Procédures modérées

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau, puis des injections d'immunothérapie et un gavage quotidien cinq jours par semaine pendant quatre semaines, avant que la tumeur ne soit prélevée à huit semaines. Le projet cherche à savoir si un récepteur de surface prédit la résistance aux traitements, un bénéfice renvoyé au conditionnel pour de futurs patients. Après des essais sur cellules en culture, le porteur affirme qu'il est "impossible" de poursuivre la validation sans un "modèle animal entier vivant".

Objectifs

Le mélanome est un cancer de la peau ayant un mauvais pronostic et une incidence croissante, ce qui en fait un problème majeur de santé publique. De nouvelles thérapies ont permis d’améliorer la prise en charge du mélanome lorsque celui-ci s’est propagé dans d’autres organes, cependant l’échappement thérapeutique et la toxicité sont des phénomènes très fréquents qui limitent grandement leur bénéfice clinique. Ainsi, l’identification de nouveaux marqueurs de la résistance à ces thérapies reste un enjeu considérable. Il a déjà été démontré qu’un récepteur présent à la surface des cellules de la peau, est impliqué dans la progression du mélanome et que son expression est associée à un mauvais pronostic avec une diminution de la survie des patients. Nous souhaitons donc évaluer si ce récepteur est impliqué dans la résistance aux traitements dans le cancer de la peau et pourrait être utilisé comme molécule permettant d’anticiper la non réponses aux traitements des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de démontrer le rôle du récepteur dans la réponse aux traitements et ainsi confirmer son rôle de cible thérapeutique dans le mélanome. A terme, ce récepteur pourrait être un marqueur prédictif de réponse à ces thérapies chez les patients atteints de mélanome.

Procédures

La mise en place du modèle d’étude consiste dans un premier temps à injecter une seule fois sous la peau des souris (au niveau du flanc) des cellules de cancer de la peau où la protéine d’intérêt est exprimée ou non. Cette injection se fait sous anesthésie et dure environ 1 minute. Lorsque la tumeur sera détectable (taille d’un petit pois), les souris recevront le traitement (3 injections, sur souris éveillée, dans l’abdomen espacées de 3 jours ; durée de l’injection : 15s). Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue (sans anesthésie ; durée : 1 min) seront réalisées avant le début du traitement, puis 1 fois par semaine (4 prélèvements maximum). Pour les groupes de souris où il y a la combinaison des molécules inhibitrices de la protéine d’interêt, en plus des 3 injections d’immunothérapies espacées de 3 jours, s’ajouteront une administration par voie orale (gavage, 1 fois par jour, 5 fois par semaine pendant 4 semaines maximum) (durée : 1 min) ou par injection dans l'abdomen (durée 15s) selon le produit inhibant la protéine d'intérêt utilisé sur souris éveillée. Les tumeurs seront mesurées deux fois par semaine (durée 30s). Au bout de 8 semaines maximum, les souris sont euthanasiées afin de prélever les tumeurs.

Impact sur les animaux

Suite à la croissance des tumeurs et/ou au développement de métastases, une perte de poids peut être observée. Un développement trop important de la tumeur peut également induire une ulcération, un changement de la respiration ou encore une agressivité. Le point d’injection des cellules tumorales étant sur le flanc, les souris peuvent présenter une mobilité réduite si la tumeur atteint une taille trop importante. Enfin, l’immunothérapie peut se révéler légèrement toxique, ce qui se manifestera par une perte de poids principalement ou un gonflement de l’abdomen. Le gavage répété du traitement peut entrainer une ulcération/irritation du tube digestif

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales afin de collecter la tumeur et le sang, qui seront analysés et conservés afin de caractériser au niveau cellulaire l’effet de la thérapie en présence ou non de la protéine d’intérêt.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences en utilisant des cellules en culture (in vitro, sans utilisation d’animaux) qui ont montré que le récepteur avait un impact sur la réponse aux traitements anti-cancéreux. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles animaux vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de nos résultats in vitro sans utiliser un modèle animal entier vivant.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Pour cela nous nous sommes basés sur des tests statistiques.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte la taille de la tumeur, l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. En effet, tout signe de souffrance et/ou douleur caractérisés par une réduction de l’alimentation avec une perte de poids ou une réduction de la mobilité donneront lieu à une mise à disposition de croquettes humidifiées dans les cages avec une surveillance quotidienne. En cas d'irritation du tube digestion avec saignement, la souris sera euthanasiée. Si ces signes sont observés d’une manière prononcée la surveillance de l’animal sera bi-quotidienne avec une mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage et la mise en place d’une analgésie injectée une fois par jour afin de soulager la potentielle douleur. Si deux de ces signes sont observés de manière prononcée simultanément, l’animal sera euthanasié selon une méthode réglementaire. En cas de signe de douleur (expression faciale, posture voutée) et de tumeur d’une taille importante (définie dans la grille de score) avec ou sans ulcération, la souris sera immédiatement euthanasiée selon une méthode réglementaire.

Choix des espèces

Le modèle de greffe de cellules cancéreuses est bien décrit dans la littérature scientifique et est pertinent pour l’étude de l’effet de thérapies sur la croissance des cellules cancéreuse. Pour mener à bien ce projet, nous utiliserons des souris adultes, afin qu’elles disposent d’un système immunitaire complétement développé. Cela nous permet d’être dans des conditions comparables à ce qui est observé chez l’Homme, le cancer de la peau étant un cancer observé chez l’adulte. Le mélanome étant un cancer qui se développe chez l’adulte, ainsi des souris mâles adultes âgées de 7-8 semaines seront utilisées lors de l’expérimentation, ce qui permettra également un suivi durant une période suffisamment longue.

Jusqu'à six interventions sous anesthésie générale par animal, espacées de deux semaines : 200 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. On leur implante des stents dans des artères saines, avec pour certains un gavage quotidien pendant trois mois, l'hébergement individuel élevant leur niveau de stress de base. Le porteur reconnaît une gêne post-chirurgicale, un risque d'infection et de thrombose au niveau du dispositif. Le projet teste des dispositifs médicaux avant leur usage chez l'humain, sur des artères pourtant saines.

Objectifs

Le traitement de pathologies cardio-vasculaires (anévrismes, sténoses, dissection) nécessite souvent le recours à des stents, dispositifs médicaux apparenté à un minuscule tube expansible qui maintient une artère ouverte. Cependant, malgré la mise en place d’un stent, il existe un pourcentage de cas (de 10 à 30 % en fonction du dispositif) dans lequel l’endothélialisation du stent, c’est-à-dire la bonne reconstruction biologique de l’intérieur du vaisseau sanguin, n’est pas obtenue, ce qui incite aujourd’hui à développer de nouvelles technologies de ces dispositifs afin d’améliorer la cicatrisation biologique. Les industriels modifient également parfois la composition et/ou la forme du dispositif afin d’améliorer ses performances, ou créent de nouveaux dispositifs permettant de s’affranchir de traitement médicamenteux antiagrégant. L’adjonction d’un autre type de traitement médicamenteux pourrait en revanche permettre de favoriser cette cicatrisation. Le projet consiste à étudier la conformabilité, la biocompatibilité et/ou l’endothélialisation de stents sur artères saines (accompagné ou non par l’adjonction d’un traitement médicamenteux). Ce projet, qui sera scindé en plusieurs études pilotes, utilisera des contrôles par imagerie à rayons X avec possibilité d'imagerie optique et nécessitera donc l'utilisation de l'animal pour être mené à bien. L’analyse sur artères saines permettra d’étudier l’endothélialisation des stents. Cela permettra, au sein d’un même animal, de comparer plusieurs dispositifs implantés (de 1 à 3). Ce projet sera réalisé sur deux sites différents identifiés EU 1/2 et EU 2/2.

Bénéfices attendus

Ce projet se déclinera en plusieurs études pilotes et permettra d’effectuer des analyses non réalisables chez l’être humain afin évaluer la faisabilité d'implantation, la sécurité et/ou la réponse biologique in vivo à l’implantation du dispositif, en fonction du ou des traitements administrés aux lapins. Il permettra notamment d’évaluer l’efficacité et la sécurité du dispositif dans des conditions proches de l’humain. L’analyse de la prolifération tissulaire sur le dispositif et sa susceptibilité à engendrer une thrombose (formation de caillots dans les vaisseaux sanguins), apportera des connaissances supplémentaires et une meilleure compréhension sur les indications du dispositif avant de l’utiliser chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis entre 2 et 6 interventions sous anesthésie générale : l’implantation du dispositif et le contrôle avant la mise à mort, d’une durée de 1h chacune +/- 15min. Des contrôles intermédiaires (jusqu’à 4 imageries à rayons X avec possibilité d'imagerie optique nécessitant une nouvelle anesthésie générale et chirurgie) pourront être effectués d’une durée attendue de 45 min. La fréquence des anesthésies générales sera discutée en amont, en fonction des hypothèses de recherches définies par l’étude, en étroite collaboration avec un vétérinaire pour la faisabilité. Pour les animaux recevant un traitement, ils seront manipulés 1 à 2 fois par jour (pendant 3 mois maximum) et le traitement sera donné par une sonde de gavage (environ 1 min par animal). En fonction des études issues de ce projet, des prélèvements sanguins pourront être effectués (jusqu’à 4 prélèvements sur la durée du projet, dans des volumes raisonnables et en laissant un temps de récupération à l’animal entre chaque prélèvement). De manière générale ces prélèvements seront effectuées lorsque l’animal sera sous anesthésie générale, ou sous contention adaptée avec la possibilité de recourir à une sédation légère ou une anesthésie locale. Ces interventions seront réalisées dans l’EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux étant hébergés en cages individuelles, le niveau basal de stress peut être plus important que la normale et sera monitoré au long de l’étude (stéréotypies, etc) (EU 1/2 et 2/2). Le reste des nuisances concernera uniquement l’EU 1/2. L’anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant, et après chaque geste/prélèvement. Un stress supplémentaire peut être observable sur les animaux qui seront amenés à recevoir un traitement oral quotidien. Une gêne et une douleur post-chirurgicales sont possibles au niveau des abords artériels, de même qu’une infection locale au niveau de l’incision. Une thrombose au niveau du dispositif implanté peut également survenir, mais reste un évènement rare. Dans le cas de la procédure 2, les animaux recevront tout au long du projet un traitement oral antiagrégant 1 fois par jour (sonde de gavage, 2 minutes/jour). Par expérience, aucun effet indésirable dû à un traitement oral antiagrégant n’a été observé. Les animaux subiront plusieurs anesthésies générales : une pour la procédure chirurgicale, une pour chaque contrôle intermédiaire et une pour les imageries de contrôle avant mise à mort avec un maximum de 6 prévues pour le projet (et 2 semaines entre chaque anesthésie). Indépendamment de la procédure, la durée d’anesthésie est d’une heure (+/- 15 min), qu’il s’agisse de la phase d’implantation et / ou de contrôle). L'administration d'un analgésique est possible. Les transports d’animaux entre les EU1/2 et EU 2/2 se feront à une fréquence définie en amont selon les conditions spécifiques des études. Des temps d’acclimatation et de récupération post-opératoires seront respectés à l’arrivée et avant chaque départ, avec un examen clinique réalisé par le vétérinaire de la structure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour le prélèvement des dispositifs et pièces anatomiques d’intérêt à des fins d’analyse sur les tissus.

Remplacement

Le projet consiste à étudier la sécurité, la conformabilité, la biocompatibilité et l’endothélialisation (l’endothélium étant le tissu cellulaire qui tapisse l’intérieur des vaisseaux sanguins) de dispositifs médicaux implantables dans des artères saines (accompagné ou non par un traitement médicamenteux) dans des conditions in vivo. Les phénomènes biologiques, tels que l’endothélialisation, la coagulation sanguine, la pression sanguine, ou encore les contraintes liées au déploiement du dispositif implantable n’ont à l’heure actuelle aucune méthode alternative, in vitro ou ex vivo, permettant de reconstruire un modèle proche de ces conditions, ainsi que son suivi au cours du temps. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est ainsi indispensable.

Réduction

Ce projet est à visée exploratoire et a pour objectif l'obtention de résultats préliminaires au cours d'études pilotes de faisabilité et de sécurité. Ces données pourront au besoin servir de base pour établir un nouveau projet intégrant des analyses d'efficacité avec calcul statistique, dans un dossier APAFiS dédié (distinct de ce dossier). Nous sommes donc ici dans le cadre d’un APAFIS général pour lequel plusieurs études pilotes distinctes pourront être développées. Dans le cadre de ce présent projet d’APAFIS, pour chaque étude, le nombre minimal de lapin sera utilisé. Ainsi, pour chaque dispositif testé dans les conditions de procédure choisie (c'est-à-dire avec ou sans antiagrégants), de groupes nécessaires ; et pour prendre en compte le risque d'échec de la procédure, de 5 à 20 lapins par étude seront utilisés, conformément aux études pilotes précédemment réalisées. Par ailleurs, l’implantation chez le même lapin de plusieurs dispositifs pourra éventuellement servir de contrôle et ainsi diminuer le nombre de lapins nécessaires. Le nombre d’animaux nécessaire dans le cadre de prochaines études supportées par cet APAFIS sera défini méthodologiquement, en fonction de(s) l’hypothèse(s) de recherche, en association avec la puissance définie à la conception de l’étude. Ce nombre sera également validé en amont par le Conseil Scientifique de l’EU 1/2.

Raffinement

Dans le cadre de chaque étude les animaux seront indifférenciés (mâles ou femelles). Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles disposant de mezzanine, mais dont les parois sont vitrées et non étanches ou comportent des trous, permettant des échanges visuels, auditifs et olfactifs entre animaux. Les animaux seront gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie expérimentale de l’EU 1/2, et leur première entrée en procédure. Dans les deux EU, une attention particulière sera apportée afin que les animaux disposent d’un enrichissement adapté et suffisant (bûchettes ou blocs de cellulose à ronger, foin (+/- compressé), jouets, cachettes...). Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état de santé et de bien-être sera évalué tout au long du protocole expérimental, avec un suivi comportemental du fait de l’hébergement individuel. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pendant les procédures chirurgicales et seront suivis au cours de la procédure. Un suivi renforcé sera effectué durant les premiers jours après chaque procédure opératoire. Si un animal présente un signe de douleur ou de souffrance, des analgésiques pourront lui être administrés. Au besoin, un traitement antibiotique pourra être mis en place. Dans le cas où l'animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique sans qu'il soit possible de le soulager efficacement (atteinte d'un point limite), l'animal sera sorti d'expérimentation et mis à mort. L’avis du vétérinaire est systématiquement demandé pour chaque EU. Le transport des animaux entre les EU sera pris en charge par l’EU 2/2, fournisseur d’animaux, qui possède un agrément pour le transport d’animaux ainsi qu’un véhicule agréé. La durée du transport est estimée à 4h. Une nouvelle période d’acclimatation de 5 jours sera observée à l’issue de chaque transport pour permettre à l’animal de récupérer. Les animaux seront transportés en cage individuelle adaptée à l’espèce avec des copeaux de bois. Des précautions supplémentaires seront prises pour tous les transports post-opératoires avec délivrance d’un certificat médical (vétérinaire de l’EU 1/2) attestant que l’animal peut être transporté sans risque.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des adultes indifférenciés (males et/ou femelles) de plus de 3 kg pour la taille des artères et la taille des dispositifs usuellement utilisés chez l'Homme. Historiquement la majorité des études précliniques sur l’implantation de dispositifs utilisaient des mâles. Cependant on retrouve également quelques études incluant les deux sexes et discutant des différences. .

Rendues immunodéficientes pour accepter une greffe de cellules leucémiques humaines, 60 souris développent une leucémie, avec anémie, amaigrissement et grossissement de la rate, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses puis jusqu'à six prises de sang sur trois mois, avant d'être toutes tuées pour analyse de la moelle osseuse. Le porteur consacre de longs développements aux méthodes sans animaux, cultures et bases de données, tout en concluant qu'un "modèle biologique complet" reste nécessaire. Le résumé enchaîne surtout des bénéfices présentés pour de futurs patients.

Objectifs

Il s’agit d’étudier l’impact de l’absence d’une enzyme sur le développement des leucémies aiguës myéloblastiques.

Bénéfices attendus

Bénéfices attendus du projet Ce projet vise à améliorer la compréhension et le traitement des leucémies aiguës myéloblastiques (LAM), un type de cancer du sang. 1 - Avancées scientifiques • Mieux comprendre comment l'absence d’une enzyme influence le développement des leucémies. • Étudier l’impact de cette enzyme sur la survie des cellules cancéreuses. • Tester ces découvertes dans un modèle de souris pour confirmer les résultats obtenus en laboratoire. 2 - Développement de nouveaux traitements • Identifier de nouvelles cibles pour des traitements contre la leucémie. • Concevoir des médicaments capables de ralentir la progression de la maladie. 3 - Amélioration du diagnostic et du suivi des patients • Trouver de nouveaux indicateurs permettant de mieux prédire la résistance aux traitements. • Adapter les soins en fonction du profil biologique de chaque patient. 4 - Impact pour les patients • Développer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels. • Réduire les effets secondaires des chimiothérapies en combinant différents types de traitements. • Mettre en place une meilleure surveillance après le traitement pour éviter les rechutes. • Proposer des soins plus personnalisés et adaptés à chaque patient. 5 - Retombées sociétales et économiques • Faire avancer la recherche sur les leucémies et d'autres cancers. • Réduire les coûts des traitements en diminuant les hospitalisations et en évitant l'utilisation de médicaments inefficaces. Conclusion En résumé, ce projet pourrait permettre de mieux comprendre la leucémie, d'améliorer les traitements actuels et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques plus ciblées.

Procédures

1 - Contention • Les souris seront manipulées avec précaution pour minimiser le stress lors des différentes interventions, en utilisant des techniques adaptées de contention douce. • Une attention particulière sera portée à la durée de la contention afin de limiter son impact sur les animaux. 2 - Greffe de cellules leucémiques • Les souris recevront une injection de cellules leucémiques pour reproduire un modèle de la maladie. • Nombre d’animaux concernés : 60 souris • Durée : une seule injection, environ 1 minute. 3 - Suivi de la maladie • Des prises de sang seront réalisées toutes les deux semaines (jusqu’à 3 mois après l’injection des cellules leucémiques) afin de surveiller l’évolution de la leucémie et d’analyser la réponse immunitaire. Nombre total maximum de prélèvements : 6. • Nombre d’animaux concernés : 60 souris • Durée : environ 1 minute par prise de sang

Impact sur les animaux

Malgré toutes les précautions prises pour assurer leur bien-être, certains effets secondaires sont attendus en raison de la nature de l’étude. Effets liés aux interventions expérimentales • Les traitements administrés avant l’injection des cellules leucémiques peuvent provoquer une fatigue passagère et une légère perte de poids. • Les prises de sang régulières, nécessaires au suivi de la maladie, peuvent entraîner un certain stress. Pour limiter cet inconfort, des techniques adaptées seront utilisées. Effets liés au développement de la maladie • La progression de la leucémie peut causer une anémie (diminution des globules rouges), une perte d’énergie, un amaigrissement et une augmentation de la taille de certains organes comme la rate. Effets liés à l’immunodéficience • Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris immunodéficientes, ce qui les rend particulièrement sensibles aux infections opportunistes.

Devenir

Mise à mort des animaux pour analyses scientifiques Toutes les souris seront mises à mort pour des analyses approfondies qui concernent principalement la moelle osseuse et le sang, éléments essentiels pour comprendre l’évolution de la maladie. • Justification : ces examens sont indispensables pour valider les hypothèses scientifiques du projet et pourraient aider à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie. • Méthode : la mise à mort sera réalisée selon des protocoles stricts garantissant une mort rapide et sans douleur, conformément aux réglementations en vigueur sur le bien-être animal.

Remplacement

Stratégies de remplacement de l’expérimentation animale Afin de limiter autant que possible le recours aux animaux, plusieurs méthodes alternatives seront utilisées pour mener cette étude sur la leucémie. 1. Expériences en laboratoire sur des cellules humaines • Des cultures de cellules leucémiques humaines seront utilisées pour observer comment une enzyme influence leur croissance et leur évolution. • Des modèles plus avancés, appelés cultures 3D et organoïdes de moelle osseuse, seront développés pour recréer un environnement proche de celui du corps humain. Cela permettra d’obtenir des résultats plus réalistes sans utiliser d’animaux. 2. Analyses informatiques et exploitation des données existantes • Des bases de données contenant des informations sur des patients atteints de leucémie seront analysées afin de repérer d’éventuels liens entre l’expression d’une enzyme et la progression de la maladie. • Ces approches bioinformatiques permettront de générer des hypothèses solides avant de tester de nouveaux traitements, réduisant ainsi le besoin d’expériences sur des animaux. 3. Études sur des cellules humaines en dehors du corps (ex vivo) • Des cellules souches du sang seront cultivées dans des conditions spécifiques pour étudier le rôle d’une enzyme sans passer par des tests sur des souris. • Des échantillons de moelle osseuse prélevés chez des patients atteints de leucémie permettront de valider les résultats obtenus en laboratoire. Conclusion L’objectif est d’utiliser autant que possible ces alternatives avant d’envisager l’expérimentation animale. Cependant, certaines questions scientifiques nécessitent encore un modèle biologique complet pour être étudiées, ce qui justifie l’utilisation de souris lorsque les autres méthodes ne suffisent pas.

Réduction

Ce projet met en place plusieurs approches pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant des résultats fiables et exploitables. 1. Optimisation des protocoles expérimentaux • Une planification minutieuse des expériences permettra de réduire le nombre de souris nécessaires tout en obtenant des données statistiquement significatives. • Chaque animal sera utilisé pour plusieurs types d’analyses afin de maximiser les informations obtenues, évitant ainsi d’avoir recours à un plus grand nombre de sujets. 2. Expériences préliminaires avant les tests sur animaux • Des tests seront d’abord réalisés sur des cultures cellulaires (in vitro) et des échantillons biologiques (ex vivo), afin d’identifier les conditions expérimentales les plus pertinentes avant de passer à des essais sur animaux. • Cela permettra d’éviter des expériences inutiles et de limiter le nombre de souris impliquées. 3. Utilisation de méthodes statistiques avancées • Des outils statistiques performants seront employés pour garantir des résultats fiables avec le plus petit nombre d’animaux possible. • Ces méthodes permettent d’optimiser les groupes expérimentaux en veillant à ce que chaque test apporte un maximum d’informations. 4. Partage des ressources et des résultats avec d’autres laboratoires • Une collaboration avec d’autres équipes de recherche permettra d’éviter de répéter des expériences déjà réalisées ailleurs. • L’exploitation de bases de données existantes sur la leucémie permettra d’affiner les hypothèses sans multiplier les tests sur animaux. Conclusion Grâce à ces stratégies, le recours aux animaux sera limité au strict nécessaire. Ces mesures s’inscrivent dans une démarche responsable et éthique, visant à réduire l’impact de l’expérimentation animale tout en poursuivant des avancées scientifiques essentielles pour la lutte contre la leucémie.

Raffinement

Afin de limiter le stress et la souffrance des animaux tout en garantissant des résultats scientifiques fiables, plusieurs mesures seront mises en place. 1. Techniques expérimentales adaptées pour minimiser l’inconfort • Les injections et prélèvements sanguins seront réalisés avec des techniques optimisées pour réduire la douleur et le stress des animaux. • Les expérimentateurs seront spécialement formés pour effectuer ces manipulations rapidement et avec le plus grand soin. 2. Surveillance attentive pour prévenir la souffrance • Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de détresse ou de douleur. • Des critères stricts seront appliqués : si un animal montre des signes avancés de souffrance ou de détérioration de son état de santé, il sera mis à mort de manière éthique et sans douleur pour éviter toute souffrance prolongée. 3. Amélioration des conditions de vie • Les souris seront élevées dans un environnement enrichi, comprenant des tunnels, des cachettes et une litière adaptée, afin de favoriser leur bien-être et de réduire leur stress. • Elles seront logées en petits groupes compatibles pour éviter l’isolement et favoriser un comportement naturel. • Les souris utilisées étant immunodéficientes, elles seront hébergées sous couvercle filtrant pour limiter le risque infectieux, qui pourrait altérer leur bien-être ainsi que les résultats expérimentaux. 4. Formation et encadrement des chercheurs • Tous les chercheurs impliqués recevront une formation continue aux meilleures pratiques en expérimentation animale, pour garantir des manipulations respectueuses et éthiques. • Un dialogue constant sera maintenu avec le comité d’éthique et les spécialistes du bien-être animal, afin d’améliorer en permanence les protocoles et de s’assurer qu’ils respectent les dernières recommandations en matière de protection animale. Conclusion Grâce à ces mesures, l’impact des expériences sur les animaux sera réduit au minimum, tout en garantissant des conditions de vie optimales et un suivi rigoureux de leur bien-être.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour cette étude car elle représente un modèle particulièrement adapté à la recherche sur la leucémie humaine. Pourquoi utiliser la souris ? • Une grande similarité avec l’humain : le système de production des cellules sanguines (hématopoïèse) chez la souris fonctionne de manière très proche de celui de l’être humain. Cela permet de reproduire fidèlement les mécanismes impliqués dans le développement de la leucémie. • La possibilité de modifier son patrimoine génétique : grâce à des modèles génétiquement modifiés, les chercheurs peuvent étudier avec précision l’effet de l’absence d’une enzyme sur la maladie. • Une expérimentation contrôlée : la souris permet de tester l’évolution de la leucémie dans un organisme vivant, en réalisant des injections de cellules leucémiques, des traitements et des analyses de sang dans des conditions proches de celles utilisées en milieu clinique. • Un modèle rapide et efficace : les souris ont une durée de vie courte et se reproduisent rapidement, ce qui permet d’obtenir des résultats en un temps relativement réduit et d’évaluer l’évolution de la maladie sur plusieurs générations de cellules. Pourquoi utiliser des souris adultes ? Les études seront débutées sur des souris à un âge compris entre 8 et 12 semaines, car : • À cet âge, leur système sanguin est totalement formé et stable, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. • Leur taille et leur maturité physiologique facilitent les procédures expérimentales, comme les prélèvements et injections.

Soumises à une pression mécanique et à une source de chaleur provoquant des réactions réflexes, à des tests d'anxiété et à un isolement de 72 heures, 528 souris vont toutes être tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est génétiquement modifié pour ne pas exprimer une enzyme dont le rôle dans le cerveau reste inconnu. Les prélèvements finaux se font sous anesthésie générale, après une injection d'analgésique. Le bénéfice avancé se limite à ouvrir de nouvelles voies de recherche.

Objectifs

Nos molécules d'intérêt coupent certains lipides présents dans les membranes des cellules. Chez l’humain, il existe plusieurs gènes codant pour différentes formes des molécules auxquelles nous nous intéressons. Elles participent à de nombreux processus biologiques, même si leurs rôles précis ne sont pas encore entièrement compris. Elles sont aussi intéressantes pour la recherche médicale, car elles jouent un rôle important dans la production de molécules qui régulent l’inflammation. Notre protéine d'intêret, une forme particulière de ces enzymes, est surtout présente dans le cœur, les muscles et certaines cellules du système immunitaire. Elle contribue notamment à réguler l’inflammation en favorisant la production de molécules pro-inflammatoires. Elle intervient également dans le fonctionnement du système cardiovasculaire, en influençant le tonus des vaisseaux et en participant à des processus comme l’athérosclérose ou l’infarctus. Elle a aussi été impliquée dans certains aspects du métabolisme, comme la régulation du glucose et la résistance à l’insuline. Cependant, toutes ces fonctions ont été étudiées en périphérie, c’est-à-dire en dehors du cerveau, et on ne sait pas encore ce que fait notre molécule d'intêret dans le cerveau. Des études récentes ont montré que chez la souris, son expression est limitée à deux zones cérébrales particulières à l'interface sang-cerveau. Le projet que nous souhaitons mener vise à étudier les conséquences comportementales d’une déficience en la molécule d'intêret dans le cerveau.

Bénéfices attendus

Nos résultats permettront de révéler des rôles cérébraux jusqu'ici inconnus pour la molécule d'intêret et permettraient d'ouvrir de nouvelles voies de recherche.

Procédures

176 souris maximum seront exposées à un stress transitoire lié à: l’isolement temporaire (1 fois chacune, 30 min max), l'anxiété (2 fois chacune, 30 min la 1ere fois, 8 min la seconde). 176 souris maximum seront hébergées individuellement (avec stimuli auditifs et olfactifs) transitoirement (72h chacune, 1x). 176 souris maximum seront soumises à une douleur mécanique et thermique qui provoqueront un inconfort momentané et des réactions réflexes (2x20 min par souris) . D’autres facteurs de stress incluent les transferts, les manipulations répétées et le changement d’environnement. A la fin des procédures, toutes les souris recevront une première injection (1x par souris, 10 sec) 15 mn avant une seconde (1 fois par souris, 10 sec). Elles subiront ensuite des prélèvements sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

176 souris max seront exposées à: - l’isolement temporaire (1 fois chacune, 30 min max) qui entrainera un stress léger et transitoire - l'anxiété pour l'open-field (1 fois chacune, 30 min) qui entrainera un stress léger et transitoire - l'Y-maze (1 fois chacune, 8 min) qui entrainera un stress léger et transitoire 176 souris max seront exposées à: - l'isolement temporaire (72h chacune, 1x) qui entrainera un stress léger et transitoire. 176 souris max les souris subiront: - une pression mécanique (20 min par souris) entrainant une douleur mécanique évitable - une chaleur provoquant un inconfort momentané et des réactions réflexes (20 min par souris). D’autres facteurs de stress incluent les transferts, les manipulations répétées et le changement d’environnement. A la fin des procédures, les souris recevront une injection d'analgésique (1x par souris, 10 sec) 15 mn avant l'induction de l'anesthésie par une injection (1 fois par souris, 10 sec). Les contentions nécessaires entraîneront un léger stress et les injections une faible douleur de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder à des prélèvements biologiques ou des analyses histologiques.

Remplacement

Les phénomènes étudiés dans ce projet, tels que la sociabilité, la cognition, le métabolisme et la douleur, nécessitent l’observation de comportements complexes intégrant le système nerveux central et périphérique, ce qui ne peut être reproduit de manière fiable par des modèles in vitro ou informatiques. Par conséquent, l’utilisation de souris est indispensable pour obtenir des données physiologiquement pertinentes et transposables.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à l’aide d'un logiciel de calcul de puissance statistique. Les critères représentent un compromis raisonné entre robustesse statistique, faisabilité expérimentale et respect du principe de Réduction, conformément aux recommandations méthodologiques en expérimentation animale.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront mises en place pour minimiser la souffrance et le stress des souris : - Habituation préalable à la salle, au matériel et aux manipulations avant les tests. - Manipulations douces et standardisées par du personnel expérimenté. - Durée d’isolement minimale dans les cages métaboliques et les tests individuels. - Surveillance attentive des animaux pendant tous les tests, avec critères d’arrêt définis pour toute détresse. - Espacement suffisant entre les tests stressants ou nociceptifs pour permettre la récupération. Une grille de score a été établie afin de définir des points limites adaptés, des mesures correctives à mettre en place et des critères d'arrêt de souffrance en cas de besoin.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car elles permettent d’étudier des fonctions complexes intégrant le système nerveux central et périphérique, comme la cognition, la sociabilité, le métabolisme et la douleur, dans un organisme intact. Leur physiologie et leur génétique sont bien caractérisées, ce qui rend les résultats transposables et comparables à d’autres études. Les alternatives in vitro ou informatiques ne permettent pas de reproduire ces interactions complexes entre tissus et organes, ni d’évaluer de manière fiable les comportements ou la nociception. Les expériences seront réalisées sur des souris âgées de 8 à 10 semaines, correspondant à l’âge adulte jeune où les systèmes nerveux, métabolique et sensoriel sont pleinement développés. Cet âge permet d’obtenir des données stables et comparables tout en évitant les variations liées à la croissance ou au vieillissement.

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs reins et d'autres organes, 456 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est rendue diabétique par injection de streptozotocine, placée en cage à métabolisme sur grille pendant plusieurs jours, puis opérée sous anesthésie sans réveil. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel sur grille génère des nuisances et que la chirurgie comporte un risque d'arrêt cardio-respiratoire. L'objectif est de décrire la composition en lipides de segments du rein et le rôle d'une enzyme dans la néphropathie diabétique.

Objectifs

Les lipides constituent une classe hétérogène de molécules tant du point de vue structurel que de leurs fonctions biologiques. Chaque catégorie de lipide présente des propriétés chimiques distinctes qui déterminent leurs rôles biologiques variés. Ils sont les composants des membranes cellulaires, servent de stockage d’énergie et peuvent aussi être des hormones. L’analyse de l'ensemble des lipides, d’un organe, d’une cellule ou même d’un organite a conduit à la définition de signatures lipidiques qui peuvent être spécifiques des fonctions ou de l’état de l’objet considéré. Ainsi, les segments du tubule rénal, ayant des fonctions différentes, présentent des signatures différentes. De surcroit, cette signature est modifiée par l’obésité, ce qui tend à prouver que cette caractéristique est modifiable et présente une capacité à changer qui pourrait expliquer en partie les pertes de fonction rénale et l’apparition d’hypertension artérielle souvent associé à ce contexte. Un des segments testés a pour caractéristique d’être enrichie en lipides particuliers, Ce qui pourrait influencer le fonctionnement des transporteurs ioniques présents dans ce segment dont le rôle dans le maintien des fonctions du rein est essentiel. Ainsi, cette surabondance de lipides pourrait impacter directement la réabsorption de sel Nos données préliminaires indiquent que la présence d’une enzyme pourrait expliquer l’accumulation de ces lipides. Ce projet vise donc à décrire l’ensemble des lipides des segments rénaux dans différentes conditions et d'étudier le rôle de cette enzyme dans la fonction du rein.

Bénéfices attendus

Cette étude contribuera à une meilleure compréhension du rôle des lipides dans la fonction rénale, et permettra d’identifier le rôle d’une enzyme du métabolisme lipidique dans la physiologie au quotidien et la néphropathie diabétique, maladie extrêmement répandue (qui touche un tier des diabétiques) et qui est la première cause d’insuffisance rénale terminale dans les pays occidentaux.

Procédures

Certains animaux seront soumis à des traitement pharmacologiques (via la nourriture ou l’eau de boisson) et à des changements de régime alimentaires pour une durée de 15 jours. Certains seront rendus diabétiques par injection unique d’une substance pharmacologique en intrapéitonéal. Pour vérifier l’installation du diabète, une prise de sang aura lieu sur animaux vigile sous contention (deux minutes par animal). Suite à ces traitements, les animaux sont répartis en lot pour les expériences subséquentes. Une partie des animaux traités ou non subira une chirurgie terminale (moins de 10 minutes) sous anesthésie et analgésie, à des fins de recueils de tissus/organes. Ils seront euthanasiés sous anesthésie et analgésie à la fin de la procédure. Pour une autre partie des animaux traités ou non, trois périodes de recueils urinaires sur animal vigile sera effectué, nécessitant de les placer, pour la première période 4 jours en cage à métabolisme (2 jours d’habituation et 2 jours pour le recueil), puis ils retourneront en cages à métabolisme pour une journée, 7 jours après traitement pour la deuxième période et 14 jours après traitement pour la troisième période. Ces mêmes animaux seront utilisés pour évaluer la filtration glomérulaire à la fin de la troisième période de recueil, ce qui nécessite l’injection d’un produit fluorescent sous anesthésie et la pause d’un enregistreur de fluorescence transdermal sur le flanc de l’animal (10 minutes/animal). Suite à leur réveil et après 2h d’enregistrement, l’enregistreur est retiré et l’animal retrouve sa cage de stabulation originelle avec ses congénères avant d’être anesthésiés et euthanasiés. Pour un lot d’animaux rendus diabétiques, la mesure de filtration glomérulaire telle que décrite ci-dessus se fera sans que les animaux ne soient passé en cages à métabolisme préalablement. Un autre lot d’animaux traités ou non subira 2 prélèvements sanguins à 7 jours d’intervalle sur animal anesthésié (1 minute par animal). Suite au deuxième prélèvement, alors que les animaux sont anesthésiés, ils seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions prévues sont connus car déjà testés chez la souris dans d’autres contextes que celui de la présente demande. Ainsi, une partie des animaux subiront des modifications de diète qui pourront entrainer une baisse de la consommation alimentaire et d’eau de courte durée lors du changement de régime (néophobie de la souris). Certains animaux pourront ressentir une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille sous la peau lors des injections de composés pharmacologiques (streptozotocine, anesthésique) et lors de la mesure de la glycémie par incision superficiel de la peau. Certains traitements (streptozotocine, régime fort en sel) vont également engendrer des désagréments tels qu’une augmentation de la diurèse et de la consommation d’eau. Pour le prélèvement de leurs reins, certains animaux seront également sujet à une chirurgie sans réveil sous anesthésie et antalgie susceptible d’entrainer une insuffisance respiratoire (risque d’arrêt cardio-respiratoire). En fonction des groupes expérimentaux, une partie des animaux subira un prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (risque d’arrêt cardio-respiratoire) pouvant entrainer une hémorragie (stress hémodynamique). En fonction des groupes expérimentaux, certains animaux seront hébergés individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur fèces. Ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont isolés et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite. Une partie des animaux subira un prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie pouvant entrainer une hémorragie. La mesure de la filtration glomérulaire nécessite d’équiper les animaux avec un enregistreur fixé sur le flanc pendant 2h pouvant entrainer un léger inconfort.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin, par exemple, de pouvoir utiliser leurs organes à des fins d’études post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Une partie du projet scientifique global consiste d’ailleurs à utiliser des cellules en culture. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront d’étudier les conséquences de différences ou de traitements systémiques (mâles/femelles, traitements pharmacologiques, diète) sur la composition lipidique et la fonctionnalité d’un segment du tubule rénal. En effet ces processus font intervenir des systèmes complexes qui travaillent de concert et qui agissent également les uns sur les autres. L’identification de l’implication possible de ces différents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilités pour développer des stratégies thérapeutiques novatrices.

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans et nécessitera l’utilisation de 456 souris. Nous avons calculé, en nous appuyant sur notre expérience des méthodes envisagées, la connaissance de leur reproductibilité et des calculs de puissance le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement robustes. Des tests statistiques seront effectués pour garantir des interprétations fiables et non biaisées de nos résultats Nous réduirons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux en limitant toutefois les expériences qui aboutiraient à des souffrances trop importantes et et/ou qui pourraient impacter négativement certains résultats, les rendant inexploitables. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est susceptible d’évoluer à la baisse 1/ si nous constatons qu’il n’existe pas de dimorphisme sexuel, ce qui permettra de mélanger les résultats des souris mâles et femelles 2/ si nous constatons que l’inhibition de notre protéine candidate n’a pas d’effet sur la composition lipidique, ceci annulera l’intérêt d’une grande partie du projet et 3/ si nous constatons que l’induction d’une néphropathie diabétique n’a pas d’effet sur la composition lipidique des tubules rénaux, ce qui annulera également l’intérêt d’une partie du projet.

Raffinement

Les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. Leur environnement sera enrichi avec au moins deux objets : du nid végétal et/ou des cylindres en carton et/ou des bouts de bois et/ou des maisons en plastique. L'hébergement en cages à métabolisme sera réalisé dans l'établissement utilisateur. Afin de limiter les désagréments liés à la grille, nous plaçons une coupelle en verre de 6 cm de diamètre ce qui permet à la souris de dormir ou de se réfugier sans être en contact avec la grille. Nous avons vérifié que la majorité des souris s’installent dans les coupelles pour dormir mais que cela ne change en rien les recueils d’urine et de féces. Ces cages sont situées sur des racks qui permettent aux souris de maintenir un lien olfactif, visuel et sonore entre elles. La détermination régulière du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux nous permettra de définir les points limites et de replacer l’animal en stabulation s’ils sont dépassés. Le cas échéant, l’euthanasie de l’animal pourra être envisagée Le poids corporel avant tout traitement servira de référence et cette mesure sera répétée quotidiennement jusqu’à 3 jours post-traitement puis8 et 15 jours post-traitement. Une diminution égale ou supérieure à 20 pourcents du poids de référence sera considérée comme la limite provoquant l’interruption de la procédure. Par ailleurs, l’aspect général des animaux (vivacité, capacité à se mouvoir, propreté du pelage etc…) sera observé au moment de la mesure de poids corporelle et toutes anomalies sera prise en compte pour sortir l’animal considéré de la procédure ou lui fournir le soin adéquat. Les actes invasifs sont effectués par un personnel qualifié et formé à l’expérimentation animal et à la chirurgie avec utilisation d’antalgique.

Choix des espèces

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'étude des fonctions rénales qui ont des effets systémiques. Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car les modèles d’invalidation des gènes susceptibles de nous intéresser ont été générés chez la souris et pourrais nous être utiles pour la suite de ce projet. De plus, ces expériences ont pour objectif d'être associées ou comparées à des expériences déjà réalisées dans le laboratoire sur ces mêmes lignées de souris. Nous utilisons des souris mâles et femelles commerciales standards âgées de 8 à 15 semaines afin d’évaluer les facteurs qui contribuent aux modifications du contenu en acide gras du rein et le rôle d'une protéine particulière dans ce processus. Les animaux seront donc matures sexuellement.

Pour évaluer un complément alimentaire à base d'extraits d'insectes destiné à la filière avicole, 120 poules vont être infectées par le parasite Eimeria, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les poussins sont infectés par voie orale dès leurs premiers jours, équipés de puces télémétriques sous anesthésie, puis tués à vingt et un jours pour prélever leurs tissus. Le porteur situe d'emblée l'enjeu du côté des pertes économiques de l'aviculture, chiffrées à plus de douze milliards d'euros par an dans le monde. Le bénéfice visé est de pouvoir recommander la supplémentation aux éleveurs.

Objectifs

Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques de plus de 12 milliards d’euros dans le monde et par an. Ces maladies infectieuses sont provoquées par la multiplication de parasites protozoaires. Une fois ingérés, ces parasites envahissent les cellules intestinales et se multiplient massivement avant d’être excrétés. Les pertes de production observées dans les élevages avicoles sont principalement dues à une morbidité chez le poulet de chair. En outre, l’infection par ce parasite prédispose les oiseaux à l'entérite nécrotique, ainsi qu'à la colonisation par d’autres bactéries pathogènes. La dégradation de la litière causée par cette infection peut également entraîner de la boiterie de la volaille. Le traitement repose principalement sur l’administration d’anticoccidiens dans l’aliment des oiseaux pendant toute la durée de l’élevage. Cependant, l’apparition de résistances souligne l’urgence de trouver des moyens de lutte alternatifs : nouvelles formulations vaccinales ou nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet vise à évaluer les propriétés anticoccidiennes d’extraits naturels d’insectes, en conditions contrôlées. Un projet antérieur a permis de caractériser in vitro les propriétés anticoccidiennes d’extraits naturels d’insectes (extrait lipidique et extrait protéique). La poursuite du projet nécessite désormais d’objectiver l’effet des extraits d’insectes in vivo. L’objectif est de quantifier l’effet de la supplémentation sur des paramètres parasitaires, la physiologie et la réponse immunitaire des oiseaux, comme la poule.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme, dans le cadre de ce projet, seraient que les lots supplémentés présentent un meilleur contrôle de l’infection parasitaire (effet anticoccidien : moins de lésions, moins d’excrétion de parasite) et une amélioration de la physiologie (moins d’inflammation et tissu à l’homéostasie). Les oiseaux non infectés et supplémentés pourraient également bénéficier d’une meilleure croissance. Le bénéfice à moyen terme serait de pouvoir recommander la supplémentation en extrait d’insecte sur le terrain, auprès des éleveurs (des produits commerciaux existent mais n’ont pas encore été recommandés pour la volaille).

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration par voie orale du parasite Eimeria à une dose qui ne cause pas de morbidité et qui n’induit pas de signes cliniques proches du point limite. L’objectif est de reproduire une infection expérimentale par voie orale (0.5 mL à l’aide d’une seringue munie d’un embout en silicone (4mm de diamètre ; 2cm de long) ou pipette avec cône de 0.5 mL) pour étudier l’effet de la supplémentation en extrait d’insecte chez des oiseaux infectés ou non par Eimeria. Les contrôles recevront 0.5 mL d’eau. L’inoculation est réalisée au fond de la cavité buccale de l’animal et n’est pas invasive comme le serait un gavage dans lequel l’embout serait inséré jusqu’à l’oesophage. L’inoculation est de courte durée (20s maximum). Aucune douleur n'est attendue suite au gavage. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Elle est effectuée par du personnel expérimenté. Tous les animaux seront régulièrement pesés au cours de l’expérimentation (1, 14, 21 jours d’âge) et les animaux seront soumis à un prélèvement de sang juste avant leur mise à mort. 3 mL de sang seront prélevés. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Après une anesthésie gazeuse flash (quelques minutes), les puces télémétriques sont injectés en intrmusculaire (moins de 1 minute) et la récupération très rapide des animaux (moins de 5 min sous lampe chauffante) et puis remis en lot dans la foulée.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à une dose qui ne cause pas de morbidité et qui n’induit pas de signes cliniques proches du point limite. Cependant, une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. L’effet attendu de la supplémentation est d’améliorer l’état des animaux comme par exemple de limiter la perte de poids causée par l’infection et les conséquences négatives de l’infection (lésions, inflammation), diminuer l’excrétion parasitaire. Dans le cas peu probable que l’état des animaux supplémentés et infectés soit pire que les animaux contrôles, l’observation des animaux (2 fois par jour) permettra de déterminer si ceux-ci atteignent le point limite (plumes ébouriffée, prostration, yeux mi-clos, …). Dans ce cas, les animaux seront euthanasiés avant la fin de l’expérimentation. Les puces télémétriques seront placées chez 10 animaux par lot, sous anesthésie générale, pouvent engendrer un stress et une douleur légère au point d'implantation.

Devenir

Pour l’unique procédure de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever différents tissus (caeca) et de pouvoir analyser la charge parasitaire contenue, le scoring des lésions et la réponse immunitaire induite.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer les propriétés anticoccidiennes in vivo or, l’agent pathogène Eimeria tenella responsable de la coccidiose a un spectre d’hôte restreint : il infecte exclusivement le poulet Gallus gallus.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est choisi en fonction de la dispersion des paramètres mesurés. Nos effectifs sont basés sur les études du laboratoire portant sur les scores lésionnels lors de supplémentation et pour lesquelles il faut en moyenne 20 animaux / groupe entre deux groupes pour avoir une différence significative avec une puissance de 93% avec un seuil alpha de 0.05 pour un test non paramétrique défini par le plan expérimental.

Raffinement

Les poulets seront hébergés dans des conditions environnementales contrôlées, ils disposeront d’un enrichissement social et comportemental. Ils seront hébergés en groupe de 20 poussins, au sol, dont la température est régulée (ajout le lampe chauffante) avec aliment et eau ad libitum ainsi qu’un éclairage 12h/24h. Ils bénéficieront également d’un enrichissement environnemental et matériel : l'espace de vie sera enrichi par la suspension de rubans, de perchoirs et de la litière favorisant le grattage (litière de miscanthus pour éviter les poussières). La prise de sang est réalisée avant l’euthanasie par du personnel formé et qualifié, ce qui permet d’effectuer une prise de sang en douceur et rapidement pour éviter toute souffrance. Dans ces conditions, l’animal est détendu et ne présente pas de signes d’angoisse et de stress. L'anesthésie gazeuse flash dure quelques minutes et récupération très rapide des animaux (moins de 5 min sous lampe chauffante), qui sont remis en lot dans la foulée. Pas de gène visible, ni de modification d’interactions entre les poussins. .

Choix des espèces

Le poulet Gallus gallus est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. Des poulets de statut sanitaire protégé sont utilisés. L’étroitesse du spectre d’hôtes des parasites du genre Eimeria empêche toute tentative de manipulation d’une espèce parasitaire aviaire sur un modèle animal autre que la poule. Des poussins de 1 jour sont utilisés afin d’apporter la supplémentation alimentaire contenant les extraits lipidique ou protéique de larves d’insecte le plus tôt possible dans la vie des oiseaux, cela pouvant agir sur la composition du microbiote digestif, et contribuer la lutter contre l’infection parasitaire. Les oiseaux seront utilisés dès l’éclosion et seront ou non supplémentés dès leur début de vie pour évaluer l’effet de la supplémentation alimentaire en extraits d’insecte sur le contrôle de l’infection parasitaire, la croissance ds oiseaux et l’inflammation. Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à 14 jours d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire. Les animaux sont mis à mort à 21 jours d’âge.