Procédures légères

Une biopsie de la queue, des injections quotidiennes pendant quatre ou cinq jours pour bloquer un gène, un prélèvement de sang sous anesthésie : les actes décrits durent chacun quelques dizaines de secondes. 2 064 souris vont être utilisées, 1 104 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 960 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever l'intestin et les fèces. Les souris issues de l'élevage qui ne servent à aucune procédure sont tuées aussi. Le porteur veut comprendre comment une alimentation riche en lipides, le microbiote et le sexe influencent le cancer colorectal, et signale que le développement spontané des tumeurs provoque une douleur modérée. Il justifie l'effectif de 2 064 animaux en une phrase, les effectifs étant "déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés".

Objectifs

Les objectifs du projet sont de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du cancer du côlon et du rectum. Des données de la littérature ont montré qu’une alimentation riche en lipides était un facteur de risque pour le cancer du côlon et du rectum. Une partie des effets délétères de ces régimes est médiée par des changement de la population microbienne de l’intestin. De plus, il existe une importante différence en fonction du sexe d’un individu en ce qui concerne la probabilité de développer un cancer du côlon et du rectum. Ce projet a pour but de comprendre comment les régimes alimentaire, le microbiote et le sexe influencent le développement de ce type de cancer.

Bénéfices attendus

Ces travaux devraient contribuer à une meilleure compréhension du rôle de la nutrition, du sexe de l’individu et du microbiote dans l’initiation et le développement du cancer du côlon et du rectum.

Procédures

1 biopsie de queue : 10 secondes. 1 Contention pour injection d’une molécule bloquant l’expression d’un gène : 20 secondes, (1X/jour pendant 5 ou 4 jours). 1 Contention pour injection d’une molécule marquant la prolifération cellulaire : 20 secondes. 1 Prélèvement sanguin : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lors de la contention et des injections. L’adaptation des souris aux nouveaux régimes ainsi que le développement des tumeurs peuvent induire une perte de poids. Une douleur légère lors de la biopsie. Le développement spontané de tumeur peut engendrer un stress chez la souris et une douleur modérée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus dans les procédures expérimentales, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.

Remplacement

L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des points limites spécifiques sont établis. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permet d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le développement du cancer colorectal. Des souris adultes âgées de 2 à 4 mois, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.

462 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 102 un niveau léger. Elles sont infectées par des bactéries multirésistantes pour provoquer une septicémie, reçoivent jusqu'à quatre injections ou prises par jour pendant cinq jours, et sont exposées trois fois au maximum à des ondes électromagnétiques, une heure par séance, immobilisées dans un tube ou sous anesthésie. Le porteur décrit une fatigue, une respiration difficile, un arrêt du toilettage et une perte de poids qui s'accentuent sur 24 à 72 heures sans traitement efficace, avec une surveillance portée jusqu'à trois fois par jour. Des souris sans poil, génétiquement modifiées et immunodéprimées, seront utilisées pour améliorer le signal de bioluminescence, et le porteur conclut qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne remplace l'animal dans une infection généralisée.

Objectifs

D’après le site de l’Organisation Mondiale de la Santé et les données scientifiques, en 2017, près de 50 millions de cas de septicémie et 11 millions de décès liés à cette maladie ont été recensés dans le monde. Cela représente encore près de 20% de l’ensemble des décès dans le monde dont près de la moitié ont été enregistrés chez les enfants de moins de 5 ans. Le sepsis est généralement causé par des bactéries nosocomiales, bien souvent résistantes aux traitements disponibles sur le marché, induisant rapidement un choc septique généralisé conduisant au décès du patient. Il y a donc une urgence dans la recherche et dans la découverte de nouveaux traitements efficaces contre ces bactéries multi-résistantes aux traitements. L’utilisation des ondes électromagnétiques comme approche thérapeutique suscite un intérêt croissant en raison de leur potentiel à moduler des processus biologiques sans recours à des agents chimiques. Dans le contexte des infections septicémiques dues à des bactéries multirésistantes, cette stratégie innovante pourrait offrir une alternative ou un complément aux traitements conventionnels, en ciblant la physiopathologie de l’infection par des mécanismes non pharmacologiques. Ce projet consiste à évaluer l’efficacité thérapeutique des ondes électromagnétiques dans le traitement de sepsis générés par infection avec des souches de bactéries multirésistantes aux traitements, bioluminescentes ou non (de type E. Coli, K. Pneumoniae, A. Baumannii, P. Aeruginosa ou encore S. Aureus) en modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’utilisation de nouvelles thérapies (expositions à des ondes électromagnétiques) appliquées seules ou en association avec des traitements antibiotiques existants pour potentialiser leur effet pour mieux contrôler et améliorer la prise en charge des infections bactériennes responsables de septicémies rencontrées notamment dans les hôpitaux.

Procédures

Les animaux seront infectés par une injection de bactéries. Chaque injection environ 1 à 2 minutes par animal. Les animaux pourront recevoir des traitements dans la limite de 4 injections ou prises par jour. Les injections sur animal vigile seront réalisées en 1 à 2 minutes. Celles réalisées sur animaux anesthésiés dureront (en comptant l’anesthésie) environ 5 minutes. La durée totale des traitements ne pourra être dépasser 5 jours. Les animaux seront également exposés aux ondes électromagnétiques sous anesthésie ou bien maintenu dans un tube/ boîte afin de limiter leur mouvement. La durée d’une session de traitement n’excèdera pas une heure et 3 sessions d’exposition seront réalisées au maximum. En cas d’utilisation de souches bactériennes bioluminescentes, des suivis de la bioluminescence au maximum pendant 7 jours sur toute la durée de l’étude seront réalisés sur animaux anesthésiés afin d’éviter tout mouvement des animaux pendant les phases d’acquisition des images. La durée de l’acquisition de bioluminescence, en comptant l’anesthésie, sera d’environ 10 minutes. Au maximum 4 prélèvements de sang à différents délais pourront être réalisés sous anesthésie ou en vigile en fonction de la voie de prélèvement. Le prélèvement durera 2 min en vigile et 5 minutes sous anesthésie (anesthésie comprise).

Impact sur les animaux

Les modèles étudiés dans ce projet correspondent à des infections généralisées qui peuvent provoquer, dans les heures suivant l’infection, différents signes de malaise chez les animaux : fatigue, diminution de l’activité, respiration plus difficile, manque de toilettage ou perte de poids. Sans traitement efficace, ces signes peuvent s’accentuer progressivement au cours des 24 à 72 heures suivant l’infection. Comme l’évolution peut varier d’un animal à l’autre, une surveillance clinique est réalisée au minimum une fois par jour. En cas de signes d’aggravation, la fréquence d’observation peut être augmentée jusqu’à trois fois par jour. Cette surveillance permet d’identifier rapidement un seuil défini à l’avance (appelé point limite) afin de mettre en place les mesures nécessaires pour limiter au maximum la souffrance animale. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les pesées, les examens cliniques ou les traitements. Certaines procédures demandent une anesthésie ou un temps de manipulation plus long (jusqu’à environ 1 heure), tandis que d’autres durent seulement quelques minutes. Ces étapes peuvent provoquer un stress passager ou, plus rarement, de petits effets indésirables comme un hématome après une prise de sang. Tout sera mis en œuvre pour réduire ces effets.

Devenir

Le modèle d’infection étant généralisé (septicémie) et les études d’évaluation de l’effet de l’exposition aux ondes électromagnétiques de la procédure n°1 et d’efficacité de la procédure n°2 nécessitant des prélèvements d’organes afin de réaliser des analyses, les animaux seront systématiquement euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Malheureusement à ce jour, malgré les évolutions constantes des modèles in-vitro et in-silico, aucun modèle ne permet de remplacer totalement le modèle animal d’autant plus dans le cas d’une infection généralisée comme celui de la septicémie. Cependant, en amont de ce projet, des études in vitro de non-toxicité et d’efficacité ont été réalisées respectivement sur des cultures cellulaires humaines et des cultures bactériennes sur gélose.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé en fonction des besoins réels de chaque étape du projet. Une première petite étude sera réalisée pour vérifier l’effet de l’application d’ondes électromagnétiques sur la physiologie des souris. Pour cette étape, un minimum de six animaux par condition testée sera nécessaire. Pour les études principales, au moins deux groupes d’animaux seront constitués (un groupe traité et un groupe non traité), avec un minimum d’environ six animaux par groupe, afin d’évaluer l’effet potentiel du traitement. Pour certaines mesures nécessitant l’utilisation de bactéries produisant de la lumière, deux animaux supplémentaires seront inclus afin de mesurer le niveau normal de signal. L’utilisation de ces bactéries bioluminescentes permet de suivre l’évolution de l’infection chez les mêmes animaux au fil du temps, sans avoir à les euthanasier pour obtenir ces données. Cela contribue à réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour mener à bien le projet.

Raffinement

Une période d’acclimatation de minimum 5 jours sera respectée. Les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilés avec des enrichissements appropriés, en groupes sociaux, y compris les souris contrôles non infectées (nécessaire à l’évaluation du bruit de fond de bioluminescence) qui seront à minima au nombre de 2 par étude afin d’éviter leur isolement. En cas d’agressivité, des enrichissements supplémentaires (cachette supplémentaire et un morceau de papier en cellulose de bois) seront ajoutés dans la cage afin de réduire au maximum l’agressivité et de ne pas avoir recours à l’isolement de l’animal agressif en première instance. Les actes techniques, en particulier ceux nécessitant une anesthésie des animaux seront, autant que possible, regroupés pour limiter le nombre d’anesthésie. Lors de chaque anesthésie, un gel oculaire sera appliqué afin d’éviter le dessèchement cornéen et les animaux seront placés autant que possible sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante pour éviter l’hypothermie. Au cours de ces études, les animaux seront suivis par du personnel formé et qualifié au minimum 1 fois par jour et jusqu’à trois fois par jour (poids, suivi clinique avec grille de scoring et éventuellement mesure de la température corporelle) en fonction de la virulence de la souche bactérienne inoculée ainsi que des stades de progression de l’infection. Cela permettra de détecter les stades précoces d’un état de santé dégradé afin de mettre en place des mesures de prises en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien de type hydratation, hébergement individuel, …) ou la mise à mort en cas d’état de santé considérablement dégradé et irréversible. Ce suivi renforcé pourra être complété par une visite vétérinaire.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car c’est un modèle standard, polyvalent (multiplicité des souches disponibles dont certaines sans poil) et couramment utilisé dans les études d’infections bactériennes. De plus, sa taille réduite permet l’utilisation de technique d’imagerie optique corps entier ce qui est cruciale pour le suivi d’une infection généralisée. Les souches de souris sans poil (immunocompétentes ou immunodéficientes) seront privilégiées dans le cas d’utilisation de souches bactériennes bioluminescentes pour obtenir les résultats les plus pertinents (absence de la bioluminescence naturelle des poils donc augmentation de la sensibilité). De ce fait des souris OGMs immunodéprimées pourront être utilisées. Les animaux seront hébergés en cage et manipulée en environnement confiné permettant ainsi de maintenir leur statut sanitaire et de ne pas observer de dommages liés à leur immunodépression. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes, des deux sexes sans distinction, entre 6 et 9 semaines au moment de l’infection ou du premier traitement. Ce stade de développement permet d’avoir des animaux avec un système immunitaire mature (pas d’autre contrainte spécifique liée à l’âge).

595 souris mâles vont être utilisées, chacune pouvant passer jusqu'à douze examens d'imagerie par résonance magnétique de trois heures sous anesthésie gazeuse, espacés de quinze jours au minimum. 315 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 280 un niveau léger, et toutes sont tuées pour prélever les muscles des membres postérieurs. Des lésions musculaires leur sont infligées par injection de notexine ou par électroporation, et un agent de contraste est injecté pendant l'examen. Le porteur présente la résonance magnétique comme relevant du premier principe des 3R, remplacer, parce qu'elle évite des prélèvements invasifs, et conclut par ailleurs que le recours aux modèles animaux reste "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant le muscle.

Objectifs

Le phénomène de résonance magnétique nucléaire (RMN), a permis de développer les techniques d’imagerie médicale non invasive depuis plusieurs décennies. Les nombreuses innovations qu'a connues la RMN, en imagerie (IRM) et aussi en spectroscopie (SRM), laissent entrevoir de nouvelles applications. Les techniques d’IRM et de SRM sont des outils puissants dans le domaine des pathologies neuromusculaires et cardiaques (suivi de l’infiltration graisseuse, de l’inflammation, de l’œdème, des atteintes métaboliques…) et sont sans cesse en développement. Le projet soumis ici a pour but de développer dans la durée de nouvelles méthodes d’imagerie et de spectroscopie RMN pour améliorer l’évaluation du muscle squelettique et cardiaque chez les rongeurs. Ces outils pourront ensuite être utilisés en routine dans les projets en expérimentation animale ou transposés en clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - D’un point de vue cognitif, il va permettre d’améliorer notre connaissance sur le tissu musculaire, sa structure et son fonctionnement. - D’un point de vue recherche préclinique, il va permettre la mise en place d’outils d’évaluation du muscle et le développement de nouveaux biomarqueurs du tissu musculaire. Ces nouveaux outils et biomarqueurs pourront ensuite être transposés en recherche clinique.

Procédures

L’ensemble des examens par résonance magnétique nucléaire (RMN), ainsi que l’induction des lésions musculaires localisées, seront réalisés sous anesthésie gazeuse. La durée maximale des examens RMN sera de 3 heures. Chaque animal pourra être soumis à un maximum de 12 examens RMN, espacés d’un intervalle minimal de 15 jours. L’induction des lésions musculaires sera brève, ne dépassant pas 15 minutes. Une analgésie préalable à la lésion sera effectuée par injection d’un analgésique. Les injections d’agent de contraste seront effectuées sur animal sédaté pendant l’examen RMN et le volume d’agent de contraste sera calculé de façon à avoir une concentration adaptée au poids corporel. À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés après sédation, afin de permettre le recueil des échantillons musculaires.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances qui sont attendues sont liés aux anesthésies mise en œuvre dans ce projet pouvant induire une détresse respiratoire, si une fréquence respiratoire inférieure à 60 cycles/minute persiste, et une hypothermie si le système de maintien de la température corporelle présente un défaut. Dans le cadre du développement des méthodes d’imagerie, l’utilisation d’un agent de contraste sera nécessaire. Cette injection n’induit pas d’effets secondaires sauf une légère irritation au moment de l’injection en qui s’accompagne d’une augmentation transitoire de la fréquence respiratoire (quelques secondes). Enfin les modèles utilisés pour la validation des méthodes d’imagerie sont des modèles de dégénérescence/régénération musculaire peu traumatiques. Les lésions musculaires mises en œuvre n’induisent pas de phénotype dommageable ni perte de fonction mais pourrait réduire transitoirement un inconfort et une réduction de la mobilité des animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de chaque procédure expérimentale, afin de permettre le prélèvement de tissus musculaires des membres postérieurs en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

La résonance magnétique nucléaire (RMN) s’inscrit dans le premier principe des 3R, Remplacer, en permettant d’évaluer in vivo un grand nombre de paramètres du tissu musculaire, réduisant ainsi le recours aux techniques invasives telles que l’histologie ou la biochimie, qui nécessitent souvent l’euthanasie de l’animal pour le prélèvement d’échantillons. Toutefois, à ce jour, aucun modèle in vitro ne reproduit fidèlement la complexité architecturale ni le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. L’utilisation de modèles animaux demeure donc indispensable à l’étude de ces tissus. Divers modèles animaux de pathologies neuromusculaires sont disponibles, notamment chez les rongeurs, les chiens ou les chats. Les modèles murins sont particulièrement répandus en recherche fondamentale et préclinique en raison de leur facilité de manipulation liée à leur petite taille, ainsi que de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques phénotypiques des pathologies humaines, telles que la fibrose, les cycles de dégénérescence/régénération musculaire et les processus inflammatoires.

Réduction

La complémentarité des techniques d’imagerie et de spectroscopie permet d’acquérir des données multiples à partir d’un même animal. Il est donc possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie er de spectroscopie RMN, d’extraire plusieurs paramètres d’évaluation du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par RMN autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Par son caractère atraumatique, la RMN offre la possibilité de réitérer un examen sur un même animal sans effets nocifs pour les individus rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces 3 spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de réduire le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R avec le 2ème R, Réduire. Le nombre total d’individus est de 595 individus. Les sous-groupes d’animaux sont au minimum de 10 individus. Ce nombre a été estimé de façon à avoir un nombre suffisant d’individus par groupe pour réaliser des tests statistiques standards.

Raffinement

La résonance magnétique nucléaire (RMN) répond également au troisième principe des 3R, Raffinement, grâce à l’évolution continue des outils méthodologiques et aux avancées technologiques en électronique, qui permettent aujourd’hui d’atteindre, en préclinique, des résolutions environ 3000 fois supérieures à celles obtenues avec les dispositifs cliniques les plus performants. Le raffinement s’applique également aux conditions d’hébergement des animaux, maintenus en groupes dans des cages à usage unique placées sur des portoirs ventilés, avec un enrichissement de l’environnement (tubes en carton, copeaux pour la nidification). Toutes les procédures RMN seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de garantir l’immobilité des animaux et de minimiser leur stress. Les modèles lésionnels seront mis en œuvre par du personnel qualifié, notamment pour les injections de notexine, de peptides et pour l’électroporation, réalisée sous anesthésie. La température corporelle sera maintenue à 38 degrés Celsius grâce à un tapis chauffant, et la fréquence respiratoire suivie en continu à l’aide d’un capteur pneumatique amagnétique. L’état de santé des animaux fera l’objet d’une surveillance quotidienne, conformément à la législation en vigueur, et leur poids sera systématiquement contrôlé avant chaque expérimentation afin de détecter toute perte anormale. Des points limites liés à l’état général de l’animal, la réalisation des lésions et la réalisation des examens RMN ont été définis.

Choix des espèces

En raison de leur petite taille et des conditions d’hébergement relativement simples qu’elles requièrent, les souris constituent un modèle animal aisément manipulable et largement utilisé en recherche biomédicale. L’ensemble des procédures sera réalisé chez des animaux ayant atteint l’âge adulte, compris entre 2 et 15 mois. Ce choix vise à limiter les variations interindividuelles liées à la croissance, susceptibles d’affecter la qualité des mesures, notamment en termes de répétabilité et de reproductibilité. Le développement méthodologique prévu dans ce projet nécessitera, dans une première phase, le recours à des animaux issus d’élevages commerciaux, avant une application ultérieure à des modèles pathologiques bien caractérisés. Les modèles lésionnels induits permettent d’étudier les mécanismes impliqués dans le développement de pathologies humaines. Dans le cadre de cette demande d’autorisation, qui concerne exclusivement un développement méthodologique, le choix a été fait de restreindre l’étude à des animaux de sexe mâle.

162 souris gestantes reçoivent un gavage de PFAS par jour pendant toute leur gestation, sept gavages de cinq minutes chacun. Leurs 1 296 souriceaux sont comptés dans le projet, ce qui porte à 1 458 le nombre de souris utilisées, 1 296 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 162 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever le sang et les organes. Le porteur indique que les petits pourraient présenter un retard de croissance, des anomalies du comportement social et de la vocalisation, voire une mortalité néonatale en cas d'exposition importante. Il revendique la souris gestante comme un "organisme entier", tout en décrivant le modèle cellulaire complexe de placenta humain qu'il utilise en parallèle.

Objectifs

Des données émergentes suscitent des préoccupations concernant les effets de l'exposition aux polluants de la famille des substances per et polyfluoroalkylées (PFAS), sur la santé placentaire et le développement du fœtus, augmentant ainsi la vulnérabilité maternelle et fœtale. Particulièrement, quatre substances PFAS associés soit à des modifications histologiques de la vascularisation placentaire, soit à un vieillissement précoce des villosités placentaires. Des études épidémiologiques ont montré que l'exposition gestationnelle aux PFAS est associée à un risque accru de complications de la grossesse, notamment le développement de maladies cardiovasculaires comme la prééclampsie, et pourrait également exposer le fœtus à des effets néfastes sur sa santé, tels qu'un faible poids à la naissance. Par ailleurs, des travaux récents chez l'homme et l'animal ont suggéré que l’altération de la fonction vasculaire feto-placentaire pourrait constituer un mécanisme clé de toxicité aux PFAS pendant la grossesse. Le projet global consistera à étudier les effets de l’exposition aux PFAS durant la grossesse sur le placenta et le fœtus en s’appuyant sur des données collectées sur une cohorte de patientes suivies pendant leur grossesse en France pour l'exposition aux polluants, y compris les PFAS. Les PFAS associés à des altérations histologiques du placenta feront l'objet d'une étude approfondie dans notre projet. Les impacts de l’exposition aux PFAS candidats seront d'abord étudiés sur un modèle de cellules placentaires, puis sur un modèle d’explants de placenta humain, et enfin sur un modèle de souris. L’ objectif de ce projet sera : D’évaluer l'impact de l'exposition à ces PFAS sur le développement placentaire et fœtal chez la souris gestante.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples et s'inscrivent dans une perspective de prévention et d'amélioration des connaissances sur les risques liés à l'exposition aux PFAS durant la grossesse. La caractérisation des mécanismes par lesquels les PFAS affectent la santé placentaire et fœtale est cruciale pour mieux comprendre les risques d'une exposition au cours de la gestation. En effet, la perte d'intégrité placentaire est un phénomène qui peut non seulement perturber le déroulement de la grossesse, mais aussi altérer le développement du cerveau fœtal. L’utilisation du modèle de souris gestante permettra d’évaluer l'impact de l’exposition aux PFAS dans un environnement biologique plus complexe, facilitant l’observation des effets sur la santé du fœtus et sur le développement de possibles pathologies futures. Toutefois, bien que certaines études aient exploré les effets des PFAS sur la santé placentaire, aucune n’a jusqu'à présent approfondi la caractérisation de l'impact de ces substances sur la structure placentaire, ni étudié leur effet potentiel sur l'interaction entre le placenta et le développement cérébral du fœtus. Ce projet permettra de combler ces lacunes en apportant une compréhension plus élargie de la réponse gestationnelle aux PFAS et d’identifier des altérations du cerveau fœtal, connues pour évoluer en troubles cognitifs durant l'enfance. À long terme, ce projet permettra de mieux évaluer les risques sanitaires associés à l'exposition aux PFAS et de définir des critères pour une réglementation plus stricte. Il permettra d'élaborer de nouvelles stratégies de surveillance, de prévention et d'atténuation des risques liés à l’exposition aux PFAS chez les femmes enceintes et les fœtus, tout en permettant l'établissement de valeurs seuils à ne pas dépasser afin de réduire les risques de pathologies chez les générations futures.

Procédures

Les gavages réalisés seront effectués une fois par jour chez les souris femelles adultes gestantes pendant toute la gestation. Celle-ci durera 5 min par gavage et par animal. Au total chaque souris recevera 7 gavages au cours de la gestation.

Impact sur les animaux

Le gavage avec une solution de PFAS peut provoquer un inconfort temporaire, notamment lors de l’introduction de la sonde, ce qui pourrait entraîner une douleur se limitant à la période de manipulation. La procédure de gavage, en particulier si elle est répétée peut entrainer du stress ainsi qu'une perte de poids modérée et une réduction de la mobilité. Des effets liés aux PFAS peuvent également être observés comme des troubles gastro-intestinaux (diarrhée, vomissements légers). Les souriceaux pourraient présenter un retard de croissance (un poids à la naissance inférieur à la moyenne), des anomalies comportementales (recherche de nid, comportement social, communication via vocalisation), voire une mortalité néonatale en cas d'exposition importante aux PFAS. A long terme, des signes d’altérations neurologiques pourraient persister. Ces paramètres seront surveillés de très près pendant toute l’étude.

Devenir

Afin de mener ce projet et d’évaluer les effets des PFAS, le sang ainsi qu’un ou plusieurs organes seront prélevés sur les animaux pour être analysés, ce qui implique que les animaux devront être euthanasiés avant de réaliser ces prélèvements.

Remplacement

Cette étude examine les effets de l'exposition prénatale aux PFAS chez la souris gestante et son fœtus. L'objectif est de mieux comprendre comment ces substances peuvent affecter le fonctionnement du placenta et, potentiellement, le cerveau du fœtus, un organe particulièrement vulnérable. Les perturbations dans le développement du cerveau du fœtus peuvent avoir des conséquences importantes sur la santé du fœtus, à long terme. L’étude a été initiée par l’étude les liens entre les niveaux de PFAS dans le sang des femmes enceintes et des anomalies dans la structure du placenta. Cette analyse a été effectuée sur des données collectées sur une cohorte de patientes enceintes suivies durant leur grossesse pour examiner les liens possibles avec des marqueurs de vieillissement ou de vascularisation dans le placenta. Avant de passer sur le modèle animal, nous avons réalisé des études cliniques, in vitro et ex-vivo qui confortent nos hypothèses et nous incitent à considérer un modèle in vivo. Le projet comprend plusieurs volets innovants qui visent à réduire/remplacer l'utilisation des animaux en utilisant: - Un modèle cellulaire complexe de placenta qui regroupe les différents types cellulaires présent dans le placenta humain sera également utilisé pour étudier l'impact des PFAS, en simulant les interactions entre tous les types de cellules présentes dans le placenta. - A la suite de la publication des résultats sur le placenta humain et en vue de l’intérêt suscité par cette étude, des expériences en laboratoire seront menées sur des cellules placentaires humaines pour étudier les effets des PFAS et leurs effets sur le placenta. En dépit de toutes les approches citées ci-dessous, notre projet ne pourra pas se passer du modèle animal. En effet, l’organisme entier offre la possibilité d’étudier les réponses globales des différents types cellulaires et d'analyser les interactions entre différents organes, cas du placenta et du cerveau fœtal. Les mécanismes recherchés ne peuvent être caractérisés que dans un contexte d’organisme entier, et non sur des cellules isolées au laboratoire dans un contexte non physiologique. L’utilisation du modèle de souris dans un contexte plus physiologique propose une recherche complète qui fournira des informations sur les effets potentiels à court et à long terme. Ainsi, ce projet vise à fournir une compréhension approfondie des effets des PFAS pendant la grossesse et leur impact potentiel sur la santé du fœtus.

Réduction

Il est prévu d’utiliser 162 souris femelles qui donneront naissance à environ 8 souriceaux chacune, soit 1458 souris au total sur une durée de 5 ans. Ces souris seront divisées en plusieurs groupes et recevront un traitement différent de PFAS. Le nombre de souris femelles a été calculé et réduit au minimum de façon à ce que les résultats puissent être exploités et interprétés de façon fiable d'un point de vue statistique. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous sommes appuyés sur des données de la cohorte sur les patientes enceintes qui a identifié les PFAS les plus pertinents à caractériser dans un organisme entier, la souris gestante. Le modèle murin sera exclusivement employé pour valider les effets observés et réaliser des expériences complémentaires, et non pour des identifications initiales.

Raffinement

Les souris seront suivies tous les jours de la semaine par les personnes impliquées dans le projet et les week-end par les personnes d’astreinte. Les souris gestantes ayant mis bas avec leurs souriceaux seront suivies tous les jours dès l’accouchement, jusqu’au moment de séparation des petits de leur mère (J42). Différents paramètres permettant le suivi de l'aspect général comme le comportement, la locomotion, ainsi que la perte de poids seront estimées de façon régulière. La mise à mort et la collecte des échantillons seront effectuées sous anesthésie. Des critères d'arrêt sont prévus dans le projet en cas de survenue d’effets inattendus.

Choix des espèces

Le modèle choisi pour cette étude est le modèle animal souris gestantes, âgées de 8 à 14 semaines, qui permettra de suivre toutes les étapes de la gestation. Le modèle souris est choisi pour sa gestation courte et proche de la gestation humaine. Comme chez l’humain, la placentation chez la souris est hémochoriale, c’est-à-dire que les échanges entre la mère et le fœtus se font à travers la barrière placentaire sans que le sang de la Maman et de son fœtus ne soient mélangés. Plusieurs études ont démontré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des gènes clés de la placentation chez les deux espèces et que plusieurs facteurs qui régulent la formation de nouveaux vaisseaux sont exprimés dans des types cellulaires similaires et régulés de la même façon.

459 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 260 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 199 un niveau léger. Chaque geste se fait sous anesthésie gazeuse, cinq prises de sang étalées sur sept mois pour 199 d'entre elles, quatre injections espacées de deux semaines puis neuf prises de sang sur cinq mois pour les 260 autres. Le projet cherche à comprendre pourquoi les femmes développent plus souvent une polyarthrite rhumatoïde, en suivant chez la souris les cellules échangées entre la mère et le fœtus, les thérapies personnalisées annoncées étant renvoyées au long terme. Leurs organes sont prélevés après la mise à mort et conservés en biobanque, pour un atlas que le porteur présente comme un moyen d'éviter d'utiliser de nouveaux animaux plus tard.

Objectifs

Il s’agit de comprendre pourquoi les femmes sont plus souvent atteintes par les maladies autoimmunes Rhumatismales. Une maladie autoimmune est une maladie où le corps se défend à tort contre soi, et ici il s’agit d’une maladie rhumatismale appelée polyarthrite rhumatoïde dont la cible est l’articulation. L’objectif est d’analyser le rôle des cellules semi-étrangères qu’un individu peut recevoir au cours de sa vie. Les femmes, comme les hommes, reçoivent des cellules maternelles pendant leur vie in utero. Chacun peut également recevoir des cellules d’un jumeau né ou non. Ces cellules issues d’un échange entre jumeaux s’appellent des cellules gémellaires ou fraternelles. Mais les femmes ont la particularité de recevoir, en plus de ces cellules maternelles et fraternelles, des cellules foetales quand elles sont enceintes. Ces cellules reçues à différents stades de la vie persistent des décennies chez leur hôte. La plupart du temps elles ne sont pas néfastes, voire même bénéfiques, pouvant contribuer à la réparation des tissus. Cependant, ces cellules, bien que peu nombreuses chez leur hôte, sont capables de produire des protéines appelées autoanticorps qui participent au développement des maladies autoimmunes rhumatismales. Elles y participent dans un contexte génétique particulier que nous étudions chez la souris. Nous pouvons réaliser des croisements différents mimant les différents contextes génétiques humains. Nous pouvons aussi visualiser et traquer ces cellules semi-étrangères issues des échanges foeto-maternels ou gémellaires grâce à des modèles de souris. Le but est de comprendre comment chaque source, maternelle, gémellaire et/ ou foetale peut indépendamment ou en collaboration avec d’autres, participer au déclenchement d’une maladie autoimmune rhumatismale chez leur hôte.

Bénéfices attendus

A court terme ce projet apportera de nouvelles connaissances. A plus long terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles thérapies personnalisées en fonction du sexe, afin de cibler ces cellules et/ou de les orienter vers une influence moins néfaste et d’enrayer le processus d’auto-immunité.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront toutes réalisées sous anesthésie gazeuse : - sur 199 animaux : 5 prises de sang (acte durant chacun moins d’une minute) par animal sur une durée de 7 mois - sur 260 animaux : 4 injections à 2 semaines d’intervalle et 9 prises de sang (actes durant chacun moins d’une minute) sur une durée de 5 mois.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress lors de la manipulation pour les placer dans la boite d’anesthésie gazeuse, et lors du réveil. Les prises de sang et les injections (équivalentes à piqûre pour vaccination) sont susceptibles d’induire une douleur/gène au point d’injection.

Devenir

A l'issue de la chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes qui seront analysés grâce à des techniques courantes de laboratoire (microscopie, …) et conservés en biobanque.

Remplacement

Il n’est pas possible d’utiliser des modèles in silico (modèle informatique) ou in vitro pour étudier le rôle des cellules acquises pendant la grossesse chez l’hôte et en particulier son rôle immunitaire. Seul un modèle murin peut permettre d’analyser la réponse immunitaire dans son intégralité, et qui implique différents organes.

Réduction

Les travaux précédents nous ont permis de définir les conditions d’immunisation et les croisements les plus propices à obtenir des échanges foeto-maternels (nombre de gestations etc..) et de connaitre les pourcentages de souris qui produisent des anticorps après immunisation pour quelques groupes. Ceci permet de calculer au plus juste le nombre d’animaux utilisés. Pour les groupes pour lesquels nous ne connaissons pas les pourcentages, nous planifions de commencer par immuniser 12 souris, puis analyserons les statistiques et n'augmenterons les effectifs que si nécessaire pour réduire au maximum le nombre à utiliser. Un morceau de chaque organe prélevé après mise à mort de l’animal sera cryopréservé, extrait en ADN et/ou préparé pour des coupes microscopiques qui pourront permettre des analyses ultérieures de recherches plus précises de cellules maternelles, gémellaires et/ou foetales au fur et à mesure du développement de nouvelles technologies, évitant ainsi d’utiliser de nouveaux animaux. Cette biobanque permettra d’établir un Atlas complet de chaque organe et pourra être mise à disposition pour de futures études collaboratives. Par exemple ici nous ne disséquons pas le cerveau pour en connaitre la composition exacte et le type de cellules maternelles, mais un spécialiste dans le domaine pourra analyser ces échantillons sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux dans le futur.

Raffinement

Chaque cage sera pourvue d’un enrichissement, rouleau en coton/ dôme en cellulose/ papier de Kraft pour satisfaire l’instinct naturel de nidification et offrir un confort optimal et une sécurité pour les souris. Après les prélèvements ou immunisations qui sont faits après anesthésie gazeuse ( 5 à 6 min), les souris seront placées dans leur cage chauffée sous lumière chauffante pour que l’animal ait suffisamment chaud au réveil. A chaque prélèvement, l’animal sera pesé et observé pour être sûr de sa bonne santé. Une fiche d’observation sera remplie afin d’assurer un suivi de l’état des animaux et de prendre les mesures adaptées (surveillance accrue, apport de nourriture gélifiée) le plus précocement possible. Si ces mesures sont insuffisantes, et que l’état de l’animal ne s’améliore pas ou se dégrade, il sera euthanasié avant la mise à mort prévue initialement.

Choix des espèces

La femelle souris est un modèle très proche de la femme en termes de placentation et d’échanges de cellules foeto-maternelles ou gémellaires pendant la grossesse. C’est également un bon modèle pour le suivi d’une réponse immune. De plus, il est possible d’utiliser des souris de génétique différente, ce qui nous permet de tracer et d’évaluer le rôle de ces cellules semi-étrangères (acquises pendant la grossesse) dans les maladies autoimmunes. Pour comprendre où vont ces cellules semi-étrangères en condition normale, non pathologique, et comment elles évoluent au cours du temps, les animaux sont étudiés à diférents stades de développement après sevrage : à 3 à 4 semaines de vie, au stade jeunes adultes (

455 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 20 d'entre elles et modéré pour 435. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales de rein ou de côlon, boit pendant une vingtaine de jours une eau contenant un traitement au goût amer, reçoit quatre à six injections et subit trois prélèvements sous anesthésie. Le porteur attend du traitement qu'il lève la résistance aux immunothérapies et écrit qu'un succès chez la souris pourrait être transposé aux essais cliniques. Sur le remplacement, il conclut que l'expérimentation animale est "indispensable" et qu'aucune méthode alternative n'existe.

Objectifs

Une grande partie des patients atteints de cancer du rein résistent aux immunothérapies utilisées en cliniques. Cette résistance peut être due en partie à une interaction entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires, qui provoque l’inhibition de la réponse immunitaire anti-tumorale. Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique, dans 2 modèles de cancers (rein et colorectal), d’un traitement qui va empêcher cette interaction et permettre ainsi de ré-activer le système immunitaire. En établissant différents modèles précliniques tumoraux de souris reproduisant cette interaction, il sera possible de tester l’efficacité de ce traitement, associé ou non à une immunothérapie déjà utilisée en clinique.

Bénéfices attendus

Le succès du traitement chez la souris pourrait être transposé aux essais cliniques chez l’homme et ainsi améliorer l’efficacité des thérapies actuelles dans le cancer du rein et colorectal.

Procédures

1x injection de 1 minute sur souris anesthésiées ; 1x administration de médicament par voie orale dans l’eau des biberons sur environ 20 jours; 4-6x injections de traitements sur souris vigiles de moins de 1 minute chacune; 3x prélèvements sous anesthésie générale de moins de 5 minutes chacun.

Impact sur les animaux

-Les différentes injections causent un stress et douleur légère de courte durée -Le traitement dans l’eau des biberons peut altérer la consommation d’eau ou de nourriture à cause de son goût amer. -La contention des souris peut induire un stress léger et de courte durée -Le développement de la tumeur peut altérer l’aspect physique et le comportement et induire une douleur modérée liée à la présence de la tumeur . - Le prélèvement peut entraîner un stress et douleur légère de courte durée

Devenir

Mise à mort pour analyses

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement tumoral. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthode alternative n'existe.

Réduction

Certains paramètres expérimentaux ont déjà été déterminés par des études précédentes publiées. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les injections et les prélèvements sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. Tous les traitements sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal, ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées et sont déjà testés en cliniques chez l'homme. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteint d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

La souris est choisie car le système immunitaire et le microenvironnement tumoral partage des similarités avec l’homme. De plus, les modèles de cancer murins, les outils et techniques d’analyses sont disponibles. Des souris adultes de 8 semaines seront utilisées car à cet âge, leur système immunitaire est mature.

Amputées d'un fragment de queue entre sept et dix jours pour connaître leur génotype, 772 souris génétiquement modifiées entrent ensuite dans un protocole de trois mois, douze injections hebdomadaires pour les unes, quatre-vingt-dix administrations quotidiennes pour les autres, une chirurgie d'une heure sous anesthésie pour d'autres encore. 492 relèvent d'un niveau de souffrance léger et 280 d'un niveau modéré. La lignée perd spontanément neurones et synapses à partir de six mois, et le porteur prévoit de tuer les souris à ce moment précis, au début de la perte, avant que leur état général ne se dégrade visiblement. Toutes sont tuées, celles qui servent à l'évaluation des traitements pour prélever leur cerveau, les autres parce que leurs modifications génétiques interdisent de les replacer ou de les réutiliser.

Objectifs

Au cours de la maladie d’Alzheimer, des pertes de neurones et de synapses, les connexions entre les neurones, se produisent dans le cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Ainsi, des traitements visant à réduire ces pertes pourraient protéger contre les déficits cognitifs. Une autre des caractéristiques de la maladie d’Alzheimer est l’agrégation d’un peptide appelée bêta-amyloïde en plaques qui vont s’accumuler de façon anormale dans le cerveau. Les traitements actuels visent à réduire leur quantité, mais ils ne permettent que de freiner l’évolution de la maladie, pas de la stopper. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de ces traitements sur les pertes de neurones et de synapses chez souris génétiquement modifiées, modèle murin de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

On estime que plus de 850 000 personnes sont affectées par la maladie d’Alzheimer en France, avec une espérance de vie de 8 à 12 ans à partir du moment où le diagnostic est établi. Le mécanisme des pertes de neurones et de synapses dans la maladie d'Alzheimer est encore très mal connu. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre l’implication du peptide bêta-amyloïde dans ces mécanismes. A plus long terme les résultats obtenus pourraient orienter vers de nouvelles pistes pour l’amélioration des traitements existant.

Procédures

Dans le cadre de l’élevage de souris génétiquement modifiées modèles de maladie d'Alzheimer nous réaliserons une biopsie chez l’ensemble des souriceaux (une fois, vigile, durée de moins d’une minute par animal) pour déterminer leur patrimoine génétique. Des souris recevront une injection hebdomadaire pendant 3 mois d’un traitement pharmacologique (12 injections maximum, vigile, durée de moins d’une minute par animal). D’autres souris recevront une administration quotidienne d’un autre traitement pendant 3 mois également (90 administrations maximum, vigile, durée de moins d’une minute par animal). Enfin des souris auront une chirurgie unique sous anesthésie générale, avec une prise en charge analgésique adaptée. Cette chirurgie durera une heure et sera faite une seule fois. Toutes les souris seront euthanasiées en fin de période de maintien par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une légère et brève douleur lors du prélèvement de l’extrémité de la queue pour déterminer leur patrimoine génétique. Il existe un risque rare de saignement suite au geste. Les souris génétiquement modifiées que nous utilisons dans ce projet développent spontanément une perte de neurones et de synapses avec l'âge, mais elles seront euthanasiées au début de cette perte. La contention des souris nécessaire pour les manipulations (administration et injection) peut entrainer du stress. Les administrations et injections pourront entrainer une légère et brève douleur ou un risque d'irritation de l'œsophage lié à la répétition des administrations. La chirurgie sera associée à un risque de douleurs et d’inconfort post-opératoire. L’anesthésie générale nécessaire pour la réaliser entrainera des risques d’hypothermie et de sécheresse oculaire ainsi qu’un risque rare d’arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Toutes les souris utilisées pour l’évaluation des traitements seront euthanasiées afin de prélever leur cerveau pour analyser les effets obtenus. Les souris non utilisées pour ces évaluations seront euthanasiés soit pour des analyses post-mortem de la pathologie soit car il ne sera pas possible de les replacer ou les réutiliser du fait de leurs modifications génétiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet le mécanisme de la neuro-dégénérescence dans la maladie d’Alzheimer n’est pas connu. Or les modèles animaux de la maladie d’Alzheimer sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de neurones et de synapses adultes au sein d’un organisme et donc d’évaluer l’effet des traitements utilisés dans la maladie d’Alzheimer sur la neurodégénérescence.

Réduction

Au cours du projet nous estimons que nous utiliserons au maximum 772 souris. Nous n’utiliserons que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour maintenir notre lignée, réaliser les procédures expérimentales, et réaliser des analyses nécessitant seulement la collecte de tissus post-mortem. De plus, le nombre d’animaux utilisés pour les procédures expérimentales est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux ayant été établie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des composants de nidification et des bâtonnets à ronger. Une observation quotidienne des animaux est effectuée. En cas d’anomalie celle-ci sera déclarée à la structure chargée du bien-être animal (SBEA), au vétérinaire et à notre équipe afin de mettre en place une prise en charge adaptée (soins ou euthanasie si nécessaire). Des points limites sont définis pour chaque procédure et ils seront respectés afin de prendre en charge les animaux et éviter toute souffrance. Les souris que nous utilisons dans ce projet présentent une perte de synapses et de neurones à partir de l’âge de 6 mois, elles seront euthanasiées à ce moment-là donc au début des pertes, avant que cela n’engendre un impact visible sur leur état général. De plus pour l’élevage nous n’utiliserons que des mâles pouvant développer ces signes afin de favoriser une bonne prise en charge des petits par leur mère. Le prélèvement d’un fragment de queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera de la plus petite taille possible. Il s’agit d’un geste rapide et parfaitement maitrisé. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un reprélèvement était nécessaire il sera réalisé au niveau de l’oreille de l’animal et n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie avec une analgésie adaptée. La température des animaux sera maintenue tout au long de leur anesthésie et un gel oculaire sera appliqué pour éviter toute sécheresse oculaire. Nous réaliserons un suivi rapproché en post-opératoire afin d’évaluer l’état de l’animal et adapter sa prise en charge.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car il s’agit d’un modèle largement utilisé en recherche pour modéliser les pathologies humaines. Son patrimoine génétique est bien connu et nous disposons des outils nécessaires pour le modifier permettant de créer et étudier de nombreux modèles de maladies humaines. Pour la maladie d’Alzheimer nous disposons d’un modèle génétiquement modifié déjà existant qui permet de reproduire les pertes de synapses et neurones observées chez l’humain, nous permettant dans le contexte de ce projet d’évaluer l’impact de traitements sur ces pertes. Le prélèvement pour déterminer les modifications génétiques portées par les souriceaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux. Les traitements visant à prévenir les pertes de neurones et de synapses seront commencés à 3 mois, avant que ces pertes ne soient détectées, et leurs effets seront analysés à 6 mois, quand les pertes sont significatives.

140 souris vont être utilisées, 80 tuées dans l'établissement et 60 proposées à d'autres chercheurs ou enseignants, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 20 d'entre elles et modéré pour 120. Les souriceaux sont tatoués et amputés d'un fragment de queue à huit jours, puis enchaînent huit tests comportementaux jusqu'à l'âge de trente jours. Ceux qui portent les deux copies de la mutation développent un déficit congénital en vitamine B12, des troubles cognitifs, des retards neurologiques et des malformations cardiaques, avec une espérance de vie inférieure à six mois. Le porteur qualifie pourtant l'amputation de la queue de geste "aucunement douloureux" et écrit que le stress des tests s'arrête dès le retour en cage.

Objectifs

Une nouvelle maladie liée à la vitamine B12 a été découverte en Europe et aux États-Unis. Elle s’appelle la « pathologie épicobalamine C ». Elle peut causer des problèmes graves chez les nouveau-nés, comme des troubles du cœur, une anémie (manque de globules rouges) et des problèmes neurologiques (liés au cerveau et aux nerfs). Cette maladie est due à un problème causé par un gène voisin de celui impliqué dans l’utilisation de la vitamine B12, c’est donc un effet indirect. Les scientifiques ne savent pas encore exactement pourquoi cela arrive chez l’humain, mais ils pensent que cela pourrait être lié au stress (comme le stress oxydatif). En 2024, des souris génétiquement modifiées ont été créées pour reproduire cette maladie. En 2025, des scientifiques en France ont commencé à élever ces souris pour observer leurs symptômes (comportement, cœur, sang, cerveau, etc.). Les souris porteuses de la maladie sont croisées entre elles pour obtenir des petits avec ou sans la maladie. Certaines souris recevront un traitement pour « réparer » le gène défectueux et voir si leurs symptômes disparaissent. Cette étude, menée en collaboration entre deux établissements utilisateurs situés sur le même campus, aidera à mieux comprendre la maladie et à trouver des solutions pour les humains touchés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont la compréhension du dysfonctionnement provoquée par la mutation et la découverte de cibles thérapeutiques qui permettraient d'améliorer la prise en charge des patients. Les animaux porteurs des 2 exemplaires de la mutation traités avec le médicament devraient retrouver un aspect et un comportement normal, sans altération du métabolisme de la vitamine B12.

Procédures

Une partie des femelles gestantes (5 souris) sera traitée avec un médicament à faible dose administré par ingestion volontaire grâce à un mélange alimentaire avec du lait concentré sucré, très appétissant pour les souris, afin d’induire la recombinaison génique chez les embryons. Cette prise alimentaire du médicament ne durera quelques secondes. Le tatouage et le prélèvement d'un petit bout de queue chez les souris âgées de 8 jours (120 souris) sont réalisés en moins de 2 minutes afin de procéder à l'identification des souris. L’enchainement des 8 tests comportementaux sera réalisé tout au long de la vie des souriceaux dès l’âge de 8 jours et jusqu’à 30 jours, et chaque test ne dure que de 2 à 5 minutes maximum. Ces tests sont basés sur une observation des animaux (66 souris) libres de leur déplacement afin de tester leurs capacités d'apprentissage, de mémorisation, de coordination locomotrice et d'interactions sociales.

Impact sur les animaux

Les souris homozygotes mutants portant l’épimutation étudiée du gène Prdx1 ont un phénotype proche de celles déficientes pour le gène MMACHC, une souche que nous avons déjà étudiée par ailleurs. La conséquence est un déficit congénital en vitamine B12 qui induit des troubles cognitifs, des retards de développement neurologique et des malformations cardiaques, donc une fragilité physique chez les animaux d’intérêt et une espérance de vie à la baisse, inférieure à 6 mois. Par ailleurs, les souris subiront un geste invasif au moment du prélèvement tissulaire d’un fragment distal de queue (

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront utilisés afin de générer un effectif suffisant pour permettre de réaliser l'étude expérimentale qui sera basée sur l'utilisation d'animaux porteurs des deux exemplaires de la mutation. Les souris dites hétérozygotes (un seul exemplaire de la forme mutante et non mutante) issus des différents croisements et présentant un génotype sans intérêt pour l'étude, seront proposées à d'autres chercheurs et enseignants pour un replacement éventuel. Toutes les autres souris (femelles génitrices, descendants présentant les 2 exemplaires mutants ou non mutants) seront étudiées et mises à mort dans l'établissement utilisateur.

Remplacement

Les études humaines in vitro sur cultures cellulaires ont donné des informations sur les mécanismes moléculaires liant les mutations entre les 2 gènes d'intérêt mais ne permettent d’établir un lien clair entre stress cellulaire et déclenchement ou maintien de ces mutations, ni d’en comprendre les conséquences physiopathologiques. Ainsi, les études nécessitent un modèle in vivo intégrant les dimensions métaboliques, comportementales, inflammatoires et hormonales. A ce jour, aucune approche in vitro ou in silico ne permet de reproduire ces interactions de manière fonctionnelle et intégrée. Une approche sur animal entier est donc indispensable pour étudier ces mécanismes dans leur globalité

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire aux phases expérimentales suivantes est déterminé à l’aide d'un logiciel spécialisé en tenant compte de différents facteurs afin de déterminer les effectifs nécessaires et suffisants pour obtenir des données statistiques fiables. Les souris mutantes auront un comportement et un métabolisme bien différent des autres, ce qui nous indique qu'un effectif de 11 animaux par groupe d'étude sera nécessaire. Ainsi, en se basant sur des portées de 6 souris, 5 femelles gestantes traitées avec du tamoxifène devraient suffire pour générer 11 mâles et 11 femelles qui ne devraient plus avoir la mutation grâce au traitement tamoxifène (100% de la portée), tandis que 15 femelles gestantes sans traitement tamoxifène généreront 11 mâles et 11 femelles mutants et 11 mâles et 11 femelles non mutants. Ce protocole expérimental impliquera donc 20 génitrices (5+15) et 120 descendants (30+90).

Raffinement

Les souris sont élevées et manipulées dans un établissement utilisateur d’animaux à des fins scientifique ayant un statut sanitaire bien contrôlé. Le transport des animaux entre les deux EU se fait à pied car les établissements sont situés sur le même campus, à quelques dizaines de mètres de distance. Les cages sont placées dans des sacs noirs isothermes, et en période de froid (température inférieure à 15°C), deux blocs chauffants sont placés dans le sac afin de maintenir une chaleur suffisante pendant la durée du transport (moins de 5 minutes). Le traitement au tamoxifène sera réalisé grâce à une prise volontaire des souris en diluant ce produit dans du lait concentré. Pendant la gestation les souris seront pesées 2 fois par semaine pour suivre l’augmentation du poids corporel et la bonne santé de l’animal. Chez les descendants, la biopsie d’un fragment de queue sera réalisée selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables stress/douleurs, couplée à une anesthésie locale au moment du prélèvement. Les animaux seront ensuite surveillés quelques minutes pour vérifier la reprise d’une activité motrice normale. A l’issue de chaque test comportemental, les souris retournent dans leur cage d’élevage en présence de leurs congénères et sont laissées quelques minutes sous la surveillance de l’expérimentateur afin de contrôler leur bon état de santé (motricité, exploration, interactions). Des points limites ont été fixés en accord avec la structure chargée du bien-être animal afin de garantir la préservation du bien-être animal tout au long du protocole.

Choix des espèces

Ce projet nécessite la génération et la gestion d’un modèle murin génétiquement modifié porteur d’une séquence humaine qui n’existe pas chez la souris. La souris constitue l’espèce modèle de référence pour ce type d’approche, en raison de sa facilité de reproduction, de la disponibilité d’outils génétiques adaptés et à la validation internationale des protocoles métaboliques et comportementaux. L’utilisation d’un modèle portant la séquence mutante est indispensable pour reproduire le contexte génétique observé chez l’humain et évaluer ses conséquences physiopathologiques. La lignée utilisée ici a été spécifiquement développée pour reproduire le contexte génétique humain de façon ciblée. Les adultes reproducteurs seront utilisés à maturité sexuelle (8 semaines d’âge) pour réaliser les accouplements nécessaires à la production des portées expérimentales tout au long du projet. Les mutations seront recherchées à l'âge de 8 jours, à partir d’un prélèvement de queue , puis sevrés à J21, avec un suivi du comportement à l'âge de 3 jours jusqu'à 30 jours, puis finalement mis à mort à l'issue de ces tests.