Procédures modérées

Administrés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou nasale jusqu'à 120 fois pour certains, 14 080 souris et rats vont être utilisés dans des études de toxicité, tous tués à l'issue pour analyser leurs organes. Ces procédures d'un niveau de souffrance modéré visent à évaluer l'innocuité de nouveaux candidats médicaments avant tout passage chez l'humain. Le porteur mentionne des points limites qui déclenchent la mise à mort anticipée des animaux dont l'état se dégrade. L'effectif, le plus élevé du lot, est présenté comme "adapté des recommandations de l'OCDE", sans que le total soit autrement justifié.

Objectifs

L’évaluation toxicologique de nouveaux candidats médicaments est une étape clé dans leur processus de développement. Ce projet vise donc à évaluer le profil toxicologique de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’avancer dans la caractérisation de nouveaux candidats médicaments en s’assurant de leur innocuité chez l’animal avant toute administration chez l’Homme.

Procédures

1) L’administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d’une minute par animal pendant la durée de l’étude pourra être réalisée via différentes voies d’administrations : - par voie orale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) - par voie intraveineuse (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 14 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intrapéritonéale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intramusculaire (une administration pour la procédure 1) – par voie sous cutanée (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) – par voie intranasale sous anesthésie gazeuse a l’isoflurane (1 administration pour la procédure 1) 2) De 1 à 3 prélèvements sur 24h pourront être réalisés jusqu’à 2 fois dans l’étude avec un volume total ne dépassant pas 15% du volume sanguin de l’animal avec un temps de récupération de 2 semaines minimum. Le prélèvement pourra être fait à la veine submentale, saphène (sans anesthésie). Les prélèvements se feront sur une durée de deux minutes par animal.

Impact sur les animaux

On pourrait observer des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés à la voie d’administration des composés ou aux composés testés en eux même avec pour certains animaux l’atteinte potentielle des points limites. Des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés aux prélèvements sanguins pourraient également être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour évaluer l’innocuité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne permet de rendre compte des potentiels effets indésirables in vivo des nouveaux candidats médicaments. De plus l’évaluation de la toxicité potentielle des candidats médicaments est une étape clé de leur développement.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’études, et donc le nombre d’animaux utilisés, les différents candidats médicaments seront préalablement testés in vitro. Ne rentreront dans les études in vivo que ceux ayant montré le plus d’efficacité ainsi qu’une absence de toxicité dans ces tests in vitro. Le nombre d’animaux utilisés par étude sera réduit au maximum de manière à pouvoir observer de potentiels effets indésirables et est adapté des recommandations de l’OCDE associées à la réalisation d’étude toxicologique chez le rongeur. Pour la détermination des doses maximales tolérées un groupe vehicule unique sera utilisé tout au long du processus afin de réduire le nombre d’animaux. De plus, l’administration des composés se fera séquentiellement ce qui permettra d’utiliser le nombre minimum d’animaux possible en n'incluant pas les reste des animaux prévu si le composé est toxique. Enfin, les études de toxicité chronique avec récupération ne se feront que sur les dose maximales testées la encore afin de réduire le nombre d’animaux. De ce fait, ce projet permet de réduire le nombre de composés qui seront testés dans les études d'éfficacité nécessaires aux études précliniques.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. Enfin, si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort éthiquement et de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance animale, de la nourriture pourra être ajoutée dans les cages sous forme de nourriture humidifiée. Les animaux seront sous anestésie chimique lors des administration intratrachéales. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton, feuilles de cellulose, …).

Choix des espèces

L’évaluation toxicologique des candidats médicaments est une étape clé de leur développement qu’il est nécessaire de réaliser dans au moins une espèce de rongeurs. Pour cela ce projet sera réalisé chez la souris et/ou chez le rat qui sont les deux espèces de rongeurs les plus utilisées pour des études de toxicologie. Cela permettra également de définir les doses maximales pouvant être utilisées dans les futures études d’efficacité qui seront réalisées dans ces deux espèces. L’âge des animaux utilisé dans ce projet sera choisi en fonction de l’indication du nouveau candidat médicament.

260 poulets de chair d'une lignée à croissance lente vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une partie subit à 24 jours la pose chirurgicale de deux capteurs de température, l'un dans l'abdomen, l'autre sous la peau, avant une exposition en fin d'élevage à cinq jours de vagues de chaleur artificielles oscillant entre 32°C le jour et 25°C la nuit. Le porteur décrit les risques de la chirurgie, le stress des prises de sang et de l'exposition à la chaleur, jusqu'aux comportements de picage aggravés par la chaleur. Les carcasses seront valorisées commercialement, sauf celles des dix animaux ayant porté les capteurs.

Objectifs

Le projet vise à évaluer, l’impact de la « programmation thermique embryonnaire » appliquée sur des œufs embryonnés de futures reproductrices, sur leur descendance, des poulets de chair produits terminaux, exposés à des vagues de chaleur. Cette étude sera conduite sur une race à croissance lente adaptée aux conditions d'élevage en plein air, qui devrait être plus sensible aux vagues de chaleur potentielles. La capacité de la progéniture de ces femelles reproductrices soumises ou non à un traitement thermique à résister aux défis de la chaleur sera évaluée à l'aide d'indicateurs physiologiques et comportementaux qui ont été validés comme mesures de la robustesse ou de la résilience dans des environnements fluctuants et sous-optimaux. LE PROJET SE DEROULERA DANS L'EU 1, SAUF LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE PAR VOIE CHIRURGICALE QUI SE DEROULERA DANS L'EU 2.

Bénéfices attendus

L’objectif général du projet est de proposer des stratégies de programmation thermique afin de renforcer la robustesse des animaux et leur capacité d’adaptation à des vagues de chaleur. L’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale réalisée sur les œufs de futures reproductrices qui est relativement peu étudiée. La connaissance de l’impact d’une programmation thermique d’œufs de futures reproductrices et la transmission potentielle à sa descendance d’une meilleure capacité à s’adapter à des vagues de chaleur n’a jamais été étudié, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être de la progéniture.

Procédures

Une prise de sang sera réalisée à l’éclosion sur 30 femelles futures reproductrices et 32 descendants. Ces animaux sont ensuite mis à mort pour des prélèvements de tissus. Une prise de sang sera également réalisées sur les femelles avant leur entrée en ponte (1 seule prise de sang) et sur les descendants avant, pendant et après le coup de chaleur (3 prises de sang sur les mêmes individus pour suivre leur réponse aux vagues de chaleur et leur capacité d’adaptation / récupération). La pose de capteurs internes de suivi de température sera réalisée par voie chirurgicale sur des poulets à l’âge de 24 jours (2 capteurs/poulet, l’un en intrapéritonéale et l’autre en sous cutané). Les animaux seront sous anesthésie générale dont de délai prévisionnel est de 30 min, le délai de chirurgie est estimé entre 15 et 20 min par poulet. L’application de vagues de chaleur sur tous les descendants débutera 10 jours avant la mise à mort pour une durée de 5 jours. Les fluctuations oscilleront entre 32°C pendant 6h en journée et 25°C durant 6h la nuit. Ces deux plages de température sont séparées de 6h durant lesquelles la température augmente ou diminue graduellement. DANS L'EU1 SERONT EFFECTUEES TOUTES LES EXPERIMENTATIONS SAUF L'ANESTHESIE GENERALE ET LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE QUI SERONT REALISES DANS L'EU2. LES ANIMAUX SERONT TRANSPORTES DEUX FOIS ENTRE LES DEUX EU (5 MIN PAR TRAJET).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer de la douleur et de l’inconfort en cas d’insuffisance d’action de l’anesthésie. Cette dernière peut provoquer une dépression respiratoire, même si le risque est limité avec une anesthésie gazeuse. Dans nos conditions, l’apparition de complications post-opératoires est peu probable mais reste possible (risques d’infection, de rejet du capteur, ou de réponse inflammatoire excessive). La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’exposition aux vagues de chaleur peut engendrer des conséquences physiologiques potentielles (augmentation de la température corporelle, déséquilibre hydro-électrolytique, réduction de l’appétit, etc.) ainsi que des conséquences comportementales (agitation, apathie, ou comportements visant à éviter la chaleur comme regroupement en zones fraîches ou tentatives d’échappement). L’élevage des animaux au sol en groupe peut entraîner des comportements agressifs, voire de picage, qui peuvent être exacerbés lors d’épisodes de chaleur. LE TRANSPORT ENTRE LES DEUX EU PEUT ENGENDRER UN LEGER STRESS.

Devenir

Suite aux prélèvements de sang à l’éclosion, les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus d’intérêt métabolique. A la fin de la procédure de chirurgie, les animaux seront replacés dans leur parquet d'origine avec leurs congénères jusqu'à la fin de l'élevage du lot. Tous les autres animaux inclus dans le protocole seront mis à mort en fin d’élevage de la bande. Les carcasses de ces animaux pourront être valorisées commercialement à l’exception de celles des 10 animaux qui auront porté les capteurs de température.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ou in vitro n'est capable de reproduire l'effet de la programmation thermique chez l'espère cible, le poulet de chair, et son impact durant toute la durée de vie de l'animal (physiologie, comportement, performances, etc..).

Réduction

Au niveau du volet des reproductrices, 15 femelles par traitement (N=30) seront prélevés (sang + tissus) à l’éclosion pour évaluer l’impact de la programmation thermique sur la physiologie de l’animal à l’état initial. De nouveaux prélèvements de sang seront réalisés avant l’entrée en ponte des femelles (N=15 par groupe) pour évaluer le statut physiologique et métabolique des femelles. Le nombre d’animaux expérimentaux choisi est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes en intégrant la variabilité interindividuelle attendue en termes de poids, composition corporelle, statut métabolique et robustesse. Nous avons volontairement choisi une puissance statistique, car en absence de challenge type conditions d'élevage dégradées ou coup de chaleur plus tard dans la vie, nous nous attendons à avoir des effets de faible amplitude mais variés. Sur la base des travaux antérieurs réalisés, les marqueurs sanguins de stress oxydatifs sont les plus variables. L’unité statistique pour les dosages de biomarqueurs sera l’animal.

Raffinement

Dès l’éclosion, les descendants seront élevés au sol sur copeaux, avec accès à l’eau et à l’aliment ad libitum, dans un bâtiment à environnement contrôlé (température, ventilation, lumière). Ce mode d’élevage favorise les interactions sociales. Les animaux seront visités au moins deux fois par jour (week-ends et jours fériés inclus). En cas de signes de détresse ou de maladie (cf grille d’atteinte des points limites), un isolement en infirmerie ou une euthanasie pourra être envisagé. L’environnement sera enrichi avec des rubans colorés à picorer et un perchoir. Lors du coup de chaleur, les pipettes seront vidangées trois fois par jour pour garantir une eau fraîche. En période de forte chaleur, une attention particulière sera portée à la baisse effective des températures pour assurer des phases de récupération. Raffinement des prises de sang : elles seront réalisées par deux opérateurs expérimentés, avec une contention calme et précise. Une garde sur l’aiguille limitera les risques de pénétration excessive et de lésions cérébrales. Raffinement de la chirurgie : une prémédication sera administrée 15 min avant l’anesthésie gazeuse (bréchet). Chaque animal sera endormi individuellement. Une antibioprophylaxie débutera la veille de l’intervention et se poursuivra pendant 3 jours post-opératoires. En cas de signes de douleur (prostration, anorexie…), une dose d'antalgique pourra être donnée. Les animaux seront isolés durant 5 jours post-opératoires en infirmerie, avec suivi individuel selon une grille dédiée à l’évaluation post-chirurgicale. Cette procédure a été testée avec succès dans un essai précédent chez des poulets à croissance lente : aucune mortalité, réintégration au parquet d’origine après traitement, et croissance équivalente aux témoins. LE TRANSPORT DES ANIMAUX DE L'EU 1 VERS L'EU 2 AVANT L'OPERATION ET LEUR RETOUR DE L'EU 2 VERS L'EU 1 SERA REALISE PAR UN TECHNICIEN FORME DANS UN VEHICULE AGREE POUR LE TRANSPORT D'ANIMAUX VIVANTS. LE TRAJET EST TRES COURT (MOINS DE 5 MIN).

Choix des espèces

Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur. Après éclosion, les animaux seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à 30 semaines pour la partie « reproducteurs », et jusqu’à environ 75 jours pour la descendance. L’évaluation de l’intérêt d’une programmation thermique embryonnaire lors de l’incubation se fera tout au long de la durée d’élevage des animaux sur les 2 générations (reproductrices et descendants). La mise en place de capteurs de température interne sera faite sur les descendants. L’opération se fera sur des animaux de 24 jours afin qu’il puisse supporter l’acte de chirurgie et permettre de suivre les paramètres du capteur tout au long de la vie de l’animal. Par ailleurs, l’épisode artificiel de forte chaleur sera appliqué en fin d’élevage, 10 jours avant mise à mort, âge où les animaux sont les plus sensibles aux variations/pics température. Il convient donc de suivre les critères zootechniques, comportementaux et sanitaires pendant toute la durée de l’élevage. Les poulets seront élevés de leur jour d’éclosion jusqu’à l’âge classique de mise à mort pour un élevage d’animaux labels (75 jours max).

Jusqu'à huit anesthésies, une électroporation par micro-choc électrique et huit injections par animal: 395 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les sites d'injection. Le porteur reconnaît les douleurs liées aux injections et aux électroporations ainsi que le stress des anesthésies répétées. L'objectif est de comparer des formulations d'ARNm afin d'en retenir les plus efficaces avant un éventuel essai chez l'humain. La régénération plus rapide de la peau promise aux patients reste une perspective, alors que les atteintes aux souris sont immédiates.

Objectifs

Dans ce projet, plusieurs candidats médicaments ont déjà été sélectionnés à l’issue de nos travaux précédents, et le modèle murin d’administration par électroporation (micro-choc électrique permettant au candidat de rentrer plus facilement dans les cellules cibles) est désormais développé et validé. L’objectif est maintenant de tester et de comparer différentes formulations de ces candidats, notamment selon une approche dose-réponse, afin d’identifier les formulations les plus efficaces et les mieux tolérées. Cette étape est indispensable pour affiner la sélection des meilleurs produits avant leur caractérisation finale et la conception d’un futur essai clinique chez l’homme..

Bénéfices attendus

Les problèmes de peau, pour certaines qui sont des pathologiques chroniques, handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La régénération des tissus de la peau est un processus très long et qui parfois ne permets pas totalement de retrouver l’état d’origine de la peau. Les patients attendent donc aujourd’hui des traitements efficaces et rapides. L’injection de nos composés pourrait permettre de régénérer la peau plus rapidement et plus longuement avec seulement une injection.

Procédures

Anesthesies pour injection, mesure bioluminescence et éléctroporation, au maximum 8 anasthesies de 10-15 min. 1 injection intradermale (durant anesthesie) : 30 sec pendant l'anesthesie. 7 injections intraperitoneale maximum : 30 sec 1 éléctroporation (injection d'aiguilles en intradermale, suivi d'une onde éléctrique) : 30 sec pendant l'anesthesie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les nuisances attendues sont : - les douleurs associés aux injections (dans ce projet une injection intradermale puis maximum 7 intrapéritonéales) - Les douleurs et stress liés aux électroporations - Stress lié aux anesthésies multiples

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, dans ce projet, les sites d’injection seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le remplacement des animaux n’est pas possible dans ce projet car les objectifs nécessitent l’étude d’un organisme vivant intégrant l’ensemble des paramètres physiologiques. L’évaluation de l’administration intradermique par électroporation, de la tolérance locale et systémique, de la bio distribution, de l’expression spatio-temporelle de l’ARNm et de l’efficacité biologique des candidats implique des interactions complexes entre la peau, le système immunitaire, la vascularisation et les processus de réparation tissulaire. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des modèles in vitro, ex vivo ou in silico. Les modèles alternatifs (ou ces constructions/formulations ont été évaluées) permettent uniquement d’étudier des mécanismes isolés (cytotoxicité, pénétration, expression locale), mais pas la réponse globale de l’organisme ni l’efficacité fonctionnelle des composés. De plus, le suivi par bioluminescence de l’expression de la luciférase nécessite un organisme vivant. Ainsi, l’expérimentation animale constitue une étape indispensable de validation préclinique.

Réduction

Nous utiliserons donc nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à des résultats statistiquement significatifs . Nous réaliserons lors la première section, des expérience sur seulement 3 animaux, afin de vérifier la bonne tolérance et la validité des constructions réalisées.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergées en groupe de 3 ou 5 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. L’injection intradermique sur le flanc est réalisée sous anesthésie par un expérimentateur entraîné. De plus, pour les étapes d’imagerie, les animaux seront également anesthésiés. Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine si l’étude est plus longue). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient le plus propres possible. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.

Choix des espèces

Bien qu’il existe actuellement des modèles de peaux humaines reconstruites ou encore des modèles ex vivo permettant de tester la toxicité ou la pénétration de certains produits ou vecteurs, ceux-ci ne prennent pas en compte la totalité des conditions physiologiques de l’Homme. Ainsi, après vérification in vitro de la non-toxicité (sur peau reconstruite notamment) des vecteurs d’intérêt dans les différentes formulations testées, nous souhaitons tester leur efficacité en condition « la plus proche de l’Homme » en reproduisant au mieux la complexité (avec des interactions cellulaires, une vascularisation et une réponse immunitaire similaires) de la peau humaine. De plus, la réponse immunitaire et l’inflammation est un facteur clé dans l’évaluation de l’efficacité des constructions/formulations (élimination plus ou moins rapide par l’organisme). Souris swiss femelles âgées de 7 semaines en début d’expérimentation et 9-14 semaines maximum en fin d’expérimentation. La peau de ces animaux est parfaitement stable et n'évolue plus à cet age.

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre applications sur la peau, une instillation dans le nez et une injection dans l'abdomen, pour tester un inhibiteur protéique dans un modèle d'inflammation pulmonaire. Le porteur décrit un inconfort de l'ordre de la minute lors de l'instillation nasale et une douleur passagère au point d'injection. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico ne permet d'étudier l'inflammation pulmonaire dans un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester une nouvelle stratégie thérapeutique dans un modèle d'inflammation pulmonaire chez la souris Balb/c. Cette nouvelle stratégie est basée sur l’injection d'un inhibiteur de nature protéique d'une protéine impliquée dans la sécrétion de mucus et dans la contraction musculaire au niveau pulmonaire.

Bénéfices attendus

Nous travaillons sur la fonction respiratoire et il n’existe pas d’alternative pour étudier les phénomènes mis en jeu dans l'inflammation pulmonaire au niveau d’un organisme entier mis à part les modèles animaux.

Procédures

4 applications percutanées (1 fois par semaine, durée 1 min) 1 application intra nasale (durée 1 min) 1 injection intra péritonéale (durée 30s)

Impact sur les animaux

La phase de challenge par voie intra nasale peut contribuer à un inconfort temporaire (ordre de la minute maximum). Lors de l’injection intrapéritonéale une légère douleur passagère peut être ressentie au point d'injection.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de la procédure pour les besoins expérimentaux

Remplacement

Les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de l'inflammation pulmonaire, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.

Réduction

Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les paramètres immunologiques (fréquences des cellules inflammatoire) (T-test, bilatéral, risque α à 0.05 et une puissance de test de 0.9) conduit à utiliser un minimum 8 souris/groupe. Le même calcul concernant la résistance des voies aériennes mesurée par FlexiVent nous conduit a un minimum de 8 souris/groupe.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi des signes généraux et le suivi des points limites sont effectués au quotidien afin de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle reconnu dans le cadre des études de l'inflammation du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. De plus, nos modèles ont été établis sur cette espèce. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de ces souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les protocoles d’induction d'inflammation seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines. L’âge de la souris pouvant modifier la réponse de type inflammation, nous utilisons des sujets sevrés. Ceux-ci sont néanmoins jeunes afin que le phénomène de sénescence ne puisse pas interférer avec les mécanismes étudiés dans le cadre de protocole de longue durée.

Greffées d'une tumeur sous la peau puis traitées par cinq injections, 1 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur, mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, peut occasionner gêne et douleur. L'objectif est de tester des anti-inflammatoires censés relancer les défenses immunitaires contre le cancer. Le porteur situe les retombées à l'identification possible de nouvelles cibles, sans engagement de résultat.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires. Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’un épuisement des globules blancs lors du cancer. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer l’impact d’un traitement bloquant l’action de ces protéines sur l’épuisement des réponses immunitaires et la croissance tumorale

Bénéfices attendus

A terme, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Une injection de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie générale (1 minute/souris). Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation. 5 injections de traitements (30 sec/souris).

Impact sur les animaux

Les injections de traitement et l'injection de cellules tumorales peuvent entraîner un stress et une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort.

Remplacement

La complexité de l’étude du cancer nécessite d’avoir recours à un organisme vivant pour étudier l’ensemble des acteurs impliqués dans ce phénomène. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes plus simples ne nécessitant pas d’animaux, et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés afin d’avoir un nombre minimal d’animaux pour pouvoir obtenir des résultats exploitables. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi très régulièrement par le responsable du projet.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies biologiques sont conservées entre la souris et l'Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus pour envisager ensuite d’éventuels traitements chez l’Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la biologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 10 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

Un choc électrique, une restriction alimentaire et des injections de toxines directement dans le cerveau : 2 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les toxines détruisent des voies nerveuses pour reproduire la maladie de Parkinson, avant l'implantation d'une canule cérébrale et une série de tests comportementaux. Le projet cherche des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur deux établissements. Le porteur reconnaît que ces modèles ne reproduisent que partiellement la maladie humaine, ce qui le conduit à en combiner plusieurs.

Objectifs

Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.

Scarifiées à la queue pour des prélèvements répétés de gouttes de sang, 1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations reproduisant un diabète ou des tumeurs du pancréas et reçoivent des injections activant la mutation, des gavages, un régime gras et des tests de glycémie répétés. Certains fœtus sont traités à travers la mère gestante. Le porteur qualifie ces souris de "modèles uniques au monde" et affirme que la mesure de la glycémie ne peut se faire qu'in vivo.

Objectifs

Récemment, une nouvelle mutation d’une protéine pancréatique a été décrite dans plusieurs familles de patients. Cette mutation cause un diabète chez les hommes, et des tumeurs du pancréas chez les femmes. Pour le moment, son mode d’action n’est pas connu. Les hommes touchés développent un diabète particulier différent du diabète de type 1 auto-immun et du diabète de type 2 lié à l’obésité. Les femmes présentent quant à elles des tumeurs particulières du pancréas issues des cellules productrices d’insuline, entrainant une sécrétion excessive et incontrôlée d’insuline qui provoque des hypoglycémies répétées (baisse anormale du sucre dans le sang). L’objectif de ce projet est donc de rechercher les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de ces troubles du pancréas. A plus long terme, ces recherches devraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi de proposer de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un grand intérêt pour le traitement à la fois du diabète et du cancer du pancréas puisque les mutations de notre protéine d’intérêt ont été décrites dans ces deux pathologies. Sur le plan clinique, nous prévoyons des retombées potentielles à moyen et à plus long terme. En effet, le diabète est une maladie métabolique complexe qui implique souvent plusieurs gènes. Cette hétérogénéité rend difficile son étude. Il existe aussi certaines autres formes de diabète qui n’impliquent qu’un seul gène. Elles sont présentes soit chez des nouveau-nés, soit chez de jeunes adultes. Dans ce contexte, il est plus facile de comprendre les mécanismes à l’origine de la maladie et ainsi de progresser vers des voies thérapeutiques. C’est le cas du facteur que nous étudions au laboratoire, qui est produit dans le pancréas. Une seule mutation du gène codant pour ce facteur suffit à déclencher un diabète. Nous pensons donc que notre étude chez la souris pourra permettre non seulement de décrire une nouvelle forme de diabète monogénique, mais aussi d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’élaborer de nouveaux traitements. Le facteur que nous étudions est également associé à l’apparition de tumeurs pancréatiques chez des patients. Son rôle biologique reste toutefois encore mal compris à ce jour. Notre projet permettra d’élucider son implication dans le cancer pancréatique qui représente une cause de mortalité importante.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des souris qui portent des mutations représentatives de celles portées par des patients qui présentent soit un diabète, soit des tumeurs du pancréas. Ces souris seront examinées à différents stades de la vie, allant de la vie fœtale à des stades âgés. Certains des animaux utilisés nécessitent l’injection d’un composé pour activer la mutation étudiée. Les animaux adultes vigiles (éveillés) porteurs de cette mutation inductible, recevront une ou cinq administrations de la substance par injection soit une (ou trois) administrations par voie orale, soit une administration par application d’une solution sur la peau (1 ou 3 fois) (durée de chaque geste inf à 30sec). Des fœtus seront également traités en administrant le composé chez la mère gestante : soit par gavage (1 à 2 doses), soit par injection (1 ou 2 fois) soit dans l’alimentation pendant une semaine (durée de chaque geste inf à 30 sec). Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la régulation de la glycémie. Pour cela, ils auront un prélèvement, puis ils seront placés à jeun pendant 16 heures, et auront un second prélèvement (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Ils recevront une injection (10 sec) suivie de 5 prélèvements d’une goutte de sang durant les 2h suivantes. Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris. Dans le cadre d’une étude longtudinale, ce lot de souris pourra être soumis à ce type d’injection puis prélèvement au maximum 3 fois lors de ces 2 tests (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Enfin, certaines souris seront exposées à un régime riche en graisse pendant des durées allant de 14 jours à 3 mois. Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la glycémie, impliquants une injection et 7 prélèvements d’une goutte de sang, Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris (durée de chaque prélèvement inf à 10sec).

Impact sur les animaux

Les modèles générés pour l’étude n’ont pas de phénotype dommageable. Les nuisances attendues sont celles liées aux différentes injections. Ces nuisances correspondent à l’introduction d’une aiguille et donc à des douleurs associées à une injection classique. Celles-ci sont de courte durée, et ces différentes injections ne provoquent aucun autre effet secondaire à l’exception de la nuisance de l’injection. Les souris exposées à régime particulier (riche en graisse) peuvent présenter une prise de poids sans conséquence sur le bien-être des animaux. Après injection, nous nous attendons à observer une légère hyperglycémie (élévation de la glycémie) à la fois chez les mâles et les femelles lorsque des tests métaboliques seront effectués. Sur la base de nos premiers résultats, l’hyperglycémie devrait être moindre chez les femelles. Néanmoins, cette hyperglycémie modérée ne sera probablement que passagère, et une glycémie normale sera rétablie après quelques heures. Pour les mesures de glycémie, le premier prélèvement étant réalisé après une légère scarification de la queue et les suivants après le retrait de la croûte, ce geste entraînera une douleur légère et de courte durée. Cela prend 10 à 20 secondes maximum répétées 5 fois sur 120 minutes, les temps de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les souris que nous utilisons sont des modèles uniques au monde. Les paramètres physiologiques, c’est à dire les mesures de glycémie et d’insulinémie ne peuvent être effectuées que in vivo. De plus, il existe un dialogue entre les différents organes de la souris. Cette interaction entre les différents organes impliqués dans le métabolisme glucidique de la souris -le foie, le muscle et le tissu adipeux- ne peut être analysée que dans un organisme entier vivant. Néanmoins, pour limiter les investigations in vivo, un maximum d’informations proviendra d’analyses sur des tissus fixés et d’analyses bio-informatiques in silico à partir de prélèvement post-mortem. Nous effectuerons également des expériences in vitro quand cela est possible pour limiter les expériences in vivo. Par exemple, la culture d’îlots de Langerhans prélevés sur des souris post-mortem, un animal pouvant générer environ 100 îlots qui sont ensuite stimulés in vitro..

Réduction

Nos modèles représentent des modèles uniques au monde pour étudier les pathologies trouvées chez l’homme. En effet, ce sont le seul moyen d’étudier les effets d’une mutation, qui chez l’homme, déclenche un diabète ou un insulinome. Les stratégies d’accouplement ont été optimisées afin de réduire le nombre d’animaux.. D’après la littérature, nous avons défini la taille de nos groupes pour permettre des résultats concluants et faire des analyses statistiques. Pour réduire le nombre de souris utilisées, une étude pilote sera réalisée pour certains modèles de souris avant de définir les conditions optimales. Une approche Go/No Go sera ensuite appliquée afin de déterminer si les inductions pour activer la mutation étudiée se feront au stade fœtal ou adulte. Cela signifie que nous ferons un choix de la méthodologie utilisée selon les résultats préliminaires obtenus. Si nous constatons que l’activation de la mutation est satisfaisante pendant le développement foetal, nous choisirons plutôt cette méthode et nous n’activerons pas la mutation au stade adulte.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine du diabète et de la cancérologie, les animaux seront suivis régulièrement afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score sera également mise en place. Dans le cadre des procédures, toutes les manipulations seront réalisés pour garantir le meilleur confort à l’animal. En particulier, lors des expériences impliquant des injections, les animaux seront observés de façon quotidienne, de manière à surveiller l'état général de la souris. Pour rappel, nous n’attendons pas de nuisance particulière, hormis une légère hyperglycémie chez les mâles après injection. De plus, les animaux aux stades fœtal et nouveau-né seront utilisés uniquement pour des prélèvements d’organes après injection. Aux stades plus tardifs, les tests réalisés ne nécessitent pas d’utiliser des analgésiques pour ces tests.

Choix des espèces

Nos modèles murins sont uniques et la souris est le seul organisme existant qui puisse permettre d’étudier l’effet de mutations de notre protéine d’intérêt. Etant donné son cycle de reproduction et sa parenté biologique avec l’homme, la souris constitue un modèle de choix pour mener nos expériences. De plus, il est accepté et validé par la communauté internationale que la souris est pleinement appropriée pour les études du métabolisme que nous proposons. Les stades de développement étudiés sont les suivants : fœtus (E18,5), 1 mois, adultes de 3 mois, 6 mois, 12 mois, 18 mois, et 24 mois. En effet, on sait que notre protéine d’intérêt peut jouer un rôle dans la différenciation des cellules pancréatiques pendant la vie fœtale, mais aussi sur leur prolifération pendant la période postnatale jusqu’à un mois.. Nous souhaitons donc déterminer si la mutation étudiée affecte ces cellules à ces stades. Plus tard, cette mutation pourrait déclencher un diabète ou une tumeur pancréatique, selon le stade de la vie de la souris. En effet, on sait que ce type de phénotype est très dépendant du métabolisme et de l’âge de la souris). C’est pour cette raison qu’il est impératif d’étudier le phénotype des souris à ces différents stades de la vie adulte.

Pour constituer une collection d'échantillons de référence, 320 volailles, des poules, des dindes et des canards, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque oiseau est infecté par de l'influenza aviaire ou un paramyxovirus déposé dans les yeux et les narines, puis subit jusqu'à dix-huit écouvillons et trois prises de sang sur vingt jours. Le porteur indique que l'effectif suit la norme réglementaire, sans analyse statistique. Les animaux sont mis à mort pour récolter un volume maximal de sérum, l'un des objectifs du projet, et pour éviter la dissémination des virus.

Objectifs

L'influenza aviaire et la maladie de Newcastle sont des maladies à virus des oiseaux dont l'impact sanitaire et économique est majeur dans les élevages de volailles. La surveillance et la lutte contre ces maladies reposent sur l'utilisation de méthodes de diagnostic de laboratoire, dont les performances doivent être préalablement déterminées et contrôlées. L'objectif de ce projet est de constituer une collection d'échantillons biologiques, d'origine et de caractéristiques connues, qui serviront à ces contrôles. Le recours aux animaux est la seule façon d'obtenir des échantillons représentatifs des prélèvements qui sont faits en pratique quand la présence de la maladie est suspectée en élevage. Les échantillons collectés pendant le projet sont des écouvillons et des sérums prélevés chez quatre espèces de volailles (poule, dinde, canard de Barbarie et canard mulard) après inoculation contrôlée avec un virus de l'influenza aviaire ou un paramyxovirus aviaire.

Bénéfices attendus

L’utilisation de méthodes d’analyses de laboratoire est obligatoire pour confirmer officiellement un cas d’influenza aviaire ou de maladie de Newcastle. Les échantillons (écouvillons et sérums) récoltés à différents stades de l'infection chez les volailles seront utilisés pour les contrôles préalables de conformité des méthodes de diagnostic de l'influenza aviaire et de la maladie de Newcastle. Ils pourront également être utilisés en routine afin d'harmoniser, au niveau national, la mise en oeuvre de ces mêmes méthodes.

Procédures

Les animaux sont soumis aux prélèvements suivants sur animaux vigiles. Au maximum, 9 écouvillons oropharyngés, 9 écouvillons cloacaux et 3 prises de sang seront réalisés par animal, sur un pas de temps de 20 jours au maximum. L'infection des animaux est effectuée par application d'une goutte de suspension de virus dans chaque oeil et chaque narine, en début de procédure. Au cours de chaque intervention, les prélèvements (3 types au maximum pour une date donnée) sont réalisés séquentiellement sur l'animal : la durée de chacun des actes ne dépasse pas une minute pour une durée totale d'immobilisation et de contention d'environ 3 à 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Suite à l’inoculation des virus, les signes cliniques suivants pourront être observés le plus souvent isolés (et éventuellement associés dans les cas les plus prononcés) : symptômes respiratoires, digestifs et symptômes généraux pouvant exceptionnellement amener l’animal à arrêter de s’alimenter ou à rester prostré. Toutefois, les virus sélectionnés ne provoquent généralement que des signes de gêne respiratoire modérée. Par ailleurs, chez les canards, l’infection est fréquemment inapparente. Les manipulations et la contention des animaux nécessaires à la réalisation des prélèvements, ainsi que ces derniers, peuvent également avoir un impact négatif sur le bien-être des animaux. Toutefois, ces nuisances sont de faible intensité et très limitées dans le temps. Le risque d’hématome suite aux prises de sang est réduit : le personnel est formé à cet acte et applique systématiquement un point de compression pour éviter la formation de l’hématome.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des oiseaux utilisés au cours d'une procédure, qui ont donc été infectés et auront produit des anticorps, est nécessaire pour procéder (au moment de cette mise à mort) à la récolte d'un volume maximal de sang permettant d'obtenir un volume final de sérum, dont la collecte est l'un des objectifs du projet, lui aussi maximal. Par ailleurs, cette mise à mort est également nécessaire pour prévenir tout risque de dissémination des virus inoculés.

Remplacement

Le modèle d’infection des oiseaux par voie naturelle permet l’obtention d’échantillons dans lesquels le virus recherché ou les anticorps produits par l'animal infecté sont naturellement associés de manière représentative à la matrice du prélèvement lui-même. Ces prélèvements, d’origine contrôlée et de caractéristiques a priori connues, sont ceux qui se rapprochent le mieux des prélèvements collectés en élevage pour le diagnostic ou la surveillance des maladies des volailles, ce qui les rend pertinents pour le contrôle des méthodes d'analyse.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés correspond à l’effectif standard (fixé par la réglementation) prélevé sur le terrain, pour le diagnostic de l‘influenza aviaire ou de la maladie de Newcastle, et il est adapté pour optimiser le volume total de sérum collecté en fin de procédure. Par ailleurs, ce projet ne nécessite pas d'analyse statistique.

Raffinement

Les souches de virus utilisés seront de préférence sélectionnées parmi des souches qui n’étaient pas associées, lors de leur détection, à des formes sévères de maladie : ceci permet de limiter l’intensité prévisible des signes cliniques que pourraient manifester les animaux inoculés lors de la procédure. De plus, un examen clinique au moins quotidien permet de suivre l’évolution des signes cliniques éventuels : il est prévu, dès la première détection éventuelle de signes cliniques prononcés, d’augmenter la fréquence des observations à deux fois par jour afin de détecter précocemment toute aggravation. Des points limites stricts et spécifiques de la procédure expérimentale associée à ce projet seront également appliqués. Les animaux sont logés dans des parcs ou des volières, en respectant les normes d'élevage adaptées (superficie et densité d'animaux, points d'alimentation et d'abreuvement), par groupes d'animaux de même espèce, bénéficiant ainsi d'un enrichissement social. Ils sont nourris et abreuvés à volonté.

Choix des espèces

Les espèces d'oiseaux choisies (poule, dinde, canard de Barbarie et canard mulard) correspondent à quatre espèces de volailles parmi les plus couramment élevées en France, et à ce titre les plus fréquemment prélevées dans le cadre des plans de lutte et de surveillance pour l'influenza aviaire et la maladie de Newcastle. Les animaux seront inoculés entre 4,5 et 6,5 semaines d'âge. Cette classe d'âge correspond à la période médiane ou finale de l'élevage de production pour les différentes filières concernées. Par ailleurs, le choix de cette tranche d'âge représente un compromis entre une bonne réceptivité à l'infection (celle-ci étant généralement plus importante, plus l'animal est jeune) et une moindre sensibilité à la maladie.