Procédures légères
Étude du rôle d’une protéine d’intérêt dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
7 009 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 439 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 4 060 un niveau léger. Elles subissent une biopsie de queue pour génotypage, deux prélèvements sur animal vigile, deux anesthésies et sept injections, et celles chez qui l'encéphalomyélite auto-immune est induite développent une paralysie partielle que le porteur qualifie de transitoire. Le bénéfice annoncé tient à la compréhension du rôle d'une protéine et au développement d'approches thérapeutiques fondées sur sa biologie, sans traitement curatif de la sclérose en plaques en vue. Le porteur affirme que les migrations de cellules immunitaires vers le système nerveux central ne sont pas étudiables in vitro et conclut qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'expérimentation animale.
Objectifs
L'objectif du projet est de caractériser l'effet protecteur d'une protéine d'intérêt dans un modèle de sclérose en plaque chez la souris. La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du système nerveux central. Elle est la première cause de déficit neurologique chez le jeune adulte. Les femmes sont atteintes deux fois plus que les hommes et le coût socio-économique de la sclérose en plaques est le second après les traumatismes dans ce groupe d’âge. Il n’y a actuellement pas de traitement curatif pour la sclérose en plaques qui est donc une maladie chronique persistant tout au long de la vie du patient. Certains traitements permettent d’en ralentir la progression chez certains patients. La sclérose en plaques implique des cellules du système immunitaire qui attaquent le système nerveux central. Il y a un grand espoir que la protéine d'intérêt, qui module le système immunitaire, puisse contribuer à l’amélioration de cette maladie. La sclérose en plaques peut être modélisée chez la souris. En utilisant un modèle de sclérose en plaques chez la souris, ce projet analysera le mode d'action de la protéine d'intérêt en prenant en compte sa production par différents types cellulaires au cours de cette maladie. Il testera également des approches thérapeutiques basées sur la biologie de cette protéine d'intérêt.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la compréhension du rôle de la protéine d'intérêt dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris, et le développement de nouvelles aproches thérapeutiques basées sur la biologie de cette protéine. Le modèle de sclérose en plaques utilisé dans ce projet est prédictif de la sclérose en plaques, et a déjà servi à la mise en place des traitements principaux aujourd'hui utilisés pour cette maladie chez l’homme.
Procédures
biopsie à la queue (génotypage invasif) pour prélèvement de la biopsie: ~10 secondes. Prélèvements (x2 sur animaux vigiles): 1x~5 secondes + 1x~15 secondes. Anesthésie (x2): ~15 minutes/anesthésie. Injections: ~30 secondes (x2 sur animaux anesthésiés) + ~10 secondes (x4 sur animaux vigiles) + ~45 secondes (x1 sur animaux vigiles).
Impact sur les animaux
Injection = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement = douleur légère à moyenne, de courte durée et localisée. Biopsie à la queue (génotypage invasif) pour prélèvement de la biopsie = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle encéphalomyélite auto-immune expérimentale=paralysie partielle et transitoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus d'intérêt.
Remplacement
Ce projet vise à caractériser l’effet de la protéine d'intérêt dans un modèle de sclérose en plaques. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires entre différents organes qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du systèmes nerveux central impliquent également la migration des cellules du système immunitaire dans le système nerveux central, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du système nerveux central. Ces processus ne sont actuellement pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez l'animal.
Réduction
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec un programme d'analyse de puissance statistique. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission après un court épisode de paralysie afin de réduire la souffrance des animaux. Nous avons établi des points limites adaptés qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable et inutile des souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal ainsi que par le/les expérimentateur(s). La gravité des symptômes et le poids sont mesurés quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes sociaux et dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Le modèle expérimental de sclérose en plaques chez la souris a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients. Il s'agit donc d'un modèle pertinent pour le développement et la compréhension de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. Utilisation de souris à partir de l’âge de 10 jours pour effectuer les gestes d'identification ainsi que la biopsie. Utilisation des souris à partir de 4 semaines pour effectuer un prélèvement pour génotypage. Cet âge est requis afin de s’assurer que les souris aient une taille appropriée et suffisante pour effectuer ces gestes sans porter atteinte à leur intégrité physique. A partir de 6 semaines d’âge et jusqu'à 16 semaines d’âge, les souris pourront être immunisées pour induire l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale parce que cela correspond à l'âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est adaptée pour étudier la pathogenèse de la maladie. Ce modèle permet l'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées qui sont nécessaires pour définir de manière robuste le rôle de chaque type cellulaire dans les processus étudiés et pour conduire les études mécanistiques.
Formation pratique à la manipulation et à l’évaluation comportementale chez le rongeur
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 50
Les gestes appris ici ne produisent aucune connaissance : ils servent à former des étudiants de master et des stagiaires de la formation réglementaire à contenir et piquer des rongeurs. 100 souris et 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit trois injections sous-cutanées sur animal vigile, et les souris passent en plus cinq tests comportementaux avant d'être tuées, la formation étant alors terminée. Le porteur affirme qu'aucun mannequin ni simulateur ne permet d'apprendre l'injection, qui exige selon lui de percevoir la tonicité musculaire et la réaction de l'animal, et juge "indispensable" de former les futurs utilisateurs.
Objectifs
Ce projet vise à former deux publics distincts à la manipulation des rongeurs dans un contexte d’expérimentation biomédicale : 1. Étudiants de Master : acquisition des compétences nécessaires pour manipuler la souris et le rat de façon douce et sécurisée, dans le respect des règles de bonnes pratiques et de respect du bien-être animal. Les étudiants apprendront la contention, la réalisation d’une injection sous-cutanée, et seront initiés aux principes d’évaluation comportementale au travers de tests simples non invasifs. 2. Participants à la formation réglementaire à l’expérimentation animale (niveaux applicateur et concepteur) : apprentissage et maîtrise des gestes techniques de manipulation, contention, injection sous-cutanée chez le rat et la souris, afin de garantir une pratique conforme aux bonnes pratiques et au respect du bien-être animal. Dans les deux contextes, l’objectif central est de permettre aux futurs expérimentateurs d’acquérir les compétences nécessaires pour une manipulation précise, contrôlée et respectueuse des animaux.
Bénéfices attendus
L'ensemble des étudiants et apprenants acquerront la maîtrise des gestes techniques de base nécessaires à l’expérimentation animale et les compétences pour manipuler en sécurité pour eux-mêmes et pour l’animal. Ils apprendront à manipuler calmement et sans contrainte excessive les rongeurs, à réaliser des injections sous-cutanées en limitant la douleur. Ceci leur permettra de reconnaître les signes comportementaux d’inconfort. Les étudiants de master apprendront également à utiliser correctement des tests comportementaux et ainsi à interpréter les réponses comportementales des souris dans une approche éthique. Ces procédures permettront aux étudiants/apprenants de pouvoir expérimenter dans les conditions réglementaires et de bien-être animal, contribueront à réduire la variabilité expérimentale future, à améliorer la qualité des manipulations de laboratoire et, de ce fait, leur permettront de développer des projets de recherche à impact pour les connaissances scientifiques. Toutes ces compétences contribueront à réduire la souffrance animale dans les projets futurs et à renforcer l’application concrète du raffinement.
Procédures
L'ensemble des animaux recevra 3 injections, espacées d'au moins 3 jours. Ce geste sera réalisé sous supervision des enseignant.e.s, sur animal vigile. Les souris seront également soumises une fois à 5 tests comportementaux visant à évaluer leurs capacités cognitives et leur état émotionnel. La durée de chaque test est comprise entre 5 et 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress léger, transitoire et limité dans le temps, lié à leur manipulation lors des tests comportementaux et lors de l'injection.
Devenir
- A l'issue de la 3ème séance de TP (réalisation d'injections chez le rat), la totalité des rats seront mis à mort car la formation sera terminée. - A l'issue de la 3ème séance de TP (réalisation d'injections chez la souris), les souris seront conservées pour la séance de TP "tests comportementaux". - A l'issue de la séance de TP utilisant les souris en comportement, les souris seront mises à mort car la formation sera terminée.
Remplacement
Afin que les projets de recherches futurs utilisant des animaux à des fins de recherches scientifiques soient effectués dans le respect du bien-être animal, il est indispensable de former les futurs utilisateurs. Aucune alternative possible (mannequin, vidéo, simulateur) ne permet l'apprentissage de la manipulation et de l’injection sous-cutanée, nécessitant la perception de la tonicité musculaire, de la pression digitale et également de la réaction comportementale de l’animal. Cependant, des mannequins de rats et souris seront disponibles pour que les apprenant.e.s puissent apprendre le geste de contention avant de le réaliser sur animal vivant.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, les animaux seront mutualisés entre les sessions de master et de formation réglementaire qui ont lieu à la même période.
Raffinement
Les manipulations sont réalisées dans un environnement calme. Elles seront douces et courtes, avec la possibilité de réaliser des pauses si l’animal montre des signes d’agitation ou d’apathie. Les manipulations se feront sous supervision systématique par des formateurs habilités niveau applicateur ou concepteur. Une grille de surveillance des animaux, des points limites et des actions associées ont été pré-définis. Ces actions seront mises en place en cas d'atteinte d'un point limite.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les deux espèces les plus couramment utilisées dans la recherche biomédicale en neurosciences et en physiologie comportementale. Ils présentent des comportements facilement observables et interprétables, une morphologie adaptée à l’apprentissage des techniques de contention et d’injection, et une grande familiarité pour les expérimentateurs en formation. • Souris : leur tempérament généralement calme et leur robustesse en font un modèle adapté à l’acquisition des gestes techniques en dans le cadre d’un apprentissage progressif et contrôlé. • Rats : leur taille plus importante permet aux apprenants de visualiser plus aisément l’anatomie externe et d’acquérir la précision des gestes dans la contention et l’injection. La combinaison des deux espèces contribue à une formation complète et représentative des pratiques expérimentales sur animaux vivants, en particulier en neurosciences. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune à adulte (1,5 – 4 mois selon disponibilité) : les animaux adultes présentent une stabilité comportementale, un poids constant, et une résistance physiologique permettant un apprentissage sécurisé des techniques de contention et d’injection, sans fragiliser l’animal. Aucun animal néonatal, juvénile ou âgé fragile ne sera utilisé dans ce projet.
Nouvelles stratégies d’évaluation des effets de substances phytosanitaires sur le système nerveux, le microbiote et le comportement chez les rats femelles et leur descendance
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des rates gestantes reçoivent du glyphosate dans une gaufrette pendant la gestation et la lactation, subissent jusqu'à quatre frottis vaginaux et sont isolées physiquement trois semaines durant. 875 rats vont être utilisés, 810 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 65 un niveau modéré, dont 30 femelles rendues réceptives par trois injections hormonales pour servir de stimulus sexuel. Le porteur écrit que cette administration "ne provoque aucune nuisance", et justifie l'effectif par la critique que l'industrie et les agences de réglementation adressent aux études toxicologiques à faibles effectifs, concluant qu'il sera "nécessaire" d'utiliser ce nombre. 845 animaux sont tués pour prélever cerveau, sang et intestins, les 30 femelles stimuli passant à d'autres procédures.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont doubles. 1) Mieux comprendre l’impact de l'herbicide le plus couramment utilisé, c'est à dire le glyphosate, sur le cerveau et sur le comportement et 2) mettre en évidence l’importance d'étudier des caractéristiques physiologiques considérées comme périphériques (en dehors du cerveau) pour comprendre comment des polluants environnementaux, y compris des produits phytosanitaires tels que le glyphosate, peuvent impacter en final le cerveau. Ainsi, au cours de ce projet de recherche, nous mettrons en évidence des mécanismes physiologiques qui peuvent être utilisés comme marqueurs d’exposition chimique en neurotoxicologie. Le nombre de marqueurs biologiques actuels utilisés pour la réglementation de substances environnementales affectant le cerveau est relativement restreint et les approches actuelles se focalisent majoritairement sur un impact direct des molécules chimiques sur le système nerveux, soit en affectant les neurones soit en affectant les cellules qui assurent leur fonctionnement, c’est-à-dire les cellules gliales. Cependant, les travaux plus récents en neuroscience mettent clairement en évidence que le système nerveux, dans un organisme vivant, est régulé par un ensemble de systèmes physiologiques, y compris le système endocrinien, le système immunitaire et le microbiote intestinal. En conséquence, nous proposons donc d’évaluer les effets d’un herbicide, le glyphosate, seul comme molécule pure ou sous formulation commerciale (phytosanitaire), sur le cerveau et sur certains comportements d'interaction sociale en utilisant le modèle rat. Nous suggérons que le glyphosate impactera le cerveau en altérant le microbiote intestinal, ce qui aura des conséquences sur le système immunitaire et sur le système endocrinien pour finalement affecter le cerveau et les comportements. Tous ces paramètres seront analysés au cours de ce protocole expérimental. Il est important de noter que tous les mécanismes biologiques investigués dans le cadre de ce projet sont extrêmement bien conservés et les connaissances acquises ici dans un modèle rat permettront une réévaluation des effets des phytosanitaires potentiels chez les vertébrés de la faune sauvage, des animaux d’élevage ainsi que chez les humains.
Bénéfices attendus
Les approches classiques en neurotoxicologie sont à l’heure actuelle trop restrictives et ne prennent pas en compte la complexité du fonctionnement du système nerveux, qui implique une interaction forte avec les systèmes périphériques, tels que le système endocrinien, le système immunitaire et le microbiote intestinal et les conséquences sur le comportement. Notre projet repose sur le développement d’une démarche globale d’investigation de l’impact de substances phytosanitaires en combinant une approche physiologique globale afin d’évaluer les effets de substances phytosanitaires sur le système nerveux et le comportement. Ce protocole que nous mettons en place ici permettra de définir de nouvelles stratégies pour évaluer un impact de substances phytosanitaires sur les interactions sociales, fondamentales en santé humaine, pour le bien-être animal en milieu d’élevage et pour la survie et la reproduction des vertébrés de la faune sauvage. De plus, nous nous attacherons à définir l'impact du glyphosate, seul ou sous formulation, sur le développement du système neuroendocrinien d’une part et le microbiote intestinale d’autre part. Les données collectées aideront dans une certaine mesure à mieux définir les stratégies de réglementation que la France, et l’Union Européenne, doivent prendre concernant l’utilisation de ce composé. Le nombre élevé d’individus par groupe est requis pour obtenir une puissance statistique suffisante dans le cadre des tests réglementaires, plus particulièrement en lien avec les tests comportementaux. A noter également que ce nombre élevé permettra de réaliser des tests statisques corrélatif pour mieux comprendre la sensibilité individuelle aux expositions chimiques.
Procédures
- 65 mères: Frottis vaginaux pour définir le cycle des femelles et la fécondation potentielle. Chaque femelle ne devrait pas subir plus de 4 frottis vaginaux. Durant la gestation (entre 18 et 21 jours), les femelles gestantes serons isolées physiquement (mais pas au niveau olfactif, visual ni auditif) afin d'assurant l'absence d'un effet de dominance et la bonne administration du composé via les biscuits. L'exposition des mères durant la gestation et la lactation au glyphosate, seul ou sous formulation commerciale via une gauffrette (voie orale, alimentation). Bien qu'il s'agisse d'une procédure d'exposition, cette administration ne provoque aucune nuisance. - 30 femelles: Induction de la réceptivité chez les femelles stimuli pour les comportements sexuels : 3 injections (48, 24 et 6 heures avant le comportement) - 100 femelles de la descendance: Frottis vaginaux pour définir le cycle des femelles afin de réaliser les tests d'interaction sexuelle au bon moment (si réaliser en dehor de la période fertile, ces tests induisent un stress chez la femelle qui n'est pas réceptive
Impact sur les animaux
Nos premiers résutlats, publiés sur les mères et en cours de rédaction sur la descendance mâle et femelle, se sont attachés à définir l'impact du glyphosate seul ou sous une formulation commerciale sur le comportement, la neuroplasticité et le microbiote intestinal, et ce à des doses supérieures à celles que nous utiliserons dans ce projet. Bien que de très nombreux paramètres physiologiques aient été affectés par le traitement, nous n'avons pas observé de douleur ni d'inconfort sur aucun de nos animaux. Il est possible que les animaux qui seront injectés par des solutions hormonales pourront ressentir une légère douleur ou inconfort et que les frottis vaginaux pour déterminer le cycle et la fécondation chez les femelles pourront induire une gêne. Les volumes d'injection sont réduits au minimum pour limiter cette douleur.
Devenir
Pour tous les animaux expérimentaux (845), nous avons besoin des différents tissus (cerveau, sang, intestin) afin de définir l'impact du glyphosate sur la physiologie. Seules des méthodes histologiques à l'heure actuelle permette de comprendre les mécanismes d'action de molécules sur le cerveau. De très nombreux aspects physiologiques seront analysés: Nous analyserons la présence potentielle du glyphosate dans différents tissus, notamment le cerveau, les intestins et le foie. Il n'existe à l'heure actuelle aucune indication de la présence de cette molécule dans les tissus après ingestion de glyphosate. Nous analyserons l'expression de plusieurs marqueurs de fonctionnement neuronaux dans de nombreuses régions du cerveau, ces différentes régions sont impliquées dans divers aspects des comportements que nous aurons étudiés au préalable. Nous analyserons également des marqueurs d'autres types cellulaires dans le cerveau, c'est à dire les cellules gliales. - Nous analyserons de nombreux marqueurs sanguins, indicateurs du fonctionnement du système immunitaire (cytokines), du fonctionnement du système endocrinien (Estrogènes et Androgènes) et du métabolisme du microbiote intestinal. Dans les intestins, en plus des fèces qui ont été collectées tout au cours de l'expérience, nous analyserons le microbiote intestinal. Les 30 animaux stimuli seront réutilisés dans des procédures ultérieures.
Remplacement
Seules des techniques utilisant l’animal vivant peuvent nous permettre de répondre à nos questions puisque notre intérêt se porte sur des interactions mères-foetus complexes et sur des effets de traitements agissant sur des circuits neuronaux complexes, aboutissant à des modulations potentielles de comportements d’interaction sociale. Il est à noter que des analyses préliminaires ont été intialement réalisées sur cultures cellulaires. Les analyses physiologiques ne peuvent être réalisées en culture cellulaire et les modèles de rongeurs sont à l’heure actuelle les meilleures alternatives pour développer ce projet. Ainsi, ce travail nous permettra de mieux définir une cible potentielle de molécules phytosanitaire en investiguant le système immunitaire, le système endocriniens (stéroïdes) et le système nerveux central ainsi que leur interelation dans le contrôle de comportements socio-sexuels. Le but de ce travail est de définir de nouvelles stratégies pour évaluer un impact de substances chimiques sur les interactions sociales, fondamentales en santé humaine, pour le bien-être animal en milieu d’élevage et pour la survie et la reproduction des vertébrés de la faune sauvage, ce qui permettra ainsi de mieux cibler à l'avenir les paramètres à évaluer
Réduction
Historiquement, une moyenne de 10-20 individus par groupe a été utilisée dans des tests comportementaux similaires afin de s’assurer une puissance statistique et un effet de taille suffisants pour déterminer les effets soit thérapeutique, soit toxicologique, sur le cerveau et surtout sur le comportement. La raison de ce nombre relativement élevé est la variabilité interindividuelle relativement élevée dans le cadre de résultats comportementaux. Nous avons donc le nombre de mères limité à 10 par groupe. Dans le cas de la descendance, les deux sexes seront analysés séparément afin de mettre en évidence les effets potentiels des différences sexuelles sur les résultats comportementaux et neurobiologiques. Il est à noter que certaines études comportementales sur le rat ont été réalisées avec un nombre d’animaux légèrement inférieur mais le faible nombre d’animaux dans diverses études toxicologiques est une critique majeure levée par l’industrie et par les agences de réglementation au niveau national et au niveau européens (empêchant donc la mise en place de réglementations potentielles). Afin de nous prémunir de ce biais potentiel, il sera donc nécessaire d’utiliser ce nombre d’animaux.
Raffinement
L’administration du glyphosate sous forme active ou sous formulation (ou du véhicule) se fera par voie orale à l’aide d’un biscuit fourré, préalablement injecté avec des doses non toxiques du composé ou du véhicule afin d’éviter tout stress provoqué sur des femelles gestantes ou allaitantes. Les tests comportementaux qui seront utilisés sont des paradigmes largement utilisés pour tester les comportements reproducteurs et sociaux chez les rats et que nous maitrisons dans le laboratoire depuis plus de 10 ans. Un grand nombre de ces observations comportementales seront réalisées directement dans la cage d'hébergement via un système de caméra afin de limiter le stress de changement de cage des animaux. Par ailleurs, les animaux seront manipulés journalièrement afin que les rats s'habituent à l'expérimentateur avant le début des traitements et des tests. Aucune chirurgie ou prélèvement ne sera effectué sur animal vivant au sein du laboratoire. Le protocole prévoit un mécanisme de surveillance continue intégrant des seuils d’intervention prédéterminés, déclenchant la mise en œuvre progressive de mesures correctives ou l’arrêt des procédures si la santé ou le bien-être de l’animal se dégradent au-delà de niveaux acceptables, conformément aux bonnes pratiques reconnues. Ces seuils sont intégrés dans un schéma décisionnel, garantissant une réaction rapide et adaptée à chaque situation observée.
Choix des espèces
Le Rat Sprague-Dawley, non consanguin et non transgénique, est le modèle historique utilisé au sein de notre laboratoire, mais aussi dans de nombreux autres laboratoires s’intéressant aux effets de très nombreuses molécules, y compris des pesticides en toxicologie, et également aux interactions sociales et sexuelles. Ainsi, l’utilisation de cette espèce, et de cette souche en particulier, nous permettra de comparer les résultats obtenus avec des données préexistantes au sein de notre laboratoire mais également celles publiées dans la littérature. Par ailleurs le catalogue de comportements de ces animaux et la neuroanatomie associée sont bien décrits dans la littérature. Nous avons choisi plusieurs stades de développement pour ces analyses, c'est à dire pendant la gestation, à la naissance, pendant la lactation, au stade juvénile et à l'ge adulte. Chacun de ces stades sont choisis pour définir s'il existe une période sensible d'exposition au pesticide et si oui, définir si l'exposition précoce au glyphosate va induire des modifications du comportement et des paramètres physiologiques à moyen (juvénile) ou à long terme (adulte).
Hébergement de chiens atteints du syndrome de Sanfilippo
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Déjà engagés dans un essai préclinique de thérapie génique, 20 chiens porteurs d'une mutation qui reproduit le syndrome de Sanfilippo changent d'animalerie pour se rapprocher de l'appareil d'IRM qui mesurera l'effet du traitement. Le séjour relève d'un niveau de souffrance léger, et aucun n'est tué à cette occasion : tous regagnent leur établissement d'origine et y poursuivent les procédures déjà autorisées. Le trajet comprend deux transports d'environ quatre heures et un de trente minutes, pour des animaux de moins d'un an chez qui la maladie évolue encore sans signe clinique visible. Le porteur présente cette autorisation supplémentaire comme une mesure de raffinement destinée à éviter le cumul du transport et de l'examen dans la même journée, et décrit le chien comme un modèle "incontournable" en raison de la taille de son cerveau et de sa proximité immunologique avec l'être humain.
Objectifs
La maladie de Sanfilippo est une maladie génétique humaine rare. Elle est causée par le déficit d’une enzyme qui engendre une accumulation toxique d'une molécule dans de nombreux organes, en particulier le cerveau. La maladie de Sanfilippo est caractérisée par une atteinte sévère du système nerveux central. La maladie débute le plus souvent entre 2 et 6 ans avec un retard du développement psychomoteur, des troubles du comportement, un défaut d'attention, une hyperactivité et une agressivité. La régression des acquisitions intellectuelles est rapide et sévère et dans la phase finale, les patients perdent tout contact avec leur entourage et developpent une encéphalopathie profonde. Le décès survient généralement au décours d'une surinfection respiratoire. L’espérance de vie des enfants atteints de cette pathologie est de l’ordre de 15 à 20 ans. Actuellement, aucun traitement curatif n'est disponible. Les seuls soins apportés visent a traiter les complications liées a la maladie et à améliorer la qualité de vie des malades et de leur entourage. Les espoirs actuels pour guérir cette maladie reposent sur la thérapie génique, qui a fait ses preuves dans le modèle murin. Chez le chien, une anomalie génétique similaire à celle rencontrée chez l'Homme a été décrite, conduisant comme chez l’homme à un développement anormal du cerveau et à des troubles moteurs tardifs. Ces animaux sont un modèle incontournable pour valider un passage en phase d'essai clinique de l'approche de thérapie génique développée, en raison de leur grande taille (y compris du cerveau), offrant la possibilité de tester des méthodes d'administration directement transposables à l'Homme. De plus, la complexité de leur système nerveux central les rapproche de l’humain plus que les modèles rongeurs. Leur système immunitaire est également proche de celui de l'Homme et leur maladie présente de nombreuses similitudes avec celle de l’humain. Le présent projet s'inscrit dans le cadre plus large qu'est celui de l'essai pré-clinique de thérapie génique dans ce modèle, et vise à assurer l'hébergement des animaux, traités ou non, dans une animalerie plus proche de l'endroit où ils iront passer un examen IRM permettant d'évaluer le bénéfice thérapeutique (machine très spécifique, disponible dans ce seul site). Cet hébergement de courte durée a pour objectif d'éviter aux animaux une trop longue journée incluant examen IRM et transport aller-retour depuis leur animalerie habituelle.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans une démarche de raffinement, afin d'éviter le cumul d'événements potentiellement stressants pour les animaux dans une même journée.
Procédures
Changement d'hébergement transitoire d'animaux avec possible phénotype dommageable. Transports routiers d'un établissement agréé à un autre par transporteur agréé (deux transports d'environ 4 heures, un transport d'environ 30 minutes).
Impact sur les animaux
En lien avec la maladie de Sanfilippo : - Apparition de signes cliniques : pertes d'équilibre, tremblements (peu probable, car habituellement au-delà de l'âge de 2 ans, animaux inclus dans le projet âgés de moins d'un an) En lien avec le projet : - Stress lié à l'arrivée dans une nouvelle structure
Devenir
Les animaux regagneront leur animalerie d'origine et poursuivront les procédures expérimentales autorisées sur place.
Remplacement
De nombreuses études in vitro ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité du produit de thérapie génique. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d’administration utilisé et la dose administrée, et ce d'autant plus lorsque c'est le système nerveux central qui est ciblé. L'utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement du syndrome de Sanfilippo. Ce projet s'inscrit dans les dernières étapes précliniques nécessaire pour une demande de la première phase d'essai clinique, pour lesquelles l’utilisation d’un modèle gros animal, permettant la mise en place d’une approche chirurgicale similaire à celle qui sera effectuée sur les patients dans l’essai clinique est indispensable et nécessite donc l’utilisation de ces chiens.
Réduction
Le nombre d'animaux hébergés dans le cadre de ce projet correspondra au nombre d'animaux inclus dans l'étude de thérapie. Ce nombre est celui requis pour une démonstration statistique de la normalisation d'un biomarqueur de la maladie dans le liquide cérébro-spinal des chiens traités.
Raffinement
Ce projet s'inscrit dans une démarche de raffinement, pour éviter aux chiens une trop longue journée avec cumul du stress lié au transport et à l'examen d'imagerie. A leur arrivée, les chiens seront rassurés par la voix et leur cage de transport ouverte dans leur lieu d'hébergement. Le temps de décider de sortir explorer leur nouvel environnement et/ou venir vers les humains présents leur sera laissé, une friandise leur sera proposée à la sortie de leur cage de transport. Un examen vétérinaire sera effectué une fois les chiens plus à l'aise. Les chiens seront hébergés dans une zone calme, isolée des autres chiens hébergés dans la structure, toujours en groupe d'au moins deux animaux, habitués à cohabiter. Ils seront hébergés sur litière avec à disposition corbeille de couchage, plateformes, et jouets divers (adaptés au tempérament du chien). Un vétérinaire sera présent dans les heures ouvrées durant la période d'hébergement des chiens, et davantage si un problème médical le justifiait. Dans une optique de raffinement également, le projet dans lequel s'inscrit plus largement cette demande d'autorisation sera mené sur des chiens dans la phase pré-symptomatique de leur maladie, au cours de laquelle il n'existe pas de signes cliniques, mais tout de même des signes détectables permettant d'évaluer un bénéfice thérapeutique (biomarqueurs). Une attention particulière sera néanmoins portée à l'apparition de signes neurologiques, même si celle-ci est improbable.
Choix des espèces
Il existe un modèle murin du syndrome de Sanfilippo, qui reproduit la pathologie humaine, mais les modèles de rongeurs sont limités par une faible complexité neurologique. Les modèles animaux de plus grande taille peuvent fournir des informations supplémentaires et complémentaires sur la pathologie et sont bien adaptés pour confirmer la sécurité et l'activité pharmacologique des traitements potentiels avant le début des essais sur l'homme. Ces modèles représentent mieux la maladie humaine et la réponse au traitement en raison de leur plus grande similitude génétique avec l'homme, de leur statut non consanguin, de leur système immunitaire robuste, de leur taille plus importante (y compris la taille et la complexité du cerveau) et de leur durée de vie plus longue. Par ailleurs, dans le cas présent, la thérapie génique est administrée grâce à un dispositif chirurgical innovant, qui pourra être utilisé sur le chien (non applicable sur le petit animal) et transposé à l'Homme dans le cadre du futur essai clinique. A ce titre, et au stade de développement de l'approche testée dans le cadre du projet plus global dans lequel sont inclus les animaux, le modèle canin du syndrome de Sanfilippo a été privilégié. Le projet sera mené au cours de la première année de vie des chiens. Les études de phénotypage menées sur le modèle ont permis de déterminer qu'à ce stade la maladie évolue de manière occulte, sans signe clinique mais avec des paramètres quantifiables (biomarqueurs dans le liquide cérébro-spinal par exemple), permettant d'objectiver un effet thérapeutique à ce stade, tout en évitant d'atteindre un stade de vie au cours duquel des signes neurologiques sont susceptibles d'apparaître.
Etudes des interactions entre les cellules nerveuses mutantes et le système immunitaire à l’aide de modèles murins génétiquement modifiés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
4 195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, certaines passant jusqu'à trente-sept jours seules en cage après une chirurgie et trois sessions de cinq jours consécutifs d'enregistrement cérébral en continu. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 471 d'entre elles, modéré pour 3 624 et sévère pour 100. Des femelles gestantes sont opérées quarante-cinq minutes pour qu'une injection soit faite dans le cerveau de chacun de leurs embryons, au risque d'un arrêt prématuré de la gestation, et les souris porteuses de la mutation développent des crises d'épilepsie dès l'âge de vingt jours. Le porteur attend de ce travail des cibles d'immunothérapie contre les gliomes, hypothèse formulée au conditionnel, quand l'implant crânien, l'isolement social et les crises convulsives sont, eux, programmés.
Objectifs
Les gliomes sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et les plus agressives. Les traitements actuels n’ont qu’un effet limité sur la survie des patients, et ces tumeurs sont souvent résistantes aux traitements, ce qui les rend rapidement mortelles. Il est donc urgent de trouver de nouvelles solutions pour les traiter. On retrouve peu de cellules immunitaires dans les gliomes, car les cellules tumorales et certaines cellules immunitaires créent un environnement qui empêche le système immunitaire de combattre la tumeur efficacement. Dans le cerveau, il existe des cellules spécialisées appelées microglies, qui jouent un rôle important dans le maintien de la santé du tissu cérébral. Cependant, leur rôle dans les gliomes n’est pas encore bien compris. Étudier comment les cellules tumorales et la microglie interagissent pourrait nous aider à trouver des moyens de stimuler le système immunitaire pour mieux lutter contre ces tumeurs. Nous étudions des gliomes avec une mutation particulière qui provoque de l’épilepsie et qui, contrairement aux autres gliomes, présente une forte présence de cellules immunitaires appelées lymphocytes. Dans ces tumeurs, les microglies sont également modifiées. Nous pensons que la communication entre les cellules tumorales et la microglie favorise le recrutement des lymphocytes, qui pourraient aider à combattre la tumeur. Précédemment, un modèle a été développé chez la souris pour étudier cette mutation et a montré qu’elle est nécessaire au développement des tumeurs et est responsable de l’épilepsie liée à ces tumeurs. Ce projet a pour but d’étudier l’effet des cellules mutées sur les cellules immunitaires (microglie) du cerveau en développement chez la souris. L’objectif est de suivre l’évolution de ces microglies au fil du temps et de comprendre comment elles interagissent avec les cellules mutées. Nous utiliserons des enregistrements de l’activité électrique du cerveau pour observer l’apparition de l’épilepsie liée à cette mutation et l’impact des changements dans les microglies.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre comment une mutation génétique spécifique affecte la microglie, modifie la communication entre la microglie et les cellules tumorales et comment elle influence la réponse immunitaire. Cela pourrait également permettre d’identifier comment ces changements dans la microglie pourraient être liés à l’épilepsie qui accompagne ces tumeurs. Nous analyserons également les profils génétiques des microglies afin de pouvoir les comparer avec ceux des patients atteints de gliomes avec cette même mutation d’intérêt. Cela nous aidera à comprendre comment ces changements se produisent au fil du temps et à identifier les mécanismes responsables de la modification des microglies et du recrutement des cellules immunitaires, appelées lymphocytes. Le projet fournira des informations cruciales sur l'évolution des réponses immunitaires et des cellules cérébrales dans le cadre de cette mutation génétique d’intérêt. Il permettra aussi de créer une base de données génétiques pour mieux comprendre l’infiltration des cellules immunitaires et aidera à concevoir des tests et des traitements pour l’avenir. En outre, les résultats offriront un aperçu du rôle des modifications du système immunitaire cérébral dans l’apparition de l’épilepsie liée à cette mutation. Ce projet pourrait aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour générer de nouveaux traitements d’immunothérapie et pourrait donc amener à améliorer les soins pour les patients atteints de gliomes.
Procédures
Pour obtenir nos animaux génétiquement modifiés d’intérêt, un petit prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur une partie des souriceaux produits pour connaitre leur patrimoine génétique. Cet acte se fera une seule fois sur animal vigile et durera moins de 1 minute par animal. Des femelles gestantes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (45minutes maximum) et analgésie adaptée afin de réaliser une injection intracérébrale dans le cerveau de chaque embryon. Une partie de ces femelles recevra 3 semaines après une injection quotidienne pendant 5 jours d’une molécule permettant de mettre en place notre modèle (vigile, durée inférieure à 1 minute par injection). Pour une autre partie des souris, une chirurgie sous anesthésie générale (1h maximum) et analgésie adaptée sera pratiquée afin de mettre un implant au niveau de leur tête permettant ensuite d’enregistrer l’activité électrique du cerveau. Cette activité sera enregistrée pendant 3 sessions de 5 jours consécutifs (24 heures sur 24), espacées de 5 jours minimum, sur les animaux vigiles via une connexion indolore et leur permettant de se déplacer librement. Tous les animaux ayant eu une chirurgie seront hébergés seuls au maximum 37 jours. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin des procédures.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux peut générer une légère et brève douleur et un léger stress chez l’animal. Il existe un risque de léger saignement. Les chirurgies génèreront un risque de douleurs post-opératoires. L’anesthésie générale nécessaire à leur réalisation entrainera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire, et de difficultés cardio-respiratoires. La chirurgie sur les femelles gestantes impliquera également un risque d’arrêt prématuré de la gestation. Le dispositif implanté sur la tête des animaux pour enregistrer l’activité du cerveau impliquera une gêne pour l’animal. Tous les animaux qui auront eu une chirurgie seront ensuite hébergés individuellement, s’agissant d’animaux sociaux cela génèrera un stress. Les injections de la molécule permettant de mettre en place notre modèle génèreront un stress lié à la contention et une légère et brève douleur au point d’injection. Cette molécule peut parfois provoquer une perte de poids chez la souris. La mutation génétique de l’animal (modèle de la maladie étudiée) peut, après activation, générer des crises épileptiques à partir de l’âge de 20 jours.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés soit pour réaliser des prélèvements pour répondre à notre question scientifique soit parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
L’impact de la mutation d’intérêt sera étudié dans des cellules tumorales issues de patients et dans des modèles d’organoïdes créés à partir de cellules souches. Ces modèles nous permettront d'étudier l’interaction entre les cellules mutées et la microglie dans un environnement en trois dimensions qui ressemble davantage à celui du cerveau humain. Cependant, bien que ces modèles soient utiles pour étudier les mécanismes d’action de la mutation, ils ne peuvent pas reproduire toute la complexité du microenvironnement immunitaire du cerveau. De plus, ils ne permettent pas d’observer l’évolution temporelle, en particulier pendant le développement embryonnaire. C’est pourquoi il sera nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier l’impact des cellules mutées sur la microglie dans un cerveau en développement. Ce modèle permettra d’observer les interactions complexes entre différents types de cellules sur une période de temps et dans un espace précis, ce qui n’est pas possible dans des cultures de cellules en laboratoire. De plus, pour étudier comment une mutation affecte le développement cérébral et la survenue de pathologies, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal, qui reflètera la complexité du cerveau en développement et des maladies qui y sont associées. Bien que les organoïdes soient proches du cerveau en termes de structure, ils ne permettent pas d’étudier comment la microglie se développe et interagit avec les autres cellules du cortex cérébral. Nos analyses exigent l’utilisation de modèles animaux, et dans le cadre de ce projet de souris génétiquement modifiées, car elles permettent d’étudier l’évolution des cellules mutées et leur impact sur la microglie dans un environnement en développement, ce qui ne peut pas être fait en laboratoire. Enfin, pour comprendre comment les changements du système immunitaire du cerveau influencent l’apparition de l’épilepsie, il est essentiel de mener cette étude dans un modèle vivant, donc chez la souris.
Réduction
Le nombre total d’animaux maximum utilisés dans ce projet sera de 4195. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte les lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à l'étude et en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée et optimiserons nos choix de croisement afin d’obtenir un maximum d’animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt, diminuant ainsi le nombre d’animaux produits et le nombre impacté par le prélèvement pour connaitre leur patrimoine génétique. Toutes les données obtenues seront analysées avec des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils seront observés quotidiennement et en cas d’anomalie un processus déclaratif à la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et au vétérinaire sera mis en place afin qu’ils apportent conseils et recommandations à l’équipe de recherche pour une prise en charge adaptée de l’animal. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide). Il sera de la plus petite taille possible et sera réalisé à l’aide de matériel propre et désinfecté entre chaque animal. Les animaux sont replacés rapidement avec leur mère après le geste afin de leur redonner un environnement réconfortant. Nous vérifierons l’absence de saignement et la bonne prise en charge par la mère immédiatement après le geste puis après environ 30 minutes. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique adaptée. Elles seront réalisées le matin afin de pouvoir observer les animaux sur la journée et administrer les médicaments nécessaires. La température des animaux sera maintenue tout au long de l’anesthésie (chambre d’induction et de réveil chauffées et tapis chauffant pendant la chirurgie). Le maintien de l’hydratation sera assuré également et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux pour éviter toute sécheresse oculaire. Nous surveillerons le réveil des animaux et leur mettrons à disposition de l’eau sous forme gélifiée ainsi que de la nourriture dans le fond de la cage afin de favoriser leur récupération. Nous ajouterons également une maisonnette en carton en plus du nid en coton et du bâtonnet de bois mis en routine dans les cages afin d’améliorer leur bien-être, notamment pour les femelles gestantes et les animaux hébergés seuls. Après les chirurgies les animaux bénéficieront d’un suivi renforcé, ils seront ensuite examinés de manière spécifique une fois par jour minimum pendant deux jours minimum, et plus si nécessaire. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Le modèle murin nous permet un travail sur le génome car il est bien connu et nous possédons des outils moléculaires bien développés pour travailler sur le génome de cette espèce et le modifier. Ainsi, les lignées génétiquement modifiées d’intérêt pour ce projet n’existent que chez la souris. Enfin, les lignées choisies sont nécessaires pour l'étude des tumeurs malignes humaines et reproduisent de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux sera réalisé sur des souriceaux de 7 à 10 jours. Nous génèrerons des modifications génétiques sur des embryons de 14,5 jours embryonnaires lors d’une chirurgie impliquant donc une femelle gestante. Cette femelle sera âgée d’au moins 7 semaines afin d’être mature sexuellement. Sachant que le but de ce projet est de suivre le développement du système immunitaire cérébral de ces embryons, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : stade embryonnaire tardif (18,5 jours embryonnaires), à une semaine post natale (phase de croissance, maturation en cours) puis aux stades de 21 et 60 jours, lorsque le cerveau devient mature. L’implantation du dispositif pour l’enregistrement de l’activité du cerveau a lieu sur un animal sevré de plus de 23 jours, période qui correspond à l’apparition des crises épileptiques dans ce modèle et permet de faciliter la prise en charge péri-opératoire ainsi que leur hébergement individuel suite à la chirurgie.
Rôle d’un moteur moléculaire dans la migration des cellules dendritiques chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie de la queue vers six jours pour le génotypage, un marquage de l'oreille et une injection dans le coussinet plantaire sous anesthésie, ce dernier geste pouvant provoquer une boiterie passagère. Les retombées annoncées, de nouvelles cibles thérapeutiques contre le cancer par l'amélioration de la mobilité des cellules dendritiques, restent au conditionnel et renvoyées à d'éventuelles thérapies cellulaires. Le porteur indique que des outils de microfluidique appliqués in vitro ont déjà mis en évidence le défaut de migration recherché, et propose malgré cela de refaire l'observation chez la souris pour disposer d'un microenvironnement tumoral complet.
Objectifs
Dans notre corps, certaines cellules jouent un rôle de sentinelles : ce sont les cellules dendritiques. Elles font partie du système immunitaire et sont chargées de repérer les intrus, comme les virus ou les cellules cancéreuses. Dès qu’elles détectent un danger, elles déclenchent une réponse de défense adaptée. Pour remplir cette mission, les cellules dendritiques doivent se déplacer rapidement dans l’organisme. Ce mouvement dépend d’un bon fonctionnement de leur "squelette" interne, composé de deux éléments : l’actine et les microtubules. Ces deux structures doivent parfaitement collaborer, mais les détails de cette coordination sont encore mal compris. Notre recherche s’intéresse à un élément clé de ce mécanisme : un moteur moléculaire. Lorsqu’il est absent dans certaines cellules immunitaires, ces dernières ont plus de mal à présenter les signes d’alerte et à déclencher une réponse efficace contre les tumeurs. Nous cherchons donc à mieux comprendre le rôle de ce moteur dans le déplacement des cellules dendritiques. Pour cela, nous comparons deux groupes de souris : l’un avec ce moteur, l’autre sans. Si nous confirmons que son absence freine le déplacement des cellules, nous testerons des traitements pour tenter de rétablir leur mobilité. L’objectif final est d’améliorer la capacité du système immunitaire à réagir face aux menaces, comme les cancers.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir de nouvelles connaissances fondamentales sur les mécanismes moléculaires nécessaires à une motilité efficace des cellules dendritiques. Il permettra d'identifier des voies de régulation susceptibles d'améliorer l'efficacité des stratégies thérapeutiques basées sur les cellules dendritiques, qui pourraient être combinées avec les effets bénéfiques des inhibiteurs des points de contrôle immunitaire, ouvrant la voie à de potentielles thérapies cellulaires.
Procédures
Un marquage de l’oreille est réalisé sur un animal anesthésié, d’une durée de 30 secondes. Une injection dans le coussinet plantaire est réalisée sur un animal anesthésié, d’une durée de 30 secondes. L'intégralité des animaux seront également génotypés de manière invasive, avec une biopsie de queue effectuée vers 6 jours.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée peut être ressentie suite au prélèvement d'une biopsie de queue pour le génotypage. Des nuisances consécutives aux injections dans le coussinet plantaire peuvent être envisagées, entraînant une légère boiterie dans les quelques minutes suivant l’injection. Des nuisances liées au marquage de l’oreille peuvent également être envisagées, entraînant une irritation légère au niveau de l'oreille ainsi que des changements comportementaux mineurs.
Devenir
La mise à mort à la fin de la procédure est nécessaire pour réaliser le prélèvement des organes et leurs analyses.
Remplacement
Des approches alternatives ont été explorées dans la première partie de ce projet. Grâce à divers outils de microfluidique appliqués in vitro sur des cellules dendritiques primaires murines et humaines, nous avons mis en évidence un défaut migratoire des cellules dendritiques déficientes en ce moteur moléculaire, ainsi qu’une altération de leur capacité d’internalisation des antigènes. Afin de mieux comprendre le rôle de ce moteur moléculaire dans la réponse anti-tumorale chez l’homme, nous prévoyons d’étudier le profil migratoire des cellules dendritiques chez la souris, ainsi que de tester l’efficacité des drogues validées in vitro dans un contexte physiologique reproduisant le microenvironnement tumoral complexe. Ces résultats sont cruciaux et pourraient ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques chez l’homme, notamment dans le cadre de pathologies impliquant un défaut de surveillance des cellules immunitaires.
Réduction
Des lots de 25 souris sont nécessaires afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques. Sur la base des travaux publiés et d’une analyse associée, le nombre de souris à utiliser a été déterminé.
Raffinement
Toutes les souris seront surveillées, tout d'abord au moment du réveil, puis 3h après le réveil par l'expérimentateur, afin de vérifier l’absence de signes de souffrance ou de gênes physiques. Les souris sont groupées par 5. Un enrichissement des cages, composé de maisonnettes en carton et de coton d’enrichissement, est prévu afin de diminuer le stress des animaux.
Choix des espèces
La souris est particulièrement adaptée pour étudier la migration des cellules dendritiques, car elle partage avec l’humain les principaux sous-types de cellules dendritiques ainsi que les mécanismes de migration. Ces processus de migration sont fortement conservés entre les espèces, ce qui permet des extrapolations pertinentes chez l’homme. Enfin, ces expériences s'appuient sur des études publiées menées chez la souris, ce qui justifie l'utilisation de ce modèle afin d'appliquer ces protocoles dans notre propre étude. Comme décrit dans la littérature, les souris utilisées auront entre 6 et 8 semaines. A cet âge les souris sont matures et le système immunitaire complétement développé.
Evaluation de solutions nutritionnelles sur le statut inflammatoire des truies pendant le cycle reproductif
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Gardées vivantes à l'issue du protocole, les 120 truies retournent à leurs cycles reproductifs dans l'établissement et pourront être réengagées dans une autre procédure expérimentale. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec quatre prélèvements sanguins, quatre prélèvements de fèces, un de colostrum pris pendant la mise bas et un de lait obtenu après injection d'une hormone. Chacune passe un mois logée seule en verraterie, puis la semaine précédant la mise bas et les vingt et un jours d'allaitement en maternité, un hébergement que le porteur présente comme "couramment pratiqué dans les élevages de porcs". L'objet du projet est de tester des solutions nutritionnelles anti-inflammatoires destinées à soutenir la production laitière des truies, pour un usage en élevage.
Objectifs
Une production insuffisante ou une absence de lait chez la truie dans les jours suivant la mise bas peut être d'origine immunitaire, infectieuse et/ou comportementale. Ce problème peut s’évaluer de différentes manières, comme par des évaluations visuelles (état de la mamelle, présence d’écoulements vaginaux, absence d’appétit, constipation), par une température rectale au-dessus de 39,5°C, par des biomarqueurs sanguins de l’inflammation et/ou par la présence de toxines bactériennes dans le sang. Selon les auteurs, plusieurs de ces critères sont considérés pour définir la présence de ce problème chez une truie. Il n’existe pas à ce jour de méthode universelle communément admise par la communauté scientifique pour caractériser ce problème. L’objectif de ce projet est d’évaluer des solutions nutritionnelles ayant des propriétés anti-inflammatoires sur la prévalence de ce problème chez la truie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont l’élaboration de stratégies alimentaires pour la truie permettant notamment de soutenir son immunité et sa production laitière.
Procédures
Chaque truie sera soumise à 4 prélèvements sanguins, chacun durant de 2 à 3 min ainsi que 4 prélèvements de fèces, 1 prélèvement de colostrum et 1 prélèvement de lait, chacun d’environ 2 min. Les truies seront logées individuellement en verraterie pendant un mois et en maternité (d’une semaine avant la mise bas jusqu’au sevrage des porcelets après 21 jours de lactation). Ce type d'hébergement est couramment pratiqué dans les élevages de porcs.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins peuvent induire un stress lors de la manipulation et la contention des animaux, ainsi qu’une douleur transitoire au moment de l’introduction de l’aiguille. Les effets indésirables sont principalement une douleur ou une gêne au point d’insertion de l’aiguille ainsi que l’apparition éventuelle d’un hématome et d’une inflammation locale à la suite du prélèvement. Les prélèvements de fèces peuvent également induire un stress, tout comme les prélèvements de colostrum et de lait.
Devenir
Les truies seront gardées en vie à l’issue de cette procédure expérimentale. Elles continueront leurs cycles reproductifs dans l’établissement utilisateur et pourront éventuellement retourner dans une procédure expérimentale.
Remplacement
Les fonctions des solutions nutritionnelles dans l’organisme étant multiples, leurs effets sur la santé et les performances des truies découlent de diverses régulations métaboliques complexes, qui ne peuvent ni être modélisées, ni étudiées in vitro.
Réduction
Pour chaque essai incluant 60 truies au début de l’étude (30 par groupe expérimental), on estime que 48 d’entre elles seront gestantes (en se basant sur une réussite de l'insémination artificielle de 80%). On aura donc en théorie 24 truies par groupe en fin de lactation (sans considérer de potentiels avortements). Le test de puissance statistique donne un nombre minimal de 22 truies par traitement pour les paramètres sanguins et fécaux. Ainsi, l’excédent de 2 truies par groupe permettra de garantir les effectifs minimaux pour une analyse statistique pertinente. Pour les échantillons de colostrum et de lait, cette même formule de calcul donne un nombre minimal de 15 répétitions car la variabilité est différente. En outre, l’étude sera réalisée sur des animaux homogènes et en bonne santé afin de réduire la variabilité individuelle en début d’essai. Pour chaque essai, les deux groupes expérimentaux seront comparés par des méthodes statistiques.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’établissement utilisateur. Des points limites stricts et définis à l’avance seront appliqués tout au long du projet. Les prises de sang s’effectueront en dehors de la salle d’élevage. Le nombre de tentatives de chaque prélèvement sanguin sera limité à 2 par veine jugulaire (gauche et droite) par animal afin de réduire le temps de collecte et de contention. Les prélèvements de fèces seront effectués directement dans la loge où les truies sont hébergées, avec un maximum de 3 tentatives par prélèvement. De même, les prélèvements de colostrum et de lait s’effectueront directement dans la loge de maternité. Le prélèvement de colostrum sera effectué pendant la mise bas. Un prélèvement de lait sera également réalisé lors de la deuxième semaine de lactation. Une injection d’une hormone favorisant l’écoulement du lait est généralement nécessaire pour obtenir un échantillon de lait alors qu’elle ne l’est pas pour l’obtention de l’échantillon de colostrum. Il y aura au maximum deux tentatives de prélèvement de colostrum et de lait sur plusieurs tétines (une avant et une autre après l’injection de l’hormone pour le cas du lait). L'intervalle de temps entre deux tentatives de prélèvement sera d’au moins 5 min. Du matériel d’enrichissement (jouet cylindrique en bois compressé consommable, chaine, étoiles en plastique…) sera à disposition de toutes les truies afin d’améliorer leur bien-être.
Choix des espèces
L'espèce choisie pour la réalisation du projet est uniquement le porc puisqu’il s’agit de l’espèce cible du projet. La finalité du projet est de mettre en place une solution applicable sur le terrain pour les élevages porcins afin d'améliorer la santé des truies et des porcelets. Les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) mis en jeu et étudiés dans le cadre du projet sont spécifiques de l'espèce porcine ce qui implique qu'il n'est pas possible de remplacer cette espèce par une autre. Les animaux utilisés seront des cochettes et truies reproductrices sur tout le cycle reproductif (attente de saillie, gestation, lactation). La réponse des truies face à des modifications nutritionnelles dépend de leur statut métabolique et hormonal. Ces deux statuts sont fortement affectés par le stade physiologique de la truie (gestante vs. allaitante, début vs. fin de gestation, etc…).
Rôle des astrocytes dans les déficiences intellectuelles
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Une chirurgie d'une heure sous anesthésie et des injections répétées cinq jours de suite attendent une partie des souris, les autres passant six jours de tests comportementaux à raison de trois à quatre sessions quotidiennes. 304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 132 d'entre elles et modéré pour 172. La lignée employée porte un phénotype dommageable qui affecte son comportement et son vieillissement, et l'objet déclaré du travail est de comprendre le dialogue entre neurones et astrocytes dans la déficience intellectuelle. Le porteur annonce ces tests comportementaux étalés sur six jours sans indiquer lesquels, et justifie le maintien du modèle animal par le fait que ces paramètres ne pourraient pas être mesurés autrement.
Objectifs
Le cerveau est constitué de neurones ainsi que d'un autre type cellulaire au moins aussi abondant appelé astrocytes. Alors que le rôle des neurones dans le fonctionnement cérébral est largement reconnu et étudié, le rôle des astrocytes et leurs interactions avec les neurones reste largement méconnu. Néanmoins, les données récentes suggèrent qu’ils seraient aussi impliqués dans le contrôle des états comportementaux et des fonctions cognitives en conditions physiologiques ainsi quedans certaines situations pathologiques. Notre étude s’intéresse aux interactions complexes qu’il existe entre les astrocytes et les neurones dans la mise en place d’une pathologie du développement, la déficience intellectuelle. Nous cherchons à mettre en évidence des anomalies de dialogue entre les neurones et les astrocytes et à plus grande échelle des anomalies de communication dans un réseau neuronal complexe du cerveau, tel que l’hippocampe. Cette structure possède des caractéristiques bien établies dans le dialogue entre les astrocytes et les neurones, faisant d'elle une référence de choix pour notre étude dans le contexte pathologique de la déficience intellectuelle.
Bénéfices attendus
L’étude de la fonction du gène impliqué et des mécanismes sous-jacents permettra une meilleure compréhension du rôle des astrocytes dans les déficiences intellectuelles, ce qui pourrait avoir des applications à visées thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests comportementaux s’étendant sur 6 jours. Un seul test sera effectué par jour. Certains tests incluent plusieurs sessions le même jour (10 à 20 minutes), généralement 3 à 4, espacées d’environ 15 minutes. Une chirurgie sera effectuée sur certains animaux anesthésiés; cette procédure dure environ 1 heure et sera réalisée une seule fois. Certains animaux seront traités par injection, cette procédure dure 5 minutes par animal et sera répétée pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Certains animaux seront soumis à une chirurgie, ce qui engendre une douleur modérée de courte durée. Les tests de comportement et leur multiplicité peuvent provoquer du stress léger sans douleur chez les animaux pendant la durée des tests. La souris de laboratoire utilisée dans ce projet présente un phénotype dommageable impactant certains paramètres comme leur comportement et leur vieillissement. Enfin, le traitement par injection engendre un stress léger et peut provoquer une douleur légère de courte durée chez les individus.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau seront collectés afin de permettre des analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
Nous voulons investiguer l’existence des anomalies de dialogue entre différents types de cellules cérébrales et à plus grande échelle des anomalies de communication dans un réseau complexe du cerveau pour ainsi caractériser et tester leur potentiel thérapeutique via des mesures comportementales. Ainsi, le remplacement du modèle animal n'est pas possible dans ce projet puisque ces paramètres ne peuvent pas être mesurés autrement.
Réduction
En se basant sur la littérature, des tests statistiques et l’expérience du personnel du laboratoire, un nombre minimal d’animaux sera utilisé. De plus, nous allons réaliser plusieurs analyses sur les mêmes souris, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Toutes les expériences invasives, comme les chirurgies seront réalisées avec une anesthésie et un traitement anti-douleur appropriés. Les souris recevront un régime alimentaire enrichi additionnel. Les souris seront inspectées quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. Des point limites précoces pour prévenir toute souffrance ou stress de l’animal seront mis en place : animal prostré, fourrure ébouriffée, yeux plissés, perte de poids excessive. Les animaux seront mis à mort si aucune amélioration n'est constatée après deux jours de traitement. De plus, la souris employée de ce projet est utilisée dans le laboratoire depuis longtemps, ce qui nous permettra d’anticiper ses points limites et de faciliter la détection précoce des signes de souffrance, lors de son hebergement, en attente d'être utilisé pour experimentation.
Choix des espèces
La génétique de la souris est bien connue, ce qui permet de créer des modèles robustes pour l'étude des pathologies humaines. De plus, la souris est un mammifère où les processus qui régissent son développement sont les mêmes que chez les mammifères supérieurs. Enfin de nombreuses lignées sont disponibles chez cette espèce, ce qui nous intéresse tout particulièrement pour étudier les altérations pouvant conduire à une déficience intellectuelle. Notre but est d'étudier le gène impliqué dans les mécanismes sous-jacents de la déficience intellecuelle au cours du developpement, dès le stade juvénile. Les expériences seront donc réalisées chez la souris juvénile jusquà l'âge adulte pour étudier le rôle de ces altérations.
Asthme allergique : évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à 162 administrations de composés et d'allergènes et 12 prises de sang sur souris éveillées : 2250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements, 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 2000 un niveau modéré. Des souris rendues asthmatiques par des acariens, de l'ovalbumine, de la papaïne ou du pollen de bouleau reçoivent des molécules candidates contre le remodelage des bronches, que le laboratoire teste pour le compte de clients. Le porteur décrit des douleurs inflammatoires et une perte de poids liées à la maladie induite, et des hématomes aux points d'injection, jusqu'à deux fois par jour pour la voie sous-cutanée. Il justifie le choix de la souris par des souches dont les génomes posséderaient "99% de similitude avec le génome humain".
Objectifs
L’asthme allergique est un type d’asthme qui est déclenché ou aggravé par des allergies. L’exposition à des allergènes, comme le pollen, les squames d'animaux, les moisissures, ou à des irritants peut augmenter les symptômes et provoquer une crise d’asthme chez les personnes souffrant d’asthme allergique. 300 millions de personnes sont atteintes d’asthme allergique à travers le monde et 80 % des asthmes sont d’origine allergique. L’asthme touche environ 4 millions de personnes en France et est associé à plus de 60 000 hospitalisations et à près de 900 décès par an. L’asthme est un syndrome inflammatoire chronique de la muqueuse bronchique dans lequel de nombreuses cellules jouent un rôle dans un processus en cascade. Chez des individus prédisposés, cette inflammation cause des épisodes récurrents de sifflements, essoufflements (dyspnée), oppression thoracique et toux, particulièrement la nuit et/ou au petit matin. Ces symptômes accompagnent habituellement une limitation du flux aérien qui est, au moins en partie, réversible (soit spontanément, soit par action thérapeutique). L’inflammation est également la cause associée d’une augmentation de la réactivité des voies aériennes à une diversité de stimuli. L’asthme ne se guérit pas, il persiste toute la vie même si des phases de rémission peuvent durer plusieurs années. Pour limiter les crises, il est fondamental d’éliminer les facteurs déclenchants de son environnement. Chez les patients atteints d’asthme modéré à sévère, le contrôle de la maladie repose sur un traitement de fond (corticostéroïdes inhalés ou des anti-leucotriènes qui peuvent être associés à un ou deux bronchodilatateurs de longue durée d’action) à prendre quotidiennement et un traitement de crise (bronchodilatateurs d’action rapide parfois associés à des corticostéroïdes inhalés, qui permettent quant à eux de limiter l’intensité des symptômes). En cas d’asthme léger, un traitement de crise peut être prescrit seul. Ce projet est un renouvellement, qui vise à étudier de nouveaux traitements contre le remodelage pulmonaire responsable des symptômes de la maladie dans un modèle d’asthme allergique induit par administration d’acariens (HDM : House Dust Mite), ovalbumine (OVA), papaïne (protéase à cystéine fragilisant la barrière épithéliale) ou de pollen de bouleau (BPE : Birch Pollen Extract) chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces dernières années, des innovations thérapeutiques majeures ont été réalisées grâce à la compréhension des mécanismes biologiques de l’asthme allergique, et cinq médicaments de thérapie ciblée sont aujourd’hui commercialisés. Ils permettent d’améliorer la prise en charge des patients les plus sévèrement atteints, non contrôlés par les traitements conventionnels. Cependant, les traitements actuels ne font que contrôler les manifestations de l’asthme : ils ne permettent pas de le guérir. Pour cela, le processus de remodelage bronchique devrait être inversé afin que le tissu des bronches revienne à la normale. Les investigations actuelles visent donc à identifier les différentes voies biologiques à l’origine du remodelage, pour pouvoir ensuite proposer des traitements ciblés. Le but est ici d'étudier ces pistes thérapeutiques. Dans notre projet précédent, nous avons pu identifier 12 molécules qui ont eu un effet bénéfique sur les animaux traités à savoir une diminution de l’inflammation et/ou une amélioration de la fonction pulmonaire. Nous espérons dans ce nouveau projet pouvoir identifier de nouvelles molécules prometteuses.
Procédures
Prélèvements de sang : maximum 12 prélèvements (1 fois par semaine maximum, 30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris). Administrations de composés + allergènes : maximum 162 administrations (2x/semaine à 2x/jour selon la voie d’administration; 30 secondes/souris).
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie. La douleur pourra générer une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées (1 à 2x /j pour les sous-cutanés, ou 2x/semaine pour les i.v.) pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Pour les traitements en gavage (1 à 2x /j), aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires). Sur les études réalisées lors de la DAP précédente, 98.7% de animaux étaient en gravité réelle légère, 0.7% en gravité modéré et 0.6% en sévère.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.
Remplacement
Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’asthme allergique chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie ou d’une combinaison thérapeutique. Ces nouvelles thérapies sont en premier lieu testées et validées sur des lignées cellulaires afin de sélectionner les doses à appliquer in vivo pour l'étude d'efficacité. Cependant, les méthodes substitutives à l’expérimentation animale ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament, tests nécessaires avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires. Nos clients s'engagent à ce que la toxicité des composés ainsi que du véhicule fourni soit validée in vitro sur des modèles pertinents avant leur passage en étude in vivo. Ils s’engagent également à recourir au modèle animal car il n’existe pas à leur connaissance d’autre modèle à même d’évaluer l’efficacité de leur molécule.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (10 souris/groupe) pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 2 variables.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré et des croquettes humides seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Dans le cas d'une analyse de la capacité pulmonaire, la pléthysmographie sera effectuée sous anesthésie générale avec administration d'un analgésique et anesthésique local. La température corporelle sera maintenue constante entre 37 et 38°C par un tapis chauffant. Dans la précédente DAP clôturée, 0.7% d’animaux ont été en gravité modéré et 0.6% en sévère sur la totalité des études réalisées. Nous avons choisi ici de raffiner la grille de scoring en ajoutant de la buprénorphine (en plus de l’ajout de croquettes humides dans la cage) dès qu’un animal se situera en surveillance renforcée. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec des enrichissements que nous ferons varier au cours de l’étude : cylindres de coton, des frisures kraft ainsi que des dômes/tunnels et objet de rongeage en bois dès leur arrivée. Cela permettra de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Nos modèles d'études ont été développés sur les souches de souris dont les génomes possèdent 99% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendue. - La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettent la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. - Le modèle d’asthme allergique est très bien décrit dans la littérature chez la souris et mis en place depuis plusieurs années au laboratoire. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines minimum) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 7000
660 000 souris et rats sont élevés pour être livrés aux laboratoires porteurs de la mutation voulue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 535 000 d'entre eux et modéré pour 125 000. Chacun peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue pour vérifier son génotype, jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour et une injection d'hormone destinée à activer sa mutation. Une partie part vers d'autres établissements, le reste est mis à mort, ces animaux appartenant au scientifique et ne pouvant, selon le porteur, être replacés. Il annonce une hausse d'environ 10 % des effectifs et indique que les scientifiques s'engagent par écrit à l'absence de solution de remplacement, l'objectif affiché étant de leur livrer le "modèle parfaitement adapté" à leurs expérimentations.
Objectifs
Ce projet consiste à maintenir des lignées de rongeurs dont certains gènes ont été modifiés. Ces modifications peuvent provoquer chez les animaux des changements visibles ou des symptômes particuliers, appelés phénotypes. L’objectif est d’observer ces animaux, de comprendre si la mutation génétique a un impact sur leur santé et leur bienêtre, et d’ajuster la manière dont ils sont suivis et soignés en fonction de ces observations. Ces animaux sont utilisés comme modèles dans la recherche scientifique, par exemple pour mieux comprendre des maladies génétiques comme la mucoviscidose, l’hémophilie ou certaines myopathies, et contribuer au développement de nouveaux médicaments. Pour savoir si un animal porte réellement la mutation recherchée, on effectue une biopsie, généralement en prélevant un morceau d’oreille. Ce prélèvement sert à extraire l’ADN et à vérifier si la mutation est présente. Cela est indispensable, car dans une même portée, tous les animaux ne sont pas forcément porteurs, et il faut pouvoir identifier précisément ceux qui seront utiles pour les recherches et garantir la fiabilité des résultats. Lorsqu’une nouvelle lignée génétiquement modifiée arrive ou est créée, et que l’on ne connaît pas encore les effets de la mutation, une phase d’observation détaillée est mise en place pour comprendre comment celleci influence l’animal et s’assurer que son bienêtre est préservé. Lorsque les effets de la mutation sont déjà connus, le suivi et les soins sont adaptés directement, en surveillant les éventuels signes cliniques et en mettant en place des mesures de prévention ou de traitement si nécessaire. Pour certaines lignées, la mutation ne s’exprime que lorsque l’animal reçoit une substance déclenchante, par exemple une hormone, ce que l’on appelle un ligand. Une administration peut donc être réalisée afin d’activer la mutation et de permettre à l’animal de manifester les caractéristiques liées à cette modification génétique. Dans l’ensemble du projet, environ 660 000 animaux sont concernés, avec une augmentation d’environ 10 % liée à une utilisation croissante de ces modèles. Ils sont répartis dans 500 à 600 projets de recherche différents. Parmi ces projets, environ 35 % portent sur des lignées génétiquement modifiées, pour lesquelles les animaux font l’objet d’une attention particulière en matière de suivi et d’évaluation des phénotypes, afin d’anticiper et de limiter au maximum l’impact potentiel de la mutation sur leur bienêtre.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait dû être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptées à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le modèle parfaitement adapté pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis (par animal) : à 1 à 2 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique : un prélèvement par animal à la queue maximum) (maximum 4 biopsies sur validation par l’équipe vétérinaire), acte d’une durée maximale de 2sec par biopsie. à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de max 3sec. à une injection d’un ligand, acte d’une durée maximale de 10sec par injection. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite).
Impact sur les animaux
Expression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité innatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dus à l'injection d’un produit.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergés et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur génétiquement altéré quand il est accouplé avec des animaux non génétiquement altéréesafin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, n’est utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypage. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européennes (au moins 7 animaux de chaque sexe et génotype, sur 2 générations).
Raffinement
En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés au suivi vétérinaire des animaux. Pour les lignées à phénotype dommageable, des observations cliniques plus fréquentes et spécifiques, avec des points limites, peuvent être mises en place. Pour limiter la douleur, une euthanasie pourrait être demandée à un point limite ou âge précis pour éviter l’expression du phénotype. Cela est évalué lors de la caractérisation du phénotype, en lien avec le scientifique et les vétérinaires. Les observations sont facilitées par des outils internes comme des grilles de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype, des points d’intervention sont adoptés pour un suivi précis et des soins adaptés (soutien nutritionnel…). Si des signes cliniques peuvent être atténués ou guéris par traitement, avec accord du scientifique, le traitement est mis en place. Les animaux présentant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final pour assurer leur réception et utilisation selon les normes éthiques et de bien-être animal.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement altérés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5 jours après la fécondation.
Traitement de la fibrose hépatique dans un modèle de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Biopsiées pour identification, injectées trois jours de suite, soumises à un changement de régime alimentaire, 457 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles portent une inactivation hépatique d'un gène qui leur fait développer une fibrose du foie spontanée, et servent à tester une molécule censée faire régresser la maladie. Le porteur ne mentionne comme nuisances qu'un stress lié à la biopsie, à la manipulation et à l'injection, et annonce un suivi hebdomadaire du poids. Toutes sont tuées après une sédation profonde, pour prélever les organes et doser des paramètres biochimiques.
Objectifs
Les maladies métaboliques du foie représentent plusieurs syndromes qui vont de la simple stéatose hépatique à la stéatose hépatique inflammatoire et peuvent évoluer vers la fibrose, la cirrhose et le cancer hépatocellulaire. Ce projet s'intéresse aux mécanismes impliqués dans le développement de ces maladies hépatiques. L’objectif du projet est de tester une molécule à potentiel thérapeutique pouvant reverser ces pathologies. Cette étude sera réalisée sur un modèle de souris n'expriment pas notre gène d'intéret spécifiquement dans le foie. Ces souris développent une fibrose spontanée.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans l'urgence clinique de trouver des traitements thérapeutiques contre la fibrose hépatique, puisqu’aucun traitement n'a été cliniquement approuvé à l'heure actuelle. Ainsi, cette étude permettra de tester des molécules pharmacologiques d'intérêt et de comprendre à partir de quel stade de développement de la maladie ces molécules peuvent avoir un effet bénéfique. Nous étudierons également les mécanismes mis en jeu dans l’amélioration du phénotype.
Procédures
Les animaux auront une biospie pour l'identification (durée 15 secondes). Les animaux auront des injections (durée 15 secondes) pendant 3 jours de suite. Ils seront soumis à un changement de régime alimentaire. Enfin ils auront une injection (15 secondes) d’un analgésique puis une injection d'un mélange anésthésique (15 secondes).
Impact sur les animaux
La biopsie, même si celle-ci est précoce peut engendrer un stress. La manipulation des animaux et l'injection peut engendrer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement d'organes et l'analyses biochimiques et moleculaires de certains paramètres.
Remplacement
Des premiers tests réalisés en culture de cellules montrent des résultats encourageants cependant la réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut être totalement subsituée par des approches entièrement en culture cellualire. Cette molécule va agir sur le foie mais également de manière indirecte sur différents organes, la communication entre les organes est indispensable. Par ailleurs, l'identification et la validation de cibles thérapeutiques par des traitements pharmacologiques nécessite l'utilisation de modèles animaux mimant le plus fidèlement la pathologie humaine. La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement en culture de cellules.
Réduction
Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions.
Raffinement
Le suivi de ces animaux sera hebdomadaire par le personnel de l’animalerie et par l'expérimentateur pendant la durée des procédures. Les régimes pourront induire une variation de poids, nous suivrons le poids des souris par une pesée 1 fois par semaine. Nous suivrons les souris selon un grille de score permettant de s'assurer du bien-être des animaux. Les animaux sont hébergés par 4 à 6. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. En fin de procédure, les animaux seront soumis à une sédation profonde afin d’éviter toute douleur (Kétamine/xylazine/buprecare 180mg/kg/20 mg/kg/ 0,1mg/kg).
Choix des espèces
L’espèce souris Mus Musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux . De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, l'utilisation de modèles de souris transgéniques permet une étude approfondie des maladies hépatiques et de tester de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons des souris adultes entre 8 semaines et 24 semaines. A ce stade de développement, toutes les voies métaboliques hépatiques et les voies de l'inflammation sont mises en places.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement modifiés utilisés dans l’étude de la douleur chez la souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Prélèvement de deux millimètres du bout de la queue, sur animal vigile maintenu en contention, sans anesthésie : 600 souris âgées de quinze à vingt et un jours vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte sert à génotyper des lignées modifiées destinées à l'étude de la douleur, le porteur indiquant que les méthodes non invasives testées ne donnent pas de résultats assez fiables. Il justifie l'absence d'anesthésie par le fait que l'extrémité de la queue est peu ossifiée et peu vascularisée, donc peu douloureuse, tout en annonçant une douleur légère et un saignement possible. 500 souris rejoignent l'élevage ou d'autres projets autorisés, les 100 dont le génotype n'est pas recherché sont tuées.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés (modifié par l’homme au niveau des gènes ) sont utilisés dans la recherche pour mieux comprendre le rôle des gènes et leurs impacts sur la santé des humains, des animaux ou de l’environnement. Pour cela, ces animaux sont élevés dans des conditions adaptées, et leurs caractéristiques génétiques doivent être bien connues afin de former des groupes expérimentaux fiables et de maintenir les lignées sur le long terme. Pour identifier les animaux qui conviennent aux projets et assurer le suivi des lignées, il est nécessaire de vérifier leur génétique. Parfois, il n’est pas possible de faire ces vérifications de manière totalement non invasive. Ce projet a pour but de présenter la méthode utilisée pour prélever les échantillons permettant de connaître le profil génétique des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de sélectionner les animaux pertinents pour les études scientifiques.
Procédures
Prélèvement unique de 2mm de l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sous contention - Durée: 10 secondes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement sur la queue. Un saignement peut aussi apparaître.
Devenir
Les animaux au génotype non recherché seront mis à mort. Les animaux au génotype recherché seront : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé ; b/ Utilisés pour le maintien de la lignée ; c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem
Remplacement
Nous avons testé plusieurs méthodes qui permettraient d’obtenir les informations nécessaires sans prélever de tissus sur les animaux. Pour l’instant, ces techniques non invasives ne donnent pas de résultats suffisamment fiables. Le projet reste donc indispensable pour produire et mettre à disposition des animaux génétiquement modifiés utilisés dans des recherches autorisées.
Réduction
Nous faisons tout pour utiliser le moins d’animaux possible. Pour cela : •Nous ne gardons en élevage que les lignées réellement utilisées dans des projets en cours ; les autres sont conservées sous forme congelée. •Nous maintenons les lignées génétiquement modifiées sur des bases génétiques stables pour éviter de produire des animaux dont le profil n’est pas utile. •Nous adaptons les schémas d’accouplement pour limiter la naissance d’animaux qui ne possèdent pas le génotype recherché, ce qui réduit aussi le besoin de prélèvements. De plus, certaines méthodes de marquage, comme les encoches à l’oreille, ne sont pas fiables sur le long terme. Elles peuvent entraîner des erreurs d’identification et obliger à refaire des prélèvements ou à utiliser davantage d’animaux. Pour éviter cela, nous privilégions des pratiques qui garantissent la précision tout en respectant les principes de réduction et de raffinement.
Raffinement
Nous appliquons des méthodes rapides, précises et standardisées, conçues pour être les moins stressantes possible pour les animaux. L’extrémité de la queue étant peu ossifiée et peu vascularisée, l'utilisation d'anesthésique n'est pas nécessaire pour la réalisation du prélèvement car ce dernier est peu douloureux et avec des risques hémorragiques extrêmement réduits. Après le prélèvement, chaque animal est immédiatement remis dans sa cage avec ses congénères. Le point de prélèvement est ensuite surveillé visuellement tous les jours (réglementairement obligatoire) par le personnel s’occupant des cages, afin de vérifier la bonne cicatrisation. Une liste de signes d’alerte et d’actions à entreprendre est utilisée pour garantir leur bien-être. Enfin, dès que la science le permet, nous privilégierons des techniques non invasives, afin de réduire encore davantage les contraintes pour les animaux.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain. Les prélèvements de l’extrémité de la queue seront réalisés entre 15 et 21 jours après la naissance. En effet, durant cette période, l’extrémité de la queue est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douloureux et avec des risques hémorragiques extrêmement réduits."