Procédures modérées

Retenus parce que leur cœur ressemble à celui de l'humain, 100 chiens, 500 porcs et 500 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie, parfois la création d'une lésion cardiaque, pour tester des dispositifs implantables comme des pacemakers ou des défibrillateurs, avec une douleur postopératoire pouvant durer plusieurs jours. Les animaux sont ensuite mis à mort pour l'examen des tissus et l'usure des implants. Le porteur affirme que l'essai sur "organisme entier" est "incontournable" et relève d'une obligation réglementaire.

Objectifs

Les dispositifs implantables chirurgicalement sont des dispositifs médicaux conçus pour être insérés en totalité ou partiellement dans le corps humain, ou à remplacer une surface épithéliale, grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer après l'intervention de façon temporaire ou définitive, pour soutenir les fonctions d'organes ou de tissus spécifiques, surveiller les activités physiologiques ou administrer des médicaments. La rythmologie étudie les troubles du rythme cardiaque, d'importants progrès ont été réalisés en matière d'explorations électrophysiologiques ou d'électrophysiologie interventionnelle. Le défibrillateur automatique implantable (DAI), ainsi que le stimulateur multisite, sont devenus des outils thérapeutiques incontournables avec un élargissement progressif des indications. La fibrillation atriale (FA) est une autre entité pathologique, son incidence augmente dans la population générale, indépendamment de l'âge. L'ablation est décrite comme un traitement de la FA, c'est une technique médicochirurgicale visant à détruire les zones du myocarde et tissus arythmogènes, à l’aide d’un cathéter d’ablation. La pose de pacemakers est aujourd’hui un acte parfaitement maîtrisé et codifié, qui nécessite toujours recherche et développement pour améliorer les performances électriques, augmenter l’espérance de vie des pacemakers, diminuer les risques de délogements, de fractures de sondes, d’infection, etc... La stimulation biventriculaire, est une autre application en rythmologie qui vise à corriger les contractions non coordonnées des ventricules, souvent observées chez les patients avec une insuffisance cardiaque sévère. L'évaluation et le developpement de nouvelles méthodes et dispositifs en rythmologie par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasive demandent une phase de recherche/développement préalable. Les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées au modèle animal en reproduisant fidèlement le contexte clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire visé pour les futures applications humaines. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour les valider selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour améliorer leur tolérance et éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients avec des durées d'hospitalisation et de convalescence réduites.

Procédures

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour améliorer leur tolérance et éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients avec des durées d'hospitalisation et de convalescence réduites.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim, lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive, - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale avec prise en charge multimodale de l'analgésie per, et post-opératoire avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés avec ajout d'anesthésiques locaux pour certains actes chirurgicaux, la protection et la surveillance des plaies, la surveillance du reveil d'anesthésie dans des espaces calmes et spécialement aménagés avec évaluation et scoring de la douleur réguliers, ou la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens spécialement formés supervisés par des Véterinaires).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur l'animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateaux techniques opératoires et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge multimodale de la douleur sont systématiquement appliqués. Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées ayant reçu une autorisation AT1 délivrée par la DDPP, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antidérapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est validé par un Vétérinaire. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme pertinenets et appropriés à cette fin. - L'anatomie et la physiologie cardiaque des ovins, porcins et canins reproduisent fidèlement celles de l'Homme, - Le processus de cicatrisation chez les ovins, porcins et canins est similaire à celui observé chez l'Homme, - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements de chirurgie interventionnelle et d'imagerie standards tels qu'utilisés chez l'Homme, - Le modèle canin est le à présenter un auricule gauche avec ostium comme chez l’Homme. La fibrillation et la défibrillation sont plus faciles à entreprendre sur le chien et il existe un large corpus de publications pour les troubles de la conduction et la pose de pacemaker ou de défibrillateurs implantables chez cette espèce. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

Saignés et mis à mort dès l'éclosion pour une partie, opérés à 24 jours pour l'implantation de deux capteurs de température pour d'autres, 260 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La pose des capteurs se fait sous anesthésie, l'un dans l'abdomen, l'autre sous la peau. Tous sont ensuite exposés à des vagues de chaleur artificielles, jusqu'à 32°C six heures par jour pendant cinq jours, pour mesurer une résistance à la chaleur transmise par la mère. Les carcasses seront valorisées commercialement, sauf celles des dix animaux ayant porté les capteurs.

Objectifs

Le projet vise à évaluer, l’impact de la « programmation thermique embryonnaire » appliquée sur des œufs embryonnés de futures reproductrices, sur leur descendance, des poulets de chair produits terminaux, exposés à des vagues de chaleur. Cette étude sera conduite sur une race à croissance lente adaptée aux conditions d'élevage en plein air, qui devrait être plus sensible aux vagues de chaleur potentielles. La capacité de la progéniture de ces femelles reproductrices soumises ou non à un traitement thermique à résister aux défis de la chaleur sera évaluée à l'aide d'indicateurs physiologiques et comportementaux qui ont été validés comme mesures de la robustesse ou de la résilience dans des environnements fluctuants et sous-optimaux. LE PROJET SE DEROULERA DANS L'EU 1, SAUF LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE PAR VOIE CHIRURGICALE QUI SE DEROULERA DANS L'EU 2.

Bénéfices attendus

L’objectif général du projet est de proposer des stratégies de programmation thermique afin de renforcer la robustesse des animaux et leur capacité d’adaptation à des vagues de chaleur. L’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale réalisée sur les œufs de futures reproductrices qui est relativement peu étudiée. La connaissance de l’impact d’une programmation thermique d’œufs de futures reproductrices et la transmission potentielle à sa descendance d’une meilleure capacité à s’adapter à des vagues de chaleur n’a jamais été étudié, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être de la progéniture.

Procédures

Une prise de sang sera réalisée à l’éclosion sur 30 femelles futures reproductrices et 32 descendants. Ces animaux sont ensuite mis à mort pour des prélèvements de tissus. Une prise de sang sera également réalisées sur les femelles avant leur entrée en ponte (1 seule prise de sang) et sur les descendants avant, pendant et après le coup de chaleur (3 prises de sang sur les mêmes individus pour suivre leur réponse aux vagues de chaleur et leur capacité d’adaptation / récupération). La pose de capteurs internes de suivi de température sera réalisée par voie chirurgicale sur des poulets à l’âge de 24 jours (2 capteurs/poulet, l’un en intrapéritonéale et l’autre en sous cutané). Les animaux seront sous anesthésie générale dont de délai prévisionnel est de 30 min, le délai de chirurgie est estimé entre 15 et 20 min par poulet. L’application de vagues de chaleur sur tous les descendants débutera 10 jours avant la mise à mort pour une durée de 5 jours. Les fluctuations oscilleront entre 32°C pendant 6h en journée et 25°C durant 6h la nuit. Ces deux plages de température sont séparées de 6h durant lesquelles la température augmente ou diminue graduellement. DANS L'EU1 SERONT EFFECTUEES TOUTES LES EXPERIMENTATIONS SAUF L'ANESTHESIE GENERALE ET LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE QUI SERONT REALISES DANS L'EU2. LES ANIMAUX SERONT TRANSPORTES DEUX FOIS ENTRE LES DEUX EU (5 MIN PAR TRAJET).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer de la douleur et de l’inconfort en cas d’insuffisance d’action de l’anesthésie. Cette dernière peut provoquer une dépression respiratoire, même si le risque est limité avec une anesthésie gazeuse. Dans nos conditions, l’apparition de complications post-opératoires est peu probable mais reste possible (risques d’infection, de rejet du capteur, ou de réponse inflammatoire excessive). La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’exposition aux vagues de chaleur peut engendrer des conséquences physiologiques potentielles (augmentation de la température corporelle, déséquilibre hydro-électrolytique, réduction de l’appétit, etc.) ainsi que des conséquences comportementales (agitation, apathie, ou comportements visant à éviter la chaleur comme regroupement en zones fraîches ou tentatives d’échappement). L’élevage des animaux au sol en groupe peut entraîner des comportements agressifs, voire de picage, qui peuvent être exacerbés lors d’épisodes de chaleur. LE TRANSPORT ENTRE LES DEUX EU PEUT ENGENDRER UN LEGER STRESS.

Devenir

Suite aux prélèvements de sang à l’éclosion, les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus d’intérêt métabolique. A la fin de la procédure de chirurgie, les animaux seront replacés dans leur parquet d'origine avec leurs congénères jusqu'à la fin de l'élevage du lot. Tous les autres animaux inclus dans le protocole seront mis à mort en fin d’élevage de la bande. Les carcasses de ces animaux pourront être valorisées commercialement à l’exception de celles des 10 animaux qui auront porté les capteurs de température.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ou in vitro n'est capable de reproduire l'effet de la programmation thermique chez l'espère cible, le poulet de chair, et son impact durant toute la durée de vie de l'animal (physiologie, comportement, performances, etc..).

Réduction

Au niveau du volet des reproductrices, 15 femelles par traitement (N=30) seront prélevés (sang + tissus) à l’éclosion pour évaluer l’impact de la programmation thermique sur la physiologie de l’animal à l’état initial. De nouveaux prélèvements de sang seront réalisés avant l’entrée en ponte des femelles (N=15 par groupe) pour évaluer le statut physiologique et métabolique des femelles. Le nombre d’animaux expérimentaux choisi est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes en intégrant la variabilité interindividuelle attendue en termes de poids, composition corporelle, statut métabolique et robustesse. Nous avons volontairement choisi une puissance statistique, car en absence de challenge type conditions d'élevage dégradées ou coup de chaleur plus tard dans la vie, nous nous attendons à avoir des effets de faible amplitude mais variés. Sur la base des travaux antérieurs réalisés, les marqueurs sanguins de stress oxydatifs sont les plus variables. L’unité statistique pour les dosages de biomarqueurs sera l’animal.

Raffinement

Dès l’éclosion, les descendants seront élevés au sol sur copeaux, avec accès à l’eau et à l’aliment ad libitum, dans un bâtiment à environnement contrôlé (température, ventilation, lumière). Ce mode d’élevage favorise les interactions sociales. Les animaux seront visités au moins deux fois par jour (week-ends et jours fériés inclus). En cas de signes de détresse ou de maladie (cf grille d’atteinte des points limites), un isolement en infirmerie ou une euthanasie pourra être envisagé. L’environnement sera enrichi avec des rubans colorés à picorer et un perchoir. Lors du coup de chaleur, les pipettes seront vidangées trois fois par jour pour garantir une eau fraîche. En période de forte chaleur, une attention particulière sera portée à la baisse effective des températures pour assurer des phases de récupération. Raffinement des prises de sang : elles seront réalisées par deux opérateurs expérimentés, avec une contention calme et précise. Une garde sur l’aiguille limitera les risques de pénétration excessive et de lésions cérébrales. Raffinement de la chirurgie : une prémédication sera administrée 15 min avant l’anesthésie gazeuse (bréchet). Chaque animal sera endormi individuellement. Une antibioprophylaxie débutera la veille de l’intervention et se poursuivra pendant 3 jours post-opératoires. En cas de signes de douleur (prostration, anorexie…), une dose d'antalgique pourra être donnée. Les animaux seront isolés durant 5 jours post-opératoires en infirmerie, avec suivi individuel selon une grille dédiée à l’évaluation post-chirurgicale. Cette procédure a été testée avec succès dans un essai précédent chez des poulets à croissance lente : aucune mortalité, réintégration au parquet d’origine après traitement, et croissance équivalente aux témoins. LE TRANSPORT DES ANIMAUX DE L'EU 1 VERS L'EU 2 AVANT L'OPERATION ET LEUR RETOUR DE L'EU 2 VERS L'EU 1 SERA REALISE PAR UN TECHNICIEN FORME DANS UN VEHICULE AGREE POUR LE TRANSPORT D'ANIMAUX VIVANTS. LE TRAJET EST TRES COURT (MOINS DE 5 MIN).

Choix des espèces

Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur. Après éclosion, les animaux seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à 30 semaines pour la partie « reproducteurs », et jusqu’à environ 75 jours pour la descendance. L’évaluation de l’intérêt d’une programmation thermique embryonnaire lors de l’incubation se fera tout au long de la durée d’élevage des animaux sur les 2 générations (reproductrices et descendants). La mise en place de capteurs de température interne sera faite sur les descendants. L’opération se fera sur des animaux de 24 jours afin qu’il puisse supporter l’acte de chirurgie et permettre de suivre les paramètres du capteur tout au long de la vie de l’animal. Par ailleurs, l’épisode artificiel de forte chaleur sera appliqué en fin d’élevage, 10 jours avant mise à mort, âge où les animaux sont les plus sensibles aux variations/pics température. Il convient donc de suivre les critères zootechniques, comportementaux et sanitaires pendant toute la durée de l’élevage. Les poulets seront élevés de leur jour d’éclosion jusqu’à l’âge classique de mise à mort pour un élevage d’animaux labels (75 jours max).

3 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour élever une lignée reproduisant la sclérose en plaques sur deux établissements. Les animaux porteurs de la mutation peuvent développer une paralysie de la queue ou des membres et un lymphome qui comprime les poumons vers 7 à 8 mois. Une biopsie de moins de trente secondes sert à génotyper chaque animal vigile. Selon leur génotype, les souris sont expédiées vers l'autre établissement, gardées pour d'autres projets, ou mises à mort quand elles n'ont pas le génotype recherché ou atteignent les points limites.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire auto-immune (le corps attaque ses propres constituants) chronique du système nerveux central (cerveau, moëlle épinière et nerfs optiques). Elle se manifeste par des troubles moteurs, sensitifs, de l’équilibre, visuels… responsables à long terme d'un handicap. Elle touche 120000 personnes en France dont 3000 nouveaux cas par an. Dans la majorité des cas, les premiers symptômes apparaissent entre 25 et 35 ans. Des facteurs génétiques mais également des facteurs environnementaux prédisposent à la maladie. Les causes exactes de la sclérose en plaques restent inconnues à ce jour. L’objectif de ce projet est d’élever des rongeurs modèles pertinents pour l’étude de cette pathologie. Ces modèles peuvent développer spontanément ou via des altérations génétiques une ou plusieurs caractéristiques de la sclérose en plaques. Les animaux issus de ces développements seront utilisés afin d’étudier l’apparition et le développement de la sclérose en plaques mais également de tester de nouveaux traitements. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles murins, au plus proche de la maladie humaine, sont donc très pertinents pour l’étude de l’apparition et du développement de la sclérose en plaques mais également le développement de traitements pharmacologiques.

Procédures

Les animaux présentent un phénotype dommageable (modèle de sclérose en plaque). Une biopsie sera réalisée sur animal vigile afin de génotyper l’ensemble des animaux obtenus. Cette procédure ne durera pas plus de 30 secondes. En règle générale, une biopsie suffit pour établir le génotype de l’animal.

Impact sur les animaux

Une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies en vue du génotypage. En fonction des besoins et afin d’améliorer l’indice de productivité de la lignée, il pourrait être nécessaire d’héberger individuellement des mâles pour une période ne dépassant pas 7 jours avant qu’ils soient présentés aux femelles afin de mettre en place des accouplements. Cela pourrait générer un stress léger. 3,5 à 4% des animaux de la lignée peuvent développer à tout âge de façon spontanée une maladie neurodégénérative dont les signes cliniques vont d’une paralysie partielle ou légère de la queue (principalement à l'extrémité) ou des membres à une paralysie complète de la queue ou des membres. Les animaux porteurs de la mutation d’intérêt développent un lymphome dont l’apparition se fait à environ 7-8 mois. Ces lymphomes touchent environ 13,5% des animaux et sont caractérisés par un gonflement du thymus induisant une constriction des poumons à l’intérieur du thorax.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur soit utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes). Les animaux ne présentant pas de génotype d’intérêt pour la poursuite du projet seront mis à mort (pas d’autre utilisation possible).

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de maladies neurodégénératives, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux par nos collaborateurs. Le nombre d’animaux est déterminé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Les animaux porteurs de la mutation d’intérêt sont susceptibles de développer une maladie neurodégénérative de façon spontanée. L’apparition des symptômes signe du développement sous-jacent d’une maladie neurodégénérative entrainera la mise à mort de l’animal concerné. De plus, à partir de l’âge de 7-8 mois, ces animaux peuvent également développer un lymphome. Afin d’anticiper l’atteinte des points limites, les animaux porteurs de la mutation d’intérêt seront donc euthanasiés, au plus tard, lorsqu’ils auront 6-7 mois. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique et leur comportement selon une grille d’observation indiquant les points limites. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux. Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.

Une injection sous-cutanée puis douze prélèvements sanguins par animal, la contention au lasso étant reconnue comme douloureuse : 60 porcs mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'essai teste une molécule qui freine le développement testiculaire et l'odeur de verrat, présentée comme une alternative à la castration chirurgicale. Le porteur indique que la filière et les salaisonniers attendent une solution administrable en une seule fois. Faute d'autorisation de mise sur le marché, la viande de ces porcs ne peut être consommée et les animaux sont mis à mort.

Objectifs

Depuis 2022, la castration chirurgicale des porcs doit être réalisée exclusivement avec anesthésie locale en France. Les éleveurs doivent être formés. La castration chirurgicale est pratiquée aujourd'hui dans 48 % des élevages porcins français et des alternatives sont nécessaires. La production de mâles entiers est une solution, mais elle requiert la mise en place d'un cahier des charges à l'élevage et la détection fiable de l'odeur de verrat sur les carcasses en abattoir. Actuellement, cette détection repose sur l'odorat humain, seule technique disponible à ce jour en abattoir. Un obstacle majeur à l'utilisation de la viande issue de mâles entiers par les clients des abattoirs persiste, notamment en raison des difficultés de détection en abattoir, mais aussi pour les viandes aux caractéristiques technologiques moins avantageuses (porcs mâles entiers plus maigres). À ce jour, une technique immunologique existe, mais son utilisation par les éleveurs est jugée restrictive (elle nécessite deux injections dont la seconde sur des animaux lourds cinq semaines avant l'abattage). Une administration unique de la molécule à tester représente une alternative nouvelle et intéressante en production porcine, en alternative à la castration chirurgicale. Une étude pilote menée avec cette molécule a démontré une grande efficacité pour réduire le développement testiculaire et, par conséquent, la teneur en composés odorants responsables du développement des odeurs de verrat dans le gras. Ces résultats ont également mis en évidence un impact positif sur les performances des animaux traités. Les mesures de qualité de la viande n'ont révélé aucune anomalie. La formulation de la molécule doit être améliorée et la durée du traitement ajustée via une étude complémentaire.

Bénéfices attendus

La filière porcine est en attente de solution pour supprimer à terme la castration physique. Si la production de mâles entiers s'est développée et atteint 51 % de la production française elle progresse difficilement en lien avec la difficulté de la détection des odeurs de mâle entier sur chaîne d'abattage, de viandes très maigres ou de comportements déviant des mâles entiers (agressions et comportement de monte). D'autres alternatives comme l'immuno-castration sont possibles mais ne se développent pas à ce jour en lien avec la nécessité de faire 2 à 3 injections. L'administration d'une molécule en une seule pose constitue une piste intéressante pour les éleveurs et la filière. Cette étude permettra de préciser le protocole. Les éleveurs distributeurs et salaisonniers sont en attente de nouvelles solutions.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une injection sous cutanée et 12 prélèvements sanguins. Les durées de prélèvements sanguins seront limitées à maximum 30 secondes par animal.

Impact sur les animaux

L'administration du traitement sous ses différents formats par injection sous cutanée et les prises de sang avec contention au lasso sont douloureux et sont des effets indésirables sur les animaux. Concernant l'administration du traitement, la prise au lasso est nécessaire pour un bon positionnement pour l'injection du produit à tester. Elle est également nécessaire pour la bonne réalisation des prises de sang. Cette douleur de la prise au lasso suivie de la pose du traitement sera très rapide et réalisée par des vétérinaires la pratiquant avec du matériel dédié à cet effet. Le personnel d'élevage assurera la contention au lasso. Toutes les interventions seront limitées à une durée de moins de 30 secondes. Le faible nombre de porc par case (5 porcs) facilitera les manipulations.

Devenir

Les différents formats de la molécule testés dans cette étude ne disposent pas d'AMM pour l'espèce porcine, aussi les porcs ne peuvent être destinés à la consommation humaine et doivent être mis à mort.

Remplacement

L'expérimentation est indispensable pour définir le meilleur format de la molécule à administrer dans le futur par les éleveurs et ainsi que l'âge idéal d'injection avec le suivi rapproché sur la testostérone qui est un très bon indicateur de la fonction testiculaire. La vérification de l'effet sur le poids des testicules ainsi que la quantité de molécules odorantes de verrat dans le gras justifie un tel essai pour prouver l'efficacité de la forme testée et rassurer toute la filière jusqu'au consommateur. Le suivi zootechnique (Indice de consommation, Gain Moyen Quotidien) suivi en parallèle permettra de mesurer les effets induits par ces traitements sur les performances des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux mis en œuvre pour l'étude est réduit au minimum à 10 animaux par lot. Une étude préalable a été réalisée: la différence attendue pour le poids des testicules à l'abattage entre un groupe traité et le groupe témoin est de 1 kg. La taille d'échantillon requise pour atteindre une puissance de 80 % est de 10 sujets par groupe (efficacité, innocuité, pharmacocinetique et pharmacodynamique).

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions conventionnelles d'élevage de production. Les prises de sang sur les porcs à l'engraissement sont effectuées en veillant à ce que la durée de contention soient limitées au maximum (moins de 30 secondes par animal prélevé). Les personnes en charge des prises de sang sont en outre des personnes habituées à ce type de prélèvement et encadrés par un vétérinaire en charge de cette partie délicate du protocole. Les porcs seront euthanasiés après tranquillisation à la fin de l'essai sur place à l'élevage sans phase de chargement en camion, sans transport et attente à l'abattoir.

Choix des espèces

Les traitements étudiés visent à réduire le développement de la fonction testiculaire et en conséquence le risque d’apparition d’odeurs dans les carcasses de porcs. Ceci s’applique donc à des porcs mâles en phase de croissance à partir de 70 jours d’âge, pour des effets persistants jusqu’à leur abattage, vers 160 jours d’âge.

Pour entraîner des opérateurs aux gestes techniques, 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des injections, des prélèvements et des gavages répétés, gestes qui peuvent provoquer hématomes, hémorragies, perforation d'un organe ou fausse route pendant l'apprentissage. À la fin de chaque session, les souris sont mises à mort pour que les opérateurs s'exercent aux nécropsies. L'effectif repose sur le nombre de personnes à former, à raison de quatre souris par personne, sans aucun calcul statistique.

Objectifs

Les objectifs de ce projet de formation sont multiples : uniformiser les pratiques afin d'être le plus reproductible possible et raffiner les techniques pour fournir une qualité optimale dans les résultats expérimentaux sur souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont multiples : première approche des gestes techniques classiques, sensibilisation sur les bonnes pratiques, raffiner les techniques réduisant l'impact sur le bien-être animal et le stress, le matériel utilisé, les manipulations et l'harmonisation des savoir-faire afin d'être reproductible.

Procédures

Les souris auront des injections (3, 3min), des prélèvements (2; 3min) et des gavages (3 ; 3min).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux seront : 1) contention : stress de l'animal, augmentation fréquence cardiaque et respiratoire 2) prélèvements : stress de l'animal, hématome, hémorragie 3) injections : stress de l'animal, hématome, perforation d'un organe, hémorragie, gonflement de la cavité occulaire 4) gavage : stress de l'animal, fausse route, saignements de la cavité buccale. Ces nuisances ou effets indésirables ne sont pas possible à éviter du fait de la phase d'apprentissage de ceux-ci.

Devenir

A la fin de chaque session de formation, les animaux seront mis à mort en systématique pour permettre aux opérateurs de réaliser des nécropsies en vue de prélèvements d'organes.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de permettre aux personnes ayant déjà la formation niveau applicateur, de mettre en pratique les connaissances acquises. Des alternatives à l’utilisation d’animaux vivants ont été envisagées : travaux pratiques intéractifs, utilisation de poupées pour imiter la taille de l'animal, etc. Dans le cadre de la première approche des gestes techniques, il est nécessaire d'assurer une formation complémentaire technique et de suivi sur animal vivant. En effet, certains gestes techniques tels que les gavages ou les injections nécessitent l'utilisation d'animaux vivants afin d'avoir la dextérité et la sensibilité du geste (contention, fausse route, injection non maitrisée, etc.).

Réduction

Dans le cadre de la mise en place de ce projet, le nombre d'animaux aura été réduit au maximum. Le nombre d’animaux utilisés est estimé en fonction du besoin d’un nombre de personnes à former. Il est pris en compte d’éviter l'effet cumulatif des gestes techniques, en limitant le nombre de geste par animal. Il est calculé l'utilisation de 4 souris pour 1 personne formée. Il est prévu 5 sessions de formation sur 20 personnes par an, soit 200 personnes au total sur les 2 ans. Au total, 800 souris mâles et femelles seront utilisées à partir de 3 semaines minimum sans limite d'âge. Il est à noter que pour les animaux destinés à ce projet, il sera envisagé de récupérer les animaux destinés à la mise à mort de n'importe quel fond génétique. Aucune approche statistique n’a été réalisée, le nombre ayant été évalué par retour d'expérience et besoins terrain.

Raffinement

Les animaux utilisés seront des animaux destinés à la mise à mort. Ces animaux n'auront subit aucun geste mise à part le prélèvement pour génotypage (prélèvement à l'oreille). L'utilisation d'anesthésie gazeuse (anesthésie gazeuse par isoflurane en induction entre 3 et 4%) sera effectuée pour la réalisation d'un prélèvement submandibulaire avec des lancettes de taille adaptée. L'utilisation de canules souples de gavages permettra de limiter l'invasivité du geste, l'utilisation d'aiguilles de taille appropriées et enfin la mise à mort des animaux à la fin des sessions de formation permettant de former le personnel sur ce geste également. Pour chaque geste technique réalisé, les points limites spécifiques seront observés : - gavage : fausse route, étouffement - injection intra-péritonéale : convulsion, hématome - injection veine caudale : convulsion, hématome - injection sous-cutanée : hématome

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée sur le site. Il est nécessaire que la formation effectuée se fasse sur cette espèce. Aucune souche ne sera privilégiée afin de permettre aux personnes formées d'être opérationnelles sur l'intégralité des demandes et contraintes techniques et ainsi limiter le nombre d'animaux. Ils pourront être utilisés à partir de 3 semaines et sans limite d'âge cependant l'âge des animaux ne dépassera pas 8 mois.

1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inoculation sous anesthésie déclenche une infection urinaire aiguë ou chronique, suivie de prélèvements d'urine et de sang, de séances d'imagerie jusqu'à trois fois par semaine et d'administrations répétées de composés, pour tester de nouveaux anti-infectieux face à l'antibiorésistance. Le porteur signale une hématurie, de la léthargie et une perte de poids possibles pendant l'infection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la colonisation des voies urinaires et conclut que le recours à la souris reste "indispensable".

Objectifs

Les infections du tractus urinaire (ITU) représentent un enjeu majeur de santé publique, en raison de leur fréquence élevée, de leur tendance à la récidive, en particulier chez les patientes, et de l’augmentation préoccupante de la résistance aux antibiotiques. Dans ce contexte, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-infectieuses constitue un besoin médical prioritaire. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements anti-infectieux dans des modèles murins d’infections urinaires aiguës et chroniques. Ces modèles, largement décrits dans la littérature scientifique, permettent de reproduire de manière contrôlée les différentes phases de l’infection et d’étudier la dynamique bactérienne ainsi que la réponse aux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser l’évolution de l’infection urinaire dans des conditions aiguës (jusqu’à 6 jours) et chroniques (jusqu’à 4 semaines) après inoculation bactérienne et évaluer l’efficacité thérapeutique de composés candidats administrés par différentes voies (orale, sous-cutanée, intra-péritonéale ou intra-veineuse), en mesurant leur capacité à réduire la charge bactérienne. Les procédure permettront de suivre longitudinalement la progression de l’infection chez l’animal vivant grâce à une approche d’imagerie non invasive basée sur la bioluminescence bactérienne, permettant une évaluation quantitative et répétée. Une analyse de la distribution bactérienne et l’impact des traitements au niveau des organes cibles (vessie, urètre, reins) en fin d’étude sera effectuée. Ce projet permettra ainsi de générer des données précliniques essentielles pour identifier et caractériser de nouvelles molécules à potentiel thérapeutique contre les infections urinaires, contribuant à répondre à la problématique croissante de l’antibiorésistance.

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation urinaire réalisée sous anesthésie inhalatoire, comprenant deux administrations rapprochées effectuées lors d’une même séance (environ 10 minutes au total par administration). Cette intervention a lieu une seule fois par animal, dans les deux procédures. Des prélèvements d’urine seront réalisés sur animaux vigiles : 2 à 3 prélèvements sur une durée maximale de 6 jours pour le modèle aigu, et un prélèvement par semaine pendant 4 semaines pour le modèle chronique. Chaque prélèvement dure environ une minute et consiste en une collecte non invasive lors d’une miction spontanée. Les traitements expérimentaux seront administrés selon la voie choisie (orale, parentérale, topique ou intraveineuse), avec une fréquence maximale quotidienne ou biquotidienne selon la voie. Chaque administration dure quelques secondes à une minute. Une imagerie in vivo pourra être réalisée afin de suivre l’évolution de l’infection de manière non invasive. Cette procédure dure environ 5 à 10 minutes sous anesthésie et pourra être effectuée jusqu’à trois fois par semaine. Les animaux seront observés quotidiennement (une à deux fois par jour selon le modèle), avec une durée d’observation inférieure à une minute, afin d’assurer leur suivi clinique et leur bien-être. En fin d’étude, chaque animal sera soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde, suivie d’une euthanasie réglementaire et de prélèvements d’organes. Cette intervention dure environ 5 à 10 minutes. Un prélèvement sanguin sera effectué une fois par semaine sous anésthésie et l'intervention durera 5 à 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en œuvre dans ce projet peuvent entraîner des nuisances ou effets indésirables, principalement liés à l’induction de l’infection et aux administrations de traitements. L’instillation transurétrale, réalisée sous anesthésie, peut provoquer une irritation locale de l’urètre et de la vessie, ainsi qu’un inconfort transitoire au réveil. Ces risques sont limités par l’utilisation de matériel adapté et par du personnel formé. Dans le modèle aigu, une inflammation locale, une hématurie modérée et une altération transitoire de l’état général (léthargie, baisse d’activité) peuvent être observées. Dans le modèle chronique, les signes sont généralement plus modérés, avec une gêne persistante et une inflammation de bas grade. Une perte de poids modérée peut survenir, en particulier en phase initiale. Les anesthésies répétées à l’isoflurane peuvent induire un stress léger et transitoire. Les prélèvements urinaires et sanguins peuvent également générer une gêne ponctuelle liée à la contention ou à la ponction. L’administration des traitements (gavage, injections) peut entraîner un stress ou un inconfort léger selon la voie utilisée. Des mesures seront appliquées afin de limiter l’intensité et la durée de ces effets.

Devenir

À la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort de manière rapide et indolore, sous anesthésie, afin de pouvoir prélever les tissus nécessaires aux analyses. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant de reproduire de manière fiable l’ensemble des aspects physiopathologiques impliqués dans les infections urinaires, en particulier la colonisation des voies urinaires, les réponses immunitaires locales, la persistance bactérienne et la pharmacocinétique des traitements. Les modèles cellulaires ou organoïdes ne permettent pas d’évaluer l’efficacité de traitements dans un contexte d’infection systémique ou tissulaire, ni d’intégrer les paramètres pharmaco-dynamiques in vivo. Par conséquent, le recours au modèle murin reste indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le projet intègre plusieurs mesures concrètes visant à limiter le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe de réduction des 3R. Le nombre d’animaux a été estimé sur la base de calculs de puissance statistique à partir de données préliminaires internes et de la littérature, afin de garantir que seuls les effectifs strictement nécessaires seront mobilisés pour répondre aux objectifs scientifiques. L’utilisation d’une technologie d’imagerie bioluminescente permet un suivi non invasif et longitudinal de l’infection sur un même animal, réduisant ainsi le recours à des euthanasies inter-médiaires pour le recueil de données. Cette approche limite significativement le nombre total d’animaux requis pour l’analyse cinétique de la réponse au traitement. Les groupes de contrôle (témoin négatif et témoin positif) seront mutualisés entre plusieurs ex-périmentations lorsque cela est possible, notamment lors du criblage de différents composés, afin d’éviter la duplication de lots témoins. L’exploitation complète des animaux en fin d’expérimentation est prévue, avec prélèvements de plusieurs organes (vessie, urètre, reins) pour différentes analyses (microbiologie, histologie, biologie moléculaire), optimisant ainsi les données obtenues par individu. Une phase pilote, menée sur un effectif réduit, permettra de valider et d’ajuster les protocoles d’infection et de traitement avant les séries expérimentales principales, afin d’éviter des essais non concluants. Les tissus prélevés sont partagés pour analyses complémentaires validées afin de réduire le nombre d’animaux supplémentaires. Les analyses statistiques seront effectuées afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser tout en assurant la robustesse des résultats.

Raffinement

Toutes les procédures ont été conçues pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. L’injection intra-urétrale de l’inoculum bactérien est réalisée sous anesthésie générale par isoflurane, avec une contention douce et un matériel adapté (cathéter à petit calibre). Pour limiter l’inconfort lors de l’instillation transurétrale, un lubrifiant stérile et un analgésique local (lidocaïne) seront appliqués sur la sonde. Ces mesures de raffinement visent à réduire la douleur et l’irritation sans interférer avec l’infection ou les traitements testés. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique quotidien incluant l’observation du comportement ainsi que la prise de poids. Des critères d’arrêt seront appliqués si un animal présente des signes cliniques dépassant les seuils définis. L’utilisation d’un suivi par imagerie bioluminescente limite les interventions répétées, les prélèvements invasifs, ainsi que le stress induit par des manipulations fréquentes. Les prélèvements d’urine sont réalisés sur animal vigile, sans ponction, par simple recueil de mictions spontanées au moment de la contention. Des mesures de raffinement sont également adaptées à chaque voie d’administration afin de limiter le stress et l’inconfort. Pour le gavage, l’utilisation de sondes adaptées, de volumes contrôlés et d’un personnel expérimenté permet de réduire les risques (fausse route, lésions). Une habituation à la contention est recommandée. Pour les injections sous-cutanées et intrapéritonéales, l’emploi d’aiguilles fines, de volumes adaptés et l’alternance des sites limitent la douleur et les réactions locales. La voie intraveineuse nécessite un personnel formé afin de réduire les échecs et les lésions. Pour la voie topique, l’utilisation de formulations non irritantes est privilégiée. La voie la moins invasive sera choisie lorsque possible, avec une surveillance des sites d’administration afin de détecter toute réaction et d’adapter les pratiques si nécessaire. En cas de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par isoflurane suivie d’une méthode physique validée (dislocation cervicale). Enfin, tous les personnels intervenant sur le projet sont formés à la manipulation des animaux, aux procédures d’anesthésie, d’injection et de suivi clinique, conformément aux exigences règlementaires.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour ce projet est la souris, qui constitue le modèle de référence pour l’étude des infections urinaires bactériennes. Ce modèle est largement documenté dans la littérature scientifique et présente une très bonne reproductibilité des infections. La physiopathologie de l’infection urinaire chez la souris reproduit de manière fiable les principales étapes observées chez l’Homme, notamment la colonisation de la vessie, l’ascension vers les reins et la réponse inflammatoire locale. La souris permet en outre de combiner des approches d’imagerie in vivo, des analyses moléculaires fines et des évaluations quantitatives de la charge bactérienne. Elle constitue donc un modèle robuste, validé et pertinent pour répondre aux objectifs de ce projet, en particulier pour tester l’efficacité de nouveaux traitements anti-infectieux dans des conditions expérimentales proches de la physiologie humaine. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris adultes, âgées de 6 à 12 semaines au moment de l’inoculation bactérienne. Ce stade de développement correspond à des animaux immunologiquement matures, physiologiquement stables, et adaptés à l’établissement reproductible du modèle d’infection urinaire utilisé dans cette étude.

Pour mettre en place trois modèles de métastase dans un ganglion, 1 338 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une chirurgie d'injection de cellules cancéreuses dans le ganglion inguinal, puis pour certains deux injections d'immunothérapie dont les effets indésirables reproduisent l'inflammation et l'auto-immunité observées chez l'humain. Le développement tumoral peut lui-même causer des douleurs. Les souris sont tuées pour des prélèvements de tumeurs et d'organes, ces trois modèles devant servir de base à un projet ultérieur sur l'immunothérapie des ganglions métastatiques.

Objectifs

Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuses ont révolutionné le traitement des cancers. Cependant aujourd’hui, l’effet de ces traitements sur les métastases au ganglion n’est pas encore bien décrit. Nous souhaitons étudier l’effet des traitements d’immunothérapie dans un ganglion métastatique, et étudier l’environnement vasculaire et immunitaire de celui-ci. Pour réaliser notre étude, nous avons besoin de 3 modèles reproductibles et robustes de ganglion métastatique. L’objectif de ce projet est de mettre en place nos modèles de ganglion métastatique, puis dans un second temps de mettre en place le schéma thérapeutique d’immunothérapie utilisé actuellement en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’obtenir 3 modèles différents de métastases au ganglion, permettant d’étudier différents types de cancer et les effets des traitements d’immunothérapie sur ceux-ci. Par la suite, nous approfondirons l’étude avec un projet nécessitant ces modèles pour étudier les interactions entre les systèmes immunitaires et vasculaires des ganglions métastatiques au cours du traitement d’immunothérapie.

Procédures

Tous les animaux de ce projet auront une chirurgie au niveau du ganglion inguinal pour l’injection de cellules cancéreuses (10 minutes) sous anesthésie générale avec un analgésique générale et une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone d’injection. Par la suite, certains animaux recevront deux injections en vigile (environ 10 secondes par injection) de traitement d’immunothérapie.

Impact sur les animaux

L’anesthésie et l’injection de cellules tumorales peut induire une douleur modérée et du stress chez les animaux, ainsi qu’une dégradation de l’état des animaux (perte de poids, lenteur dans les mouvements). Le développement tumoral peut causer des douleurs chez l’animal. Les traitements d’immunothérapie peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l’homme avec une inflammation et une autoimmunité.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements post-mortem de tumeurs ou organes.

Remplacement

Les procédures réalisées sur l’animal ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. A ce jour, il n’est pas possible d’étudier le système immunitaire et son interaction avec le développement tumoral et le système vasculaire in vitro. La mise en place de métastases nécessite un organisme complexe pour étudier les interactions et paramètres mis en jeux. De plus, les cellules des vaisseaux sanguins auxquelles nous nous intéresserons dans la suite de ce projet sont très plastiques et ne conservent leur phénotype que dans un environnement particulier in vivo.

Réduction

Nous souhaitons mettre en place des modèles de tumeur métastatique dans le ganglion inguinal. Pour la robustesse de nos résultats, nous avons besoin de plusieurs modèles cellulaires. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est suffisant pour mettre en évidence que les modèles sont robustes et écarter de façon certaines ceux qui ne le sont pas. Ce projet est conçu avec une hiérarchie entre les deux procédures, où la réalisation d’une procédure ultérieure n’est possible que si les résultats des procédures précédentes le justifient.

Raffinement

Pour l’injection des cellules ainsi que pour l’imagerie, les souris sont maintenues sur tapis chauffant. Les conditions d’anesthésie, avec une analgésie générale et locale, sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. La colle chirurgicale permettra d’une part de diminuer les traumatismes induits à la peau causés par des points de suture et d’autre part d’augmenter la rapidité d’action et de diminuer ainsi le temps d’anesthésie. Le suivi des animaux sera réalisé tous les jours par les expérimentateurs et les soigneurs, tous ayant connaissance des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques du projet.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. Les ganglions lymphatiques étant apparus tardivement au cours de l’évolution, un modèle mammifère est nécessaire pour l’étude présentée ici, centrée sur les métastases dans ces ganglions lymphatiques. Les souris sont âgées entre 6 à 12 semaines, et présentent à ce stade un système immunitaire mature.

Infectées par le virus de la fièvre jaune dans un modèle décrit comme "à forte morbidité", 400 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Ces souris génétiquement modifiées ont des défenses immunitaires désactivées pour devenir sensibles au virus et développer la maladie. La liste des signes attendus comprend perte de poids, prostration, difficultés respiratoires, tremblements et convulsions, encadrés par des points limites. Le classement en souffrance seulement "modérée" contraste avec un tableau clinique aussi lourd et une visée assumée de forte morbidité.

Objectifs

Le virus de la fièvre jaune est responsable d’une maladie grave qui reste une menace dans certaines régions du monde, malgré l’existence d’un vaccin. Il n’existe actuellement aucun traitement spécifique permettant de réduire la quantité de virus ou d’améliorer l’état des personnes infectées. Le développement de nouveaux traitements est donc un enjeu important. Ce projet a pour objectif de mettre en place et de caractériser des modèles d’infection murin au virus de la fièvre jaune dans le but, de tester secondairement l’efficacité de candidats antiviraux contre le virus de la fièvre jaune dans ces modèles. L’objectif est d’identifier les molécules les plus prometteuses afin de préparer, à terme, leur évaluation chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements antiviraux contre l’infection par le virus de la fièvre jaune. À terme, le bénéfice attendu est de contribuer au développement de futurs médicaments qui pourraient être mis sur le marché pour améliorer la prise en charge de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront infectés en dose unique. Les animaux traités recevront le traitement à tester soit en une seule dose, soit en plusieurs doses, tout en respectant les volumes d’injection recommandés. En cas d’administration répétée, un maximum de 6 injections par animal pourra être réalisé. Chez les animaux non anesthésiés, une injection dure seulement quelques secondes (moins d’une minute). Sous anesthésie, la procédure dure environ 5 minutes. Des prélèvements sanguins pourront être effectués sous anesthésie, au maximum deux fois par semaine (jusqu’à 8 prélèvements au total). Chaque prélèvement dure en moyenne 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différentes procédures, avec ou sans anesthésie (infection, pesées, suivi clinique, administration du traitement, prélèvements sanguins…). Ces manipulations peuvent entraîner un certain stress. En lien avec l’objectif du projet — qui comprend d’une part la mise en place d’un modèle d’infection à forte morbidité par le virus de la fièvre jaune et, d’autre part, l’évaluation de nouveaux traitements — les animaux peuvent présenter différents signes liés à la maladie : perte de poids, variations de température, baisse d’activité, prostration, déshydratation, difficultés respiratoires, tremblements, convulsions, diarrhée ou modifications des paramètres sanguins (comme une baisse de la proportion de certaines cellules). Des points limites précoces et adaptés seront définis afin d’assurer une prise en charge rapide et appropriée des animaux présentant des signes cliniques. L’intensité et la durée de ces signes pourront varier selon les groupes, en fonction du modèle utilisé et de l’efficacité des traitements testés.

Devenir

Le projet ayant pour but, dans un premier temps, la caractérisation de nouveaux modèles murins d’infection au virus de la fièvre jaune puis dans un second temps l’utilisation de ces modèles pour l’évaluation de l’efficacité de traitements curatifs ou prophylaxiques, l’euthanasie des animaux est nécessaire pour récupérer des organes en vue de la réalisation de différentes analyses (dosage de la charge virale, évaluation de l’état inflammatoire, etc).

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative capable de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Pour évaluer l’efficacité d’un traitement contre le virus de la fièvre jaune, il est nécessaire d’observer l’infection dans son ensemble : la façon dont le virus se multiplie, comment l’organisme réagit, et comment le traitement agit sur les fonctions essentielles du corps. À ce jour, seul un modèle animal permet de reproduire l’infection complète et les signes cliniques caractéristiques de la fièvre jaune. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour comprendre l’effet du traitement dans un organisme vivant et vérifier son efficacité globale.

Réduction

Pour obtenir des résultats fiables et interprétables, il est nécessaire d’inclure au minimum six animaux par groupe. Dans le cadre de l’étude d’efficacité, un groupe infecté et non traité sera systématiquement inclus afin de servir de référence pour évaluer l’effet du traitement. Par ailleurs, chaque animal servira de contrôle pour lui même grâce aux mesures réalisées avant l’infection, ce qui évite de recourir à un groupe contrôle non infecté supplémentaire et permet ainsi de réduire le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’au moins 5 jours sera respectée avant le début du projet, portée à 7 jours en cas de transport aérien. Les animaux seront hébergés ensemble en cages tout au long de l’étude, avec un enrichissement adapté pour favoriser leur bien être. Ils feront l’objet d’une observation quotidienne afin de détecter rapidement tout signe anormal et mettre en place les mesures nécessaires : soins de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement…), ou, si leur état l’exige, une euthanasie. Après l’infection, le poids des animaux sera suivi au minimum une fois par jour. Un scoring clinique sera également réalisé à partir d’une grille d’évaluation simple. Celui ci prendra en compte l’état général (activité, aspect du pelage, écoulements nasales et/ou oculaires…) ainsi que d’éventuels signes plus spécifiques (difficultés respiratoires, troubles neurologiques…). L’ensemble permettra d’obtenir un score global reflétant leur état de santé et d’orienter les décisions de prise en charge. Des examens cliniques plus approfondis pourront être réalisés si nécessaire, et toute anomalie sera signalée au vétérinaire responsable. Lors des anesthésies, des mesures seront prises pour éviter toute hypothermie, notamment l’utilisation d’un tapis chauffant ou d’une lampe chauffante pendant toute la procédure.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle préclinique de référence pour l’étude du virus de la fièvre jaune, car elles permettent d’observer la maladie dans un organisme vivant et de tester de nouveaux traitements. Ce modèle est bien établi, largement utilisé et reconnu par la communauté scientifique. Cependant, les souris classiques ne développent que très peu de symptômes lorsqu’elles sont exposées au virus. Pour pouvoir étudier réellement la maladie, des souris génétiquement modifiées dont certaines défenses immunitaires ont été désactivées sont donc utilisées. Ces animaux deviennent alors sensibles au virus et présentent des signes de la maladie similaires à ceux observés chez l’être humain, ce qui permet d’évaluer plus efficacement les mécanismes de l’infection et les traitements potentiels. Grâce à leur âge, leur sexe et leur état sanitaire standardisés, les souris offrent des conditions très homogènes. Cela permet d’obtenir des résultats fiables et comparables entre les animaux, notamment pour suivre l’évolution de l’infection, la réponse du système immunitaire et l’effet du traitement testé. Ce modèle permet également de mesurer de manière précise différents paramètres importants, comme la quantité de virus, les signes cliniques, l’état général ou la survie, tout en maintenant un bon équilibre entre les aspects scientifiques, éthiques et pratiques. Leur taille et leurs caractéristiques biologiques sont adaptées aux volumes de traitement et aux prélèvements nécessaires pour ce type d’étude. Dans ce projet, des souris âgées d’au moins 6 semaines (stade jeune adulte/adulte) seront utilisées afin d’éviter la phase de forte croissance et de travailler avec des animaux d’environ 20 g, ce qui assure une meilleure stabilité des mesures.

Immunodéprimées pour accepter des cellules pulmonaires humaines, 169 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un emphysème est d'abord provoqué par instillation d'élastase dans la trachée, avant la greffe de cellules alvéolaires humaines par inhalation sous anesthésie. L'atteinte pulmonaire peut entraîner des difficultés respiratoires et une perte de poids. Les poumons sont prélevés après la mise à mort pour évaluer si les cellules greffées réparent les alvéoles détruites, une preuve de concept en vue d'une éventuelle thérapie cellulaire humaine.

Objectifs

L’emphysème pulmonaire est une maladie fréquente et potentiellement grave pouvant évoluer vers une insuffisance respiratoire. Il est principalement lié à l’exposition à la fumée de cigarette et se caractérise par la destruction progressive des alvéoles pulmonaires. Cette altération résulte d’un défaut de régénération alvéolaire dont les mécanismes restent encore mal connus. À ce jour, aucun traitement ne permet de former de nouvelles alvéoles ni d’améliorer durablement la fonction alvéolaire chez les patients atteints de formes sévères. Des avancées récentes suggèrent que les cellules épithéliales alvéolaires (CEA) peuvent se greffer dans le poumon de souris endommagées par une autre pathologie, la fibrose pulmonaire, et contribuer à une amélioration de leur état de santé. Il a également été montré que le vieillissement cellulaire, appelé sénescence, peut limiter l’efficacité de ces greffes. L’hypothèse de ce projet est que la transplantation de CEA, en particulier de cellules non sénescentes, dans un modèle murin d’emphysème induit par instillation d’élastase, permettrait de réparer les alvéoles lésées. Il sera également étudié si l’association avec des fibroblastes peut renforcer l’efficacité de la greffe. Le premier objectif de ce projet est de mettre en place un modèle d’emphysème chez des souris immunodéprimées en déterminant la concentration d’élastase nécessaire pour induire l’atteinte pulmonaire. Le second objectif va consister à greffer des CEA humaines obtenues à partir de poumons humains transplantés dans les poumons emphysémateux murins (xénogreffe) afin d’évaluer leur capacité de réparation. Les CEA humaines seront greffées seules, avec ou sans élimination des cellules sénescentes et avec ou sans des cellules de support (fibroblastes) et les fibroblastes primaires humains obtenus de poumons de patients emphysémateux et non emphysémateux ayant subi une chirurgie thoracique carcinologique ou une transplantation. Les cellules sénescentes et non sénescentes seront isolées grâce à des sondes fluorescentes puis transplantées dans le modèle murin. Le recours au modèle animal est justifié par sa pertinence pour l’étude des thérapies cellulaires, contrairement aux cultures in vitro.

Bénéfices attendus

Si les résultats sont positifs, ils constitueront une première preuve de concept concernant : 1) la capacité des CEA à s’implanter avec succès dans le poumon emphysémateux avec l’aide ou non des fibroblastes. Cela permettrait d’envisager la transplantation de cellules dans cette maladie chez l’homme. 2) la sélection de cellules non sénescentes comme outil important pour augmenter la capacité des CEA à s’implanter dans le poumon emphysémateux et d’augmenter leur capacité de réparation Dans l’ensemble, ces résultats ouvriraient un nouvel axe de recherche pour l’équipe, fondé sur l’optimisation de la thérapie cellulaire à base de cellules CEA dans l’emphysème.

Procédures

Injection dans l'abdomen sur animal vigile. Durée de la procédure : 30 sec Instillation dans la trachée. Durée de la procédure : 5 min Xénogreffe par inhalation sous anesthésie générale. Durée de la procédure : 1 à 2 min Prélèvement des poumons sous anesthésie générale profonde. Durée de la procédure : 3 à 4 min. L’instillation d’élastase est une instillation unique, de même que l’instillation des cellules épithéliales alvéolaires humaines (à différents temps en fonction des groupes).

Impact sur les animaux

L’instillation endotrachéale peut générer une douleur légère au moment de l’anesthésie. Elles peuvent potentiellement générer du stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal, ou encore lors des déplacements de cage. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil. Le développement de l’emphysème dû à l’instillation de l’élastase conduit à des dommages du poumon qui peuvent entraîner des difficultés respiratoires (dyspnée) et potentiellement une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue de leurs procédures respectives afin de prélever et d’étudier leurs poumons.

Remplacement

Les modèles de culture cellulaire, qu’ils soient en 2D ou en 3D, ne permettent pas de reproduire l’emphysème. Ils ne permettent pas non plus d’appréhender la faisabilité et les effets d’une greffe de CEA dans le poumon ou d’évaluer l’efficacité de traitements visant à atténuer cette pathologie. À l’inverse, le modèle murin d’emphysème induit par l’élastase est un modèle largement utilisé et validé pour l’étude de l’emphysème. Il permet d’évaluer l’effet thérapeutique de la greffe de CEA dans un contexte physiologique de lésion pulmonaire. De plus, si ce modèle permet de réparer le poumon lésé chez la souris grâce aux cellules implantées, cela suggérera que ces cellules d’intérêt jouent un rôle clé dans la régénération pulmonaire. L’identification et la caractérisation des cellules greffées capables de restaurer la fonction pulmonaire permettront ainsi de les définir comme des cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 169. Cela correspond au minimum pour obtenir des résultats pour une expérience pilote. Des expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=8 d’animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans nos modèles d’emphysème.

Raffinement

Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les porteurs de ce projet. Une surveillance accrue de notre part sera faite durant les 24h suivant l’instillation d’élastase. Les souris seront hébergées en groupe de 5 par cage dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi par des maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton. Les zootechniciens et les porteurs du projet seront en communication concernant le bien-être, la santé des animaux et le respect des points limites. Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine. Si nous sommes amenés à avoir un mâle isolé, nous réduirons au maximum l’impact de cet isolement par une augmentation de l’enrichissement de son environnement et par le maintien de stimulations sociales indirectes (contacts visuels à travers la cage, contacts olfactifs en ajoutant de la litière provenant de la cage d’où il provient).

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée. Également, le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique instillation d’obtenir un emphysème important chez la souris et ce modèle est très utilisé dans la littérature. Les animaux ne seront pas utilisés avant l’âge de 2 mois, pour attendre la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris. Les souris seront utilisées quand elles pèseront au moins 25 g.