Procédures légères

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou présentent des troubles neurologiques sont tuées. 7 800 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes mises à mort à l'issue. Infectées par le virus de la dengue, certaines très sensibles faute de défenses immunitaires, elles peuvent développer fièvre, paralysie ou tremblements avant l'atteinte du point limite. Le prélèvement final se fait par ponction intracardiaque sous anesthésie, pour tester de nouveaux composés antiviraux.

Objectifs

La dengue reste aujourd’hui un problème majeur de santé publique. Chaque année, plus de 400 millions de personnes sont infectées par ce virus transmis principalement par le moustique Aedes aegypti. Environ 100 millions développent des symptômes : fièvre, douleurs, fatigue, et parfois des formes graves comme la dengue hémorragique ou le choc dengue, qui peuvent être mortels. Le virus de la dengue existe sous cinq formes différentes (appelées sérotypes). Cette diversité complique la protection à long terme : être infecté une première fois ne protège pas toujours des infections suivantes (surtout des sérotypes différents), qui peuvent même être plus sévères. Un vaccin est disponible mais son utilisation est limitée. Il fonctionne seulement chez les personnes ayant déjà été exposées au virus et pourrait augmenter les risques chez celles qui ne l’ont jamais été. Par ailleurs, il n’existe actuellement aucun traitement antiviral spécifique contre la dengue. Les médecins peuvent seulement traiter les symptômes et surveiller les complications. Dans ce projet, nous souhaitons tester de nouveaux composés capables d’empêcher le virus de progresser. Nous chercherons à bloquer différentes étapes clés : l’entrée du virus dans les cellules, sa capacité à reproduire son matériel génétique, ou encore d’autres mécanismes essentiels à son cycle infectieux. Nous étudierons également la réponse immunitaire déclenchée par la dengue et vérifierons si des composés thérapeutiques peuvent aider l’organisme à éliminer le virus plus rapidement et plus efficacement. L’objectif final est d’identifier des pistes prometteuses pour le développement de futurs traitements contre la dengue, afin de mieux protéger les populations exposées.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de tester l’efficacité de nouveaux traitements susceptibles de bloquer le virus de la dengue ou de renforcer les défenses immunitaires chez l’homme. Pour cela, nous utiliseront différents types de souris, car chacune réagit au virus d’une manière particulière. Certaines sont très sensibles et aident à comprendre les formes les plus graves de la maladie, d’autres permettent surtout d’observer la façon dont le virus se multiplie et comment l’organisme réagit. Enfin, des souris possédant un système immunitaire complet donnent des indications précieuses sur la production d’anticorps et l’activation des cellules immunitaires. En combinant ces modèles, le projet offrira une vision plus complète de ce qui se passe lors d’une infection : l’évolution du virus, les réactions immunitaires et les effets sur l’organisme. Cette approche permettra de repérer les candidats thérapeutiques les plus prometteurs et d’évaluer leur action, que ce soit en prévention ou en traitement. À long terme, ce projet contribuera à accélérer le développement de nouvelles stratégies contre la dengue. L’utilisation de modèles variés, allant de souris très sensibles au virus à d’autres possédant un système immunitaire entièrement fonctionnel, aidera à mieux comprendre les interactions entre le virus et l’hôte. Elle permettra également d’identifier les mécanismes qui protègent l’organisme ainsi que les raisons pour lesquelles certains patients développent des formes graves. Les connaissances obtenues serviront de base pour créer des traitements plus précis et plus efficaces. À terme, ces avancées pourraient améliorer considérablement la prise en charge de la dengue et réduire son impact sur les populations exposées, en diminuant la gravité des infections et la charge que représente cette maladie dans les régions touchées.

Procédures

Selon les procédures appliquées : - Infection des souris par le virus de la Dengue : Injection rétro-orbitale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Injection Sous cutanée : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Injection Intradermique : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Injection intrapéritonéale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes - Administration de composés thérapeutiques sur une durée max de 8 jours. Par voie orale, vigile, 1 à 3 fois par jour par animal, 1 minute OU Par voie sous-cutanée : anesthésie générale, 1 fois par jour maximum, durée 1 minute OU par voie intramusculaire : anesthésie générale, 1 fois par patte arrière et par semaine, soit 2 fois par animal max, durée 1 minute OU par voie intrapéritonéale : vigile, 1 fois par jour maximum, durée 1minute (pendant 8 jours max) - Suivi clinique et pondéral : Pesée et bilan clinique tous les jours par animal sur la durée de l’étude (30 jours), sur animal vigile. La périodicité sera adaptée en fonction des signes cliniques et des recommandations du vétérinaire. - Prélèvement sanguin : A la veine submandibulaire (1x/2semaines) ou à la queue (50uL max/jour), vigile, pendant 2 semaines maximum tout du long de l’étude ; pendant 30 jours max Prélèvement terminal sous anesthésie profonde, par ponction intracardiaque, durée 2 minutes, sur tous les animaux du projet

Impact sur les animaux

Lorsqu’on infecte les souches de souris utilisées avec le virus de la dengue, certains effets sur leur santé peuvent apparaître. Ces souris sont très sensibles au virus parce qu’elles n’ont pas certains types de défenses immunitaires. Elles peuvent donc perdre du poids, parfois plus de 10 %, avoir de la fièvre ou au contraire une baisse de température, et montrer des changements de comportement comme une diminution de l’activité ou un état de fatigue marqué. Dans certains cas particuliers, surtout quand l’infection touche directement le cerveau, des signes neurologiques peuvent apparaître, comme des problèmes d’équilibre, des tremblements ou une paralysie. Des effets indésirables peuvent aussi apparaître selon les produits testés, en fonction de leur nature et de leur éventuelle toxicité. Pour protéger au mieux les animaux, des critères stricts sont établis afin d’arrêter l’expérience si leur état se dégrade trop fortement : par exemple une perte de poids supérieure à 20 %, l’apparition de troubles neurologiques importants ou une altération générale de leur état de santé. Une surveillance quotidienne permet de repérer rapidement tout signe inquiétant et d’intervenir si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux dans cette procédure sont euthanasiés en fin d’étude en raison des prélèvements de fin d'études nécessaires, et pour des raisons de sécurité biologique.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas de méthode entièrement alternative qui permettrait d’éviter totalement l’utilisation d’animaux pour les expériences prévues, car les exigences scientifiques et réglementaires nécessitent encore des études en organisme vivant. Les méthodes In Vitro (sur cellules cultivées en laboratoire) sont utiles pour comprendre certaines étapes du cycle du virus et tester des pistes de traitements. Toutefois, elles restent limitées : elles ne reproduisent pas toute la complexité du corps humain, par exemple la réponse immunitaire complète, les réactions entre différents organes ou encore la structure 3D d’un organisme vivant. C’est pourquoi des études In Vivo, réalisées chez l’animal, restent indispensables pour comprendre comment l’infection se développe, comment le virus se propage, comment le système immunitaire réagit, et pour évaluer la toxicité et l’efficacité de nouveaux traitements dans un organisme complet.

Réduction

Le schéma expérimental du projet repose sur des données bibliographiques robustes préalables permettant de définir le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Seuls les modèles et conditions présentant un intérêt scientifique clairement démontré seront retenus. Les études In Vitro réalisées en amont permettront de réduire le nombre de molécules ou approches à tester In Vivo, limitant ainsi l’utilisation d’animaux aux candidats les plus prometteurs. Le nombre d’animaux sera strictement limité grâce à plusieurs critères. Les différents modèles murins disponibles seront utilisés de manière complémentaire, permettant de sélectionner pour chaque question scientifique le modèle le plus pertinent, évitant toute expérimentation redondante. Par ailleurs, chaque animal contribuera à plusieurs types d’analyses (virologie, immunologie, histologie), maximisant l'information obtenue par individu et réduisant le recours à de nouvelles cohortes.

Raffinement

Enfin, en ce qui concerne le Raffinement pour les expériences : A. Raffinement des manipulations pour limiter le stress des animaux : les expérimentateurs sont formés afin d’appliquer les méthodes dans les conditions les moins contraignantes pour les animaux (préhension adaptée). Toute manipulation considérée comme invasive et/ou stressante pour l’animal sera faite sous anesthésie. B. Les signes cliniques seront observés quotidiennement : perte de poids, érection des poils et altération de la posture, isolement, vocalisation lors de la manipulation, positionnement des vibrisses, température. Si les animaux présentent une perte de poids jusqu’à 10% par rapport à leur poids initial, une observation renforcée sera faite et un gel nutritif sera mis dans la cage afin de faciliter l’ingestion de liquides et nutriments. Si les animaux présentent différents signes cliniques, ou une perte de poids jusqu’à 20%, l’animal sera sacrifié en accord avec les points limites définis en amont de chaque procédure.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris constitue l’option la plus appropriée pour étudier l’infection par le virus de la dengue (DENV), car elle offre un modèle fiable, bien caractérisé et largement validé dans la littérature. Les lignées transgéniques présentent des niveaux contrôlés et prédictibles de sensibilité au DENV, permettant d’explorer de manière progressive la dissémination virale, la réponse antivirale précoce et les atteintes systémiques, tout en limitant l’exposition à des procédures plus invasives. Les lignées immunocompétentes, permettent d’analyser la réponse immunitaire dans un cadre physiologique. Le recours à ces modèles établis maximise la pertinence scientifique des résultats tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires. Les procédures sont conçues pour minimiser la douleur, le stress et tout dommage durable, conformément aux exigences réglementaires, en privilégiant les conditions expérimentales les moins contraignantes compatibles avec les objectifs de recherche.

1 844 souris sont utilisées dans ce projet sur le diabète de type 1, dont 1 784 subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires et 1 504 une transplantation chirurgicale d'îlots pancréatiques. Le niveau de souffrance déclaré va de léger à modéré, et toutes les souris sont tuées en fin de procédure pour prélever les tissus. Une partie des animaux est rendue diabétique, par induction ou génétiquement, et certains sont immunodéficients pour permettre la greffe de cellules humaines. Le porteur transporte les souris d'un établissement à l'autre et conclut que seule la transplantation chez l'animal permet d'étudier la fonction des cellules sur la durée.

Objectifs

Certains récepteurs sont des modulateurs du métabolisme et de l'inflammation notamment des cellules du pancréas. Leurs actions ciblent la viabilité et de la fonction des cellules pancréatiques. Notre hypothèse est qu'en modulant leur activité respective dans les cellules du pancréas produisant l'insuline, on pourrait prévenir les processus inflammatoires qui se produisent lors du diabète de type 1 et entrainerait une sécrétion d'hormone défaillante. Leur possible modulation pourrait donc jouer un role majeur. Le projet sera mené dans deux établissements-utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les résultats escomptés sont l'identification de cibles spécifiques dans la création d'ilots pancréatiques résilients capables de survie et d'adaptation à long terme. De plus, il pourra montré l'intérêt de certaines molécules anti- diabètiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1/ des injections quotidiennes au maximum en respectant les volumes maximum (280 animaux en EU1 et 60 animaux dans EU2), 2/ ainsi qu'à des prélèvements sanguins hebdomadaires en respectant les volumes (1784 animaux dans EU 1) , 3/ une unique transplantation d'ilots pancréatiques pour certains animaux (1504 animaux au sein de EU 1).

Impact sur les animaux

Les nuisances induites dans ce projet seront de plusieurs types : Nous utiliserons des modèles de souris diabétiques (induits ou génétiques) qui créera un inconfort pour les animaux (palié par la gestion de leur environnement). Certains animaux subiront une transplantation de cellules qui sera faite par voie chirurgicale qui induit une ouverture des parois cutanée et musculaire qui engendrera une douleur modérée (paliée par traitements associés). Des traitements avec des molécules seront faits par injection intrapéritonéale (douleur légère très transitoire) ou intravasculaire sous anesthésie. Les molécules utilisées n'ont pas d'effets néfastes connus. Les virus utilisés sont sans impact direct sur le phénotype et bien-être murin. Les prélèvements sanguins faits à la queue lors notamment des tests au glucose engendreront une douleur légère paliée par les anti-douleurs locaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les tissus et les étudier ensuite (histologie).

Remplacement

Le diabète est un maladie qui affecte tous les organes. Aussi les expériences de culture cellulaire et études ex vivo ne sont pas appropriées dans ce contexte. La nécessité de l'étude de la réponse auto-immune nécessite l'usage des animaux. A l"heure actuelle, il n'existe pas de méthode alternative à l'usage des animaux pour étudier la fonction des cellules au long court. Le seul moyen est de les transplanter chez l'animal.

Réduction

1844 animaux sont inclus dans ce protocole. Nous avons estimé un nombre moyen de 3 à 10 souris par groupe pour avoir des résulatsts statistiquement satisfaisants (confiance 95% et puissance 80%). Aprés étude, l'analyse statistique se fera par test Two way anova.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés en portoir ventilé, en cage de 5 maximum. Les animaux diabètiques seront changés plus régulièrement que les congénères sains. Ils seront traités avec soin avec visite quotidienne; enrichissement de l'environnement et traitement anti-douleur le cas échéant. Pour les animaux subissant une chirurgie, des granulés de nourriture seront disposés au sol, avec une portion de nourriture gélifiée pour une meilleure récupération post-opératoire. Le bien-être animal sera observé au quotidien et un arbre décisionnel permettra de guider le personnel quant à la démarche de soin pour éviter d'atteindre un point-limite non réversible. Les animaux immunodéficients seront hébergés dans des portoirs ventilés clos afin de préserver leur environnement. Le transport des animaux d'un EU à l'autre se fera dans des cages spécifiques comportant de la litière, de l'eau gélifiée, des croquettes et de l'enrichissement (cocon et tunnel) dans un véhicule à température adéquate (22 +/_ 2 °C).

Choix des espèces

Nous disposons de l'ensemble des outils adaptés aux modèles "souris". De plus, sa petite taille permet un hébergement aisé. Pour ce projet, nous utiliserons des souris adultes (maturité sexuelle atteinte). Des souris avec une immunité affaiblie seront utilisées pour permettre la greffe de cellules humaines et ainsi éviter le rejet.

2 688 chiens vont être utilisés pour des études réglementaires de toxicologie, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit un candidat médicament de façon unique ou répétée, subit des prélèvements de sang, parfois la pose de cathéters ou d'implants enregistrant ses paramètres physiologiques, et des effets toxiques légers à modérés sont attendus. La plupart seront tués pour l'examen de leurs organes exigé par la réglementation, 200 réutilisés dans d'autres études, une dizaine renvoyés à l'élevage et une vingtaine placés. Ces essais sur le chien sont présentés comme une obligation réglementaire avant tout passage à l'humain.

Objectifs

La réalisation d’études de toxicologie (générale, de reproduction, juvénile, de pharmacologie de sécurité) est une obligation réglementaire avant de réaliser des essais cliniques avec un médicament à visée humaine ou pour obtenir une Autorisation de Mise sur le Marché pour les dispositifs médicaux, médicament vétérinaire ou produit chimique. Ces études consistent à administrer le candidat médicament de manière unique ou répétée, puis de réaliser des observations régulières des animaux incluant des pesées corporelles, un suivi des paramètres sanguins ou urinaires, une évaluation des fonctions respiratoires, musculaires et cardiovasculaires. Ces études permettront d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit, mais aussi de choisir ou ajuster de manière raisonnée les doses et les protocoles d’études réglementaires avant les essais chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les études de toxicologie dans lesquelles un candidat médicament est évalué, sont réglementairement requises par les lignes directrices Européennes et Internationales. Elles représentent une étape essentielle avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain (d’abord sur des volontaires sains, puis sur des patients à moyen et long terme) ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (dispositifs médicaux, médicament vétérinaire, produit chimique). Pour les médicaments (humains et vétérinaires) et dispositifs médicaux, ces études sont des pré-requis indispensables aux essais cliniques. Elles visent à définir la toxicité ou la tolérabilité des produits à tester et donc de rendre les essais cliniques plus sûres pour les patients ou volontaires participants à l'essai. Les résultats récoltés permettent aussi de définir le niveau de dose (marge de sécurité) pour la première administration à l’homme ou l’animal (dans le cadre de médicament vétérinaire). Ces études incluent des évaluations toxicocinétiques pour déterminer les taux d’exposition entrainant une toxicité. Ce projet permettra également d’évaluer la sécurité des molécules chimiques dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal comme demandé par la loi et par les lignes directrices Européennes. Ce projet permettra donc d’avancer dans le développement des solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques innovantes pour le traitement de certaines maladies chez l’homme, les animaux ou les plantes et de contribuer à l’évaluation de la sécurité des produits chimiques.

Procédures

Ces études consistent en administration unique ou répétée du produit à tester. La fréquence de ces administrations varie en fonction du produit (par exemple 1 fois par jour, 1 fois par semaine). La durée des administrations est généralement rapide quelques secondes à quelques minutes, pour les administrations orales, sous-cutanée ou intraveineuse en bolus. Les administrations peuvent être faite avec échoguidage si nécéssaire. Elles peuvent parfois être plus longue pour les perfusions (de plusieurs minutes à continue). Les administrations sont suivies d’observations régulières des animaux (plusieurs fois par jours), pesées corporelles (généralement de 1 fois par jour à 1 fois par semaine), évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires (généralement 1 à 4 fois par étude), sur le développement neurocomportemental, squelettique et des fonctions reproductives, évaluation des fonctions respiratoires et cardiovasculaires et histopathologique. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les autres techniques ou procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec le cas échéant un protocole d’analgésie adapté. Le nombre et la durée des interventions sont adaptés en fonction de l'utilisation clinique, de la durée d'étude, de la cinétique d'exposition, des effets attendus et sont définis dans le plan d'étude. A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés pour examen macroscopique, pesée des organes et collecte des organes/tissus pour analyse microscopique.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration, de prélèvement de sang ou de pose de cathéter - Stress, ou inconfort lié à à l'enregistrement de certains paramètres physiologiques (ECG, BP par exemple) ou certaines administrations nécessitant le placement en hamac ou le port d’un gilet contenant une pompe ou des dispositifs d’enregistrement, ou la mise en place d'électrodes ou de brassards. Modification ponctuelle et de courte durée du cycle nycthémèral lorsque des actes d’études (prise de sang pour de la bioanalyse, par exemple) doivent se faire pendant la période nocturne - Pour des cas exceptionnels, stress, inconfort lié à la mise dans un compartiment individuel pour une durée maximum de 16 h pour recueil d’urines/fèces - Douleur légère à modérée en post-opératoire (quelques jours) pour la pose des cathéters ou d’implants de capteurs collectant des données physiologiques (par exemple pression artérielle, ventriculaire, pleurale, ECG, EMG ou autres) - Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration des médicaments ou produits chimiques à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Des points limites précoces adaptés sont mis en place selon la typologie d’etude et la classe du produit à tester afin d’eviter une prolongation inutile des effets observés. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures seront rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie).

Devenir

En accord avec le plan d’étude, les animaux pourront être : 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examen et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques, microscopiques et/ou squelettiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles ; 2) gardés en vie et retournent en zone d’hébergement hors étude suite après avis vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies ; 3) replacés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude qui sera conditionnée par un examen vétérinaire favorable.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux permettant de déterminer la toxicité de substances suite à une exposition systémique. Il est nécessaire d’avoir accès à un modèle expérimental, tel que le chien, pouvant mimer au mieux les interactions biologiques et physiologiques complexes observés chez l’Homme. L'utilisation du chien répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Le choix du chien est fait en fonction des données de pharmacocinétiques, de métabolisme et de pharmacodynamiques disponibles ainsi qu’en fonction des similitudes entre l’homme et l’animal. Pour les produits à usage vétérinaire administré chez le chien, on choisira et utilisera cette espèce cible. De plus, dans ces études, un relevé des signes cliniques et un suivi des paramètres sanguins et une observation microscopiques des organes post-mortem sont requis ce qui serait impossible à faire via des méthodes alternatives. Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son intégralité pour évaluer les effets du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux pour les études réglementaires est défini dans les lignes directrices internationales applicables. Ce nombre est adapté selon le nombre de produits testés, le nombre de doses testées et de la présence ou non d’une période de réversibilité (effet à long terme). Pour les études préliminaires, le nombre d’animaux par lot est réduit au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des objectifs de l’étude, du nombre de doses testées et du nombre de produits. Le nombre d’animaux est revu par le Directeur d’étude et est mentionné dans le plan d’étude.

Raffinement

Pour améliorer leur bien-être, les chiens seront hébergés en groupes sociaux sauf incompatibilité avec la procédure expérimentale ou incompatibilité comportementale. Les chiens seront hébergés dans des boxes équipés de planchette de repos et ont à disposition des jouets (dont le renouvellement est effectué régulièrement). Pour se défouler, les chiens bénéficient d’un temps d’activité/exercice dans une zone dédiée plusieurs fois par semaine. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les actes pouvant engendrer du stress ou de l’inconfort seront réduits au minimum nécessaire (fréquence et durée) et seront réalisés sous anesthésie avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Les animaux seront observés au moins 1 fois par jour (incluant les week ends et jours fériés) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques par un personnel d’étude formé et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur. En cas de signes cliniques ayant un impact sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption des administrations, réduction de la dose testée par exemple, euthanasie si nécessaire).

Choix des espèces

Il s’agit d’une justification réglementaire. En effet, le chien est une espèce non-rongeur acceptée par les agences réglementaires. Le choix de cette espèce répond à des critères scientifiques précis telles que des données de pharmacocinétiques, de métabolisme et de pharmacodynamiques disponibles mais aussi en fonction des similitudes entre l’Homme et l’animal. De la naissance à adulte mature. En fonction du type d’étude, de la population visée (ou animaux visés si médicament vétérinaire), l’âge le plus adéquat sera choisi.

Une biopsie de l'oreille vers le dixième jour de vie, un jeûne de six à douze heures, puis la mise à mort entre trois et quatre mois: 240 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reproduisent une maladie rénale liée au diabète, étudiée à un stade précoce où le RNT affirme qu'aucun signe de mal-être n'apparaît encore. Toutes sont tuées pour prélever reins, foie et graisses. Sur les 240 produites, 32 souris sans intérêt pour l'étude serviront à entretenir l'élevage des lignées.

Objectifs

Le diabète peut abîmer, avec le temps, les reins. Cette complication, appelée néphropathie diabétique, est aujourd’hui la première cause de maladie rénale chronique dans le monde. Lorsque les reins sont trop endommagés, la maladie peut évoluer vers une insuffisance rénale sévère obligeant les patients à recourir à la dialyse ou à une greffe. Malgré les traitements existants, de nombreuses personnes diabétiques voient encore leur état s’aggraver, ce qui montre qu’il est urgent de mieux comprendre les mécanismes en jeu pour développer de nouvelles thérapies. Les causes de cette maladie sont multiples et complexes. Ces dernières années, les chercheurs ont mis en évidence un phénomène important : l’accumulation anormale de graisses dans les reins. Cette accumulation devient toxique pour les cellules et contribue à l’aggravation de la maladie rénale. Au niveau mécanistique, lorsque le taux de glucose est trop élevé, une protéine, nommée ChREBP, est fortement activée ce qui favorise la formation de lipides dans le rein et accélère le développement des lésions rénales. Des études chez la souris ont montré que bloquer cette protéine d’intérêt dans le rein réduit l’accumulation de graisses et ralentit la progression de la maladie, soulignant son rôle central. Grâce à de nouvelles technologies, il est désormais possible d’analyser très finement les graisses présentes dans les tissus et d’étudier l’activité des gènes cellule par cellule. Ces outils offrent une occasion unique de mieux comprendre comment la maladie se développe au niveau du rein. L’objectif de ce projet est d’utiliser ces techniques de pointe pour mieux comprendre comment l’excès de sucre et de graisses abîme les reins, et quel rôle exact joue la protéine ChREBP dans ce processus. À terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir ou ralentir les atteintes rénales liées au diabète et à d’autres maladies métaboliques.

Bénéfices attendus

Les personnes présentant une maladie métabolique comme le diabète ou une glycogénose de type 1 (maladie génétique rare) ont un risque très élevé de développer une maladie rénale chronique. Cette complication est un enjeu majeur de santé publique puisqu’elle touche plus de 30 % des personnes diabétiques (soit environ 1,2 million de personnes en France), et jusqu’à 70 à 80 % des patients atteints de glycogénose de type 1. Aujourd’hui, il n’existe aucun traitement efficace pour empêcher l’aggravation de ces lésions rénales, qui peuvent mener à une insuffisance rénale sévère, nécessitant une dialyse ou une transplantation rénale. L’objectif du projet est de mieux comprendre comment la maladie rénale se développe en étudiant • Les graisses (lipides) qui s’accumulent dans leurs reins, et leur rôle dans l’aggravation de la maladie. • Les mécanismes moléculaires qui déclenchent précocement les lésions rénales. • L’impact de l’alimentation sur l’activité d’une protéine clé qui régule le métabolisme des sucres et des graisses dans le rein. • Le rôle des cellules immunitaires et la communication entre les cellules du rein dans l’évolution de la maladie. dans un modèle de souris transgéniques reproduisant les perturbations métaboliques des reins diabétiques ou de glycogénose de type 1. En identifiant ces mécanismes, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour ralentir, voire stopper, la progression de la maladie rénale chez les patients atteints de glycogénose de type 1 ou de diabète. Cela pourrait améliorer leur qualité de vie et réduire le risque d’insuffisance rénale.

Procédures

Pour identifier les souris porteuses des modifications génétiques nécessaires à l’étude, un petit échantillon de tissu (biopsie) sera rapidement prélevé (en quelques secondes) afin d’analyser leurs gènes. En fin de procédure, 4 lots de 20 souris mâles et 20 souris femelles seront mis à jeun pendant 6h pour contrôler leur état métabolique avant leur mise à mort. Dans une deuxième étude, des lots de 8 souris mâles et de 8 souris femelles seront mis à jeun pendant 12h; ou mis à jeun pendant 12h puis renourris pendant 12h, juste avant leur mise à mort. Une prise de sang sera réalisée sur tous les animaux, juste avant la mise à mort, pour réaliser des dosages biochimiques. Cette prise de sang unique sera réalisée en environ 20 secondes.

Impact sur les animaux

1.Biopsie de l’oreille (à 7–10 jours de vie) : Les souriceaux subissent un petit prélèvement (biopsie) au niveau de l’oreille. Cela peut causer une légère douleur passagère et un peu de stress, car ils sont maintenus immobiles pendant l’opération. Le risque de saignement est très faible. 2. Maladie rénale : Dans cette étude, les animaux sont euthanasiés à l’âge de 3 et 4 mois, stade très précoce de la maladie rénale, n’entrainant aucun signe de mal-être puisque la maladie reste silencieuse. Les problèmes graves (perte de fonction des reins) n’apparaissent qu’après 12–15 mois. 3. Jeûne de 12 heures : Quand les animaux ne mangent pas pendant 12 heures, ils deviennent moins actifs, perdent un peu de poids (5–10%), et leur température corporelle baisse légèrement. Leur taux de sucre dans le sang diminue, mais reste dans la normale (entre 70 et 110 mg/dL). 4. Jeûne de 6 heures (avant l’euthanasie) :Un jeûne de 6 heures cause un léger stress : les animaux cherchent plus de nourriture dans leur litière et perdent un peu de poids (moins de 5%). 5. Prélèvement sanguin. Ce prélèvement est rapide (15–20 secondes) et peut provoquer une légère douleur ou un petit saignement.

Devenir

Les animaux transgéniques seront produits en zone d’élevage et seront mis à mort en fin d’expérimentation pour le prélèvement des tissus (rein, foie et graisses au minimum) qui seront analysés au niveau structurel et moléculaire

Remplacement

Aujourd’hui, les scientifiques savent créer en laboratoire de mini-organes (appelés organoïdes) qui reproduisent certaines cellules du rein. Cependant, ces modèles restent trop simplistes : ils ne permettent pas d’étudier comment le rein interagit avec le reste du corps, comme le foie, ou comment l’alimentation et le métabolisme influencent la maladie. Or, la maladie rénale chronique étudiée ici est étroitement liée à des déséquilibres métaboliques, comme ceux observés chez les patients diabétiques ou atteints de certaines maladies génétiques (comme la glycogénose de type 1). La souris est le modèle le plus adapté pour plusieurs raisons : -Un métabolisme proche de l’humain : Elle permet d’étudier comment le rein réagit dans un contexte global, en tenant compte des interactions entre organes. -Un modèle unique : La souris atteinte de glycogénose dans les reins développe une maladie rénale chronique similaire à celle des patients, causée par une surcharge métabolique (comme dans le diabète). -Des outils scientifiques robustes : Les chercheurs disposent de nombreuses données et d’outils génétiques pour étudier précisément le rôle d’un facteur d’intérêt dans le rein.

Réduction

Pour obtenir des résultats fiables, il faut analyser un nombre suffisant d’échantillons afin de réaliser des analyses statistiques permettant de comparer les différents groupes analysés. Une méthode statistique robuste sera utilisée. La connaissance des modèles animaux et des approches moléculaires utilisées nous a permis de définir un nombre d’animaux minimum par groupe. Comme les reins de souris sont très petits, nous avons prévu d’augmenter le nombre d’animaux pour avoir assez de matériel biologique pour pouvoir réaliser toutes les analyses. Les maladies métaboliques (comme le diabète) peuvent se développer différemment chez les mâles et les femelles. Il est donc essentiel d’inclure les deux sexes pour obtenir des résultats complets. Au total, 240 souris transgéniques (mâles et femelles) seront produites et 208 souris d’intérêt seront étudiées. Parmi les 32 souris produites mais sans intérêt pour le projet, certaines pourront être utilisées pour maintenir l’élevage de ces lignées transgéniques utilisées dans différents projets. Les reproductions seront arrêtées dès que ce nombre sera atteint, pour éviter d’utiliser plus d’animaux que nécessaire.

Raffinement

Pour réduire la douleur, les prélèvements de tissus (biopsies) seront réalisés sur des souriceaux âgés de 7 à 10 jours, à un moment où leurs terminaisons nerveuses ne sont pas encore totalement développées. Afin d’éviter le stress dû à la séparation d’avec leur mère, les soigneurs manipuleront les petits en portant des gants imprégnés de la litière de leur cage, pour conserver leur odeur familière. Pour habituer les souris à être manipulées et réduire leur stress, elles seront régulièrement en contact avec les expérimentateurs et seront prises en main à l’aide d’un petit tunnel plutôt qu’attrapées directement. La maladie est ciblée uniquement dans les reins, ce qui évite les hypoglycémies graves grâce à la production de glucose par le foie. Lors des mises à jeun, les souris sont placées dans de grandes cages avec des maisons en plastique pour limiter l’agressivité et le stress. Pour assurer leur confort thermique, une partie des cages est posée sur une plaque chauffante pour qu’elles puissent se réchauffer si besoin. Grâce à la bonne connaissance de ce modèle animal, des critères précis ont été définis pour éviter toute souffrance inutile. Les souris seront euthanasiées précocement (entre 3 et 4 mois), avant que la maladie rénale entraine des signes de mal-être. La surveillance du bien-être des souris est basée sur le contrôle de leur poids et l’observation de leur comportement : Des points limites ont été clairement définis (perte de poids conséquente, mal être non résolu malgré la prise en charge des animaux) nécessitant la mise à mort de l’animal. En cas d’alopécie (perte de poils) ou d’agressivité, l’enrichissement du milieu sera renforcé : Ajout de jouets ou d’accessoires pour limiter le stress et permettre l’isolement vis-à-vis de leur congénère. La cage pourra être divisée en deux dès l’apparition des premiers signes pour éviter les conflits entre individus.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour notre projet de recherche car, contrairement à d’autres espèces comme le poisson, elle possède des mécanismes de régulation du métabolisme similaires à ceux de l’être humain. De plus, il est possible dans cette espèce de désactiver précisément un gène important dans les reins grâce à des techniques génétiques avancées. Ce modèle de souris imite très fidèlement la maladie chronique rénale associée à la glycogénose de type 1, ce qui en fait un outil précieux pour mieux comprendre cette pathologie et développer de nouvelles approches. Au laboratoire, tous les outils nécessaires, comme des anticorps spécifiques à la souris, sont disponibles pour analyser les effets de la maladie et des traitements. Les manipulations sur les souris seront limitées et réalisées à différents âges : une petite biopsie de l’oreille sera faite chez les bébés souris (entre 7 et 10 jours) pour vérifier leur patrimoine génétique. Ensuite, les expérimentations seront réalisées à l’âge de 3 à 4 mois, juste avant l’euthanasie des souris.

575 juvéniles de bar sauvages vont être capturés puis marqués, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, avant d'être relâchés dans leur zone de capture. Après anesthésie, chaque poisson reçoit une puce électronique, et 375 d'entre eux subissent en plus l'incision de l'abdomen pour y implanter une marque acoustique. Un poisson qui ne se réveille pas au bout de trente minutes est tué. L'étude cherche à comprendre les déplacements et la survie des juvéniles, dont le déclin est lié à celui des stocks de bar.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de marquer des juvéniles de bars sauvages dans leurs nourriceries pour mesurer leur présence dans différents habitats, leurs mouvements et leur survie. Au stade juvénile, le bar réside dans les zones côtières et estuariennes mais nous manquons d’informations sur leur écologie car ils vivent très près des côtes et ne sont pas facilement capturables avec les méthodes de pêches classiques (chaluts mis en œuvre à partir de bateaux de pêche). Le déclin des bar adultes pouvant être pêchés, s’explique en partie par une diminution du taux de survie des juvéniles dans les nourriceries. Comprendre leur comportement (utilisation d’habitat, mouvements, saisonnalité) et leur survie nous permettra d’identifier les zones d’habitats essentiels et in fine de comprendre l’effet des facteurs environnementaux (vagues de chaleur, hypoxie, etc.) sur ces paramètres. Ce projet s’articule autour de deux méthodes de marquages : des puces électroniques et des marques acoustiques. La fonction générale d’une marque individuelle est d’identifier les animaux et leur recapture (puce électronique) ou leur détection à proximité d’un récepteur (marque acoustique) nous permettent d’estimer la présence/absence d’un individu dans une zone (et donc son déplacement si les informations sont collectées dans différents lieux). Les puces électroniques nous permettront d’évaluer le taux de recapture des poissons (càd le ratio entre le nombre de poissons marqués, relâchés puis recapturés par le nombre total de poissons marqués initialement). Les marques acoustiques nous permettront de caractériser les mouvements des juvéniles de bar sur plusieurs mois et d’estimer leur taux de survie dans leur environnement naturel.

Bénéfices attendus

Les jeux de données générés seront : - Pour tous les poissons (N = 575) : l’âge des animaux marqués et le taux de recapture du bar juvénile lors de trois sessions ultérieures 10 jours, 20 jours et 3 mois après les captures initiales. - Pour les poissons avec une marque acoustique (N= 375) : leurs trajectoires, leurs zones d’habitat, et leur survie pendant 3 à 12 mois (selon la taille du poisson et de la marque acoustique). Le taux de recapture nous est nécessaire pour préparer nos futurs projets dans ces sites. Les marquages par puce électronique ont un prix limité (n = 100 poissons = 570 € contre 73 521 € pour les marques acoustiques) et sont peu invasifs (simple implant dans le muscle). Cela nous permettra d’évaluer le taux de recapture des bars juvéniles sur ces sites d’études (pourcentage d’animaux marqués puis recaptures) et de déterminer nos tailles d’échantillons pour les projets futurs impliquant des suivis longitudinaux avec recaptures. A court terme, le projet de marquage acoustique nous permettra de comprendre l’écologie des juvéniles de bar dans leur nourricerie. A moyen terme, ce projet nous permettra d’envisager le déploiement de marques acoustiques dans de plus grandes nourriceries estuarienne et dans des zones contrastées pour consolider nos connaissances sur les juvéniles de bar.

Procédures

Les animaux seront pêchés à la senne de plage ou au chalut et maintenus dans leur milieu naturel dans des nasses. Les animaux seront soumis à une anesthésie (< 10 min), puis prélèvement d’écailles (< 1 minute) et implant d’une petite puce électronique (< 1 minute, 575 poissons). 200 des 575 poissons seront réveillés (< 10 min), surveillés minimum 1 heure et remis à l’eau. 375 des 575 poissons seront sédatés et opérés afin d'implanter une marque acoustique (< 10 min). Ils seront ensuite réveillés (< 10 min), surveillés minimum 1 heure et remis à l’eau.

Impact sur les animaux

Voici le détail des nuisances : - Stress lié à la capture (intensité légère < 15 min). - Stress lié au maintien dans une nasse (intensité légère 1-24 heures). - Stress lié à la période de captivité dans un bac de stockage avant intervention (intensité légère 1-3 heures). - Transfert des poissons de leur bac de stockage au bac d’anesthésiant avec une épuisette. - Le prélèvement de quatre écailles et la pose d’une puce électronique pourront induire une douleur d’intensité légère (< 1 min) - L’incision de la cavité abdominale pour insérer une marque acoustique (intensité modérée pendant 5 min). - Stress lors la phase de réveil en milieu captif (intensité légère pendant 1 heure).

Devenir

Les animaux seront libérés dans leur zone de capture.

Remplacement

Cette étude vise à caractériser les habitats marins utilisés par les juvéniles de bar européen dans leur milieu naturel et à analyser leurs mouvements et taux de survie. Ces processus sont le résultat d’interactions complexes entre les individus et leur environnement physique et biologique, et donc permettent de caractériser les réponses comportementales face à l’environnement. Il n’est donc pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement.

Réduction

L’effectif total de 575 individus assure une réduction du nombre de poissons utilisés, tout en s’assurant de la pertinence de l’étude. Le taux de recapture est d’environ 10% sur les bars adultes. Si ce taux est similaire chez les juvéniles – ce que l’on cherche à identifier ici - il faudrait marquer avec une puce électronique 100 poissons pour en recapturer 10. Le N = 10 est la limite inférieure dans les expérimentations (notamment sur la physiologie des animaux en réponse à leur environnement) qui suivront ce projet. Quatre sites représentatifs des zones de nourricerie du Finistère, c’est-à-dire des cours d’eau à débit variable, allant de très faible à très fort, dans un habitat proche d’une plage ou d’un petit estuaire, ont été choisis pour rendre compte de la variabilité des comportements des juvéniles. Le nombre de poissons qui sera implanté avec une marque acoustique a été réduit au minimum et défini au regard de la pertinence scientifique. Il est communément admis que les marques acoustiques permettent d’estimer raisonnablement les mouvements et le taux de survie des individus d’une zone à partir de N = 100. Pour les marques acoustiques, nous prévoyons de réaliser 3 sessions de marquage à 2 périodes de l’année (juin : été, septembre : automne). En tout, nous marquerons 125 juvéniles par session dans un site (deux sessions) et 125 juvéniles dans un autre (N = 375 au total). En effet, l’implant de marques acoustiques sur les bars adultes n’entraine pas de mortalité et les poissons reprennent ra,pidement un comportement classique (chasse, mouvements journaliers, etc. ; observations personnelle). Néanmoins, le taux de mortalité naturelle est plus important chez les juvéniles que chez les adultes ; c’est pourquoi nous avons décidé de marquer 125 juvéniles par session avec les marques acoustiques.

Raffinement

Nos observations sur le terrain ont montré que les techniques de pêche n’altèrent que peu l’état de santé des poissons capturés. Les individus seront maintenus en groupe dans de grands bacs équipés d’un bulleur pour maintenir l’oxygène à un niveau saturant (poissons capturés à la senne de plage) ou des viviers (poissons capturés au chalut) afin qu’ils aient un comportement normal et calme. - Le transfert de chaque poisson entre les bacs se fera avec une épuisette adaptée. - Les poissons seront gardés dans des bacs opaques. - Une fois le poisson mis dans l’anesthésiant ou le bac de réveil, il sera surveillé par un expérimentateur en continu. - Si le poisson ne se réveille pas au bout de 30 min, il sera mis à mort. - La manipulation du poisson anesthésié se fera avec des mains équipées de gants en latex. - Lorsque le poisson sera mesuré et pesé, et les gestes 1 & 2 réalisés (procédure 1), il sera posé sur une éponge humide (< 1 min). - l’eau des bacs sera l’eau du site de pêche du poisson. - Les quatre écailles seront prélevées au niveau ventral, dans une zone où le poisson se frotte le moins et où les risques de blessures à la suite du retrait des écailles sont minimaux. - Les écailles seront prélevées loin les unes des autres afin de ne pas créer de zone continue sans écaille. - La puce électronique est la plus petite disponible sur le marché (1.4x8 mm) et est utilisée chez des individus encore plus petits que les nôtres sans effets négatifs - L’injecteur monobloc stérile est aussi miniaturisé : l’aiguille ne mesure que 1,75 mm de diamètre, et il est couramment utilisé chez des individus encore plus petits que les nôtres sans effet négatif. - Un pansement sera ensuite appliqué sur la zone d’insertion de l’aiguille de l’injecteur (poudre gélifiante). – Pour l’implant des marques acoustiques, nous réaliserons une incision aussi petite que possible (environ 1,5 fois le diamètre de la marque), nous utiliserons un antalgique (injection intra-musculaire par seringue). La dose de lidocaïne sera de 1mg/kg, soit 50 μL pour un poisson de 1kg. La dose sera ajustée à la masse de chaque animal. - Nous surveillerons les poissons au moins 1 heure avant de les relâcher dans le milieu naturel

Choix des espèces

Le bar européen est un poisson d'intérêt écologique, économique et social. Le déclin de survie des juvéniles dans les nourriceries a été identifié comme une des raisons ayant conduit au déclin du stocks de bar dans la zone Manche-Mer du Nord entre 2015-2020. Il est donc important de mieux comprendre le comportement de cette espèce dans son environnement naturel et son utilisation des zones côtières au stade juvénile. Juvéniles – entre 0 et 3 ans, car c’est l’utilisation des zone côtières par les stades juvéniles qui nous intéressent et qui nous permettront de mieux comprendre prédire les stocks de bars adultes (stade cible de la pêche). Avant de connaître leur âge précis, nous utiliserons la biométrie afin de sélectionner les classes d’âges ciblées. Les juvéniles 0 à 3 ans pèsent en moyenne moins de 250 g (données issues des campagnes scientifiques; les gammes de poids pour les poissons d’âge 0, 1, 2 et 3 ans sont respectivement : 3-35g, 7-152g, 35-365g, 230 – 580g). Aucun poisson de moins de 30 grammes ne sera marqué avec des marques acoustiques afin que le ratio entre le poids de la marque acoustique et celui du poisson soit inférieur ou égal à 4%.

1 152 souris vont être utilisées dans une étude sur le cancer de la prostate, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leurs organes. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales puis subissent l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe diffusant en continu un inhibiteur. Les tumeurs se développent pendant plusieurs mois avant l'analyse, sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les mutations du cancer prostatique humain. L'équipe affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité des lésions précancéreuses, concluant à la nécessité de l'expérience sur l'animal.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier les effets d'inhiber une forme de modification post-traduction de protéine qu'on appelle "hypusination" sur le développement du cancer de la prostate dans un modèle de souris. Nos résultats préliminaires démontrent qu'inhiber cette voie par un composé disponible commercialement bloque la multiplication des cellules cancéreuses de prostate. Afin de valider ces résultats chez la souris, nous traiterons les souris avec ce composé en diffusion continue grâce à l’utilisation de mini-pompes couramment utilisées en expérimentation animale. La diffusion est gérée par la mini-pompe qui envoie une concentration régulière du traitement afin de traiter l’animal en continue et en maitrisant la dose délivrée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si la voie de l’hypusination est impliquée dans la tumorigénèse du cancer de la prostate. Si c’est le cas, cette étude ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate qui dans ses formes résistantes à la castration possède actuellement un pronostic très sombre pour les patients avec une médiane de survie n'excédant pas 15 mois. Modification : Ce projet permettra également de déterminer le rôle de l'hypusination en fonction de l'agressivité de la tumeur et du stade de la tumeur ainsi que sur la formation des métastases.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale par jour pendant 5 jours, soit 5 x 1 minutes, puis à une procédure chirurgicale sous inhalation durant 45 minutes, temps d'implantation de la mini-pompe. Aucun prélèvement ne sera fait sur l'animal vigile. Modification : Après réévaluation et observation du geste chirurgicale, l'implantation de la pompe ne durera que 10 minutes. La durée totale des interventions sera de 5 minutes pour les 5 injections et 10 minutes pour l'implantation de la pompe pour un total de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir une éventuelle douleur post-opératoire ou une infection post-opératoire. Cependant, toutes les mesures seront prises pour éviter ces nuisances, avec une prise en charge sous asepsie et une administration systématique d'antalgiques, ainsi que surveillance et réévaluation rapprochée dans les suites. Modification : Les tumeurs ne sont pas cliniquement palpables jusqu'à 9 mois après l'injection du composé qui déclenche la formation des tumeurs. L'évolution de la tumeur sera suivie et des mesures seront prises en cas de douleur due à une évolution plus rapide de la tumeur.

Devenir

Modification :tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organes suivis d'analyses.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Modification : En raison de l'hétérogénéité des tumeurs, et pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, il est nécessaire d'inclure 18 souris par groupe par génotypage et par temps (5 souris pour les analyses histologiques, 8 souris pour les analyses immunophénotypiques (FACS) et 5 souris pour l'analyse des transcrits (RNA). Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (t-tests). Etant donné la variabilité inter-individuelle observée dans nos études précédentes (d'environ 15%), nous avons estimé que 18 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement avec une p-valeur de 5%.

Raffinement

Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’implantation de la pompe avec surveillance des points de suture et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de la buprénorphine sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Enfin, il a été fait le choix de l'implantation des mini-pompes afin d'améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes en intra-péritonéales du composé qui peuvent causer des nuisances. La surveillance générale sera visuelle, avec un suivi de l'aspect global de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal presente un dos voute, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort immédiatement. Une nourriture enrichie sous forme de nourriture gelifiée pourra être mise dans les cages durant toute la durée du traitement par mini-pompe afin de favoriser une bonne alimentation des animaux.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le cancer prostatique humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de cancer de la prostate afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux seront injectés à 8 semaines de vie, puis les mini-pompes seront implantées à partir de 3 mois plus tard, soit à 5 mois de vie. A ce stade, les souris présentent des lésions prénéoplasiques. Nous aurons 4 temps au bout desquels un groupe de souris sera mis à mort pour étudier l'effet du composé à différents temps : 1, 3, 6 ,10 semaines après implantation de la pompe. Modification : Les animaux seront injectés entre 8 et 12 semaines de vie afin d'élaborer des groupes expérimentaux plus conséquents et afin de réaliser les implantations des pompes simultanément. Ces injections ne peuvent se faire qu'au moment de la puberté qui se déroule entre 8 et 12 semaines car le système d'invalidation des gènes permettant la formation des tumeurs ne peut être induit qu'au moment de la puberté. Les mini pompes seront également implantées à partir de 5 mois après injection de tamoxifène soit à 7 mois de vie. A ce stade les souris présentent des adénocarcinomes.

Ces études répondent à une obligation réglementaire avant le premier essai chez l'enfant: 2 708 souris transgéniques du syndrome de Sanfilippo vont être utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent chaque semaine, pendant quatre à vingt-six semaines, un candidat médicament par voie intraveineuse, précédé d'un antihistaminique contre les réactions allergiques. Les souris porteuses de la mutation seront tuées pour l'examen de leurs organes exigé par la réglementation. Plus de deux mille autres, hétérozygotes ou non mutées, seront réutilisées pour entraîner le personnel aux gestes expérimentaux.

Objectifs

L’objectif de ce projet est la réalisation des études réglementaires non cliniques nécessaires pour permettre la première administration à l’homme du candidat médicament pour le traitement d’une maladie génétique sans traitement actuellement et touchant les jeunes enfants, la mucopolysaccharidose MPSIII de type IIIA ou syndrome de Sanfilippo. Cette maladie provoque une neurodégénérescence progressive, chez les jeunes enfants, avec complications neurologiques sévères, perte de la mobilité et de la communication et une espérance de vie réduite (adolescence ou début d’âge adulte. Ce projet sera conduit sur le modèle de souris transgénique Sgsh D31N x hTfR afin de répliquer les caractéristiques physiopathologiques de la maladie. Des études preuves de concept ont déjà été réalisées chez le laboratoire développant le candidat médicament et les résultats concluant permettent d’avancer dans les étapes suivantes de développement Les études de ce projet permettront d’avoir les données de sécurité suffisantes pour démarrer les premiers essais cliniques chez les jeunes enfantsdés l’âge de 2 ans.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - la détermination de la tolérance et de la sécurité du candidat médicament dans l’espèce rongeur transgénique la plus adaptée. - l'obtention de l'autorisation d'essai clinique et la réalisation d'essai clinique chez le patient dés l’âge de 2 ans avec le maximum de sécurité pour les personnes incluses - à long terme la disponibilité pour les patients d’un médicament pour le traitement de la MPSIII ou syndrome de Sanfilippo, maladie génétique avec espérance de vie courte, très invalidante et sans traitement actuellement en dehors de traitements symptomatiques

Procédures

Ces études consistent en l’administration hebdomadaire pendant 4 à 26 semaines, du candidat médicament. L’administration est une injection bolus, donc rapide, dans la veine de la queue qui ne nécessite pas d’anesthésie préalable. Les animaux recevront une injection (courte intraveineuse ou sous cutanée) d’un antihistaminique préalablement à chaque traitement pour limiter le risque de réactions allergique. Des prélèvements de sang seront réalisés pour dosage des concentrations et recherche d’anticorps, 2 à 3 occasions par étude. Les animaux pourront subir des anesthésies de quelques minutes et réveil d’anesthésie (incoordination) lors des prélèvements de sang réalisés sous anesthésie. Des test neuro comportementaux (incluant mais non limités aux tests d’apprentissage et mémoire, sensoriales [ex: auditif], activité locomotrice et batterie d’observations fonctionnelles [FOB]) peuvent être réalisé (durée du test de quelques minutes à 1 heure).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes: - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration, de prélèvement de sang (pouvant être réalisée sous anesthésie) ou lors des tests de maturation sexuelle et/ou frottis vaginaux. Des effets liés au modèle spécifique de cette souche de souris transgénique et pouvant arriver potentiellement avec l’âge, principalement neurocomportementaux, seront surveillés par les vétérinaires. Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration du candidat médicament (perte de poids, baisse d’activité, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Stress lors de changement d’environnement, confrontation à une situation inconnue et modification des conditions de luminosité (obscurité partielle ou totale avec utilisation possible d’une lumière rouge) et de température lors d’évaluations neurocomportementales. Des signes d’hypersensibilité possible notés dans les études préalables chez le sponsor et si confirmés dans les études en cours seront prises en charges par l’administration préalable systématique d’un antihistaminique.

Devenir

Les animaux homozygotes mutés seront euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes, de sang ou de tissus, tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles. Les animaux hétérozygotes ou Wild Types pourront être éventuellement réutilisés dans un autre projet pour la formation du personnel aux procédures expérimentales.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la toxicité de substances sur un organisme entier, ni de déterminer sa distribution et la dose sans effet adverse. Dans ces études sur les animaux adultes ou juvéniles, un relevé de poids, des signes cliniques et observation spécifique du développement d’animaux jeunes est requise par les lignes directrices en vigueur (ICH S11), ainsi que l’examen histologique complet des animaux en fin d’étude et en relation avec leur exposition dans le sang (ICH M3 (R2) et ICH S6) et dans le cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les guidelines.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des recommandations des lignes directrices en vigueur, des objectifs de l’étude, de la spécificité de la souche qui va demander 2 groupes contrôle dans les études chroniques pour obtenir une quantité de données suffisante pour l’évaluation des groupes traités (demande FDA). La possibilité de réaliser l’étude chronique 26 semaines en démarrant sur des animaux juvéniles de 3 semaines d’âge, permet d’éviter de dupliquer deux études chroniques et de limiter ainsi le nombre d’animaux dans le programme. La possibilité de livrer les animaux juvéniles homozygote sera privilégiée et le process sera validé dans l’étude préliminaire. Ceci permettra de laisser à disposition de l’éleveur les animaux hétérozygotes pour continuer leur phase d’amplification. L’option de la livraison de la portée entière ne sera utilisée qu’en cas de retard des résultats génétique, afin de ne pas perdre la portée entière. Le nombre d’animaux utilisés pourra donc être nettement réduit et l’élevage optimisé.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (par exemple : papier kraft, mouchoirs, tunnel, …). Le traitement des animaux par voie intraveineuse engendre peu de stress ou d’inconfort et sur une durée la plus courte possible (quelques secondes). La fréquence de traitement hebdomadaire est limitée. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. Une observation minimum sera faite les jours de traitement Une information spécifique sera apportée aux techniciens et sur le modèle pathologique pour identifier les signes liés au modèle et faire un suivi adapté. Un examen vétérinaire adapté à réception des animaux et à une fréquence régulière pourra être mis en place, compte-tenu du modèle pathologique spécifique. En cas de signes cliniques ayant des répercussions importantes sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire. Les femelles seront hébergées socialisées. Au sevrage, les males seront hébergés isolément selon les procédures en vigueur, avec ajout de balles de bois comme enrichissement Afin de limiter les nuisances pour les animaux en cas de réaction d'hypersensibilité qui ont été reportées occasionnellement dans le laboratoire ayant effectué des études de pharmacologie, une administration préalable d'anti-histaminique pourra être réalisée . Le volume d’administration et de prélèvement de sang de cette étude se basent sur les recommandations éthiques.

Choix des espèces

Le rongeur est une espèce acceptée par les agences réglementaires. La sélection de la souche de souris transgénique du modèle exprimant le gène déficient permet d’avoir le modèle pharmacologique le plus adapté et proche de l’homme pour répondre aux objectifs d’évaluation de la sécurité. L’âge des animaux au démarrage des études permettra de couvrir le traitement des patients dès l’âge de 2 ans.

Sept jours d'isolement en cage métabolique, des prélèvements de sang répétés et des séances de vaccination attendent 360 souris, utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré et toutes tuées ensuite pour prélever leurs tissus. Le projet vise à comprendre le rôle d'un gène lié à l'actine, à partir de patients porteurs de mutations provoquant des maladies auto-immunes précoces. Sur le remplacement, l'équipe affirme qu'il est impossible de modéliser la complexité du système immunitaire et du métabolisme sans passer par l'animal. Les cibles thérapeutiques évoquées pour les patients restent renvoyées au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Nous avons identifié chez des patients des mutations d’un gène associé à l’actine, une protéine majeure de la structure et de l’activité cellulaire. Ces patients présentent des manifestations pathologies immunitaires précoces et sévères. Les mécanismes sont complexes et les pistes thérapeutiques sont limitées. Dans un modèle de délétion génétiques de ce gène chez la souris nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes de ces pathologies afin d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles efficaces. Ce projet est multisite et se déroulera dans deux EU.

Bénéfices attendus

L’analyse de ce modèle de souris permettra d’étudier le rôle de la délétion d'un gène impliqué dans des maladies métaboliques et immunitaires. Ce projet permettra l'avancée des connaissances fondamentales. Et, à terme ce projet pourrait permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les patients porteurs de mutation ou présentant des maladies similaires.

Procédures

Prélèvement de sang (de 6 à 10 x 30secondes), Injections (de 3 à 5 x 30 secondes), vaccinations (4x 1 minute), prélèvement urinaire et fèces en cage métabolique (pendant 7 jours).

Impact sur les animaux

Le transfert des animaux entre les deux EU peut entrainer un léger stress. Les injections causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements de sang causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les vaccinations sont une source de stress modéré chez la souris avec une douleur légère de courte durée. L’isolation des souris en cage métabolique pendant 7 jours est la source d’un stress modéré chez les souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus d'intérêt.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est justifié par l’impossibilité de modéliser la complexité du système immunitaire, du métabolisme énergétique et des comportements associées. Il est nécessaire de comprendre l’organisation et la coopération de différents tissus métaboliquement actifs.

Réduction

Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées. Le nombre de souris par groupe a été déterminé pour permettre de détecter des différences statistiquement significatives.

Raffinement

Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des expériences pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Des grilles de score et des points limites strict et spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les gestes décrits dans les procédures se font sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Les mécanismes immunitaires et métaboliques sont similaires entre l'homme et la souris, qui représente donc un modèle pertinent pour mimer ce qui survient chez des patients présentant des maladies avec des effets sur le métabolisme. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes, à partir de 6-8 semaines pour lesquelles le système immunitaire est mature.

10 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant subir un gavage oral quotidien pendant dix mois. Le projet étudie la régulation du microbiote intestinal et son rôle dans les maladies inflammatoires. Certaines approches induisent une inflammation intestinale chronique, un cancer colorectal ou un diabète chez les souris. La mise à mort finale sert à prélever les organes pour analyse.

Objectifs

Ces expérimentations ont pour objectif d’évaluer les facteurs environnementaux régulant le microbiote intestinal, ainsi que de caractériser les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal peut conduire au développement de maladies inflammatoires chroniques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal est régulé, et l’importance de ce dernier dans les maladies inflammatoires

Procédures

MODIFICATIONS 2 texte en majuscules LES ANIMAUX SERONT SOUMIS À DES PRÉLÈVEMENTS DE SANGS DE 5 À 10µL PAR PRÉLÈVEMENT SUR ANIMAUX VIGILES. LES ANIMAUX SUBIRONT 4 PRÉLÈVEMENTS UNIQUES DE SANG POUR UNE DURÉE INFÉRIEURE À 1 MINUTE. MODIFICATIONS texte en majuscules LES ANIMAUX SUBIRONT 6 PRÉLÈVEMENTS MULTIPLES DE SANG SUR UNE DURÉE DE 2H, CHACUN DE CES PRÉLÈVEMENTS MULTIPLES SERONT SÉPARÉS D’AU MOINS UNE SEMAINE. LES ANIMAUX SUBIRONT AU MINIMUM 1 GAVAGE ORAL HEBDOMADAIRE ET AU MAXIMUM 1 GAVAGE ORAL QUOTIDIEN D’UN VOLUME MAXIMAL DE 200MICROL SUR PÉRIODE DE 10 MOIS. LES ANIMAUX SUBIRONT UN PRÉLÈVEMENT UNIQUE DE SANG EN FIN DE PROTOCOLE.

Impact sur les animaux

MODIFICATIONS 2 texte en majuscules Certaines approches induiront une inflammation intestinale chronique et/ou un cancer colorectal chez les animaux. De plus, certains animaux développeront des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse. Les facteurs alimentaires étudiés, via leurs effets sur le microbiote intestinal, pourront favoriser la dysbiose intestinale de manière à promouvoir une inflammation intestinale chronique et/ou certaines dérégulations métaboliques légères. ENFIN, LES SOURIS DIABÉTIQUES PRÉSENTERONT UNE SOIF EXCESSIVE ET UN BESOIN ANORMAL DE BOIRE DE GRANDES QUANTITÉS D’EAU INDUISANT UNE AUGMENTATION DE LA FRÉQUENCE DES MICTIONS. Aucun stress ni comportement anormal n’est anticipé. Ces nuisances attendues sont de sévérité modérée.

Devenir

A l’issue de toutes les procédures proposées, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes nécessaires à des analyses approfondies dans le but de répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment intestin/microbiote en lien avec le développement de pathologies inflammatoires chroniques.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 15 souris par condition et par sexe était nécessaire être utilisé afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès des biostatisticiens.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.

Choix des espèces

L’exploration de l’interaction du système immunitaire avec le microbiote nécessite un modèle flexible qui permette de manipuler chacun de ces domaines, de tester les causalités et de mesurer les paramètres moléculaires et cellulaires. En ce sens, le modèle souris est le plus adapté, car les outils permettant de manipuler et d’analyser le système immunitaire chez la souris sont les mieux développés parmi les mammifères. De plus, les connaissances acquises chez la souris permettent un transfert chez l’homme, du moins conceptuellement, et bien souvent en l’état. Les souris utilisées seront âgées de 3-8 semaines d’âge lors du démarrage des différentes procédures. Le microbiote intestinal se met en place dès les périodes précoces de la vie, et il est nécessaire pour nous d’utiliser de jeunes animaux afin d’étudier les facteurs environnementaux impactant la mise en place du microbiote.