvement urinaire par ponction de la vessie (sous anesthésie 10 minutes), durée de la ponction 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une légère douleur transitoire aux sites d’injection lors de l’administration du produit testé, d’anesthésique ou de médication, liée à l’introduction d’une aiguille (ex : sous cutanée, intra-musculaire…). En revanche pour d’autres voies d’administration telles que intraoculaire ou intranasale, ou lors de certains prélèvements (exemple sondage urinaire), une anesthésie sera mise en place afin de prévenir tout stress ou douleur. Suite à l’administration du produit testé, les animaux pourront présenter des signes cliniques locaux et/ou généraux, qualifiés d’effets indésirables transitoires connus des vaccins comme une réaction cutanée locale (prurit, œdème, tuméfaction, nodule, douleur à la palpation), des réactions systémiques transitoires (perte de poids, réduction de consommation alimentaire). Ces nuisances pourront être répétées car plusieurs administrations pourront être réalisées selon la posologie envisagée (schéma vaccinal). Le suivi de la température par voie rectale pourra causer de l’inconfort temporaire et/ou de la douleur transitoire. Enfin, lors du suivi régulier des animaux, les nuisances envisagées seront fonction du type de prélèvements réalisés telles qu’une légère gêne (ex : lavage/écouvillon nasal), ou douleur transitoire liée à l’introduction de l’aiguille (ex : prise de sang), le cas échéant.

Devenir

Les carnivores domestiques, ainsi que les cobayes qui auront reçu uniquement un produit connu, sans impact sur l’environnement et suivi via des marqueurs biologiques par prélèvement pourront faire l’objet d’un replacement ou adoption. La majeure partie des carnivores domestiques sera réutilisée dans un autre projet afin d’évaluer l’efficacité des produits testés face à une épreuve virulente exigée par la réglementation. La majorité des rongeurs utilisés sera réutilisée dans autre projet afin d’évaluer l’efficacité des produits testés face à une épreuve virulente ou euthanasiée à la fin du projet dans le but de collecter des prélèvements terminaux (sérum, tissus, organe) afin de développer un test sérologique (test de libération sur l’espèce non cible) ou évaluer l’activité immunologique des produits pour mieux comprendre leur mécanisme d’action.

Remplacement

Cette procédure a un caractère de stricte nécessité : elle ne peut pas, pour le moment, être remplacée par des méthodes alternatives car elle répond à l’obligation réglementaire ou scientifique d’être conduite sur l’espèce de destination du produit ou sur un modèle de rongeurs le cas échéant. Néanmoins, cette procédure pourrait permettre de substituer le test de libération sur modèle rongeur avec épreuve virulente par des tests de libération sans recours à une épreuve virulente, ce qui constitue une alternative ex vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux envisagés dans cette procédure à été défini à son minimum : -soit en conformité avec la réglementation et la pharmacopée -soit étayé à l’aide d’un raisonnement scientifique et/ou d’une analyse statistique et/ou d’une recherche bibliographique permettant l’atteinte de l’objectif du projet. Il est également évalué en fonction du développement des projets de recherche sur les 5 ans à venir. Par ailleurs, lorsque cela est possible, un groupe contrôle unique (qui n’a pas reçu le produit) sera commun à plusieurs essais répétés.

Raffinement

Les mesures de raffinement utilisées sont : -Une période d’acclimatation adaptée aux conditions de l’étude -Hébergement des animaux en groupe de manière à ne pas induire un stress d’isolement et renforcer le comportement social intra-espèce. -Habituation et socialisation des animaux (standard à renforcée) -Enrichissement des box afin d’améliorer le confort des animaux (musique, jouets adaptés…). -Selon le produit et l’étude, possibilité d’utiliser un sédatif/anesthésique pour soit l’administration, soit les prélèvements, soit les 2, selon les caractéristiques du produit et l’instruction d’utilisation en vigueur. Une surveillance sera mise en place jusqu'au réveil complet de l’animal. -Médication : selon le produit, l’objectif de l’étude et l’impact scientifique, l’utilisation d’anti-douleur sera étudiée au cas par cas et selon les caractéristiques du produit. -Adaptation du type de nourriture afin de faciliter l’alimentation des animaux (pâtée). -Observation quotidienne des animaux et examen/suivi clinique effectué aussi souvent que cela sera jugé nécessaire avec une fréquence qui pourra être augmentée en cas de besoin (en particulier pour le suivi d’innocuité). -Mise en place de points limites adaptés et précisément définis qui pourront être réévalués en fonction des observations recueillies.

Choix des espèces

De façon réglementaire, l’efficacité et l’innocuité d’un produit doit être établie sur l’espèce cible (chien, chat et furet). Des essais préalables pourront être réalisés sur des modèles rongeurs afin de limiter le nombre de carnivores à utiliser. Des jeunes animaux sevrés sont utilisés car il s’agit d’une part du stade de développement permettant d’obtenir les résultats les plus pertinents en matière d’immunité mais il s’agit aussi du stade revendiqué pour l’administration du produit selon les besoins vétérinaires recueillis sur le terrain. Dans le cadre du développement de produits chez des animaux très jeunes, les procédures pourront être conduites sur des carnivores domestiques sevrés plus précocement.

285 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un poinçon à l'oreille, six prises de sang dans la veine faciale espacées de quatorze jours et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, pour tester une immunothérapie fondée sur le parasite Neospora caninum contre le carcinome ovarien. Le porteur indique qu'une ascite peut se développer au-delà de 45 jours et provoquer des douleurs, les souris dépassant 20 % de gain de poids étant alors mises à mort. Sur le remplacement, il conclut que les approches in vitro et les organoïdes ne reproduisent pas le "modèle de régulation complexe" recherché.

Objectifs

Le projet, basé sur l’efficacité d’un microorganismee en immunothérapie antitumorale, a déjà montré sa pertinence et son efficacité dans un modèle d’étude de tumeur solide et dans des modèles précliniques murins de cancers de mauvais pronostics. Plusieurs stratégies ont été développées au sein de notre laboratoire afin de contrôler le développement de tumeurs solides, ici appliquées au carcinome ovarien chez la souris. Des premières données ont été obtenues démontrant la capacité du microorganisme à réduire le développement tumoral par différents mécanismes ayant des actions complémentaires. L’objectif du présent projet est d’optimiser cette nouvelle approche d’immunothérapie notamment dans le but de se rapprocher de ce qui est observer en clinique en termes de délai de prise en charge des patients mais également d’améliorer son efficacité. Nous avons d’ores et déjà obtenus au sein de l’équipe des microorganismes capables de sécréter des molécules d’intérêt en immunothérapie qui doivent maintenant démontrer leur supériorité en termes de protection en modèles précliniques murins dont le carcinome ovarien.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une inhibition totale du développement tumoral en faisant sécréter par Neospora caninum une ou plusieurs molécules immunothérapeutiques d’intérêt contre le carcinome ovarien. Le but ultime étant de démontrer également son efficacité lors d’une prise en charge tardive ce qui laisserait envisager une nouvelle issue thérapeutique pour les femmes atteintes de cancer ovarien.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à une identification individuelle par poinçon à l'oreille (moins d'une minute / animal), six prises de sang espacées de 14 jours dans la veine faciale (environ 1 minute / animal), de une à cinq injections par voie intrapéritonéale espacées de 14 jours (moins d'une minute / animal).

Impact sur les animaux

La souris, tout comme l’homme, n’est pas un hôte naturel de ce protozoaire (WTNEO) et y est résistant avec une prise en charge rapide par son système immunitaire. Jusqu’à présent, les recombinants testés ont sans exception montré une virulence comparable, c’est-à-dire le plus souvent sans aucun signe clinique. Il peut parfois être observé une légère asthénie pendant 2 à 3 jours. Cependant, si des signes cliniques devaient survenir à la suite de l’infection (5 à 10 jours après), ceux-ci seraient les suivants : asthénie prolongée, prostration, hyporéactivité, piloérection, perte de poids supérieure à 15%. Concernant le développement tumoral, d’après les données bibliographiques, aucun signe de douleur particulier n’est détecté au cours des 45 premiers jours du protocole expérimental. Au-delà de ce temps, une ascite peut se développer reflétant le développement d’une tumeur solide sur les ovaires, ce qui peut entrainer des douleurs ou de la souffrance inutile pour les animaux.

Devenir

A l'issu des procédures les animaux seront mis à mort afin d'étudier la protection conférée en termes de croissance tumorale (nécessité de prélever la tumeur située sur les ovaires et l'omemtum) et également d'étudier la réponse immunitaire associée à cette protection ( prélèvement des rates, ganglions mésentériques, ganglions inguinaux, tumeur).

Remplacement

Une approche in vitro a été développée en amont afin de valider notre hypothèse de travail et l’utilisation de tachyzoïtes sur des cellules immunitaires impliquées dans le contrôle de la tumeur mais cela ne reproduit pas un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie. Des modèles d’organoïdes sont également en cours de développement dans le laboratoire afin d’étudier certains mécanismes.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et nos données préliminaires. L’étude statistique des résultats entre les lots de souris implantées traitées ou non (les lots contrôles ne sont pas intégrer dans les études statistiques, ce sont des animaux utilisés comme référence interne à titre indicatif mais cependant nécessaire dans les dosages effectués) sera réalisée avec le test non paramétrique pour l’étude de la réponse immunitaire cellulaire (dosage de cytokines) ainsi que pour l’étude de protection liée du développement tumoral qui est notre critère d’étude principal.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Le modèle de développement tumoral a été choisi est pour être le moins lourd en termes de procédures pour l’animal (injection intrapéritonéale et non chirurgie orthotopique des cellules tumorales). Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Ainsi que d’un enrichissement ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique des points limites. L’apparition d’une ascite liée au développement tumoral est possible à partir de 45 à 60 jours, dès lors un suivi journalier et une pesée 3 fois par semaine seront effectués pour détecter aux plus tôt l’apparition de signes cliniques modérés à sévères (absence de toilettage, apparition de poils hérissés, hyporéactivité, dos voûtés et un gain de poids rapide, supérieur à 20%, associé à une dilatation visible de l’abdomen) qui conduira à la mise à mort sans délai des animaux (si un signe sévère ou plusieurs signes modérés cumulés). Concernant le traitement par Neospora caninum, celui-ci n’est pas reconnu ni dans la littérature ni par notre expérience pour induire de symptômes chez la souris. Jusqu’à présent, les recombinants testés ont sans exception montré une virulence comparable, c’est-à-dire le plus souvent sans aucun signe clinique. Il peut parfois être observé une légère asthénie pendant 2 à 3 jours. Cependant, si des signes cliniques devaient survenir à la suite de l’infection (5 à 10 jours après), ceux-ci seraient les suivants : asthénie prolongée, prostration, hyporéactivité, piloérection, perte de poids supérieure à 15% et conduiront à la mise à mort sans délai des animaux. Tout type de médication pouvant interférer avec l’étude de la réponse immunitaire et/ou la multiplication parasitaire est proscrit.

Choix des espèces

Le modèle d’implantation de tumeur est déjà établi et maîtrisé chez la souris qui est un modèle adapté à la greffe de cellules tumorales syngéniques. De plus, tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Ce modèle de cancer ovarien reproduit avec fidélité le développement du cancer humain. Adulte. Il n’y a pas la nécessité d’utiliser des animaux plus jeunes ou gestants

50 souris vont être utilisées, trente-cinq tuées à l'issue et quinze réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Trente-cinq reçoivent une pompe implantée diffusant un composé censé induire une schizophrénie, puis passent cinq tests comportementaux d'interaction sociale, d'anxiété et d'anhédonie, avant d'être tuées pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les animaux traités montrent un retrait social et sont isolés, les quinze souris visiteuses étant gardées pour d'autres projets. Il affirme que l'étude de la cognition sociale ne peut se faire ni par ordinateur ni hors des mammifères.

Objectifs

La schizophrénie (SCZ) est un trouble de santé mentale fréquent, chronique, grave et invalidant, caractérisé par des symptômes positifs et négatifs (trouble cognitifs et retrait social). De plus, près des 2/3 des patients schizophrènes sont résistants au traitement par des antipsychotiques. Les substrats cérébraux des dysfonctionnements négatifs et cognitifs restent peu clairs. En effet, on retrouve des dysfonctionnements du cervelet, testé en imagerie par résonnance magéntique fonctionnelle (IRMf) de repos, chez les patients schizophrènes en lien avec les symptômes négatifs . De plus, des stimulations du cervelet par TMS (méthode non-invasive magnétique), effectuée par nos collaborateurs permettent de réduire ces symptômes négatifs. Une meilleure compréhension de la neurobiologie sous tendant les effets de la stimulation du cervelet sur les symptômes négatifs permettra de mieux cibler les stimulations chez l’homme. Pour répondre à cette question, nous devons passer sur un modèle animal afin de trouver les bases neurobiologiques du fonctionnement de la stimulation et tester et comparer différents protocoles de stimulation. Nous avons précédemment démontré des troubles de la cognition sociale et de la communication en utilisant un modèle préclinique de schizophrénie via l’injection aigue d’un antagoniste des récepteurs NMDA MK-801 chez la souris . Notre objectif est ici de confirmer ces déficits cognitifs dans le modèle chronique d'infusion de MK-801 avant de pouvoir envisager de voir les dysfonctionnements du cervelet.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de determiner la pertinence du modéle chronique MK-801 comme permettant de modéliser les altérations sociale de la schizophrénie. Ceci nous permettra alors de poursuivre ces travaux en collaboration avec nos collègues.

Procédures

une procédure chirurgicale d'implantation de puces RFID et de minipompe est réalisée .Nous ouvrons la peau au niveau du dos et insérons une puce RFID et une mini-pompe osmotique , l'incision est ensuite recousue. Nombre 1, durée 5 min. 5 tests de comportements seront réalisés. Le test d’interaction sociale, durée 40 min, le test des 3-chambres (3-CH), durée 2 fois 20 min, un test de comportement social d’une durée de 3 jour, un test d’anxiété d’une durée de 5min puis un test d’anhédonie d’une durée de 3 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances principales seront un isolement, à l'age adulte des animaux, et une modification probable du comportement social des animaux MK-801 avec un retrait social.

Devenir

les animaux expérimentaux (35) seront euthanasiés et leur cerveau prélevés. Les 15 animaux visiteurs seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets. en fonction de l’avis du responsable de projet et l’avis du vétérinaire référent.

Remplacement

Les objectifs de ce projet étant d'étudier l'altération de la cognition sociale et de l’organisation d’interaction sociale dans un groupe chez des animaux modéle de schizophrénie, il ne peut donc pas être remplacé par des modélisations informatiques, ni être conduit chez des espèces autres que les mammifères.

Réduction

Nous utilisons uniquement un groupe restreint d'animaux traités (20 animaux expérimentaux) car nous voulons juste savoir si le modéle est pertinent, sans pour autant utiliser trop d'animaux. De plus, nos experiences précédentes montrent que 20 animaux permettront une analyse avec des tests statistiques et de prendre en compte la variabilité de réponse au traitement des animaux.

Raffinement

Nous allons faire des protocoles complexes et utiliser des materiels innovant permettant de dissequer précisement le comportement social en vue de bien caracteriser les déficit sur un groupe restreint d'animaux. Tout les animaux sont élévés dans des cages avec de l'enrichissemnent (papier/coton) et une cachette. Au niveau de la procédure chirurgicale, il sera utilisé un anesthésiant gazeux et anesthésique local pour les incisons de la peau, un antalgique en cas de douleur détectée selon une grille d’évaluation de la douleur.

Choix des espèces

Le choix de la souris est dû au fait que ces animaux ont des capacités cognitives et sociales adaptées aux questions posées dans le projet. Notre projet entend modéliser des alterations cognitive équivalent à ceux de patients adultes, donc les animaux seront utilisés à l'age adulte

71 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent par chirurgie une greffe de cellules de foie humain dans la rate, puis un régime déclenchant une maladie des voies biliaires pendant six semaines, avec cinq injections d'anticorps et des prélèvements de sang hebdomadaires. Le porteur indique que les prélèvements sanguins peuvent provoquer une cécité et que les foies sont récupérés après mise à mort, y compris chez les animaux dont la greffe a échoué. Il affirme qu'aucun système cellulaire ne reproduit une maladie biliaire menant à la fibrose, ce qui imposerait le modèle animal.

Objectifs

Bien que rare individuellement, les maladies de l’arbre biliaire du foie représentent jusqu’à 80% des indications de transplantation hépatique pédiatrique et environ 20% chez l’adulte. La cholangite sclérosante primitive (CSP) est une maladie de l’arbre biliaire affectant principalement les personnes jeunes avec une prévalence estimée à 16,2/100.000 en Europe. Dans cette pathologie, une inflammation, une cholestase (rétrécissement des voies biliaires) et une fibrose (cicatrisation du foie) sont établies. Au cours de l’évolution de la maladie, le rétrécissement des voies biliaires du foie altère la fonction de l’arbre biliaire conduisant à une cirrhose et une insuffisance hépatique. Avec un risque de développer un cholangiocarcinome, le 2ème cancer du foie le plus fréquent, la CSP est considérée comme une maladie pré-maligne. A ce jour, la transplantation hépatique est la seule solution thérapeutique, présentant malgré tout un risque de récidive de CSP dans 25% des cas. Il est donc urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour la CSP. Nous souhaitons ainsi utiliser un modèle murin au foie humanisé pour tester l’efficacité d’un anticorps dirigé contre une protéine exprimée à la surface des cellules du foie. Cet anticorps s’est déjà montré efficace dans des modèles animaux de fibrose hépatique, et de cancer du foie. Dans ce projet nous souhaitons donc utiliser le modèle de souris au foie humanisé afin d’évaluer l’effet de notre anticorps sur l’arbre biliaire humanisé.

Bénéfices attendus

Ce projet doit nous permettre de démontrer l'efficacité de notre anticorps dans les cas de CSP. Cet anticorps étant déjà en développement clinique pour le traitement de la fibrose dans les cas de stéato-hépatite non alcoolique plus connue sous le terme maladie du foie gras ou maladie du soda, et pour le traitement du carcinome hépatocellulaire cancer du foie le plus fréquent, cette étude nous permettrait d'envisager une extension des indications thérapeutiques afin de faire bénéficier un maximum de patients de cette option de traitement.

Procédures

Les animaux recevront tout d’abord une injection afin d’améliorer la prise de greffe des cellules humaines. Cette injection est réalisée sur animaux anesthésiés et ayant reçu une analgésie locale et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux seront ensuite soumis à une petite chirurgie permettant la greffe de cellules de foie humain. L’injection de cellules de foie humain est réalisée dans la rate des animaux après anesthésie générale et analgésie. Cette chirurgie est réalisée en moins de 10 minutes. Un prélèvement de sang sous anesthésie générale et analgésie locale sera réalisé 3 mois après la greffe afin de nous assurer de la prise de greffe. Ce prélèvement prend moins d’une minute à être réalisé. Les animaux seront ensuite soumis à un régime induisant la maladie pendant 6 semaines au cours desquelles ils recevront une injection hebdomadaire d’anticorps à partir de la 2ème semaine de nourriture induisant la CSP, soit 5 injections d’anticorps. Les injections sont réalisées sur animaux vigiles et sont faites en quelques secondes. Les animaux subiront un prélèvement sanguin hebdomadaire, sur animal après anesthésié générale et analgésie locale, pendant 6 semaines, soit 6 prélèvements. Le prélèvement de sang est réalisé en moins d’une minute. Un prélèvement de sang terminal sera effectué en fin de protocole sous anesthésie générale, réalisé en 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux avec une greffe de cellules non efficace vont développer une insuffisance hépatique. Les animaux qui seront sous nourriture induisant la CSP pendant 6 semaines, vont développer un rétrécissement des voies biliaires rapide en 2 à 4 semaines avec une perte de poids. Les maladies hépatiques ne sont pas douloureuses est sont compatibles avec une vie normale, sauf en cas extrême de décompensation des fonctions hépatiques, ce qui ne sera pas le cas avec le protocole adopté dans ce projet. Les animaux recevront un total de 5 injections intrapéritonéales d'anticorps ou de placébo, soit 1 par semaine pendant 5 semaines, ce qui pourrait engendrer inflammation/induration au point d’injection. Les prélèvements de sang prévus dans ce projet peuvent entrainer une cécité, ainsi que les injections intraveineuses.

Devenir

Les animaux reproducteurs dont l’activité de reproduction décroit ont un âge trop avancé pour être utilisé en expérimentation et sont donc mis à mort. Les animaux chez lesquels la prise de greffe est inefficace ne peuvent pas être utilisés dans les protocoles ultérieurs et sont donc mis à mort également. Afin d'analyser l'effet thérapeutique de notre anticorps sur la fibrose biliaire, tous les animaux de chaque groupe devront être mis à mort afin de procéder à la collecte du foie et à un prélèvement sanguin terminal. Ces prélèvements nous permettront d'analyser les fonctions hépatiques (sérum) et le niveau de fibrose du foie suite au traitement.

Remplacement

Aucun système cellulaire actuel ne permet de récréer in vitro le développement d’une pathologie de l’arbre biliaire conduisant à une fibrose hépatique et/ou au cancer du foie. Ainsi notre approche thérapeutique ne peut être testée que dans un modèle animal physiologique complet avant une possible transposition chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant de conclure quant à l’efficacité de notre approche. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire et des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre de manière précoce les procédures permettant de soustraire les animaux à la souffrance si besoin. Les interventions le nécessitant sont réalisées sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi permet de récapituler au plus proche les caractéristiques des maladies de l’arbre biliaire du foie en 3 à 6 semaines. De plus ce modèle permet d’étudier cette pathologie dans un contexte humain grâce à la greffe de cellules humaine de foie. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8-10 semaines au moment de la greffe et entrerons dans le protocole expérimental à un âge de 20-22 semaines. Les animaux sont utilisés à un âge adulte afin de faciliter la procédure de greffe qui se fait par injection des cellules humaines dans la rate des animaux.

5 550 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes reçoivent de l'acide valproïque ou un agent immunitaire pour que leur descendance développe des traits autistiques, testés par des épreuves de locomotion, de sociabilité, d'anxiété et de compulsivité répétées jusqu'à six fois. Le porteur indique que les mères sont tuées après le sevrage et que les petits sont euthanasiés pour prélever des structures cérébrales, une perte de poids supérieure à 15 % déclenchant la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe pour l'autisme et que le recours au rongeur vivant s'impose.

Objectifs

Les Troubles du Spectre Autistique (TSA, dont font partie notamment l’autisme, le syndrome de l’X fragile, le syndrome d’Asperger...) sont considérés comme des maladies du développement du système nerveux qui se manifestent dès la petite enfance (premiers signes entre 18 et 36 mois). Cette pathologie se traduit par des troubles du comportement (mouvement répétitifs, autoagression...), par des troubles d’interaction sociale (peur de la nouveauté, hypersensibilité à l’environnement…), par des problèmes de communication (trouble du langage), qui ne sont pas systématiquement associés à des retards intellectuels. A ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux contre les TSA. L’objectif va être de tester par des études comportementales et/ou neurochimiques de nouvelles molécules issues de notre centre de recherche sur des modèles de rongeurs développant des TSA : -Une exposition prénatale à l’acide valproïque chez le rat ou la souris provoque des altérations comportementales similaires à celles observées chez des patients présentant des TSA : déficit d’interaction sociale, mouvements répétitifs… -Certaines souches de souris présentent de nombreux traits comportementaux mimant ceux de l'autisme chez l'homme, comme des problèmes de sociabilité, de communication et des comportements répétitifs. -Chez le rat ou la souris, une réponse immunitaire induite chez la femelle gestante perturbe la neurogénèse et induit chez la descendance des perturbations comportementales et neurologiques associées au TSA.

Bénéfices attendus

La correction d'un des signes de troubles du spectre autistique par une de nos nouvelles molécules dans un modèle animal permettrait de valider le concept et ainsi permettre de continuer le développement de cette nouvelle molécule avec une indication thérapeutique qui ne possède pas à ce jour de traitement.

Procédures

Des femelles gestantes vont recevoir un traitement pharmacologique afin d'obtenir une descendance présentant des symptomes proche des troubles du spectre autistique. La détermination de certains symptômes autistiques chez les animaux se fera grace à une série de tests comportementaux (activité locomotrice, sociabilité, anxiété, compulsivité). Ces tests d'une durée maximale de 20 minutes par animal peuvent être répétés jusqu'à six fois sur la durée totale de la procédure (animaux gardés au maximum 4 mois). Avant chaque test de comportement les animaux pourront recevoir une administration des molécules à tester. Dans le cadre de la procédure "neurochimie", les animaux vont recevoir une administration aigüe de nouveaux composés à tester avant une mise à mort au maximum 4 h après l'administration du composé.

Impact sur les animaux

Suite à un traitement pharmacologique, les souris gestantes peuvent présenter un mal être transitoire. Ce mal être se traduit par une prostration, des yeux clos. Si cet état se prolonge au-delà de 4 heures après traitement (femelle gestante en allongée sur le flanc malgré la présence d'un tapis chauffant) alors elle est euthanasiée. Les études comportementales peuvent engendrer une légère anxiété chez la souris. Ces tests étant répétés dans la durée (au maximum 6 fois étalées sur une durée de 4 mois), un suivi pondéral des animaux est effectué : les animaux présentant une perte de poids supérieures à 15% sur une semaine sont euthanasiés. Par ailleurs les animaux présentant des signes d'agressivité ou des mutilations sont également euthanasiés. Même si elles ont fait l’objet d’une sélection au préalable, nos nouvelles molécules à tester pourraient présenter des risques de toxicité aigüe. Une surveillance continue est effectuée jusqu'à 4 heures après administration des produits à tester.

Devenir

Les femelles ayant reçu un traitement pharmacologique durant la gestation sont euthanasiées après sevrage des petits. En effet, ces femelles ne peuvent pas être incluses dans les procédures car elles ne développent pas de trouble autistique. A la fin des études compotementales les animaux sont euthanasiés ou sont utilisés pour la procédure "étude neurochimique". Dans le cadre des études de neurochimie, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le différentes structures centrales d'intérêt.

Remplacement

Aucune donnée scientifique relative aux aspects étudiés n’est disponible pour les composés de recherche qui seront investigués. La nature des troubles de spectre autistique requière la mise en place de modèles in vivo afin de pouvoir apporter des données comportementales d'efficacité potentielle de candidat médicament. A ce jour aucun modèle in vitro n'a été décrit dans ce domaine.

Réduction

Afin de limiter le nombre de lots et d'animaux à utiliser, une sélection au préalable des nouvelles molécules à tester a été réalisée en tenant compte des données de pharmacocinétique et des tests in vitro. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Un même animal va pouvoir être testé dans plusieurs études comportementales et également être inclus dans la procédure neurochimie.

Raffinement

Une fois par semaine, lors du change des animaux, une feuille de Suivi de Bien-Être Animal est remplie en fonction d'une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu'une action puisse corriger ces déviations, alors l'euthanasie de l'animal est envisagée. Ces grilles de critère bien-être animal sont archivées.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. Concernant le modèle VPA : les mères gestantes reçoivent une administration de valproate de sodium entre le 9ème et le 15ème jour de gestation selon la littérature. Les études comportementales et/ou neurochimiques sont menées sur les descendants mâles de ces mères après le sevrage. Pour le modèle BTBR, les études portent sur des animaux âgés au minimum de 6 semaines. Dans le modèle Poly(I:C), les femelles gestantes reçoivent une administration de Poly(I:C) entre le 9ème et 12ème jour de gestation selon la littérature. Les études comportementales et/ou neurochimiques sont menées sur les descendants mâles et femelles de ces mères après le sevrage.

1 293 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des ratons nouveau-nés subissent jusqu'à sept injections dans le ventre ou sous les paupières pour induire trois modèles de rétinopathie du prématuré, par hyperglycémie, excès d'oxygène ou inflammation, avant un examen de la vue sous anesthésie. Le porteur indique qu'une glycémie supérieure à 20 mmol/L ou une perte de poids de 10 % déclenche la mise à mort, les yeux étant prélevés après euthanasie. Il affirme que les études sans animaux ne reproduisent pas la complexité de la rétine et de ses interactions, ce qui rendrait le recours au rat "nécessaire".

Objectifs

La rétinopathie du prématuré est la principale maladie oculaire du nouveau-né et une des causes principales de déficience visuelle sévère de l’enfant. Il s'agit d'une maladie multifactorielle du développement rétinien, dans laquelle l’exposition à des quantités excessives d’oxygène, une inflammation/infection ou une hyperglycémie, qui sont des complications fréquentes de la grande prématurité, jouent un rôle important. Notre stratégie vise à atténuer les effets néfastes de l'hyperglycémie et de l'exposition excessive à l'oxygène sur la rétine en développement, grâce à la régulation d’une protéine de l’immunité, identifiée ces dernière années comme un facteur protecteur contre diverses agressions, notamment le stress oxydatif et l'inflammation. L’expression de cette protéine reste faible dans la rétine dans un modèle de rétinopathie induite par l’hyperglycémie néonatale, en comparaison de son expression dans la rétine de rongeurs et d'humains adultes diabétiques. Le but de ce projet est d'évaluer cette molécule comme cible thérapeutique dans la rétinopathie du prématuré, et d'étudier le potentiel d’une classe de médicaments déjà utilisés chez l’homme à prévenir les lésions rétiniennes induites par l'hyperglycémie et l'excès d’oxygène, en augmentant son expression. Enfin notre objectif est d’identifier le médicament le plus efficace et le plus sûr ainsi que sa dose optimale, afin de guider le transfert chez l’enfant prématuré de formulations oculaires (gouttes) spécifiques.

Bénéfices attendus

Nous espérons montrer 1) qu’un déficit de la protéine d'intérêt est délétère dans la rétine en développement exposée à un stress oxydatif ou hyperglycémique, qui sont des agressions fréquemment observées chez le prématuré en pratique clinique ; 2) que le médicament étudié, administré localement, permet de prévenir les lésions rétiniennes induites par l'hyperglycémie, l'inflammation et l’hyperoxie en augmentant l'expression de la protérine d'intérêt. Au terme de ce projet, les bénéfices attendus sont l’identification de la molécule la plus efficace et la plus sûr ainsi que sa dose optimale, afin de guider le transfert chez l’enfant prématuré de formulations oculaires (gouttes) de ce médicament et ainsi proposer une nouvelle approche thérapeutique de la rétinopathie du prématuré.

Procédures

Les expériences seront menées chez des ratons nouveau-nés, dont le développement rétinien postnatal est superposable à celui d’un bébé prématuré, grâce à trois modèles de rétinopathie (hyperglycémie, inflammation, oxygène) dont les caractéristiques individuelles se complètent, afin de modéliser tous les aspects de la physiopathologie complexe de la rétinopathie de l’enfant prématuré. Les animaux subiront une ou plusieurs (maximum 7) injections intra-péritonéales ou sous-cutanées palpébrales pour induire les modèles de rétinopathie du prématuré et/ou pour administrer le traitement à l'étude au cours de la 1ère semaine de vie (durée d'une injection : moins de 3 secondes). Une partie des animaux sera soumis à une anesthésie générale pour un examen de la fonction visuelle (électro-rétinogramme) pendant 15 minutes. En dehors d'une goutte de sang (prélevée en moins de 5 secondes) pour surveiller le taux de sucre dans le sang pendant 6 jours chez une partie des animaux, il n'y aura pas de prélèvements sur animaux vivants. Aucune procédure chirurgicale n'est prévue.

Impact sur les animaux

Le modèle d’hyperglycémie néonatale nécessite une injection intra-péritonéale au 2ème jour de vie d'un produit qui réduit le nombre de cellules du pancréas. Ce produit induit une hyperglycémie nette et une diminution modérée de l’insulinémie, mais sans altérer significativement la prise pondérale ni l’état général des animaux car elle est utilisée à faible dose. L’hyperglycémie se résout spontanément au bout de 5 à 6 jours ; la mortalité des animaux est très faible. Cependant, le modèle nécessite d’effectuer une surveillance du taux de sucre dans le sang (prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue) quotidienne pendant 5 à 6 jours. Le modèle de rétinopathie induite par l'oxygène consiste à exposer des rongeurs nouveau-nés et leur mère allaitante à des concentrations variables d'oxygène pendant 5 à 14 jours. Le retentissement sur l’état général des animaux et les nuisances sont habituellement faibles. Le modèle de rétinopathie induite par l’inflammation consiste en une injection intra-péritonéale de d’endotoxine au 4ème jour de vie ; le retentissement sur l’état général est transitoire et modéré et les animaux atteignent l’âge adulte avec une santé normale. Les nuisances associées à l’administration du traitement étudié sont la nécessité d’une injection sous-cutanée palpébrale (qui ne concerne donc pas le globe oculaire) car les paupières sont soudées dans les premiers jours de vie. Les effets indésirables décrits de ce traitement chez l'homme sont une sensation de picotement généralement modérée et de courte durée au moment de l’administration ; les autres effets indésirables décrits paraissent peu probables ici car la période de traitement et d’analyse est courte (quelques jours). Les nuisances associées à l’examen de la fonction visuelle sont la nécessité d’effectuer une anesthésie générale (injection intra-péritonéale) le temps de l’examen.

Devenir

Les analyses seront effectuées sur les rétines ce qui nécessite de prélever les yeux post-mortem. Cela implique que tous les animaux devront être euthanasiés par une méthode réglementaire afin d'effectuer ces prélèvements tissulaires. Les mères seront euthanasiées par une méthode réglementaire.

Remplacement

La rétine est un tissu complexe composé de nombreux types cellulaires qui fonctionnent en réseau, et interagissent en permanence avec les autres tissus oculaires et la circulation. Des études in vivo dans des modèles animaux mimant la rétinopathie du prématuré humaine sont nécessaires dans ce projet translationnel visant à établir une preuve de concept thérapeutique chez l’enfant prématuré, car les études in vitro ne permettent pas de prendre en compte la multiplicité de ces interactions, ni les mécanismes complexes en jeu dans cette maladie. Le recours à l'expérimentation animale pour la recherche de traitements efficaces est justifié par les conséquences visuelles graves de la rétinopathie du prématuré.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum, sans toutefois grever la possibilité d’obtenir des résultats exploitables. Nous prévoyons que les expériences nécessiteront au total 1254 ratons nouveau-nés soit au maximum 210 portées, et 39 mères exposées à l'oxygène (+171 mères sans procédure). Chaque fois que possible, nous mettrons des couples en reproduction afin de ne pas euthanasier les femelles. Dans les trois modèles de rétinopathie utilisés, l’absence de manipulation et de douleur oculaires (injection intra-péritonéale) nous permettra d’utiliser, après l’euthanasie, les deux yeux de chaque raton, ce qui divise par 2 le nombre d’animaux nécessaires. Nous utiliserons des techniques permettant l'analyse de plusieurs éléments sur un même prélèvement oculaire : vaisseaux, inflammation, mort neuronale. Les deux yeux de chaque animal seront utilisés pour des analyses complémentaires en biologie moléculaire et en immuno-histochimie. Sur la base de nos résultats précédents, nous n'avons sélectionné que les points de temps les plus pertinents pour les analyses. Le même groupe d’animaux contrôle sera utilisé pour l’analyse de l’efficacité des différentes posologies du médicament étudié. La taille des portées sera homogénéisée à P1 par sélection aléatoire afin de limiter la variabilité expérimentale liée à la croissance. Le fond génétique des rats KO pour la protéine d’intérêt est contrôlé et homogène. Les rats contrôles proviendront des mêmes croisements que les rats mutés. Ces facteurs permettront réduire fortement la variabilité expérimentale, donc le nombre d’animaux nécessaires. Par ailleurs, une collaboration avec une autre équipe de recherche a été engagée pour partage de tissus rénaux dans nos modèles nouveau-nés.

Raffinement

Les femelles gestantes seront reçues à l’animalerie au moins 8 jours avant la date présumée de mise bas pour leur permettre de s’acclimater, et hébergées en conditions stables et adaptées à l'espèce, en stabulation conventionnelle, avec un régime alimentaire spécial femelles gestantes/allaitantes (1 femelle et sa portée par cage). Les cages seront enrichies de nids végétaux. Afin de limiter stress, angoisse et douleur, les nouveau-nés seront manipulés lentement et doucement sous lampe chauffante et les injections seront effectuées en les contenant doucement dans la paume de la main. Au regard de la rapidité d’une injection intrapéritonéale ou sous-cutanée palpébrale, une anesthésie générale ne sera pas effectuée car source d’un inconfort comparable et dangereuse chez les ratons nouveau-nés. Les électrorétinogrammes chez les jeunes adultes seront effectués sur tapis chauffant et sous anesthésie générale et locale. Le comportement des ratons et de leur mère sera observé tous les jours. Dans le cas où les traitements pharmacologiques seraient à l'origine de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité (diminution des mouvements, perte d'appétit/absence de réplétion gastrique, perte de poids, changement d’aspect physique, hypothermie, isolement) le traitement sera interrompu et le raton sera euthanasié. En particulier, les animaux soumis au modèle d’hyperglycémie seront surveillés quotidiennement avec pesée, évaluation de leur santé et mesure de leur glycémie pendant toute la période d’hyperglycémie ; ces éléments seront reportés dans un tableau de surveillance. Une glycémie > 20 mmol/L ou des signes de mauvaise santé (déshydratation, perte de poids de 10% par rapport au poids de la veille, ictère, prostration notamment) entrainera l’euthanasie immédiate des animaux concernés. En revanche, la durée d’expérimentation sera trop courte pour que d’éventuels effets mutagènes à long terme de la streptozotocine aient des conséquences observables cliniquement et constituent des critères d’arrêt dans ce modèle.

Choix des espèces

Les expériences utiliseront des ratons nouveau-nés de J2 à J21 postnatal, dont le développement rétinien correspond à celui d’un enfant prématuré né vers 6 mois ½ de grossesse. La fenêtre pour étudier le développement rétinien est courte chez le rongeur et correspond à la période post-natale immédiate ; il est terminé à 15 jours postnatal. Les différentes caractéristiques de la rétinopathie du prématuré humain peuvent être reproduites en exposant des rats nouveau-nés à de l’oxygène, une hyperglycémie ou une inflammation. Les rats nouveau-nés sont donc particulièrement adaptés pour étudier la rétinopathie du prématuré et en développer des traitements, d'autant plus que des modèles transgéniques peuvent être utilisés.