Procédures légères

240 poussins vont être utilisés, tués à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent une prise de sang au sinus occipital à sept ou dix jours, puis sont tués pour prélever le tube digestif et les organes, afin de tester des additifs alimentaires censés renforcer la robustesse du poulet d'élevage. Le porteur reconnaît que certains régimes testés peuvent provoquer des désordres digestifs. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'animal, tout en présentant le projet comme visant aussi à développer une méthode ex vivo alternative.

Objectifs

Chez le poussin, le passage à une alimentation solide exogène après l’éclosion stimule le développement du système gastro-intestinal et du microbiote. Cette forte plasticité offre une fenêtre unique pour renforcer la robustesse du poulet sur le long terme. Aussi, l'objectif est de développer des stratégies alimentaires précoces contribuant à renforcer la santé et le bien-être des oiseaux en s'appuyant sur un maximum de matières premières locales. L'objectif est d'étudier et de comparer les impacts de différents additifs alimentaires présentant un panel d'activités biologiques (effets antioxydants, anti-inflammatoires, immunomodulateurs ou prébiotiques) sur les fonctionnalités intestinales des jeunes poussins et d'identifier si la nature des aliments utilisés dans l'alimentation interagit avec ces réponses. Nous proposons également de développer une méthode de référence ex vivo alternatif à l'expérimentation animal pour pouvoir évaluer la robustesse des animaux.

Bénéfices attendus

Ce programme contribuera à proposer : -des biomarqueurs de santé pouvant être utilisés pour quantifier la robustesse du poulet et proposer des stratégies de prévention. -un outil d’évaluation de la robustesse des oiseaux pour anticiper les risques. -un socle de connaissances sur la programmation nutritionnelle précoce des fonctionnalités digestives jusqu’à alors peu étudiées. -des recommandations nutritionnelles pour les aliments de démarrage. -Proposer un modèle ex vivo alternatif à l'expérimentation animale

Procédures

Pour l’essai 1, les animaux subiront une seule prise de sang au sinus occipital à J7 (procédure 1). Pour l’essai 2, les prises de sang seront effectuées à J10 (procédure 1).

Impact sur les animaux

Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut engendrer du stress lié à la contention de l’animal et un hématome. Cette procédure est assurée par des personnes expertes qui maitrisent parfaitement la technique réduisant le risque de stress et d’hématome pour l’animal. De plus, les régimes notamment alternatifs intégrant des matières premières plus locales et alternatives au soja (importé) sont susceptibles d’entrainer dans certains cas des désordres digestifs qui pourraient être contre-carrés par l’ajout des additifs testés. Ces désordres sont malheureusement fréquents sur le terrain ; ils affecteraient près de 50% des lots.

Devenir

Suite à la procédure de prise de sang (J7 essai 1 et J10 essai 2), les animaux seront sacrifiés par dislocation cervicale (n = 492) en respectant la règlementation en vigueur (annexe 4 de l’arrêté du 1/02/13). Des prélèvements seront réalisés sur les différentes parties du tube digestif, les organes annexes et digesta sur les animaux.

Remplacement

Les connaissances sur la physiologie digestive du poussin et les effets bénéfiques de l'alimentation sont éparses et ne permettent d'envisager une expérimentation in silico. L’utilisation de l’animal ne peut être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.

Réduction

Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard. L’effectif minimal favorisant les interactions sociales dans un groupe oscille entre 6 et 30 (Collias et al 1966 ; Animal Behaviour). 6 poussins par groupe correspondent à un effectif minimal pour permettre l’expression des liens sociaux. La taille du parquet est suffisante pour permettre aux poussins de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement Le nombre de répétitions (6 parquets/traitement) permettra de détecter une différence de consommation entre traitements de 4 g de prise alimentaire individuelle (moyenne (moy.) = 30 g, écart-type (ET)= 2,5). Un nombre de 22 poussins est nécessaire pour identifier une différence de 15 g de poids corporel (moy.= 190, ET =15). En deçà, les écarts de consommation à cet âge sont mal connus et peuvent entraine un ET important. Si on augmente ne serait-ce que de 1,5 l’ET, soit 16,5, le CV passant de 7,9 à 8,7% ce qui est peu, les 22 permettent de passer la barre des 80% du test Mann & Whitney. Ces nombres minimaux devraient être suffisants pour mettre en évidence un effet significatif des traitements au regard de l’expérience acquise sur des études précédentes concernant ces paramètres. Pour les prises de sang, un effectif de 15 animaux a été retenu s’appuyant sur des résultats antérieurs (Travel et al., 2021 Front Vet Sci) : une différence de 5,47 U/mL d’activité de la SOD au niveau plasmatique a pu être mise en évidence (moy.1= 13,25 ; moy.2 = 7,78 ; ET1=7,1 et ET2=1,18). Dans le second essai visant à développer une méthode alternative à l’expérimentation animale, nous avons estimé que 15 par traitement (14 poussins + 1 poussin supplémentaire pour prendre en compte une mortalité potentielle) est un effectif suffisant en nous appuyant sur des résultats antérieurs (Travel et al., 2021 : réponse à une supplémentation en mélisse induit une différence d’expression de l’IL6 de 361,82 U (avec moy.1 = 540,38, moy.2 = 178,55 et ET 1=445,28 ; ET 2=108,79).

Raffinement

Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Le milieu sera enrichi avec des enrichissements permettant aux animaux de grimper et de se cacher (Perch'up).

Choix des espèces

1) Pour le premier essai Le premier objectif de ce projet est d'évaluer différentes stratégies alimentaires précoces (J0 à J10). Compte tenu de ce prérequis, les animaux seront des poussins (J7) 2) Pour le second essai Le second objectif de disposer d'une méthode référente ex vivo pour évaluer la robustesse des animaux durant leur vie. Compte tenu de ce prérequis, les animaux seront des poulets en cours d'élevage (J10).

120 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 24 d'entre elles tuées par surdose d'anesthésiant et les 96 autres remises dans le circuit d'élevage. Nourries selon deux régimes pendant six semaines, elles reçoivent une injection destinée à marquer les protéines musculaires, avant dissection du muscle et du foie. Le projet vise à mieux comprendre la croissance musculaire pour optimiser la production de chair en aquaculture. Le porteur indique n'attendre aucune nuisance de la phase d'alimentation et réaliser les injections sous anesthésie.

Objectifs

Optimiser les conditions d’élevage des poissons constitue un objectif important de recherche qui permettra de contribuer à répondre aux enjeux de la filière aquacole concernant les pratiques d’élevages piscicoles dans le contexte général d’une gestion durable de la pêche mondiale. Dans ce cadre, l’objectif de ce projet est de mieux définir les mécanismes de croissance de la masse musculaire de la truite arc-en-ciel. Une accumulation efficace des protéines musculaires est essentielle à la croissance et aux qualités nutritionnelles recherchées dans la chair de poisson. Dans les cellules musculaires, cette synthèse des protéines nécessite néanmoins une très grande quantité d’énergie qui est fournie par la conversion des nutriments et la consommation d’oxygène au sein de véritables centrales énergétiques cellulaires appelées les mitochondries. Des travaux récents notamment chez la souris, indiquent que la production d’énergie par ces mitochondries doit être finement couplée à la synthèse des protéines pour éviter une perte de croissance de la masse musculaire. Ce couplage serait notamment régulé par des interactions membranaires appelées MAMs (mitochondria-associated membranes), entre mitochondries et réticulum endoplasmique (siège de la synthèse protéique). Le but de ce travail chez la truite est d’explorer le couplage entre synthèse protéique musculaire et l’activité des mitochondries en relation avec l’étendue des MAMs et de déterminer son importance pour la croissance des poissons. Ce couplage sera donc étudié dans le muscle de truites dont la croissance aura été modulée à l’aide de 2 régimes alimentaires. A l’issue de la période d’alimentation, les truites recevront une injection d’un composé permettant de marquer les protéines nouvellement synthétisées. Les muscles et le foie seront prélevés par dissection pour l’analyse de la respiration des mitochondries, la synthèse des protéines et des interactions membranaires.

Bénéfices attendus

Le couplage énergétique entre les mitochondries et la synthèse protéique, ainsi que l'importance des MAMs dans la croissance musculaire n’a pas été explorée à ce jour chez le poisson. L'ambition de notre projet est de déterminer comment orienter l’intensité de ce couplage, la production d’énergie et au final favoriser son utilisation pour la synthèse protéique avec des conséquences bénéfiques sur la masse musculaire des poissons. L’enjeu à terme serait d’optimiser la croissance des animaux en jouant sur l’efficacité alimentaire (selon le ratio protéines digestibles/énergie digestible du régime ou la source de protéines (végétale ou animale).

Procédures

Les poissons seront soumis à une période d'alimentation de 6 semaines. A l'issue de cette période, les poissons échantillonnés seront anesthésiés, leur poids sera enregistré puis ils recevront une injection intrapéritonéale d’un composé permettant de marquer les protéines nouvellement synthétisées (5 minutes). Les poissons seront ensuite remis dans un bain au calme pour le réveil (1 minute), et pendant 25 minutes le temps du marquage des proteines. A l’issue des 25 minutes, les poissons échantillonnés seront euthanasiés par une surdose d’anesthésiant.

Impact sur les animaux

Concernant la période d’alimentation, nous n’escomptons pas de nuisances pour les poissons. Les régimes ont été formulés de façon à avoir un niveau d’énergie digestible qui permet aux poissons d’ajuster leur prise alimentaire en fonction de leurs besoins. En cas de stress, les poissons craignent la prise alimentaire et se réfugient sous la partie abritée des bacs. Le comportement et la mortalité des animaux seront donc observés 2 fois par jour dans les bacs, par les animaliers en charge des élevages. Concernant les injections de puromycine, les manipulations sont réalisées le plus rapidement possible et sous anesthésie générale (dans un bain de tricaïne à 50mg/l) pour limiter le stress. Une étude préliminaire a été réalisée au laboratoire sur des truites contrôles pour déterminer la concentration optimale n’entrainant pas de comportement atypique ou de stress suivant le réveil des animaux.

Devenir

A l’issue de la période d’alimentation, un échantillon de 12 poissons par régime (soit 24 poissons au total) placés en expérimentation sera euthanasié et utilisé pour les prélèvements de tissu musculaire et de foie.

Remplacement

Cette étude se propose d’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la croissance du tissu musculaire adulte dans un modèle animal d’intérêt agronomique, la truite arc en ciel, à l’aide de régimes alimentaires spécifiques. Elle ne peut donc pas être réalisée par modélisation informatique. Elle ne peut également pas être réalisée sur des cultures cellulaires car il n’existe pas de lignées établies de cellules musculaires chez la truite.

Réduction

L’analyse statistique de nos précédentes données de respiration mitochondriale sur fibres musculaires nous permettent de fixer le nombre de poissons à 12 poissons par groupe de régime. Chaque régime sera testé en triplicat de bassin (3 bassins x 2 régimes) afin tenir compte de la variabilité individuelle observée dans les essais nutritionnels et en cas de perte de bassin (bassin qui se bouche, contamination ...). De plus, nous devons respecter un nombre minimal de poissons pour assurer le bien-être des animaux et éviter les comportements agressifs qui peuvent survenir avec un petit groupe de poissons (relation dominant/dominé). Afin de limiter au maximum le nombre de poissons utilisés, l’expérimentation se déroulera dans des petits bassins de 80 litres, pouvant contenir 20 poissons par bassin. Ainsi 2 lots de 60 poissons répartis en 3 bassins seront utilisés pour cette procédure, soit au total 120 poissons. Les poissons restants seront remis dans le circuit d’élevage traditionnel.

Raffinement

Dans nos conditions d’élevage standard, les alevins de truite seront élevés dans des bassins d’eau de source à température constante de 17°C et saturée en oxygène avec un éclairage naturel et un taux de renouvellement de 6 fois par heure. Les bassins disposent de couvercles à bordure opaque permettant aux poissons de se cacher. Ils seront nourris manuellement (2 fois/jour) ad libitum de la satiété visuelle pendant 6 semaines. Le comportement et les mortalités seront contrôlés 2 fois par jour lors de l’alimentation des animaux. Si un comportement atypique était observé (comportement de fuite anormal pendant l’alimentation, léthargie, hyperactivité locomotrice, perte d’intégrité physique suite à un cannibalisme ou à des comportements agressifs), les animaux concernés seraient euthanasiés. Les injections sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter le stress. Au réveil des animaux, le comportement sera également observé afin d’évaluer le stress induit par l’injection. Si un comportement atypique était observé, les animaux concernés seraient euthanasiés. Enfin, tous les prélèvements seront réalisés sur animaux préalablement euthanasiés.

Choix des espèces

La truite arc en ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale. L’expérimentation sera réalisée sur des truites arc-en-ciel de 100g. Cette taille de poissons permet la collecte d’échantillons tissulaires dont les tailles sont compatibles avec la réalisation de plusieurs analyses.

20 lamas et alpagas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants et immunisés de façon répétée pendant des années plutôt que tués. Chaque animal reçoit jusqu'à vingt-quatre injections et douze prélèvements sanguins par an, sur animal vigile, pour produire des anticorps de camélidés transformables en nanocorps. Le porteur indique que les immunisations peuvent entraîner une fatigue temporaire et qu'un entraînement médical limite le stress des manipulations. Il affirme qu'aucune technique alternative n'existe à ce jour pour produire ces anticorps à domaine unique, les animaux étant utilisés de 1 an jusqu'à leur retraite à 15 ans.

Objectifs

Les lamas et les espèces animales qui leur sont apparentées possèdent une forme unique d’anticorps, ces substances défensives secrétées par le système immunitaire lorsqu'une infection ou des cellules anormales envahissent l’organisme. Comparativement aux anticorps humains ou à ceux de nombreuses autres espèces animales, ces anticorps possèdent une architecture plus simple et peuvent être transformés en laboratoire en anticorps à domaine unique, substances aussi dénommées « nanobodies » ou « nanocorps », dont la taille est dix fois plus petite que celle des anticorps monoclonaux conventionnels. Leur petitesse pourrait leur permettre d’atteindre des cibles pathologiques dans l’organisme humain qui sont inaccessibles aux anticorps traditionnels et de produire des protéines capables d’atteindre plusieurs cibles simultanément. Ces nanocorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies et ouvrent des perspectives fascinantes pour la prise en charge de multiples pathologies.

Bénéfices attendus

La génération d’anticorps de camélidés permet notamment d’optimiser divers technologies existantes (diagnostic in vitro/in vivo, immunothérapie ciblée, ciblage cellulaire, microscopie…). Les bénéfices pour les êtres humaines relèvent de l’optimisation des techniques de soins de différents cancer, de leurs détection précoce pour une meilleure prise en charge, mais également de l’amélioration de l’habitat, avec la possibilité de doser les polluants dans l’environnement par des techniques de dosage immunologiques. Enfin, cela génère également des bénéfices directement au sein de la recherche, par l’optimisation des techniques optiques et de diagnostic.

Procédures

Injection et prélèvement sur animaux vigiles – une procédure sur 6 semaines. Pour un animal sur la durée de la procédure, il sera soumi à 24 injections maximum par un et à 12 prélèvements sanguins maximum par an. La durée des injection est d'approximativement 5 minutes sur animal vigile, et la durée d'un prélèvement est estimé à 10/15 minutes sur animal vigile également.

Impact sur les animaux

Suite aux immunisations, les animaux peuvent avoir une réaction immunitaire normale, et donc présenter des signes temporaires de fatigue.

Devenir

Repos de 4 à 6 semaines puis répétition de la procédure. Les nouveaux nés sont exclus de l’expérimentation. Nous pouvons utiliser les jeunes sevrés (au delà de 1 an) car ils vont avoir une meilleure réponse immunitaire que les adultes. Les adultes seront également immunisés jusqu’à l’âge de 10 ans. (Durée de vie moyenne entre 15 et 20 ans). Les animaux de plus de 10 ans ne seront plus immunisés mais serviront à la génération de banque immunitaires (uniquement prélèvement sanguin 3 fois par an). Les femelles gestantes/allaitantes ne seront jamais utilisées en expérimentation. A l'issu de la procédure autorisée pour 5 ans, deux de nos animaux actuels (agés de 6 et 5 ans) seront réutilisés uniquement pour la génération de banque naïve car ils auront atteint l'âge de 10 ans. Notre 3ieme alpaga agé aujoud'hui de 2 ans, sera réutilisés pour l'expérimentation.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’est pas possible d’utiliser une technique alternative de production d’anticorps à domaine unique. Mais une veille scientifique est en place dans notre structure permettant de rester informé des innovations dans ce domaine.

Réduction

La mise en place d’un cheptel de minimum 20 individus nous permet de faire une rotation dans l’utilisation des animaux, afin de garantir le minimum de soufrance et de stress sur l’année. Augmenter le nombre d’individus dans le cheptel nous permet de réduire le nombre de procédure/an/individu, et cela sans perdre de vue les objectifs scientifiques.

Raffinement

Un training médical est mis en place tout au long de la vie des animaux, afin de limiter le stress des manipulations expérimentales. Les lamas et alpagas seront élevés et stablués dans le respect de leurs besoins biologiques et sociaux. L’enrichissement environnemenal et alimentaire est assuré par la nature même de l’enclos herbacé et boisé (paturage naturel) et les diverses structures et accessoires disponibles sur le terrain (abris, brosses, branches de saules, branches de sapin…) participant à leur bien-être au quotidien. Un cheptel de minimum 20 individus sera mis en place : ce sont des animaux fondamentalement grégaires qui vivent en groupe avec une structure sociale forte et hiérarchisée. Au pâturage, quelques éléments guetteurs du groupe se placent en périphérie du reste du troupeau en position d’éveil, à l’affut du danger. Les communications intra-spécifiques se basant sur des modifications de posture de la tête, de la queue et des oreilles principalement,ce mode de communication intra individus est utile aussi à l’observateur qui les côtoie afin de détecter des postures d’attaque ou de bien-être. Par exemple, un alpaga présentant des oreilles campées sur la nuque, le museau relevé et la queue dressée à la verticale est en posture d’attaque, alors qu’une posture de bien-être sera plutôt marquée par des oreilles dressées vers l’avant et une queue posée sur le périnée. Si l’animal présente des signes de stress intense, une sédation légère pourra être effectuée afin de limiter l’angoisse de la procédure : Sedivet intraveineux 0,8 ml/80kg ou Domosedan gel oral 0 ,5 ml/80 kg

Choix des espèces

Mis à part les camélidés, ce type d’anticorps n’existe pas chez d’autres espèces, à l’exception curieuse des requins et autres poissons cartilagineux, mais d’un point de vue pratique, ces espèces n’ont pas été retenues pour notre projet. Les camélidés seront utilisés entre l'âge de 1 an et l'âge de la mise en retraite à 15 ans

Soumis à des prises de sang au sinus occipital, prévues à J8, J21 et J35, 240 poulets de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une partie reçoit un régime alternatif au soja, à base de matières premières locales, que le porteur dit susceptible d'entraîner des désordres digestifs, et la moitié des poulets subit un "challenge vaccinal (anticoccidien surdosé)" qui peut perturber leur santé digestive. L'objectif est de repérer des biomarqueurs de santé digestive pour les élevages de poulets de chair, et le porteur compte d'avance 5 % de mortalité, soit trois oiseaux par traitement. Il promet des outils de suivi en élevage "ne nécessitant pas de procédure invasive pour les animaux". Pour les mettre au point, tous les poulets sont tués par injection de pentobarbital afin de prélever leur tube digestif, leurs organes annexes et leur contenu digestif.

Objectifs

Le maintien de l’homéostasie intestinale - équilibre entre l'hôte, le microbiote intestinal et les composés alimentaires présents dans le tube digestif - est essentiel pour assurer la santé et le bien-être du poulet. Cependant, plusieurs facteurs inhérents à la qualité des aliments, à la gestion des oiseaux et à l'environnement peuvent affecter cette homéostasie et engendrer potentiellement de multiples perturbations avec des conséquences négatives sur la santé, le bien-être et des rejets dans l'environnement.

Bénéfices attendus

Ce programme contribuera à proposer : - des biomarqueurs de santé les moins invasifs possibles pouvant être utilisés pour quantifier la robustesse du poulet et proposer des stratégies de prévention. -un socle de connaissances sur la l’homéostasie digestive des volailles peu étudiée de façon globale. - un ou plusieurs outils de suivi en élevage ne nécessitant pas de procédure invasive pour les animaux.

Procédures

A J8, J21 et J35, les animaux subiront une prise de sang au sinus occipital , cette intervention prend 5 secondes.

Impact sur les animaux

Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut engendrer du stress lié à la contention de l’animal et un hématome. Cette procédure est assurée par des personnes expertes qui maitrisent parfaitement la technique réduisant le risque de stress et d’hématome pour l’animal. De plus, le régime alternatif intégrant des matières premières plus locales et alternatives au soja (importé) sont susceptibles d’entrainer dans certains cas des désordres digestifs. Ces désordres sont malheureusement fréquents sur le terrain ; ils affecteraient près de 50% des lots. Pour la moitié des animaux, un challenge vaccinal (anticoccidien surdosé) sera appliqué pouvant induire une perturbation temporaire de la santé digestive des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par injection de pentobarbital en respectant la règlementation en vigueur (annexe 4 del’arrêté du 1/02/13) afin de réaliser les prélèvements des différentes parties du tube digestif, les organes annexes et digesta.

Remplacement

Les connaissances sur la physiologie digestive et sur les possibles liens entre matrices invasives (tissu, contenu digestif), peu invasive (sang) et non invasive (fientes) sont encore très éparses et ne permettent d'envisager une expérimentation in silico. L’utilisation de l’animal ne peut être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.

Réduction

Les animaux seront élevés en groupe et au sol dans un bâtiment d’élevage standard. Il a été estimé qu’un nombre de 20 poulets par condition était nécessaire pour identifier une différence significative entre les groupes en termes de santé digestive et biologiquement pertinente au regard de la bibliographie (phosphatase alcaline, Chen et al., 2014). Considérant une mortalité de 5% (3 animaux par traitement), il est nécessaire de considérer 63 animaux par traitement (20 animaux * 3 dates + 3 mortalités possibles).

Raffinement

Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Le milieu sera enrichi avec des enrichissements permettant aux animaux de grimper et de se cacher (Perch'up).

Choix des espèces

Le projet est un programme de recherche finalisée visant à identifier des biomarqueurs de la santé digestive chez le poulet de chair afin de proposer des méthodes d’évaluation peu ou non invasives. Il n’existe pas de modèle mathématique ni de test in vitro permettant d’atteindre cet objectif. L’objectif premier de ce projet est d'identifier des biomarqueurs peu ou non invasives de santé digestive spécifiquement chez le poulet qui sera le modèle d’étude.

1 946 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune anesthésiée deux fois à six heures d'intervalle pour une injection intraveineuse puis une administration de produits directement dans la trachée. Le porteur qualifie ces produits de "non douloureux" sans les nommer, et affirme que "les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l'animal". Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes, une partie appartenant à une lignée transgénique riche en cellules mémoires dites "MAIT". Le projet porte sur "une question fondamentale en immunologie", et les applications évoquées, de nouveaux adjuvants pour la vaccination, sont renvoyées au conditionnel et au "plus long terme".

Objectifs

Le système immunitaire a pour rôle de détecter un potentiel danger et d’y répondre par le biais des globules blancs afin d’éliminer cette source de danger. On compte parmi ces globules blancs des cellules appelées « lymphocytes T », dont le sous-type dit « CD4 » est absolument essentiel pour l’organisation et l’action du système immunitaire. Par exemple, les patients qui ont un déficit en lymphocyte T CD4 développent de graves maladies infectieuses. Chaque lymphocyte T généré dans l’organisme est capable de reconnaître une cible qui lui est unique. Quand un lymphocyte T n’a pas encore rencontré sa cible au long de la vie de l’individu, on dit qu’il est « naïf » et lorsqu’il a rencontré sa cible, on dit que cette cellule est « mémoire ». Les cellules mémoires sont capables de répondre plus rapidement en cas de reconnaissance d’un danger et c’est sur ce principe qu’est basée la vaccination.

Bénéfices attendus

Ce projet tente de répondre à une question fondamentale en immunologie : comprendre les différents signaux qui sont intégrés par les cellules T CD4 naïves et qui peuvent influencer leur activité. Ce projet pourrait permettre à court terme d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent l’activation des cellules T CD4 naïves qui, pour rappel, sont des cellules clés de la fonction du système immunitaire. A plus long terme, nos résultats pourraient avoir des applications très intéressantes notamment dans le domaine de la vaccination car nous pourrions développer de nouveaux adjuvants capables d’activer des cellules mémoires et ainsi orienter la réponse T CD4 naïve de la façon la plus optimale par rapport à l’effet recherché.

Procédures

Dans la procédure expérimentale visant à évaluer l’effet des cellules mémoires sur l’activité des cellules naïves, les souris anesthésiées recevront une injection intraveineuse (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : suite à l'injection d’anesthésique dans l'abdomenn : douleur légère immédiate, durée brève suite à l'administration intra-trachéale après anesthésie : douleur légère post anesthésie, durée brève suite à liInjection intraveineuse sur souris anesthésiées par inhalation d’isoflurane : douleur légère post anesthésie, durée brève Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées

Remplacement

Le type d’activité que peut adopter une cellule CD4 naïve a déjà été étudiée in vitro et nous sommes capables aujourd’hui de modifier le comportement d’un lymphocyte T CD4 in vitro. Cependant, le comportement que va adopter un lymphocyte T CD4 in vivo peut être très différent de celui obtenu in vitro. Malheureusement, nous n’avons pas aujourd’hui les technologies nous permettant de reproduire in vitro les différents signaux complexes que peuvent recevoir les cellules naïves au sein de leur environnement proche. En effet, les mécanismes qui peuvent moduler l’activité des cellules naïves CD4 sont très nombreux et font notamment intervenir les cellules présentatrices de l’antigène (c’est-à-dire la source de danger), les cellules naïves et les cellules mémoires. Ainsi, une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris est nécessaire. Cette étape est notamment indispensable pour tester les mécanismes de régulation. Stratégie de remplacement : Des expériences in vitro ont déjà été réalisées au laboratoire et ont démontré que l’environnement immédiat des lymphocytes est déterminant pour leurs fonctions. Il est maintenant nécessaire de valider ces résultats dans un environnement intégré qu’est la souris.

Réduction

Nous utiliserons de façon générale 12 souris par groupe expérimental. Il s’agit d’un nombre suffisant nous permettant de surmonter les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à notre modèle. Ce nombre se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire en utilisant ce modèle.

Raffinement

Afin de limiter aux maximums les douleurs et souffrance de l’animal : Utilisation d’anesthésiques pour les injections intraveineuses (par inhalation d'isoflurane dans une boite à tapis chauffant) et intratrachéales (mélange de kétamine et xylazine injectées par voie intrapéritonéale et réalisées sur tapis chauffant pour éviter le refroidissement de l’animal). De plus, nous injecterons après l’anesthésie une solution de réhydratation Ringer-Lactate chauffée afin d’éviter le refroidissement de l’animal. Confort : Crème vaseline oculaire déposée à l’aide d’un coton tige pour éviter l’assèchement de l’œil durant et après l’anesthésie. Surveillance : Surveillance de l’animal tous les 3 jours pour surveiller l’état général des souris. Une grille de score sera utilisée pour évaluer de manière objective l’état des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie pour plusieurs raisons : a) nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet notamment d'utiliser des souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt. b) la souris est aussi un modèle de choix du fait de la disponibilité de souches congéniques (« génétiquement proches ») et transgéniques (« génétiquement modifiées »). c) enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris Nous utiliserons des souris de « phénotype sauvage » (non génétiquement modifiées) mais également une lignée transgénique car cette lignée possède un plus grand nombre de cellules mémoires particulières dites « MAIT » ce qui permettrait d’observer plus facilement l’effet biologique attendu (influence des cellules mémoires sur le devenir des cellules naïves). Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 12 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.

90 souris mères porteuses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un transfert d'embryons par voie naturelle, sans chirurgie, pour valider une technique de revitalisation de lignées transgéniques, puis sont euthanasiées faute de pouvoir être réutilisées. Le porteur indique que le passage de la sonde peut irriter le vagin et que les petits nés seront gardés pour l'élevage. Il affirme ne pas pouvoir mettre au point cette technique sans recourir aux animaux, la réussite se mesurant au nombre de naissances.

Objectifs

L'objectif est d'avoir une méthode de révitalisation des lignées de souris transgéniques sans geste chirurgical.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est la validation d'une technique de réimplantation d'embryon sans geste chirurgical

Procédures

Un seul transfert par voie naturelle d'embryons de souris (durée quelques secondes).

Impact sur les animaux

Le passage de la sonde peut irriter le vagin. Les souris anesthésiées restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. En fonction de l'évaluation de la douleur, du doliprane par voie orale peut être donné. L'évaluation de la douleur se fait notamment avec l'aide d'une grille de scoring.

Devenir

Les mères porteuses seront euthanasiés après la manip car elles ne peuvent plus être réutilisées pour une autre manip. Les petits générés pourront être gardés et utilisés en fonction des besoins de l'élevage ou d'autres procédures expérimentales.

Remplacement

Nous ne pouvons pas faire une mise au point d’une nouvelle technique de revitalisation sans l’utilisation d’animaux. Nous avons besoin de savoir si la technique marche et pour cela nous avons besoin de voir s'il y a des naissances.

Réduction

Réduire le nombre d'animaux au minimum pour atteindre la compétence du transfert d'embryon jusqu'à 80%

Raffinement

Raffiner en utilisant au mieux les animaux. Renforcement de l'enrichissement des cages contenant les mâles vasectomisés isolés. La durée d'isolement des mâles est réduite au maximum. Eviter tout stress des animaux pendant les manips (gestation...) Des points limites sont définis. Les animaux opérés lors du transfert d’embryon seront soumis à une attention particulière pour la gestion de la douleur avec réadministration d’antalgique si nécessaire après la chirurgie. Les cages hébergeant les femelles réimplantées sont enrichies avec une cabane, du sopalin. Deux femelles maximum sont mises par cage. Une surveillance quotidienne est réalisée. Le transfert se passe sous anesthésie avec une prise en charge analgésique appropriée à la procédure. Des points limites et spécifiques sont mis en place.

Choix des espèces

Nous revitalisons les lignées pour toute entrée de souris transgéniques. Les femelles C57Bl6 productrices de blastocyste sont des femelles sexuellement matures de 6 à 8 semaines. Les mâles C57Bl6 mis en accouplement avec les femellles C57Bl6 pour récupérer les embryons sont également sexuellement matures. Les femelles mères-porteuses sont des femelles adultes, àgées au minimum de 8 semaines tout comme les mâles vasectomisés.

276 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une poche d'air est formée sous leur peau, des cristaux y sont injectés pour déclencher une inflammation, et un jeûne de vingt-quatre heures est imposé deux fois, avant un prélèvement de sang sans réveil, afin d'étudier l'effet du jeûne intermittent sur l'inflammation de la goutte. Le porteur indique n'attendre ni comportement douloureux ni effet nuisible du régime. Il juge difficile de reproduire un jeûne in vitro et renvoie à la vérification dans un "organisme entier".

Objectifs

Les poussées inflammatoires articulaires observées dans les maladies microcristallines sont responsables de douleur et d’handicap majeur. Leurs mécanismes exacts demeurent encore incompris. La réaction inflammatoire est une réaction complexe qui peut être modulée par des facteurs environnementaux tels que l’alimentation et le cycle circadien. Le jeûne intermittent (JI) est une stratégie alimentaire qui améliore la santé. Il diminue les altérations liées au vieillissement, le stress oxydatif et les marqueurs inflammatoires. Il diminue l’inflammation de la polyarthrite rhumatoïde mais l’effet anti-inflammatoire s’arrête lors de la reprise de l’alimentation. Les mécanismes impliqués dans cette baisse de l’inflammation ne sont pas bien connus. D’un point de vue cellulaire et moléculaire, le JI module le métabolisme cellulaire, la régulation épigénétique (ce qui module l’expression des gènes) et plusieurs acteurs clés impliqués dans l’autophagie (mécanisme de défense cellulaire permettant le recyclage des organites et des protéines défectueux). Il favorise le catabolisme (c'est-à-dire la dégradation) des acides gras et la production de corps cétoniques (produits de dégradation des lipides) qui ont des propriétés anti-inflammatoires. L’autophagie assure le bon fonctionnement et l’intégrité cellulaires. Elle régule le métabolisme cellulaire, la réaction inflammatoire et la réponse immunitaire. Son activation inhibe le plus souvent la réaction inflammatoire. A l’inverse, son inhibition aggrave la réaction inflammatoire en favorisant la différenciation des macrophages inflammatoires. Nos objectifs sont d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires associés à l’effet anti-inflammatoire du JI. Nous confirmerons l’implication de l’autophagie dans cet effet anti-inflammatoire, identifierons les modifications du métabolisme cellulaire et épigénétiques et les signatures métaboliques associées au JI et à l’effet anti-inflammatoire. L’objectif ultime est d’identifier la meilleure stratégie alimentaire permettant de limiter la réaction inflammatoire. Cette stratégie pourra alors être testée chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’acquérir des nouvelles connaissances sur l’inflammation microcristalline et des effets bénéfiques du JI. Il permettra d’avoir une vision élargie des modifications métabolomiques (ensemble des produits de dégradation des macromolécules comme les lipides, des protéines et du glucose) associées au JI sur 6 tissus différents chez un même individu. Il identifiera aussi les modifications épigénétiques régulées par le JI et associées à la réduction de l’inflammation et leur transmission potentielle aux descendants. Il identifiera des signatures métabolomiques liées au JI et à l’inflammation. Il permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies inflammatoires basées sur des stratégies alimentaires.

Procédures

Injection en sous cutané de 3 ml d'air sur animal anesthésié : 20 secondes pour l'injection, 1 poche/animal, la poche est gardée une semaine. Injection dans la poche de 1 ml de solution saline ou de cristaux: 20 secondes pour faire l'injection réalisée sous animal anesthésié, 1 seule injection réalisée sous antalgique (buprénorphine 50 µg/kg en sous-cutané). Jeûne intermittent : 24 heures de jeûne, 2 jours non consécutifs. Prélèvement sanguin et lavage de poche sous animal anesthésié (kétamine/xylazine 160 mg/kg et 6mg/kg) et après injection d'antalgique (buprénorphine 50 µg/kg par voie sous-cutanée), procédure sans réveil.

Impact sur les animaux

La création de poche sous la peau est réalisée sous anesthésie gazeuse, les souris ne montrent pas de comportement douloureux. Lors de l'injection des cristaux dans la poche, il se produit une réaction inflammatoire locale, non visible par l'inspection. Les souris sont mises à mort 6 heures plus tard, elles n'ont pas de comportement douloureux durant les 6 heures de stimulation. Le protocole de jeûne intermittent qui sera mis en place est utilisé dans la littérature et a montré des effets bénéfiques sur la longévité et les maladies métaboliques. Il n'est donc pas attendu d'effet nuisible avec ce régime.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure 4 pour prélèvement d'organe.

Remplacement

il est difficile de reproduire in vitro les conditions qui miment un jeûne car les cellules isolées ne résistent pas à une culture sans apport nutritif. Nous testerons les différentes concentrations de cristaux à utiliser in vitro pour réaliser une seule concentration in vivo. Nous testerons in vitro des cultures sans sérum et des cultures avec des milieux appauvris en acides aminés et en nutriment. Les expériences in vivo permettront de confirmer les résultats obtenus in vitro en intégrant les résultats au sein d’un organisme entier.

Réduction

pour réduire au minimum le nombre de souris, nous réaliserons le maximum de tests in vitro afin de déterminer les temps optimaux de privation de nutriments. Nous utiliserons, lorsque c’est possible, le même groupe témoin (régime normal) pour chaque expérience de jeûne. Les expériences in vivo seront adaptées au fur et à mesure afin de limiter le nombre d’expérience et de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ces adaptations et ces tests in vitro permettront de mener une seule expérience in vivo pour répondre à une question précise. Si les résultats obtenus lors des premières expériences ne confirment pas l'hypothèse initiale, les expériences suivantes qui découlaient de l'hypothèse initiale soit ne seront pas réalisées soit seront adaptées aux résultats obtenus.

Raffinement

les souris seront, à la réception dans l’animalerie, réparties de façon aléatoire par groupes de 10 dans un environnement enrichi (jeux, abris, substrats, cachette, blocs de bois). Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant toute intervention sur les animaux. Les animaux sont élévés dans un environnement calme et surveillés de façon quotidienne. En cas de lésions générées par des combats de dominance, l'animal recevra des soins locaux (désinfection, pommade hydratante) associés à des analgésiques. Si les lésions sont importantes, l'animal sera isolé, mis dans un environnement calme et des soins locaux et des analgésiques poursuivis. Si l'animal montre des signes de souffrance (stéréotypie, repli, baisse des activités, perte de poids, vocalisation), il sera isolé dans un environnement enrichi, recevra un traitement analgésique. Son alimentation sera mise à disposition directement dans la cage. En l'absence d'amélioration, l'animal sera mis à mort. Il sera réintégré dans la cage après récupération d'un comportement normal et guérison des lésions. Tout animal qui s'alimente moins ou qui perd du poids en dehors du jeûne sera exclu de l’étude pour ne pas induire de biais expérimental. En l’absence de reprise de poids après isolement et soins, l’animal sera mis à mort. Dans le modèle de poche à air, utilisé dans le laboratoire depuis plusieurs années, les procédures de création de poche et injection de cristaux sont très bien tolérées par les animaux. Nous n'avons pas observé antérieurement de modification des comportement des animaux ni de lésion des poches. Après les injections de cristaux, si l'animal présente des signes de souffrance, un traitement analgésique sera administré

Choix des espèces

La réaction inflammatoire est complexe et dépend de nombreuses interactions cellulaires qui ne peuvent pas être évaluées uniquement par des tests in vitro. De même le jeûne intermittent a des répercussions dans l'organisme entier qui ne peuvent pas être appréhendées in vitro. Les expériences in vivo permettront de confirmer les résultats obtenus in vitro en intégrant les résultats au sein d’un organisme entier. C’est une étape de vérification indispensable avant l’évaluation chez l’homme. L'utilisation des souris est basée sur : 1/ La maîtrise du modèle de poche à air chez la souris par le laboratoire. 2/ Le modèle animal utilisé est reconnu sur le plan international. 3/ Le modèle utilisé est représentatif de la maladie humaine. 4/ Des découvertes majeures dans la goutte (inflammation déclenchée par les cristaux d’urate) ont été réalisées avec ce modèle. 5/ Des protocoles bien établis sur le jeûne intermittent dans cette espèce montrant des effets bénéfiques Les souris mâles seront utilisées à l’âge adulte entre 2 et 4 mois. Il s’agit de souris adultes pas trop âgées permettant 1/ d’éviter la modulation de la réaction inflammatoire liée au vieillissement et 2/ d’avoir des souris avec un système immunitaire et inflammatoire compétent. Les 4 souris femelles utilisées pour la génération des descendances seront âgées de 2 à 6 mois pour garder les mêmes caractéristiques que les mâles.

1200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue sans réveil, dans des procédures classées de gravité légère mais menées sous anesthésie terminale. Selon le test, l'extrémité de la queue est sectionnée, une sonde est posée sur la carotide ou un dispositif induit une thrombose sur la veine cave, pour évaluer l'effet de substances sur la coagulation dans le développement de médicaments. Le porteur n'attend pas d'effets toxiques majeurs, les composés ayant déjà été caractérisés à ce stade. Il indique que les tests in vitro ou informatiques ne peuvent "entièrement suppléer" le modèle animal, faute d'un environnement biologique intact.

Objectifs

En dépit des efforts menés pour prévenir et traiter la thrombose, la thrombose artérielle notamment reste une cause majeure de mortalité dans la population adulte des pays développés puisqu’aucune des thérapies proposées à ce jour ne donne entière satisfaction en termes d’efficacité et/ou de sécurité. En effet, les substances utilisées actuellement présentent d’importantes restrictions thérapeutiques en raison de leurs effets secondaires tels que le saignement prolongé en lien avec une altération de la coagulation sanguine. Par ailleurs, si certains cancers, comme la leucémie, peuvent causer une thrombocytopénie qui se caractérise une baisse du nombre de plaquettes (essentielles à une bonne coagulation sanguine), les traitements de certains cancers peuvent aussi d’affecter la moelle osseuse et de mener à une baisse du nombre de plaquettes (agents chimio-thérapeutiques, médicaments biologiques, radiothérapie). Les hémorragies ainsi causées, cérébrales notamment, constituent un problème médical majeur qui justifie la poursuite des recherches vers des thérapies anti-thrombotiques et anti-cancéreux efficaces et plus sûres. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets des substances sur la circulation sanguine, et en particulier sur la coagulation du sang, dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles permettent d'écarter les molécules qui auraient des effets néfastes sur la santé humaine (troubles de la coagulation, saignement, thromboses), ou de garder des molécules qui pourraient faire preuve d'efficacité soit dans le cas de pathologies en lien avec la coagulation sanguine (thrombose artérielle ou veineuse) soit dans le cadre des traitements des cancers.

Bénéfices attendus

Les modèles décrits dans ce projet sont nécessaires à la découverte et à la mise sur le marché de nouveaux médicaments efficaces pour traiter les problèmes de coagulation sanguine, de manière sûre, ou pallier à certains effets secondaires d'autres médicaments sur la circulation sanguine. Ces modèles permettent d'écarter les molécules qui auraient des effets néfastes sur la santé humaine (troubles de la coagulation, saignement, thromboses), ou de garder des molécules qui pourraient faire preuve d'efficacité soit dans le cas de dans le cas de pathologies en lien avec la coagulation sanguine (thrombose artérielle ou veineuse) soit dans le cadre des traitements des cancers.

Procédures

Dans les modèles de ce projet, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure. Pour le test d’évaluation du temps de saignement (durée maximum de 30 minutes), les animaux sont anesthésiés et l’extrémité de la queue (2 mm) est coupée avant d’être plongée dans du sérum physiologique à température ambiante. Pour le test d’évaluation de la thrombose artérielle, les animaux sont anesthésiés puis une sonde de débit sanguin est positionnée autour d’une artère carotide pour la mesure en continue du débit sanguin. Un patch (dispositif induisant localement une thrombose) est positionné sur la carotide. Pour le test d’évaluation de la thrombose veineuse, les animaux sont anesthésiés puis un patch (dispositif induisant localement une thrombose) est positionné sur la veine cave au niveau abdominal. Pour le test d’évaluation de la thrombose dans le modèle du shunt artérioveineux, les animaux sont anesthésiés puis un cathéter est introduit d’un côté dans une artère carotide et de l’autre dans une veine jugulaire (de façon à établir une circulation extra-corporelle. Tous ces tests (sous anesthésie) n'excèdent généralement pas 2 heures et les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans réveil préalable). Pour les besoins de l'étude, peuvent être réalisés en fin de test (animal anesthésié), selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes. Les administrations par bolus rapide (par voie orale, intraveineuse, sous6cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) ou par perfusion lente (intraveineuse) sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure d’administration par bolus est de quelques secondes. Celle d’une administration par perfusion intraveineuse peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité de la substance testée.

Impact sur les animaux

Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux substances évaluées dans ces tests.

Devenir

Mises à part les administrations substances évaluées qui peuvent être effectuées avant le test lui-même, les procédures, qui sont toutes réalisées chez l'animal anesthésié, ne permettent pas un retour à l'état conscient (perte importante de volémie sanguine ou chirurgie).

Remplacement

En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement par rapport à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison). Les tests statistiques paramétriques (e.g. : Student, Kuruskal, ANOVA...) utilisés seront définis en fonction du design expérimental de chaque étude (nombre de groupes testés). Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer des données sur la cinétique d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de stopper précocement la douleur, la souffrance ou l'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et fréquemment manipulés par des techniciens formés et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. A l'exception des traitements lorsqu'ils sont effectués sur animal éveillé, les animaux sont anesthésiés et analgésiés tout au long de la procédure. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes.

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur la coagulation sanguine chez le rat est prédictif de leur efficacité en clinique. Les procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisées de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mises en oeuvre à grande échelle au sein des laboratoires de pharmacologie. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques.

250 otaries à fourrure australes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées dans leur milieu naturel. Des femelles sauvages sont capturées au filet, anesthésiées, équipées de balises et soumises à des prélèvements de sang, de lait, de poil et de vibrisse, ainsi qu'à des séparations mère-petit, pour étudier l'effet des changements climatiques sur leur écologie. Le porteur décrit un stress de capture, une désorientation au réveil et une gêne possible pour les petits, tout en indiquant qu'aucune perte de lien mère-petit n'a été observée. Il indique qu'il n'est pas possible de remplacer ces espèces sauvages étudiées dans leur habitat.

Objectifs

Ce projet vise à 1) comprendre les effets des changements environnementaux sur l’écologie en mer, le succès reproducteur, et la santé des deux seules espèces d’otaries à fourrure du territoire français, les otaries à fourrure Antarctiques (Arctocephalus gazella – océan austral) et subAntarctiques (Arctocephalus tropicalis – océan indien), et 2) prédire les futurs impacts de scenarios climatiques pressentis sur les individus et les populations. Les océans absorbent 93 pourcents de la chaleur produite en excès par les activités humaines, et connaissent donc des changements importants qui affectent le fonctionnement et la santé des écosystèmes. Les océans polaires sont impactés 2 à 3 fois plus et plus vite que la moyenne mondiale. Il est donc essentiel d’étudier l’impact de ces changements climatiques sur ces écosystèmes et sur les animaux qui y vivent. Les prédateurs supérieurs tout en haut de la chaine alimentaire, tels les otaries à fourrure, sont des espèces considérées comme des sentinelles des changements qui s’opèrent dans leur environnement et des espèces clés de voute pour le maintien des écosystèmes. Elles permettent de comprendre les mécanismes en jeu dans les perturbations observées du fonctionnement de ces écosystèmes. Cependant, les otaries à fourrure sont des espèces particulièrement vulnérables aux conditions environnementales suboptimales, en particulier les femelles pendant la saison de reproduction et les jeunes pendant leur première année de vie (dont la survie dépend directement de la quantité d’énergie que la mère a pu leur fournir pendant l’allaitement) avec une capacité limitée d’adaptation à ces changements climatiques. Ce sont en outre des espèces qui ont été historiquement chassées jusqu’à quasi extinction, et dont la récupération après l’arrêt de la chasse semble ralentir. Par conséquent, ce projet vise à étudier l’écologie en mer des otaries en fonction des conditions climatiques annuelles et leur impact sur leur capacité à survivre et se reproduire avec succès dans une optique de conservation, et s’inscrit dans le contexte de (et complémente les données) d’un observatoire à long terme de l’institut polaire français IPEV sur les changements des populations et des paramètres démographiques de ces espèces (fin non programmée). Ces deux espèces d’otaries évoluent de plus dans des milieux océaniques différents, et nous offrent donc des informations complémentaires sur des écosystèmes marins adjacents.

Bénéfices attendus

Ce projet permet en premier lieu l’amélioration de nos connaissances de la biologie, de l’écologie (par exemple, les mouvements et les capacités de recherche alimentaire pendant les mois d’hiver sont soit inconnus pour les otaries de Kerguelen, soit méconnus pour les otaries d’Amsterdam), de la santé (émergence de nouveaux pathogènes), et des capacités d’adaptations des espèces d’otaries à fourrure australes aux changements qui s’opèrent dans leur environnement. Ces deux espèces d’otaries évoluent dans des océans qui sont affectés différemment et à différentes vitesses par les activités anthropiques et le réchauffement climatique, et elles nous permettent donc d’en comprendre les impacts dans 2 écosystèmes marins différents mais adjacents et interconnectés. Ces informations nous permettent de comprendre les mécanismes en jeux par lesquels les individus et les populations d’otaries sont impactés, et d’en prédire l’évolution en fonction de scenarios climatiques futurs. Ces connaissances nous permettent de comprendre les impacts de ces changements climatiques sur le fonctionnement des écosystèmes marins, dont les otaries sont les sentinelles, dans un but de conservation efficace et robuste de l’environnement, des espèces et de la biodiversité.

Procédures

1. Deux captures et contentions des mères jusqu’à anesthésie, séparées de 7-15 jours en été et 7-8 mois en hiver (10 minutes), 2. Deux anesthésies des mères, séparées de 7-15 jours en été et 7-8 mois en hiver (30-45 min + 5-10 min pour un réveil complet) pour pose ou récupération de balise et pour prélèvements de tissus, 3. Une pose de balise et 1 récupération de balise sur l’animal anesthésié – l’animal porte la balise sur la tête ou le dos de 7-15 jours en été et sur une nageoire 7-8 mois en hiver, 4. Un prélèvement d’1 vibrisse sur l’animal anesthésié, 5. Un prélèvement de poil sur l’animal anesthésié, 6. Un frottis nasal sur l’animal anesthésié, 7. Deux prélèvements de 5ml de lait en l’espace de 7-15 jours en été et 7-8 mois en hiver sur l’animal anesthésié, 8. Deux prélèvements de sang en l’espace de 7-15 jours en été et 7-8 mois en hiver sur l’animal anesthésié, 9. Deux séparations mère-petit espacées de 7-15 jours en été et 7-8 mois en hiver (1h au maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux capturés subissent un stress lors de la capture (la taille et la robustesse des otaries à fourrure rend la probabilité de blessures lors de captures au filet extrêmement faible pour l’animal, en 20 ans d’expérience sur 7 espèces d’otaridés différentes et environ 400 captures, il n’y a jamais eu de blessures au-delà d’égratignures sporadiques). Une fois équipées de balises de tête, les femelles qui partent en mer peuvent subir une très légère augmentation de la force de trainée lors de leurs déplacements dans l’eau puisque les balises posées sur la tête changent leur hydrodynamisme naturel. La balise de tête n’étant laissée sur l’animal qu’une courte période de temps, il a été démontré que cela n’a que très peu d’impact sur les femelles à court, moyen et long termes. Les animaux équipés peuvent aussi subir une diminution très localisée de l’isolation thermique pileuse à l’endroit où la balise est collée sur la tête. La perte notable d’hydrodynamisme ou d’isolation thermique n’a pas été démontrée pour la balise posée sur le tag d’identification (beaucoup plus petit, et dont la localisation à la base de la nageoire n’est pas aussi importante en terme d’hydrodynamisme, et ne touche pas le poil ou la peau). La capture des femelles peut engendrer un stress passager de séparation ainsi qu’une perte passagère d’apport calorique pour les petits lors de la capture des mères pour pose de balise et prélèvement de tissu. Cependant, la perte de liens mère-petit n’a jamais été observée chez aucune espèce d’otaries après capture, manipulation et anesthésie, et les réunions se font très rapidement une fois les animaux relâchés. Au sortir de l’anesthésie, les mères peuvent montrer une légère désorientation et/ou ataxie momentanée (de très courte durée, la récupération chez les otaridés étant très rapide 5-10 min après la fin du gaz anesthésiant).

Devenir

Tous les animaux sont immédiatement relâchés dans leur milieu naturel (sur le lieu de capture) dès que les manipulations sont terminées

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les espèces cibles du projet puisqu’il s’agit d’une étude sur les impacts des changements environnementaux sur la biologie et l’écologie des otaries à fourrure sauvages et de leurs populations dans leur habitat naturel.

Réduction

Le nombre maximal d’individus échantillonné par année est un compromis entre le besoin de représentativité des données collectées, étant donnée la variabilité individuelle au sein des populations d’otaries à fourrure sauvage (analyse de puissance statistique sur données précédentes), et la faisabilité des procédures sur le terrain (milieu sauvage austral). De plus, pour réduire l’impact de cette variabilité individuelle (liée au sexe, à l’âge, au stade de cycle de vie et à la saison) et donc l’incertitude dans les modèles statistiques, nous avons choisi de ne travailler que sur des femelles en âge de se reproduire. Dans la mesure du possible, le nombre d’animaux utilisés dans cette étude sera réduit en équipant les mêmes femelles de la balise de nageoire en hiver pendant la procédure de récupération de la balise de tête/dos en été (évite de capturer et anesthésier un animal supplémentaire pour l’équiper d’une balise d’hiver). Le concepteur du projet s’engage à réaliser un suivi de près en terme de faisabilité et de bien-être animal pour maximiser cette réduction d’effectif potentiel. Notre étude repose également sur des mesures en mer répétées dans le temps sur le même individu (mesures prises à intervalles réguliers par les balises enregistreuses), ce qui permet d’utiliser des modèles mixtes, robustes, qui prennent en compte à la fois les effets aléatoires (individus), et fixes (population), et permet de réduire le nombre d’individus utilisés dans la population afin d’obtenir une puissance statistique suffisante. Pour étudier les impacts des changements environnementaux dans les dernières décennies, cette étude réutilisera également les données collectées par le passé au sein de l’équipe sur ces mêmes espèces, ce qui permettra d’augmenter le nombre d’échantillons (et donc le pouvoir analytique des analyses statistiques) via la valorisation de ces études précédentes pour suivi des changements temporels.

Raffinement

Les otaries peuvent être choisies visuellement, et seuls des femelles adultes, en bonne condition corporelle, qui ne sont pas activement en train d’allaiter (pour limiter la gêne aux petits), et de préférence en bordure de colonie (pour limiter la perturbation générale) seront considérés pour capture. La capture, par filet, sera faite le plus rapidement possible par des manipulateurs expérimentés. L’animal capturé sera immédiatement transporté à l'écart vers la station de travail installée dans un endroit suffisamment éloigné pour garantir la sécurité des animaux et des manipulateurs (quelques dizaines de mètres de la colonie, en fonction de la topographie). Il y sera anesthésié le plus rapidement possible, alors qu’il est toujours dans le filet pour diminuer le stress physique et émotionnel de l’animal et garantir sa sécurité et celle des manipulateurs (la pré-anesthésie n’est pas recommandée chez les mammifères plongeurs). Le stress de la manipulation pendant l’induction de l’anesthésie sera limité par une diminution maximale des stimuli auditifs (bruits, paroles etc) et visuels (mouvements brusques). La perception visuelle de l’animal sera diminuée par la présence du filet, qui sera remplacé par un chiffon occultant une fois le filet retiré. La prise de sang et de la vibrisse se fera après avoir appliqué un analgésique local (lidocaïne) pour limiter la douleur. Une fois les procédures effectuées, l’anesthésie gazeuse sera stoppée (30-40 min). L’animal sera transporté (sur une planche) encore anesthésié, dans un endroit proche de la colonie mais assez éloigné de ses congénères pour ne pas les perturber, et ne sera relâché que lorsqu’il sera assez alerte pour éviter les interactions sociales (5-10 min après la fin de l’anesthésie). Il sera libre de retourner à la colonie par lui-même et sera visuellement suivi pendant 30 min pour s’assurer de la bonne récupération, réunion avec son petit, et réinsertion dans la colonie. La récupération de la balise se fait en laissant le socle de colle sur lequel la balise est collée aux poils (rapidement perdu pendant sa mue en février/mars), puisque cela engendre moins de pertes thermiques que de couper le poil. En cas très improbable de blessures ou d’accidents involontaires, toutes les activités seront stoppées immédiatement, et l’animal soigné (désinfectant, colle chirurgicale, etc..) puis relâché en conséquence.

Choix des espèces

A. gazella et A. tropicalis sont des espèces clés pour le maintien des écosystèmes, et sont considérées comme des sentinelles des changements que subit l’écosystème dans lequel elles vivent. Ces otaries vivent dans des milieux marins qui subissent des changements climatiques à différentes échelles (sud de l’océan indien pour A.tropicalis et océan austral pour A. gazella) et nous informent donc sur leur écosystème respectif. De plus, les otaries sont particulièrement vulnérables aux variations environnementales pendant les stades de vie critiques c’est-à-dire les femelles pendant la saison de reproduction et les jeunes pendant leur première année de vie, aux conditions environnementales suboptimales. Elles ont de plus une aire de répartition limitée en été, ont une capacité de plongée limitée, et ont un mode de vie très couteux en énergie, ce qui limite leur capacité d’adaptation aux changements environnementaux dans leur habitat. Ce sont également des espèces qui ont été historiquement chassées jusqu’à quasi extinction, et dont la récupération après l’arrêt de la chasse semble ralentir. Toutes ces caractéristiques en font deux espèces essentielles dans l’étude de impacts des changements environnementaux sur les écosystèmes subpolaires. Tous les animaux utilisés dans cette étude sont des adultes en âge de reproduction (c’est-à-dire plus de 3 ans) avec un petit confirmé. Ce choix est motivé par un effort de minimisation de la variabilité dans les données collectées en ne choisissant qu’une seule tranche d’âge et statut reproducteur au sein des populations. Le poids minimum choisi est de 28 kg, en l’état actuel des balises utilisées, de façon à ce que le poids et surtout la surface des balises sur le corps des otaries n’entrainent qu’une force négligeable de frottement lors de la nage.