Procédures légères

162 souris gestantes reçoivent un gavage de PFAS par jour pendant toute leur gestation, sept gavages de cinq minutes chacun. Leurs 1 296 souriceaux sont comptés dans le projet, ce qui porte à 1 458 le nombre de souris utilisées, 1 296 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 162 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever le sang et les organes. Le porteur indique que les petits pourraient présenter un retard de croissance, des anomalies du comportement social et de la vocalisation, voire une mortalité néonatale en cas d'exposition importante. Il revendique la souris gestante comme un "organisme entier", tout en décrivant le modèle cellulaire complexe de placenta humain qu'il utilise en parallèle.

Objectifs

Des données émergentes suscitent des préoccupations concernant les effets de l'exposition aux polluants de la famille des substances per et polyfluoroalkylées (PFAS), sur la santé placentaire et le développement du fœtus, augmentant ainsi la vulnérabilité maternelle et fœtale. Particulièrement, quatre substances PFAS associés soit à des modifications histologiques de la vascularisation placentaire, soit à un vieillissement précoce des villosités placentaires. Des études épidémiologiques ont montré que l'exposition gestationnelle aux PFAS est associée à un risque accru de complications de la grossesse, notamment le développement de maladies cardiovasculaires comme la prééclampsie, et pourrait également exposer le fœtus à des effets néfastes sur sa santé, tels qu'un faible poids à la naissance. Par ailleurs, des travaux récents chez l'homme et l'animal ont suggéré que l’altération de la fonction vasculaire feto-placentaire pourrait constituer un mécanisme clé de toxicité aux PFAS pendant la grossesse. Le projet global consistera à étudier les effets de l’exposition aux PFAS durant la grossesse sur le placenta et le fœtus en s’appuyant sur des données collectées sur une cohorte de patientes suivies pendant leur grossesse en France pour l'exposition aux polluants, y compris les PFAS. Les PFAS associés à des altérations histologiques du placenta feront l'objet d'une étude approfondie dans notre projet. Les impacts de l’exposition aux PFAS candidats seront d'abord étudiés sur un modèle de cellules placentaires, puis sur un modèle d’explants de placenta humain, et enfin sur un modèle de souris. L’ objectif de ce projet sera : D’évaluer l'impact de l'exposition à ces PFAS sur le développement placentaire et fœtal chez la souris gestante.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples et s'inscrivent dans une perspective de prévention et d'amélioration des connaissances sur les risques liés à l'exposition aux PFAS durant la grossesse. La caractérisation des mécanismes par lesquels les PFAS affectent la santé placentaire et fœtale est cruciale pour mieux comprendre les risques d'une exposition au cours de la gestation. En effet, la perte d'intégrité placentaire est un phénomène qui peut non seulement perturber le déroulement de la grossesse, mais aussi altérer le développement du cerveau fœtal. L’utilisation du modèle de souris gestante permettra d’évaluer l'impact de l’exposition aux PFAS dans un environnement biologique plus complexe, facilitant l’observation des effets sur la santé du fœtus et sur le développement de possibles pathologies futures. Toutefois, bien que certaines études aient exploré les effets des PFAS sur la santé placentaire, aucune n’a jusqu'à présent approfondi la caractérisation de l'impact de ces substances sur la structure placentaire, ni étudié leur effet potentiel sur l'interaction entre le placenta et le développement cérébral du fœtus. Ce projet permettra de combler ces lacunes en apportant une compréhension plus élargie de la réponse gestationnelle aux PFAS et d’identifier des altérations du cerveau fœtal, connues pour évoluer en troubles cognitifs durant l'enfance. À long terme, ce projet permettra de mieux évaluer les risques sanitaires associés à l'exposition aux PFAS et de définir des critères pour une réglementation plus stricte. Il permettra d'élaborer de nouvelles stratégies de surveillance, de prévention et d'atténuation des risques liés à l’exposition aux PFAS chez les femmes enceintes et les fœtus, tout en permettant l'établissement de valeurs seuils à ne pas dépasser afin de réduire les risques de pathologies chez les générations futures.

Procédures

Les gavages réalisés seront effectués une fois par jour chez les souris femelles adultes gestantes pendant toute la gestation. Celle-ci durera 5 min par gavage et par animal. Au total chaque souris recevera 7 gavages au cours de la gestation.

Impact sur les animaux

Le gavage avec une solution de PFAS peut provoquer un inconfort temporaire, notamment lors de l’introduction de la sonde, ce qui pourrait entraîner une douleur se limitant à la période de manipulation. La procédure de gavage, en particulier si elle est répétée peut entrainer du stress ainsi qu'une perte de poids modérée et une réduction de la mobilité. Des effets liés aux PFAS peuvent également être observés comme des troubles gastro-intestinaux (diarrhée, vomissements légers). Les souriceaux pourraient présenter un retard de croissance (un poids à la naissance inférieur à la moyenne), des anomalies comportementales (recherche de nid, comportement social, communication via vocalisation), voire une mortalité néonatale en cas d'exposition importante aux PFAS. A long terme, des signes d’altérations neurologiques pourraient persister. Ces paramètres seront surveillés de très près pendant toute l’étude.

Devenir

Afin de mener ce projet et d’évaluer les effets des PFAS, le sang ainsi qu’un ou plusieurs organes seront prélevés sur les animaux pour être analysés, ce qui implique que les animaux devront être euthanasiés avant de réaliser ces prélèvements.

Remplacement

Cette étude examine les effets de l'exposition prénatale aux PFAS chez la souris gestante et son fœtus. L'objectif est de mieux comprendre comment ces substances peuvent affecter le fonctionnement du placenta et, potentiellement, le cerveau du fœtus, un organe particulièrement vulnérable. Les perturbations dans le développement du cerveau du fœtus peuvent avoir des conséquences importantes sur la santé du fœtus, à long terme. L’étude a été initiée par l’étude les liens entre les niveaux de PFAS dans le sang des femmes enceintes et des anomalies dans la structure du placenta. Cette analyse a été effectuée sur des données collectées sur une cohorte de patientes enceintes suivies durant leur grossesse pour examiner les liens possibles avec des marqueurs de vieillissement ou de vascularisation dans le placenta. Avant de passer sur le modèle animal, nous avons réalisé des études cliniques, in vitro et ex-vivo qui confortent nos hypothèses et nous incitent à considérer un modèle in vivo. Le projet comprend plusieurs volets innovants qui visent à réduire/remplacer l'utilisation des animaux en utilisant: - Un modèle cellulaire complexe de placenta qui regroupe les différents types cellulaires présent dans le placenta humain sera également utilisé pour étudier l'impact des PFAS, en simulant les interactions entre tous les types de cellules présentes dans le placenta. - A la suite de la publication des résultats sur le placenta humain et en vue de l’intérêt suscité par cette étude, des expériences en laboratoire seront menées sur des cellules placentaires humaines pour étudier les effets des PFAS et leurs effets sur le placenta. En dépit de toutes les approches citées ci-dessous, notre projet ne pourra pas se passer du modèle animal. En effet, l’organisme entier offre la possibilité d’étudier les réponses globales des différents types cellulaires et d'analyser les interactions entre différents organes, cas du placenta et du cerveau fœtal. Les mécanismes recherchés ne peuvent être caractérisés que dans un contexte d’organisme entier, et non sur des cellules isolées au laboratoire dans un contexte non physiologique. L’utilisation du modèle de souris dans un contexte plus physiologique propose une recherche complète qui fournira des informations sur les effets potentiels à court et à long terme. Ainsi, ce projet vise à fournir une compréhension approfondie des effets des PFAS pendant la grossesse et leur impact potentiel sur la santé du fœtus.

Réduction

Il est prévu d’utiliser 162 souris femelles qui donneront naissance à environ 8 souriceaux chacune, soit 1458 souris au total sur une durée de 5 ans. Ces souris seront divisées en plusieurs groupes et recevront un traitement différent de PFAS. Le nombre de souris femelles a été calculé et réduit au minimum de façon à ce que les résultats puissent être exploités et interprétés de façon fiable d'un point de vue statistique. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous sommes appuyés sur des données de la cohorte sur les patientes enceintes qui a identifié les PFAS les plus pertinents à caractériser dans un organisme entier, la souris gestante. Le modèle murin sera exclusivement employé pour valider les effets observés et réaliser des expériences complémentaires, et non pour des identifications initiales.

Raffinement

Les souris seront suivies tous les jours de la semaine par les personnes impliquées dans le projet et les week-end par les personnes d’astreinte. Les souris gestantes ayant mis bas avec leurs souriceaux seront suivies tous les jours dès l’accouchement, jusqu’au moment de séparation des petits de leur mère (J42). Différents paramètres permettant le suivi de l'aspect général comme le comportement, la locomotion, ainsi que la perte de poids seront estimées de façon régulière. La mise à mort et la collecte des échantillons seront effectuées sous anesthésie. Des critères d'arrêt sont prévus dans le projet en cas de survenue d’effets inattendus.

Choix des espèces

Le modèle choisi pour cette étude est le modèle animal souris gestantes, âgées de 8 à 14 semaines, qui permettra de suivre toutes les étapes de la gestation. Le modèle souris est choisi pour sa gestation courte et proche de la gestation humaine. Comme chez l’humain, la placentation chez la souris est hémochoriale, c’est-à-dire que les échanges entre la mère et le fœtus se font à travers la barrière placentaire sans que le sang de la Maman et de son fœtus ne soient mélangés. Plusieurs études ont démontré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des gènes clés de la placentation chez les deux espèces et que plusieurs facteurs qui régulent la formation de nouveaux vaisseaux sont exprimés dans des types cellulaires similaires et régulés de la même façon.

459 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 260 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 199 un niveau léger. Chaque geste se fait sous anesthésie gazeuse, cinq prises de sang étalées sur sept mois pour 199 d'entre elles, quatre injections espacées de deux semaines puis neuf prises de sang sur cinq mois pour les 260 autres. Le projet cherche à comprendre pourquoi les femmes développent plus souvent une polyarthrite rhumatoïde, en suivant chez la souris les cellules échangées entre la mère et le fœtus, les thérapies personnalisées annoncées étant renvoyées au long terme. Leurs organes sont prélevés après la mise à mort et conservés en biobanque, pour un atlas que le porteur présente comme un moyen d'éviter d'utiliser de nouveaux animaux plus tard.

Objectifs

Il s’agit de comprendre pourquoi les femmes sont plus souvent atteintes par les maladies autoimmunes Rhumatismales. Une maladie autoimmune est une maladie où le corps se défend à tort contre soi, et ici il s’agit d’une maladie rhumatismale appelée polyarthrite rhumatoïde dont la cible est l’articulation. L’objectif est d’analyser le rôle des cellules semi-étrangères qu’un individu peut recevoir au cours de sa vie. Les femmes, comme les hommes, reçoivent des cellules maternelles pendant leur vie in utero. Chacun peut également recevoir des cellules d’un jumeau né ou non. Ces cellules issues d’un échange entre jumeaux s’appellent des cellules gémellaires ou fraternelles. Mais les femmes ont la particularité de recevoir, en plus de ces cellules maternelles et fraternelles, des cellules foetales quand elles sont enceintes. Ces cellules reçues à différents stades de la vie persistent des décennies chez leur hôte. La plupart du temps elles ne sont pas néfastes, voire même bénéfiques, pouvant contribuer à la réparation des tissus. Cependant, ces cellules, bien que peu nombreuses chez leur hôte, sont capables de produire des protéines appelées autoanticorps qui participent au développement des maladies autoimmunes rhumatismales. Elles y participent dans un contexte génétique particulier que nous étudions chez la souris. Nous pouvons réaliser des croisements différents mimant les différents contextes génétiques humains. Nous pouvons aussi visualiser et traquer ces cellules semi-étrangères issues des échanges foeto-maternels ou gémellaires grâce à des modèles de souris. Le but est de comprendre comment chaque source, maternelle, gémellaire et/ ou foetale peut indépendamment ou en collaboration avec d’autres, participer au déclenchement d’une maladie autoimmune rhumatismale chez leur hôte.

Bénéfices attendus

A court terme ce projet apportera de nouvelles connaissances. A plus long terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles thérapies personnalisées en fonction du sexe, afin de cibler ces cellules et/ou de les orienter vers une influence moins néfaste et d’enrayer le processus d’auto-immunité.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront toutes réalisées sous anesthésie gazeuse : - sur 199 animaux : 5 prises de sang (acte durant chacun moins d’une minute) par animal sur une durée de 7 mois - sur 260 animaux : 4 injections à 2 semaines d’intervalle et 9 prises de sang (actes durant chacun moins d’une minute) sur une durée de 5 mois.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress lors de la manipulation pour les placer dans la boite d’anesthésie gazeuse, et lors du réveil. Les prises de sang et les injections (équivalentes à piqûre pour vaccination) sont susceptibles d’induire une douleur/gène au point d’injection.

Devenir

A l'issue de la chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes qui seront analysés grâce à des techniques courantes de laboratoire (microscopie, …) et conservés en biobanque.

Remplacement

Il n’est pas possible d’utiliser des modèles in silico (modèle informatique) ou in vitro pour étudier le rôle des cellules acquises pendant la grossesse chez l’hôte et en particulier son rôle immunitaire. Seul un modèle murin peut permettre d’analyser la réponse immunitaire dans son intégralité, et qui implique différents organes.

Réduction

Les travaux précédents nous ont permis de définir les conditions d’immunisation et les croisements les plus propices à obtenir des échanges foeto-maternels (nombre de gestations etc..) et de connaitre les pourcentages de souris qui produisent des anticorps après immunisation pour quelques groupes. Ceci permet de calculer au plus juste le nombre d’animaux utilisés. Pour les groupes pour lesquels nous ne connaissons pas les pourcentages, nous planifions de commencer par immuniser 12 souris, puis analyserons les statistiques et n'augmenterons les effectifs que si nécessaire pour réduire au maximum le nombre à utiliser. Un morceau de chaque organe prélevé après mise à mort de l’animal sera cryopréservé, extrait en ADN et/ou préparé pour des coupes microscopiques qui pourront permettre des analyses ultérieures de recherches plus précises de cellules maternelles, gémellaires et/ou foetales au fur et à mesure du développement de nouvelles technologies, évitant ainsi d’utiliser de nouveaux animaux. Cette biobanque permettra d’établir un Atlas complet de chaque organe et pourra être mise à disposition pour de futures études collaboratives. Par exemple ici nous ne disséquons pas le cerveau pour en connaitre la composition exacte et le type de cellules maternelles, mais un spécialiste dans le domaine pourra analyser ces échantillons sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux dans le futur.

Raffinement

Chaque cage sera pourvue d’un enrichissement, rouleau en coton/ dôme en cellulose/ papier de Kraft pour satisfaire l’instinct naturel de nidification et offrir un confort optimal et une sécurité pour les souris. Après les prélèvements ou immunisations qui sont faits après anesthésie gazeuse ( 5 à 6 min), les souris seront placées dans leur cage chauffée sous lumière chauffante pour que l’animal ait suffisamment chaud au réveil. A chaque prélèvement, l’animal sera pesé et observé pour être sûr de sa bonne santé. Une fiche d’observation sera remplie afin d’assurer un suivi de l’état des animaux et de prendre les mesures adaptées (surveillance accrue, apport de nourriture gélifiée) le plus précocement possible. Si ces mesures sont insuffisantes, et que l’état de l’animal ne s’améliore pas ou se dégrade, il sera euthanasié avant la mise à mort prévue initialement.

Choix des espèces

La femelle souris est un modèle très proche de la femme en termes de placentation et d’échanges de cellules foeto-maternelles ou gémellaires pendant la grossesse. C’est également un bon modèle pour le suivi d’une réponse immune. De plus, il est possible d’utiliser des souris de génétique différente, ce qui nous permet de tracer et d’évaluer le rôle de ces cellules semi-étrangères (acquises pendant la grossesse) dans les maladies autoimmunes. Pour comprendre où vont ces cellules semi-étrangères en condition normale, non pathologique, et comment elles évoluent au cours du temps, les animaux sont étudiés à diférents stades de développement après sevrage : à 3 à 4 semaines de vie, au stade jeunes adultes (

455 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 20 d'entre elles et modéré pour 435. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales de rein ou de côlon, boit pendant une vingtaine de jours une eau contenant un traitement au goût amer, reçoit quatre à six injections et subit trois prélèvements sous anesthésie. Le porteur attend du traitement qu'il lève la résistance aux immunothérapies et écrit qu'un succès chez la souris pourrait être transposé aux essais cliniques. Sur le remplacement, il conclut que l'expérimentation animale est "indispensable" et qu'aucune méthode alternative n'existe.

Objectifs

Une grande partie des patients atteints de cancer du rein résistent aux immunothérapies utilisées en cliniques. Cette résistance peut être due en partie à une interaction entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires, qui provoque l’inhibition de la réponse immunitaire anti-tumorale. Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique, dans 2 modèles de cancers (rein et colorectal), d’un traitement qui va empêcher cette interaction et permettre ainsi de ré-activer le système immunitaire. En établissant différents modèles précliniques tumoraux de souris reproduisant cette interaction, il sera possible de tester l’efficacité de ce traitement, associé ou non à une immunothérapie déjà utilisée en clinique.

Bénéfices attendus

Le succès du traitement chez la souris pourrait être transposé aux essais cliniques chez l’homme et ainsi améliorer l’efficacité des thérapies actuelles dans le cancer du rein et colorectal.

Procédures

1x injection de 1 minute sur souris anesthésiées ; 1x administration de médicament par voie orale dans l’eau des biberons sur environ 20 jours; 4-6x injections de traitements sur souris vigiles de moins de 1 minute chacune; 3x prélèvements sous anesthésie générale de moins de 5 minutes chacun.

Impact sur les animaux

-Les différentes injections causent un stress et douleur légère de courte durée -Le traitement dans l’eau des biberons peut altérer la consommation d’eau ou de nourriture à cause de son goût amer. -La contention des souris peut induire un stress léger et de courte durée -Le développement de la tumeur peut altérer l’aspect physique et le comportement et induire une douleur modérée liée à la présence de la tumeur . - Le prélèvement peut entraîner un stress et douleur légère de courte durée

Devenir

Mise à mort pour analyses

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement tumoral. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthode alternative n'existe.

Réduction

Certains paramètres expérimentaux ont déjà été déterminés par des études précédentes publiées. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les injections et les prélèvements sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. Tous les traitements sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal, ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées et sont déjà testés en cliniques chez l'homme. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteint d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

La souris est choisie car le système immunitaire et le microenvironnement tumoral partage des similarités avec l’homme. De plus, les modèles de cancer murins, les outils et techniques d’analyses sont disponibles. Des souris adultes de 8 semaines seront utilisées car à cet âge, leur système immunitaire est mature.

Amputées d'un fragment de queue entre sept et dix jours pour connaître leur génotype, 772 souris génétiquement modifiées entrent ensuite dans un protocole de trois mois, douze injections hebdomadaires pour les unes, quatre-vingt-dix administrations quotidiennes pour les autres, une chirurgie d'une heure sous anesthésie pour d'autres encore. 492 relèvent d'un niveau de souffrance léger et 280 d'un niveau modéré. La lignée perd spontanément neurones et synapses à partir de six mois, et le porteur prévoit de tuer les souris à ce moment précis, au début de la perte, avant que leur état général ne se dégrade visiblement. Toutes sont tuées, celles qui servent à l'évaluation des traitements pour prélever leur cerveau, les autres parce que leurs modifications génétiques interdisent de les replacer ou de les réutiliser.

Objectifs

Au cours de la maladie d’Alzheimer, des pertes de neurones et de synapses, les connexions entre les neurones, se produisent dans le cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Ainsi, des traitements visant à réduire ces pertes pourraient protéger contre les déficits cognitifs. Une autre des caractéristiques de la maladie d’Alzheimer est l’agrégation d’un peptide appelée bêta-amyloïde en plaques qui vont s’accumuler de façon anormale dans le cerveau. Les traitements actuels visent à réduire leur quantité, mais ils ne permettent que de freiner l’évolution de la maladie, pas de la stopper. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de ces traitements sur les pertes de neurones et de synapses chez souris génétiquement modifiées, modèle murin de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

On estime que plus de 850 000 personnes sont affectées par la maladie d’Alzheimer en France, avec une espérance de vie de 8 à 12 ans à partir du moment où le diagnostic est établi. Le mécanisme des pertes de neurones et de synapses dans la maladie d'Alzheimer est encore très mal connu. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre l’implication du peptide bêta-amyloïde dans ces mécanismes. A plus long terme les résultats obtenus pourraient orienter vers de nouvelles pistes pour l’amélioration des traitements existant.

Procédures

Dans le cadre de l’élevage de souris génétiquement modifiées modèles de maladie d'Alzheimer nous réaliserons une biopsie chez l’ensemble des souriceaux (une fois, vigile, durée de moins d’une minute par animal) pour déterminer leur patrimoine génétique. Des souris recevront une injection hebdomadaire pendant 3 mois d’un traitement pharmacologique (12 injections maximum, vigile, durée de moins d’une minute par animal). D’autres souris recevront une administration quotidienne d’un autre traitement pendant 3 mois également (90 administrations maximum, vigile, durée de moins d’une minute par animal). Enfin des souris auront une chirurgie unique sous anesthésie générale, avec une prise en charge analgésique adaptée. Cette chirurgie durera une heure et sera faite une seule fois. Toutes les souris seront euthanasiées en fin de période de maintien par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une légère et brève douleur lors du prélèvement de l’extrémité de la queue pour déterminer leur patrimoine génétique. Il existe un risque rare de saignement suite au geste. Les souris génétiquement modifiées que nous utilisons dans ce projet développent spontanément une perte de neurones et de synapses avec l'âge, mais elles seront euthanasiées au début de cette perte. La contention des souris nécessaire pour les manipulations (administration et injection) peut entrainer du stress. Les administrations et injections pourront entrainer une légère et brève douleur ou un risque d'irritation de l'œsophage lié à la répétition des administrations. La chirurgie sera associée à un risque de douleurs et d’inconfort post-opératoire. L’anesthésie générale nécessaire pour la réaliser entrainera des risques d’hypothermie et de sécheresse oculaire ainsi qu’un risque rare d’arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Toutes les souris utilisées pour l’évaluation des traitements seront euthanasiées afin de prélever leur cerveau pour analyser les effets obtenus. Les souris non utilisées pour ces évaluations seront euthanasiés soit pour des analyses post-mortem de la pathologie soit car il ne sera pas possible de les replacer ou les réutiliser du fait de leurs modifications génétiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet le mécanisme de la neuro-dégénérescence dans la maladie d’Alzheimer n’est pas connu. Or les modèles animaux de la maladie d’Alzheimer sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de neurones et de synapses adultes au sein d’un organisme et donc d’évaluer l’effet des traitements utilisés dans la maladie d’Alzheimer sur la neurodégénérescence.

Réduction

Au cours du projet nous estimons que nous utiliserons au maximum 772 souris. Nous n’utiliserons que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour maintenir notre lignée, réaliser les procédures expérimentales, et réaliser des analyses nécessitant seulement la collecte de tissus post-mortem. De plus, le nombre d’animaux utilisés pour les procédures expérimentales est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux ayant été établie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des composants de nidification et des bâtonnets à ronger. Une observation quotidienne des animaux est effectuée. En cas d’anomalie celle-ci sera déclarée à la structure chargée du bien-être animal (SBEA), au vétérinaire et à notre équipe afin de mettre en place une prise en charge adaptée (soins ou euthanasie si nécessaire). Des points limites sont définis pour chaque procédure et ils seront respectés afin de prendre en charge les animaux et éviter toute souffrance. Les souris que nous utilisons dans ce projet présentent une perte de synapses et de neurones à partir de l’âge de 6 mois, elles seront euthanasiées à ce moment-là donc au début des pertes, avant que cela n’engendre un impact visible sur leur état général. De plus pour l’élevage nous n’utiliserons que des mâles pouvant développer ces signes afin de favoriser une bonne prise en charge des petits par leur mère. Le prélèvement d’un fragment de queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera de la plus petite taille possible. Il s’agit d’un geste rapide et parfaitement maitrisé. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un reprélèvement était nécessaire il sera réalisé au niveau de l’oreille de l’animal et n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie avec une analgésie adaptée. La température des animaux sera maintenue tout au long de leur anesthésie et un gel oculaire sera appliqué pour éviter toute sécheresse oculaire. Nous réaliserons un suivi rapproché en post-opératoire afin d’évaluer l’état de l’animal et adapter sa prise en charge.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car il s’agit d’un modèle largement utilisé en recherche pour modéliser les pathologies humaines. Son patrimoine génétique est bien connu et nous disposons des outils nécessaires pour le modifier permettant de créer et étudier de nombreux modèles de maladies humaines. Pour la maladie d’Alzheimer nous disposons d’un modèle génétiquement modifié déjà existant qui permet de reproduire les pertes de synapses et neurones observées chez l’humain, nous permettant dans le contexte de ce projet d’évaluer l’impact de traitements sur ces pertes. Le prélèvement pour déterminer les modifications génétiques portées par les souriceaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux. Les traitements visant à prévenir les pertes de neurones et de synapses seront commencés à 3 mois, avant que ces pertes ne soient détectées, et leurs effets seront analysés à 6 mois, quand les pertes sont significatives.

140 souris vont être utilisées, 80 tuées dans l'établissement et 60 proposées à d'autres chercheurs ou enseignants, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 20 d'entre elles et modéré pour 120. Les souriceaux sont tatoués et amputés d'un fragment de queue à huit jours, puis enchaînent huit tests comportementaux jusqu'à l'âge de trente jours. Ceux qui portent les deux copies de la mutation développent un déficit congénital en vitamine B12, des troubles cognitifs, des retards neurologiques et des malformations cardiaques, avec une espérance de vie inférieure à six mois. Le porteur qualifie pourtant l'amputation de la queue de geste "aucunement douloureux" et écrit que le stress des tests s'arrête dès le retour en cage.

Objectifs

Une nouvelle maladie liée à la vitamine B12 a été découverte en Europe et aux États-Unis. Elle s’appelle la « pathologie épicobalamine C ». Elle peut causer des problèmes graves chez les nouveau-nés, comme des troubles du cœur, une anémie (manque de globules rouges) et des problèmes neurologiques (liés au cerveau et aux nerfs). Cette maladie est due à un problème causé par un gène voisin de celui impliqué dans l’utilisation de la vitamine B12, c’est donc un effet indirect. Les scientifiques ne savent pas encore exactement pourquoi cela arrive chez l’humain, mais ils pensent que cela pourrait être lié au stress (comme le stress oxydatif). En 2024, des souris génétiquement modifiées ont été créées pour reproduire cette maladie. En 2025, des scientifiques en France ont commencé à élever ces souris pour observer leurs symptômes (comportement, cœur, sang, cerveau, etc.). Les souris porteuses de la maladie sont croisées entre elles pour obtenir des petits avec ou sans la maladie. Certaines souris recevront un traitement pour « réparer » le gène défectueux et voir si leurs symptômes disparaissent. Cette étude, menée en collaboration entre deux établissements utilisateurs situés sur le même campus, aidera à mieux comprendre la maladie et à trouver des solutions pour les humains touchés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont la compréhension du dysfonctionnement provoquée par la mutation et la découverte de cibles thérapeutiques qui permettraient d'améliorer la prise en charge des patients. Les animaux porteurs des 2 exemplaires de la mutation traités avec le médicament devraient retrouver un aspect et un comportement normal, sans altération du métabolisme de la vitamine B12.

Procédures

Une partie des femelles gestantes (5 souris) sera traitée avec un médicament à faible dose administré par ingestion volontaire grâce à un mélange alimentaire avec du lait concentré sucré, très appétissant pour les souris, afin d’induire la recombinaison génique chez les embryons. Cette prise alimentaire du médicament ne durera quelques secondes. Le tatouage et le prélèvement d'un petit bout de queue chez les souris âgées de 8 jours (120 souris) sont réalisés en moins de 2 minutes afin de procéder à l'identification des souris. L’enchainement des 8 tests comportementaux sera réalisé tout au long de la vie des souriceaux dès l’âge de 8 jours et jusqu’à 30 jours, et chaque test ne dure que de 2 à 5 minutes maximum. Ces tests sont basés sur une observation des animaux (66 souris) libres de leur déplacement afin de tester leurs capacités d'apprentissage, de mémorisation, de coordination locomotrice et d'interactions sociales.

Impact sur les animaux

Les souris homozygotes mutants portant l’épimutation étudiée du gène Prdx1 ont un phénotype proche de celles déficientes pour le gène MMACHC, une souche que nous avons déjà étudiée par ailleurs. La conséquence est un déficit congénital en vitamine B12 qui induit des troubles cognitifs, des retards de développement neurologique et des malformations cardiaques, donc une fragilité physique chez les animaux d’intérêt et une espérance de vie à la baisse, inférieure à 6 mois. Par ailleurs, les souris subiront un geste invasif au moment du prélèvement tissulaire d’un fragment distal de queue (

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront utilisés afin de générer un effectif suffisant pour permettre de réaliser l'étude expérimentale qui sera basée sur l'utilisation d'animaux porteurs des deux exemplaires de la mutation. Les souris dites hétérozygotes (un seul exemplaire de la forme mutante et non mutante) issus des différents croisements et présentant un génotype sans intérêt pour l'étude, seront proposées à d'autres chercheurs et enseignants pour un replacement éventuel. Toutes les autres souris (femelles génitrices, descendants présentant les 2 exemplaires mutants ou non mutants) seront étudiées et mises à mort dans l'établissement utilisateur.

Remplacement

Les études humaines in vitro sur cultures cellulaires ont donné des informations sur les mécanismes moléculaires liant les mutations entre les 2 gènes d'intérêt mais ne permettent d’établir un lien clair entre stress cellulaire et déclenchement ou maintien de ces mutations, ni d’en comprendre les conséquences physiopathologiques. Ainsi, les études nécessitent un modèle in vivo intégrant les dimensions métaboliques, comportementales, inflammatoires et hormonales. A ce jour, aucune approche in vitro ou in silico ne permet de reproduire ces interactions de manière fonctionnelle et intégrée. Une approche sur animal entier est donc indispensable pour étudier ces mécanismes dans leur globalité

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire aux phases expérimentales suivantes est déterminé à l’aide d'un logiciel spécialisé en tenant compte de différents facteurs afin de déterminer les effectifs nécessaires et suffisants pour obtenir des données statistiques fiables. Les souris mutantes auront un comportement et un métabolisme bien différent des autres, ce qui nous indique qu'un effectif de 11 animaux par groupe d'étude sera nécessaire. Ainsi, en se basant sur des portées de 6 souris, 5 femelles gestantes traitées avec du tamoxifène devraient suffire pour générer 11 mâles et 11 femelles qui ne devraient plus avoir la mutation grâce au traitement tamoxifène (100% de la portée), tandis que 15 femelles gestantes sans traitement tamoxifène généreront 11 mâles et 11 femelles mutants et 11 mâles et 11 femelles non mutants. Ce protocole expérimental impliquera donc 20 génitrices (5+15) et 120 descendants (30+90).

Raffinement

Les souris sont élevées et manipulées dans un établissement utilisateur d’animaux à des fins scientifique ayant un statut sanitaire bien contrôlé. Le transport des animaux entre les deux EU se fait à pied car les établissements sont situés sur le même campus, à quelques dizaines de mètres de distance. Les cages sont placées dans des sacs noirs isothermes, et en période de froid (température inférieure à 15°C), deux blocs chauffants sont placés dans le sac afin de maintenir une chaleur suffisante pendant la durée du transport (moins de 5 minutes). Le traitement au tamoxifène sera réalisé grâce à une prise volontaire des souris en diluant ce produit dans du lait concentré. Pendant la gestation les souris seront pesées 2 fois par semaine pour suivre l’augmentation du poids corporel et la bonne santé de l’animal. Chez les descendants, la biopsie d’un fragment de queue sera réalisée selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables stress/douleurs, couplée à une anesthésie locale au moment du prélèvement. Les animaux seront ensuite surveillés quelques minutes pour vérifier la reprise d’une activité motrice normale. A l’issue de chaque test comportemental, les souris retournent dans leur cage d’élevage en présence de leurs congénères et sont laissées quelques minutes sous la surveillance de l’expérimentateur afin de contrôler leur bon état de santé (motricité, exploration, interactions). Des points limites ont été fixés en accord avec la structure chargée du bien-être animal afin de garantir la préservation du bien-être animal tout au long du protocole.

Choix des espèces

Ce projet nécessite la génération et la gestion d’un modèle murin génétiquement modifié porteur d’une séquence humaine qui n’existe pas chez la souris. La souris constitue l’espèce modèle de référence pour ce type d’approche, en raison de sa facilité de reproduction, de la disponibilité d’outils génétiques adaptés et à la validation internationale des protocoles métaboliques et comportementaux. L’utilisation d’un modèle portant la séquence mutante est indispensable pour reproduire le contexte génétique observé chez l’humain et évaluer ses conséquences physiopathologiques. La lignée utilisée ici a été spécifiquement développée pour reproduire le contexte génétique humain de façon ciblée. Les adultes reproducteurs seront utilisés à maturité sexuelle (8 semaines d’âge) pour réaliser les accouplements nécessaires à la production des portées expérimentales tout au long du projet. Les mutations seront recherchées à l'âge de 8 jours, à partir d’un prélèvement de queue , puis sevrés à J21, avec un suivi du comportement à l'âge de 3 jours jusqu'à 30 jours, puis finalement mis à mort à l'issue de ces tests.

Une partie des 780 rats utilisés est aveugle, issue d'une lignée dont la rétine dégénère comme dans la rétinite pigmentaire humaine. 580 relèvent de procédures d'un niveau de souffrance léger et 200 d'un niveau modéré, tous sont tués et leurs yeux comme leurs cerveaux prélevés. Les uns reçoivent une injection dans les deux yeux, les autres une injection dans l'aire visuelle du cerveau au cours d'une chirurgie de trente minutes, suivie pour la moitié d'entre eux d'un enregistrement cérébral pouvant durer trois heures sous anesthésie. Le porteur annonce 780 rats et renvoie, pour seule justification de ce chiffre, à un calcul de puissance fondé sur des études passées.

Objectifs

La rétinite pigmentaire (RP) et le glaucome sont parmi les maladies les plus fréquentes menant à la cécité. Le développement de méthodes pouvant assurer la restauration d’une vision utile tout en couvrant cette variété de pathologies reste un défi majeur. Les stratégies de restauration visuelle par des techniques novatrices appelés optogénétiques et sonogénétique reposent sur l’expression de protéines sensibles à la lumière ou aux ultrasons, dans les structures du système visuel. Dans ce projet, nous traiterons différentes structures : la rétine et les aires visuelles du cerveau Ces nouvelles techniques sont de plus en plus utilisées aujourd’hui pour trouver denouvelles alternatives thérapeutiques et permettre de « redonner » la vision » à des patients aveugles. Pour cela nous allons tester différentes protéines photosensibles ou mécanosensibles. Ces constructions seront administrées dans les tissus cibles grace à des vecteurs non pathogènes pour l’Homme et l’animal. Nous étudierons dans ce projet l’efficacité de nos constructions dans l’activation des neurones cibles de la rétine et du cerveau .

Bénéfices attendus

En France, 0,12 pour cent de la population (80 000 personnes) souffre de cécité et 2 pour cent (1,3 million de personnes) souffre de malvoyance Notre projet comporte des stratégies d’amélioration de la thérapie au niveau de l'œil. Le but du projet étant de tenter de redonner une vue avec une acuité suffisante pour pouvoir vivre de manière autonome à l’aide de technologies innovantes. La comparaison des résultats entre stimulation lumineuse pour l’optogénétique et par ultrason pour la sonogénétique sera également un atout majeur, apportant un bénéfice direct de combiner ces tests et trouver la meilleure thérapeutique.

Procédures

Dans cette étude, nous réaliserons deux types d'interventions chirurgicales, oculaires et cérébrales. Ces interventions chirurgicales sont pratiquées sur deux groupes d'animaux différents. Elles seront réalisées comme suit : Chirurgie oculaire : injection dans l’oeil de particules sélectionnées, sous anesthésie générale et analgésie. Durée de l’intervention : 10 minutes ; une fois par animal pour les deux yeux. Études ; Observation du fond d'œil par des techniques optiques, sous anesthésie générale. Durée : 10 minutes ; jusqu’à quatre fois par animal. Chirurgie cérébrale : injection dans l’aire visuelle du cerveau de particules sous anesthésie générale et analgésie. L’intervention dure 30 minutes par animal et est réalisé une seule fois. Études ; La moitié des animaux de ce groupe subissent des enregistrements cérébraux pendant que leur cerveau est stimulé par la lumière ou le son. La durée d’une mesure est de 180 minutes (au maximum) sous anesthésie et analgésie. La mesure est réalisée une seule fois par animal, expérience.

Impact sur les animaux

La manutention des animaux peut engendrer un leger stress. Les injections peuvent engendrer une légère douleur au moment de l’introduction de l’aiguille. Il y a un léger risque d’hypothermie et de défaillance cardiovasculaire lors des anesthésies générales. Suite aux chirurgies de l’œil, il existe un faible risque d’une brève hémorragie localisée et d’inflammation de l’œil. Il existe un risque de douleur postopératoire. Suite aux chirurgies au niveau du cerveau, il existe un petit risque d’ouverture des points de suture dans les 24 heures qui suivent la chirurgie. L’animal pourra aussi éprouver de la gêne momentanée vis-à-vis de points de sutures. Tous ces risques aussi rares soit-il peuvent créer un stress physique sur les animaux et engendrer une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les yeux et les cerveaux des animaux seront prélevés post mortem pour des analyses complémentaires, ce qui justifie l’euthanasie.

Remplacement

Avant de mener des expériences sur des animaux, nous testons les protéines dans des cultures cellulaires. Nous testerons préalablement nos constructions virales sur des organoïdes rétiniens in vitro. Parallèlement, nous développons une plateforme d'organoïdes rétiniens pour le criblage viral. Cependant, Les mécanismes physiologiques de diffusion des particules virales dans l’œil et le cerveau ainsi que leur pénétrance dans les tissus et la pénétrance de ces particules dans la rétine, ne peuvent être observés que dans un organe dans son ensemble. De même, les mécanismes physiologiques de diffusion des particules utilisés pour une diffusion dans le cerveau ne peuvent être observés que dans des cerveaux fonctionnels. L’utilisation de l’animal est donc indispensable dans notre étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir obtenir suffisamment de données statistiquement significatives et atteindre l’objectif scientifique fixé ci-dessus ; il a été défini grâce a un calcul de puissance statistique se basant sur des études passées utilisant une technique similaire. Les résultats seront quant à eux analysés avec des outils statistiques adaptés. Nous prévoyons d’utiliser 780 rats

Raffinement

Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation (minimum 5 jours). Les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. L’atmosphère est contrôlée pour les conditions d’hébergement (température et hygrométrie stable). Nous utilisons de la litière de peuplier dépoussiérée de 2 mm en vue de limiter la poussière qui pourrait etre irritante pour les yeux. Lors de la procédure d’imagerie, les animaux bénéficieront d’une anesthésie gazeuse. Pour les enregistrements d’électrorétinogramme, une anesthésie fixe et locale de la cornée sera administrée et les animaux seront placés sur une table chauffante. Les chirurgies se feront dans le respect de l’asepsie, les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant. Ils bénéficieront d’une analgésie, d’une anesthésie générale et d’une anesthésie locale adapté aux actes. Suite à la chirurgie, le bien-etre des animaux est surveillé quotidiennement. Une signalétique indiquant le type d’intervention permet une surveillance plus adapté en fonction des actes réalisés. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rat car c’est un modèle très largement utilisé pour l’exploration de la perception sensorielle. C’est un animal qui nous permettra de tester de nombreuses combinaisons et d’obtenir des résultats prédictifs sur l’efficacité des molécules candidates. Nous avons choisi un modèle de référence de rat aveugle. Ce modèle a une dégénérescence des cellules rétiniennes comparable à celle de l’Homme dans le cas d’une rétinite pigmentaire qui nous permettra d’avoir des résultats pertinents Notre deuxième modèle est un modèle courant de rat souche commerciale, non aveugle. Les animaux commerciaux seront agés de 9 semaines, les animaux aveugles seront agés de 36 semaines au début des études. À cet age, la structure cérébrale et rétinienne sont matures, et la dégénérescence rétinienne est complète pour le modèle aveugle