Procédures modérées

Anesthésiées puis injectées dans la trachée avec des bactéries, des cellules immunitaires ou une chimiothérapie, 356 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Un sepsis pulmonaire leur est provoqué, avec hypothermie, gêne respiratoire et perte de poids attendues. L'objectif déclaré est de comparer les sous-types de sepsis humains à ce modèle murin. Le porteur reconnaît lui-même que la souris pourrait ne représenter qu'une partie des malades, ce que le projet vise justement à vérifier.

Objectifs

Le sepsis est une infection grave qui touche 50 millions de personnes par an dans le monde. Il est responsable de >10 millions de décès par an. Les infections respiratoires sont la première cause de sepsis.Malgré sa gravité, les traitements n’ont guère évolué depuis 30 ans, en partie parce que les patients atteints de sepsis sont très différents les uns des autres. Des chercheurs ont identifié chez certains patients des « sous-types » de sepsis basés sur le niveau de certains marqueurs de l’inflammation dans le sang. Ces sous-types permettent de regrouper les patients plus uniformément et pourraient aider à mieux cibler les traitements. Comprendre comment ces sous-types fonctionnent est donc essentiel pour développer de nouvelles thérapies. Chez la souris, ces sous-types n’ont pas encore été étudiés, il est possible que la souris ne représente qu'une seule partie des malades. D'autre part , Le sepsis modifie profondément le système immunitaire, créant ce qu’on appelle une « mémoire immunitaire », qui peut être bénéfique ou au contraire délétère. Le projet vise à reproduire un modèle de sepsis pulmonaire chez la souris. L’objectif est de décrire l’évolution spatiale et temporelle des principales cellules immunitaires pulmonaires chez l’animal afin de le comparer aux sous types de sepsis observés chez l'homme.Dans un second temps, nous cherchons à connaître le rôle des sous-types cellulaires dans la cicatrice immunitaire laissée par le sepsis en injectant à des souris des macrophages porteurs de cette mémoire immunitaire.

Bénéfices attendus

Jusqu’à présent, les traitements visant à réguler le système immunitaire chez les patients atteints de sepsis ou de syndrome de détresse respiratoire n’ont pas donné de résultats efficaces, et seuls les corticoïdes sont parfois utilisés en pratique. Ce projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire réagit dans ces maladies. À terme, il pourrait permettre de repérer quels patients sont les plus susceptibles de bénéficier des traitements existants et d’aider à développer de nouvelles thérapies.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de bactéries, de cellules immuniatires ou de chimiothérapie dans la trachée sous anesthésie générale. L'administration de la bactérie dure 30 secondes sous anesthésie générale. L'administration des cellules immunitaire dure 30 secondes sous anesthésie générale. L'administration de la chimiothérpaie dure 30 secondes sous anesthésie générale. Cette administration est répétée une fois 5 jours après.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une injection intratrachéale de bactéries, de cellules immunes ou de chimiothérpie sous anesthésie générale. Ce geste n’est pas douloureux. Il en découlera une hypothermie, une gène respiratoire et une perte de poids transitoire qui est récupérée très rapidement

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de prelever les différents organes à analyser

Remplacement

Le sepsis est une réaction inappropriée d’un hôte à un pathogène qui se traduit par une défaillance d’organe. Il met en jeu une physiopathologie complexe à un niveau moléculaire, cellulaire, d’organe mais aussi de l’organisme entier. L’infection respiratoire nécessite le recrutement de cellules inflammatoires produites par la moelle osseuse, qui sont transportées par le sang jusqu’aux organes et pénètrent les organes via des signaux moléculaires. Il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro (culture cellulaire ou organoïde) qui reproduise la complexité de l’immunité innée humorale, de l’immunité adaptative (qui met plusieurs jours à se mettre en place) ou de la communication entre les organes. L’obtention de données de transcriptomique sur les cellules immunitaires pulmonaires permettra de remplacer un certain nombre d’observations chez l’animal, car ces données permettent d’étudier « in silico » les mécanismes immunitaires à l’œuvre. Ces données pourront être réutilisées pour de futurs projets.

Réduction

La première partie de l’étude consiste à observer et décrire ce qui se passe chez les animaux, sans chercher à tester un traitement particulier. Il n’est donc pas possible de prévoir exactement combien d’animaux seront nécessaires. Pour limiter leur nombre, l’équipe s’est appuyée sur des expériences similaires publiées et sur son expérience passée. Pour la deuxième partie de l’étude, le nombre d’animaux et de groupes a été calculé de manière statistique afin d’être sûr de détecter les différences importantes tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les injections intratrachéales se font sous anesthésie générale, qui apporte du confort pour l’animal et réduit son stress pendant l’intervention. Une dose d'antidouleur sera administrée en cas d’observation de souffrance de l’animal. Des points limites bien établis et suffisamment précoces permettront de minimiser la douleur de l’animal en appliquant les décisions définies.

Choix des espèces

Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle murin de pneumonie est relativement similaire à la pathologie humaine. De plus, le modèle murin pour l’étude de la réponse immunologique au sepsis pulmonaire est le plus couramment utilisé dans la littérature. Souris de 4 à 8 semaines correspondant à de jeunes adultes permettant de mimer les conditions pathologiques humaines. C’est également le stade le plus utilisé dans la littérature permettant une extrapolation et une comparaison de nos résultats avec d’autres travaux.

Capturés dans quinze populations sauvages le long d'un gradient climatique, 225 lézards vivipares mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sur le terrain des mesures, une biopsie de la queue et une prise de sang, puis une semaine d'exposition à des conditions thermiques imposées en captivité, avec deux nouvelles prises de sang. L'objectif déclaré est de comprendre la sensibilité de l'espèce au réchauffement climatique, à des fins de conservation. Tous sont relâchés à leur lieu de capture à l'issue de l'étude, ce que confirment le champ de devenir et la narration.

Objectifs

Comprendre les mécanismes de réponse des organismes aux variations environnementales est un enjeu majeur en écologie et notamment en écologie de la conservation. Les animaux à température variable sont soumis à des contraintes thermiques récurrents pendant la saison d’activité (canicules). Dans ce contexte, il est important de clarifier l’impact de l’exposition à la chaleur et des possibilités d’atténuation des effets. Par exemple, l’accès à la fraicheur nocturne pourrait jouer un rôle clé pour récupérer de l’exposition à la chaleur en journée. De plus les effets des contraintes thermiques peuvent varier selon les populations selon les gradients climatiques avec des effets plus fort des canicules dans les populations en environnement frais. L’objectif principal de ce projet est donc d’évaluer dans quelle mesure, un petit vertébré terrestre, le lézard vivipare répond à des simulations de conditions thermiques imposées en comparant des populations situées sur un gradient climatique naturel. Ces travaux ont des implications importantes en termes de connaissance biologique et de conservation d’espèces qui ont des possibilités limitées de déplacement et sont donc très dépendantes des conditions locales. La prise en compte de ces besoins dans la gestion des habitats/microhabitats naturels pourra par exemple atténuer les effets des épisodes climatiques extrêmes (refuges microclimatiques) et donc favoriser la survie des populations. Cette étude sera menée sur des mâles adultes pour une durée totale de 20 jours. Nous étudierons l’impact de conditions thermiques imposées pendant une période brève (7 jours) avec trois conditions contrastées (frais, chaud le jour, chaud le jour et la nuit). Les conditions choisies reflètent les conditions auxquelles sont exposés les individus dans leur milieu et sont en dessous des seuils dangereux pour la santé. Nous étudierons ainsi les conséquences sur des paramètres physiologiques et comportementaux de cette espèce selon son aire de répartition. Afin de quantifier au mieux les adaptations locales, nous étudierons un maximum de 15 mâles adultes de 15 populations naturelles différentes, un total de 225 mâles soit 75 individus par groupe expérimental. La captivité temporaire est très bien maîtrisée pour l'espèce. Les individus seront replacés sur le terrain à l'issue de l'étude.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de comprendre la réponse au stress thermique dans les populations naturelles de lézards vivipares. Nos précédents travaux dans des populations vivipares du Massif Central suggèrent une accélération du vieillissement, la compréhension écologique et physiologique de ce processus, en explorant l’état de santé des lézards dans des populations ovipares avec des conditions climatiques très contrastées. Par ailleurs, en caractérisant finement les différences de conditions environnementales entre populations nous pourrons mieux comprendre quels facteurs du milieu provoquent ou renforcent ce stress et comment les conditions diurnes et nocturnes interagissent pour moduler ces effets. Ces travaux ont des implications importantes en termes de connaissance biologique et de conservation d’espèces avec des possibilités limitées de déplacement et donc très dépendantes des conditions locales. La prise en compte de ces besoins dans la gestion des habitats/microhabitats naturels pourra par exemple atténuer les effets des épisodes climatiques extrêmes (refuges microclimatiques) et donc favoriser la persistance des populations.

Procédures

Une fois capturés, les individus feront l'objet de mesures morphométriques, d’une biopsie d’un petit morceau de queue et d’une prise de sang. Lors de la phase de captivité, deux prises de sang seront réalisées, avant et après la phase d’exposition thermique.

Impact sur les animaux

La capture sur le terrain est associée à un stress transitoire. Les prélèvements réalisés sur le terrain (prise de sang et biopsie caudale) et en captivité (deux prises de sang) peut générer un stress et douleur transitoire. Enfin une nuisance potentielle est associée aux conditions expérimentales imposées pour simuler les conditions thermiques (7 jours) et notamment le traitement avec chaleur nocturne et diurne. Les conditions thermiques reflètent les conditions auxquelles sont exposés les animaux en situation naturelles et le reflète donc des contraintes écologiquement cohérentes. Les animaux ne sont jamais exposés à leur limite thermique maximum.

Devenir

L'ensemble des animaux sera relâché à l'endroit de leur capture après les mesures réalisées. La remise en nature est cadrée dans l'autorisation de capture de cette espèce de la faune sauvage.

Remplacement

Cette étude vise à comprendre la sensibilité au réchauffement climatique d’une espèce de lézards de milieux frais. Le projet concerne spécifiquement une espèce de la faune sauvage afin de comparer les variations selon les contextes climatique et les populations. Il n’est pas possible de remplacer in vivo ou in silico le modèle biologique utilisé.

Réduction

Pour correctement caractériser l’effet des conditions thermiques et des populations nous avons estimé empiriquement et en tenant compte de nos travaux précédents qu’un effectif de 15 individus par population permettra d’obtenir un échantillonnage suffisant à nos analyses. Ce choix est justifié par un test de puissance statistique pour une taille d'effet équivalente à nos travaux précédents. Nous échantillonnerons 15 populations le long d'un gradient climatique (15 lézards mâle adultes x 15 populations = 225).

Raffinement

Plusieurs raffinements seront mis en place dans le cadre de cette étude. Les mesures sur le terrain seront effectuées en un temps réduits pour limiter les contraintes. Le protocole de terrain a été défini et raffiné par l’équipe depuis plusieurs dizaines d’années. Avant la biopsie caudale l’utilisation d’analgésique local permettra réduire l’inconfort. Le volume sanguin prélevé (sinus orbital) est de 40 µL, soit au maximum (1% masse corporelle). Un collyre ophtalmique analgésique (tétracaïne) sera appliquée sur l’œil une fois l’acte terminé. Les prélèvements seront suivis d’une réhydratation par voie orale) et si besoin d’un apport en fer. Les études sur la sensibilité thermique impliquent souvent la mesures des températures critiques maximum ce qui peut être risqué pour les individus. Nos traitements expérimentaux (7 jours) correspondent à une contrainte thermique modérée avec des températures et éloignées de limites aigues. Les conditions thermiques des conditions d’hébergement standard et lors des traitements thermiques seront suivies en temps réel avec un système de mesure et transmission des alertes (site web, téléphone portable). En captivité au laboratoire, les animaux seront maintenus dans des conditions enrichies validées durant nos précédentes études et respectant la réglementation européenne ainsi que leurs exigences biologiques (gradient de température permettant une thermorégulation active, température des pièces contrôlées, litière et abris, mise à disposition d'eau et de nourriture en illimité. Ces conditions d’hébergements seront raffinées pour mieux correspondre aux besoins spécifiques de l’espèce notamment en terme hydriques sur la base de nos travaux de recherche. En pratique nous réaliserons des aspersions d’eau journalières pour éviter tout risque de déshydratation.

Choix des espèces

Notre étude vise à comprendre comment les conditions climatiques altèrent de façon le niveau de stress et les comportements du lézard vivipare dans le Sud de sa répartition géographique. Il est donc indispensable d’avoir recours à des animaux issus de la faune sauvage pour atteindre nos objectifs. Notre étude se concentre uniquement sur les mâles adultes réduisant les potentiels effets sur les femelles et leurs progénitures. L’ensemble des animaux étant relâchés à la fin de l’expérimentation, cela permet de limiter largement l’impact général de l’étude sur les effectifs naturels.

Pour étudier comment le cortex visuel se réorganise après une lésion de la rétine, 845 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie subit une chirurgie d'une à deux heures pour poser une fenêtre crânienne et une barre de tête, une autre une lésion de la rétine, puis des observations au microscope sur animal éveillé, répétées jusqu'à vingt fois. L'étude déclare vouloir éclairer des maladies comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge et développer des outils de restauration visuelle. Le cerveau est prélevé en fin de projet pour compléter les données anatomiques.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre les dynamiques de la réorganisation des neurones du cortex visuel après une lésion partielle de la rétine. Après une lésion, une partie du secteur du cortex visuel ne reçoit plus d’informations visuelle. Les neurones de ces secteurs finissent par retrouver une activité visuelle, en étant recruté par des neurones avoisinants dont le champ récepteur spatial est proche. La dynamique exacte de cette réorganisation est inconnue. En particulier, nous cherchons à comprendre si la sélectivité pour certains aspects des stimuli visuels de ces neurones avant et après lésion influe sur leur réorganisation. La réponse des neurones du cortex visuel avant et après lésion sera quantifiée par des techniques d’imageries. Dans un second temps, nous chercherons à mesurer in vivo la force des connexions entre les neurones avant et après lésion. Ces mesures seront faites par des techniques d’imageries spécialisés. Ce projet permettra de mieux comprendre les réorganisations des neurones qui suivent une perte fonctionnelle localisée de la fonction rétinienne, qui se produit dans certaines pathologies comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue un axe de recherche essentiel, dont les bénéfices attendus sont technologiques et biologiques. Au niveau technologique, le développement de mesure de la connectivité in vivo via des méthodes tout-optiques, encore jamais été réalisé, constitue une avancée méthodologique importante. Au niveau biologique, les lésions rétiniennes sont un modèle classique de dégénérescence maculaire liée à l’âge. Ce projet permettra de mieux comprendre les conséquences de cette maladie au niveau du système nerveux central. A un niveau plus fondamental, ce projet permettra de mieux comprendre comment les réseaux corticaux adaptent leurs représentations des stimuli visuels lors de perte sensorielles. Enfin, une perspective de ce projet consiste à développer les outils qui pourront être utilisés dans différentes stratégies de restauration visuelle.

Procédures

Une partie des animaux auront une chirurgie sous anesthésie et sous analgésie consistant à injecter des molécules d'intérêt et à poser une fenêtre et une barre de tête pour étudier l'activité neuronale. Durée de la chirurgie : 1h-2h, une fois par animal. Une partie des animaux observés en microscopie sera éveillée, les animaux seront observés sous un microscope et sur un tapis roulant. Durée : 1-3h, répétée au maximum 20 fois. Une partie des animaux subira une lésion focale de la rétine sous anesthésie et analgésie. Durée de la procédure : 5 minutes, une fois par animal.

Impact sur les animaux

La contention de l'animal pour les injections et pour les expériences sur animaux vigiles peut entrainer un léger stress des animaux. Les injections peuvent induire légère douleur de courte durée au moment de l'introduction de l'aiguille. L’immobilisation des animaux sous le microscope peut occasionner un léger stress. De rares effets pourront se produire pendant les chirurgies : mauvaise réaction à l’anesthésie, saignements pendant la chirurgie. Nous nous attendons à ce que les chirurgies de pose d’implants chroniques puissent causer des douleurs post-opératoires, du stress ou une perte de poids temporaire. Après lésion de la rétine, dans de rares cas des atteintes oculaires inflammatoires peuvent être observées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin du projet. Les cerveaux seront prélevés afin d'obtenir des données anatomiques supplémentaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Les nouvelles molécules de ce projet seront d’abord testées sur des échantillons in vitro (cultures cellulaires, organotypiques). Nous sélectionnerons les plus prometteurs pour nos expérimentations in vivo). Des simulations par ordinateur, préliminaires aux expériences, sont utilisés pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des opsines). Les animaux seront utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux impliqués dans la réponse à une stimulation visuelle ne sont pas observables in vitro.

Réduction

L’utilisation d’animaux avec implants chroniques nous permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à chaque expérience et répéter les stimulations et les acquisitions tout en respectant le bien-être des animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (845) est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé à l'aide d'un test statistique de puissance. L’utilisation de méthodes de protéomique moderne permet de quantifier l’expression de nombreuses protéines (jusqu’à 200) sur les mêmes échantillons, réduisant considérablement le nombre d’animaux nécessaires. Nous utiliserons ensuite des tests statistiques adaptés pour l’analyse de nos résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. La température des cages, l’hygrométrie et le cycle jour nuit sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Selon les procédures, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale et d’une analgésie. L’efficacité de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée tout au long de la procédure par test des réflexes. En cas de signes de réveil, une adaptation du niveau d’anesthésie sera réalisée. Des traitements analgésies/anesthésies locaux seront également mis en place. Les souris seront constamment surveillées et réchauffées pendant la phase d’anesthésie et de réveil à 37 degrés Celsius (dans une boîte ou sur un tapis chauffant). Pendant les procédures d’anesthésie générale les yeux seront protégés contre le dessèchement avec gel oculaire. A la fin de la chirurgie l’animal reçoit une dose de solution saline de réhydratation pour l’aider à récupérer rapidement ses capacités. Les procédures sont affinées au cours du temps pour garantir le bien-être des animaux (par exemple la mise à disposition dans la cage de gel pour l’alimentation en cas de perte de poids en post-opératoire). Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée pour assurer une surveillance adaptée des animaux. L’utilisation d’une grille d’évaluation et scoring permettra de définir les points limites précoces et prédictifs à chaque acte expérimental pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être de l'animal. Les animaux étant observés éveillés, ils seront soumis à un entrainement avant les observations au microscope, pour les habituer à leur environnement et réduire le stress.

Choix des espèces

La souris adulte est un modèle très utilisé par les laboratoires de recherche pour étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques. La souris est un modèle établi et très utilisé du système visuel. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études en microscopie multi-photonique en profondeur avec une résolution cellulaire. Au début des procédures, les souris seront âgées entre 7 et 24 semaines (système visuel mature), puis nous effectuerons des expériences sur les réorganisations post lésions des circuits neuronaux corticaux jusqu’à 6 mois post-lésion. La souris permet également d'obtenir des modèles transgéniques présentant un phénotype non dommageable et ne pas nécessitant l’injection de vecteurs viraux.

Huit injections rétro-orbitales, une irradiation du cerveau, un prélèvement de liquide céphalorachidien et une perfusion intracardiaque terminale : 7 137 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines lignées reproduisent la maladie d'Alzheimer et développent, vers neuf mois, troubles de mémoire, déclin cognitif et convulsions. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle de cellules immunitaires inflammatoires dans le vieillissement, les maladies neurodégénératives et les tumeurs du cerveau. Les cibles thérapeutiques évoquées pour les patients restent une perspective lointaine, quand les atteintes infligées aux souris sont immédiates.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de certaines cellules immunitaires inflammatoires dans le cerveau. Ces cellules peuvent apparaître lors du vieillissement, dans certaines maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer, ou dans les tumeurs cérébrales. Nous voulons comprendre comment ces cellules arrivent dans le cerveau, comment elles interagissent avec les cellules cérébrales et comment elles contribuent à l’inflammation. L’objectif est également d’identifier si certaines stratégies thérapeutiques pourraient limiter cette inflammation et améliorer l’évolution de ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait améliorer notre compréhension du rôle du système immunitaire dans plusieurs maladies du cerveau, notamment la maladie d’Alzheimer et le glioblastome. Les résultats pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques visant à réduire l’inflammation cérébrale et à ralentir la progression de ces maladies. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de maladies neurodégénératives ou de tumeurs cérébrales.

Procédures

Irradiation cérébrale unique sous anesthésie générale (durée 4 minutes), suivie d’injections rétro-orbitales répétées (8, durée 1 minute, vigile), de prélèvements sanguins (jusqu’à 3, durée 1 minute, anesthésie locale), d’un prélèvement terminal de liquide céphalorachidien et d’une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde et analgésie adaptée, durée 5 minutes, n=1.Des biopsies auriculaires seront réalisées à J10 à l’aide d’un emporte-pièce stérile (2–3 mm) pour le génotypage sous anesthésie locale, n=1, durée moins d'une minute anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les biopsies auriculaires unduiront un stress léger et transitoire. Les irradations localisées du cerveau et les phénotypes des modèles Alzheimer induiront une inflammation cérébrale et donc possiblement une fatigue générale liée à la réponse inflammatoire systémique et des modifications comportementales légères (réduction de l’interaction sociale, augmentation des périodes de repos). Les modèles Alzheimer peuvent aussi développer des troubles de la mémoire, apathie et anomalies sociales à partir de ~9 mois, associés à une perte neuronale, un déclin cognitif, troubles moteurs (dont ataxie), altération de l’apprentissage et du comportement social ou un déclin cognitif progressif, avec ataxie légère et risque accru d’épisodes convulsifs. Les prises de sang pourront induire une douleur légère et transitoire au point de ponction, un stress bref lié à la contention et rarement des hématomes localisés ou saignements mineurs, rapidement résolutifs. Le prélèvement de liquide céphalorachidien n'induira aucune nuisance étant fait sous anesthésie générale profonde sans réveil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Des approches alternatives ont été envisagées, comme l’utilisation de cultures cellulaires ou de modèles informatiques. Ces méthodes permettent d’étudier certains mécanismes biologiques mais ne reproduisent pas la complexité d’un organisme entier. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment des cellules immunitaires circulant dans le sang peuvent entrer dans le cerveau et interagir avec les cellules cérébrales. Ces phénomènes impliquent de nombreux organes et systèmes biologiques, notamment la circulation sanguine et la barrière hémato-encéphalique. Ces interactions complexes ne peuvent actuellement être étudiées que dans un organisme vivant, ce qui rend nécessaire l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique afin de garantir une robustesse des résultats tout en limitant l’utilisation d’animaux. Pour une analyse comparative multi-groupes (effet du modèle Alzheimer, sexe, temps d'intérêt), nous avons calculé et optimisé le nombre d'animaux nécessaires avec un calcul de puissance. Ce design expérimental permet d’atteindre une puissance statistique suffisante tout en respectant les principes éthiques de la réduction animale. Le caractère terminal des expérimentations (prélèvement du cerveau) ne permet malheureusement pas de suivre un animal.

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement seront mises en œuvre afin de limiter la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec matériaux de nidification et objets d’exploration afin de favoriser l’expression de comportements naturels. Un suivi clinique quotidien sera réalisé afin de détecter précocement tout signe de détresse ou d’altération de l’état général. Toutes les procédures potentiellement douloureuses ou stressantes seront réalisées sous anesthésie et/ou analgésie adaptées, conformément aux recommandations en vigueur. Des points limites précoces permettront d’interrompre les procédures si nécessaire. Dans les modèles impliquant des animaux âgés ou présentant des signes neurologiques, l’accès à la nourriture et à l’eau sera facilité, et une alimentation ramollie ou un gel nutritif pourra être fourni. Dans les modèles tumoraux, une surveillance renforcée sera mise en place afin de détecter rapidement les signes neurologiques et de mettre en place des mesures palliatives (nourriture adaptée, soins) ou d'arrêter la procédure si nécessaire.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet est pertinente en raison de sa forte similitude biologique avec l’humain, tant sur le plan génétique, anatomique que physiologique. Les modèles transgéniques reproduisent des caractéristiques clés de la maladie d’Alzheimer, telles que la formation de plaques amyloïdes, la dégénérescence neuronale ou les troubles cognitifs, permettant d’étudier leurs mécanismes et d’évaluer l’efficacité de traitements dans un contexte biologiquement pertinent. La souris est également privilégiée pour sa facilité de manipulation génétique : il est possible de créer des lignées ciblant spécifiquement les gènes impliqués dans la maladie. Certains outils indispensables à notre étude, comme le suivi in vivo des monocytes, n’existent actuellement que chez ce modèle. Enfin, la physiologie générale du cerveau murin, et en particulier celle de la barrière hémato-encéphalique, reproduit fidèlement celle de l’humain, renforçant la pertinence de ce modèle. L’utilisation de ces souris s’inscrit également dans la continuité de nos travaux antérieurs, permettant de tirer pleinement parti des outils et lignées disponibles dans notre laboraotire. En fonction des études et suivant l'évolution de la maladie dans les modèles considérés, les animaux adultes seront âgés entre 3 et 12 mois. .

1 575 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe une tumeur mammaire, une partie subissant en plus une ablation des ovaires, puis elles reçoivent des injections d'hormonothérapie ou de cellules immunitaires avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever rate, tumeur, foie et poumons. L'objectif déclaré est de comprendre l'effet des œstrogènes sur les réponses immunitaires face au cancer du sein. Le porteur indique avoir envisagé des insectes ou des organismes non-vertébrés, écartés faute d'un système immunitaire comparable, et conclut que la souris est "indispensable".

Objectifs

Le système immunitaire est capable dans la plupart des cas de contrôler l’apparition et le développement des cancers. Dans certains cas les cancers peuvent échapper à ce contrôle immunitaire grâce à de nombreux mécanismes, incluant l'induction de cellules dites "immuno-suppressives". Ces cellules sont capables de bloquer la capacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales. Plusieurs sous-types de cancers du sein ont été définis, basés sur la présence (l’expression) par les cellules tumorales des récepteurs hormonaux ER (récepteurs aux œstrogènes), ou PR (récepteurs à la progestérone). Les cancers hormono-dépendant dépendent ainsi de ces récepteurs. Cliniquement, il est possible de bloquer ces récepteurs en utilisant des molécules spécifiques. Cependant, outre les cellules cancéreuses, certaines cellules immunitaires pourraient également exprimer ces mêmes récepteurs hormonaux. L’effet des œstrogènes sur ces cellules immunitaires reste à ce jour peu connu. Ce projet a ainsi pour objectif de caractériser l’influence des hormones femelles sur les cellules immunitaires tueuses anti-tumorales et sur les cellules immunitaires pro-tumorales impliquées dans l’échappement des cancers au système immunitaire. Un modèle de cancer du sein de souris représentatif des cancers du sein humain et maîtrisé depuis 20 ans par le laboratoire sera utilisé.

Bénéfices attendus

Les données générées au cours du projet proposé devraient permettre : 1) de clairement déterminer l’effet des oestrogènes, le rôle des récepteurs hormonaux ER et des hormonothérapies sur différentes populations de cellules immunitaires pro- et anti-tumorales. 2) De déterminer si, en modifiant le contexte immunitaire chez des souris porteuses de tumeur, les hormonothérapies permettent d’améliorer l’efficacité des immunothérapies. Notre objectif à long terme est d'améliorer les réponses cliniques chez les patientes atteintes de cancer du sein.

Procédures

Modèle de cancer du sein de souris : injection dans la glande mammaire de cellules tumorales (~10 secondes). Ablation des ovaires, environ 15 min. Les procédures se feront sous anesthésie générale. Pour les thérapies: injections intraveineuses (dans la circulation sanguine), intrapéritonéales (dans la cavité péritonéale) ou intratumorales d'hormonothérapie (3 injections tous les 2-3 jours), ou de lymphocytes T (cellules immunitaires anti-tumorales) (1 injection) (temps de la procédure ~10 secondes). Les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale, y compris les animaux mis à mort aux points limites. Des prélèvements des différents organes seront effectués uniquement après la mort de l'animal : - Rates - Tumeurs - Foies - Poumons - Sang.

Impact sur les animaux

Les nuisances, stress et douleurs anticipés seront liés à la manipulation et contention des animaux, aux injections (cellules tumorales ou thérapies) ainsi qu’à la croissance tumorale. La croissance tumorale s'accompagne d'une fatigue générale. Un handicap physique lié à la tumeur primaire n'est pas anticipé puisque les souris seront euthanasiées avant qu'elles atteignent ce stade basé sur des points limites définis. Basé sur nos travaux précédents, les immunothérapies proposées sont bien tolérées et aboutissent dans certain cas à la régression des tumeurs et à la guérison des animaux. Les stratégies permettant une réduction de la souffrance et du stress sont détaillées dans les sections « remplacement, réduction, raffinement » et spécifiquement décrites pour chaque procédure.

Devenir

A l'issu de toutes les procédures, les animaux sont euthanasiés pour collecter les différents organes d'intérêt permettant une analyse du nombre, du phénotype et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires

Remplacement

L'utilisation de modèles de cancers de souris est indispensable à ces études et ne peut être remplacée par des approches alternatives : en effet, la simplicité des systèmes de culture in vitro n'est pas adaptée et ne permettrait pas de reconstituer toute la complexcité cellulaire d'une tumeur et de son environnement immunitaire. De plus, ces systèmes in vitro ne permettent pas l'évaluation de l'influence du microenvironnement propre à chaque organe sur les cellules pro-tumorales in vivo. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des modèles d'insectes ou des systèmes non-vertébrés, mais ces organismes ne possèdent pas les cellules immunitaires retrouvées chez les mammifères, rendant impossible une extension des résultats à l'Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux sera restreint au minimum permettant de dresser des conclusions scientifiques basées sur une approche statistique. Par ailleurs les réponses immunitaires pouvant varier d'une expérience à l'autre, les expériences nécessitent d'être répétées au moins 3 fois.

Raffinement

La procédure majeure consiste à injecter des cellules cancéreuses dans la glande mamaire des souris. Cette procédure ne demande pas de chirurgie, et permet un suivi à long terme; la manipulation des animaux n'engendre pas de douleur et n'est associée qu'à un stress limité. L'évolution tumorale est très documentée, permettant un suivi reproductible et fiable des animaux, ainsi que d'anticiper les signes de détresse potentiels. Concernant l'objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l'angoisse infligées aux animaux, les souris sont hébergées dans des conditions très contrôlées, adaptées à leur fragilité (cages, nourriture et litière stériles). Elles sont observées chaque jour pour repérer tout signe de malaise. Si un animal montre trop de souffrance, il est euthanasié rapidement pour éviter toute douleur inutile. Des limites précises ont été fixées : Perte de poids de plus de 20% d’une semaine à l’autre; Changement de comportement (isolement, posture anormale, poils hérissés); Tumeur dépassant 2 cm. Les souris étant des animaux sociaux, 5 animaux seront placé par cage en présence d'un enrichissement de leur environnement (matériaux pour la fabrication de nids).

Choix des espèces

Il n´existe pas de méthode alternative pour ce projet. Le suivi de la réponse immunitaire chez les patients ne donne qu'une réponse partielle. Il est impossible, pour des raisons techniques et éthiques, d’observer directement chez l’être humain comment une tumeur agit sur le système immunitaire au fil du temps. C’est pourquoi la souris est utilisée, dont l’immunité ressemble beaucoup à celle des humains. L’étude sur la souris permet de suivre précisément comment les cellules du système immunitaire réagissent et évoluent face à une tumeur. Les expériences sur des cellules isolées ou sur des organismes plus simples (comme les insectes) ne permettent pas d’obtenir ces informations, car ils ne possèdent pas un système immunitaire comparable. La souris est donc le modèle le plus fiable et le plus couramment utilisé pour comprendre les mécanismes immunitaires liés au cancer.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant porter une tumeur mammaire pendant deux à six mois. On leur greffe des cellules tumorales dans la glande mammaire, puis elles reçoivent jusqu'à deux administrations par jour pendant 35 jours, avec chirurgie, radiothérapie et prélèvements sanguins répétés selon les protocoles. L'objectif déclaré est de tester des candidats médicaments contre le cancer du sein, aux retombées annoncées à long terme. Le porteur précise choisir des femelles jeunes de 6 à 10 semaines parce que la prise tumorale est moins bonne chez des individus plus âgés.

Objectifs

Les cancers du sein sont les cancers les plus fréquents chez la femme. Ils représentent une pathologie très hétérogène au regard de leurs profils moléculaires et de leurs issues cliniques. En effet, différents sous-types existent et deux patients ayant le même diagnostic initial pourront présenter des différences significatives en termes de localisation dans l’organe, d’agressivité, d’histologie, d’altérations génétiques et de réponse aux thérapies conventionnelles. Un seul type de modèle ne peut donc représenter l’ensemble de ces pathologies. Ce projet vise à évaluer les propriétés anti-tumorales de différentes approches thérapeutiques incluant notamment des candidats médicaments, l’utilisation de rayonnements ionisants (radiothérapie) (associées ou non à une ablation chirurgicale de la tumeur) ou encore l'utilisation de dispositifs médicaux dans des modèles de tumeurs mammaires obtenues par greffe de matériel biologique d’origine tumorale directement dans la glande mammaire de rongeurs (rat ou souris), la souris étant l’espèce animale la plus utilisée.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du sein qui sont les plus fréquents chez la femme. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de tumeurs mammaires ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

Chaque animal pourra subir : - Des contentions vigiles pour induire une anesthésie et une analgésie, administrer le produit ou pour le suivi pondéral et la mesure de la tumeur avec un pied à coulisse : 1-2 min/ geste. - Une implantation, sous anesthésie, de cellules tumorales dans la glande mammaire, durée : environ 2 à 5 min. - Une administration du candidat-médicament, du véhicule ou d’un molécule référence. Durée : jusqu’à 2 min et au maximum 2/jour pendant 35 jours. - Les suivis du poids et de la croissance tumorale par mesure du volume de la tumeur avec un pied à coulisse sont réalisés au moins 1 fois par semaine et jusqu’à tous les jours en fonction de l’apparition des signes cliniques et de l’évolution de la croissance tumorale. La durée du suivi des animaux dépend du développement tumoral mais sera au maximum de 6 mois, avec une moyenne de 2-3 mois. - L’utilisation d’imagerie nécessitera le transport des animaux vers la plateforme d’imagerie. Durée : inférieure à 30 min. - La durée l’imagerie est comprise entre 1 et 5 minutes et entre 15 et 30 min pour une IRM. - Le suivi des tumeurs par imagerie/IRM se fait au maximum 2 fois par semaine sur 5 semaines mais généralement 1 fois par semaine sur 4 semaines. - Une contention dans le cas d’irradiation locorégionale. La durée d’une irradiation excède rarement 5 minutes, 1 fois/jour pendant 2 à 7 jours. - Potentiellement, l’exérèse de la tumeur, Durée : 5 à 15 min, - Des prélèvements sanguins. Durée : 1 à 5 min La fréquence de ces prélèvements est dépendante du volume prélevé et sera par exemple de 1 /semaine sur 6 mois maximum ou 5 /semaine sur 1 semaine.

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux vigiles peuvent engendrer un stress mineur. Ils pourront également subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille ou une contrainte légère lors des administrations selon le type d’administration utilisée, ainsi qu’une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins. Le développement de la tumeur mammaire peut amener à un inconfort voire une réduction de la mobilité des animaux. Les tumeurs peuvent également développer une lésion qui sera évaluée par une échelle de cotation. L’ablation de la tumeur par chirurgie peut entrainer des douleurs post-opératoires limitées par l’administration d’un médicament anti-douleur. Le développement des métastases peut entrainer des inconforts voire des douleurs. La surveillance des animaux est d’autant plus nécessaire dans le cas d’atteinte des poumons, les métastases pulmonaires étant les plus fréquentes dans ce modèle de tumeur mammaire. Par ailleurs, les effets potentiellement indésirables du/des produits testés font l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques et d’ajuster les points limite.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expérimentations car ils auront reçu des cellules tumorales.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les tumeurs mammaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

De nombreuses études publiées dans ce domaine de recherche et utilisant des modèles animaux similaires, et plus particulièrement ces modèles rongeurs, décrivent l'utilisation de 6-10 animaux par groupe. Ce nombre est suffisant pour réaliser une analyse statistique et a également été confirmé et validé en interne. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état de santé des animaux utilisés sera assurée. Le poids des souris sera mesuré régulièrement (au moins une fois par semaine jusqu’à 5 fois par semaine). Lors de l’anesthésie pour les chirurgies, la température corporelles des animaux est maintenue constante grâce à une couverture chauffante ou un bloc chauffant. Les chirurgies se font sous anesthésie et analgésie. Lors du transport à l’extérieur, d'une durée inférieure à 30 min, les cages utilisées seront fermées avec un filtre permettant le maintien du statut sanitaire et éviter une contamination. Et la cage contiendra des éléments hydratants et nutritifs sous forme de gel, des croquettes ainsi que des éléments d’enrichissement. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Sur le site où sont réalisées les expérimentations tout est mis en oeuvre pour limiter les risques de contamination des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués avec notamment une attention particulière à la prise ou à la perte de poids de l’animal. Dans le cas de développement de signes cliniques, de la nourriture humidifiée ou en gel sera mise directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. Dans le cas d’animaux avec phénotype dommageable, selon le phénotype, des enrichissements, de la nourriture humidifiée ou en gel seront mis directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. La SBEA pourra être consultée pour valider les actions mises en place.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans les modèles animaux de tumeurs mammaires obtenues par greffe orthotopique de matériel biologique d’origine tumorale. Ces espèces permettent en effet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie du rongeur. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de candidats médicaments sur la prévention et/ou la thérapie de la pathologie. Généralement, des animaux femelles adultes âgés de 6 à 10 semaines seront utilisés au moment de l’implantation. La prise tumorale est connue pour être moins bonne chez des individus plus âgés.

Impossibles à garder en vie parce que l'irradiation du cerveau provoque des dommages irréversibles et une souffrance prolongée, 234 souris saines vont être utilisées puis tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur cerveau est irradié en une séance sous anesthésie, selon la méthode classique ou le mode FLASH, puis elles passent des batteries de tests comportementaux jusqu'à six mois après. L'étude déclare vouloir mesurer les effets de ces irradiations sur la mémoire, la mobilité et l'anxiété. Le porteur présente ce suivi comportemental comme un progrès pour le bien-être des animaux non-humains, alors qu'il consiste à irradier le cerveau d'individus sains.

Objectifs

La radiothérapie fait partie des traitements les plus utilisés contre le cancer, souvent associée à la chirurgie ou à la chimiothérapie. Elle consiste à utiliser des rayons pour détruire les cellules cancéreuses. Malgré son efficacité, ce traitement peut aussi endommager les tissus sains proches de la zone traitée, ce qui provoque des effets secondaires parfois importants. Une nouvelle approche, appelée « radiothérapie FLASH », cherche à réduire ces effets indésirables. Elle utilise des rayons délivrés à un débit extrêmement élevé, en une fraction de seconde, contrairement aux irradiations conventionnelles plus lentes. Elle pourrait permettre de mieux protéger les tissus sains tout en conservant la même efficacité de traitement contre le cancer. Le projet présenté a pour but d’étudier plus en détail cette technique innovante. Des souris saines seront irradiées au niveau du cerveau, soit selon la méthode classique, soit selon le mode FLASH. L’originalité de cette étude vient du fait qu’elle ne se limitera pas uniquement à l’observation du cerveau au microscope. Elle visera surtout à évaluer les effets de l’irradiation sur le comportement des animaux, à l’aide de plusieurs tests qui permettront d’étudier leur mémoire, leurs réflexes, leur mobilité, leur sensibilité et leurs émotions. Ces observations seront effectuées au fil du temps, afin d’identifier les éventuels changements de comportement à court et à long terme. Ces tests permettront de mieux comprendre comment le cerveau réagit à ce type d’exposition et de déterminer si la radiothérapie FLASH est réellement moins dommageable pour les fonctions cérébrales. À plus long terme, les résultats pourraient aider à améliorer les traitements pour qu’ils soient plus ciblés et mieux tolérés par les patients. Ainsi, cette recherche constitue une étape importante pour développer une une radiothérapie plus protectrice et pour améliorer la prise en charge du patient.

Bénéfices attendus

L’étude consiste à comparer deux types d’irradiation : une irradiation conventionnelle et une irradiation FLASH. Les souris recevront une exposition ciblée au niveau du cerveau, puis seront suivies pendant plusieurs semaines à l’aide d’une série de tests destinés à analyser leurs comportements : mémoire, locomotion, odorat, motricité, anxiété ou encore interactions sociales. Ces évaluations permettront de détecter, avec précision, d’éventuels changements du comportement à différents moments après l’exposition aux irradiations. Ce travail se distingue des recherches habituellement menées en radiothérapie FLASH, souvent centrées uniquement sur des analyses biologiques ou tissulaires. En s’intéressant aux fonctions cérébrales et au comportement, il apportera une vision plus globale des effets des irradiations et permettra de mieux relier les données observées au laboratoire à des effets concrets sur les fonctions du cerveau. Ce projet contribuera aussi à améliorer les pratiques de recherche animale, conformément aux principes des « 3R ». En observant finement le comportement des animaux, il pourrait permettre d’identifier des signes précoces de souffrance ou de dégradation avant qu’ils ne deviennent trop éprouvants et ainsi arrêter l’expérience. À court terme, ces informations aideront à adapter les protocoles pour améliorer le bien-être animal. À long terme, elles serviront à mieux définir les critères de suivi et de protection dans les futures études. En combinant innovation technologique et approche comportementale, cette recherche représente une étape importante pour comprendre comment la radiothérapie FLASH agit sur le cerveau et pour concevoir, à terme, des traitements anticancéreux plus sûrs, plus efficaces et mieux tolérés.

Procédures

Chaque souris recevra une seule séance d’irradiation sous anesthésie générale. Chaque animal sera ensuite soumis à des batteries de tests comportementaux non invasifs, réalisées à 72h, 2 mois et 6 mois post-irradiation. Chaque session de tests dure entre 3 à 30 minutes par animal. Les animaux ne seront soumis qu’à un seul test de comportement par jour sur une durée maximale de 5 jours consécutifs aux temps 72h et 2 mois post-irradiation, puis à nouveau 5 jours consécutifs sur une période de 14 jours, 6 mois après l’irradiation.

Impact sur les animaux

Les effets attendus dépendent du type d’irradiation utilisé. Chez les animaux exposés à une dose de radiothérapie, des effets indésirables peuvent apparaître, tels que : - des réactions locales sur la peau (rougeurs, inflammation, desquamation), - une fatigue générale, une perte de poids, une baisse d’activité, - des troubles neurologiques progressifs comme des difficultés de mémoire ou une augmentation de l’anxiété. Les tests comportementaux peuvent induire des stress légers à modérés et ou révéler de l’anxiété ou de la dépression sur des durées inférieures à 30 minutes.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort si les points limites sont atteints ou à la fin du projet. Les souris ne peuvent pas être gardées en vie après les tests car les irradiations cérébrales peuvent causer des dommages irréversibles et entraîner une souffrance prolongée.

Remplacement

Une formation sur vidéos pour les tests comportementaux remplace l’utilisation d’animaux lors de la phase d’apprentissage des protocoles. L’utilisation d’animaux pour la formation sera limitée, elle ne sera pas nécessaire pour tous les tests comportementaux. Seuls certains tests cognitifs ou moteurs nécessiteront une pratique sur animaux éveillés, car leur fiabilité dépend directement de la qualité de la manipulation, qui ne peut être acquise juste par la théorie. L’étude de l’effet FLASH ne peut actuellement être menée de façon fiable que sur des animaux vivants, car les réponses du cerveau et de l’organisme (inflammation, fonctionnement des neurones, mémoire, comportement) ne peuvent pas être reproduites sur des cellules en culture ou des tissus isolés. Aucune méthode alternative ne permet de simuler fidèlement une irradiation cérébrale totale et ses conséquences cognitives et émotionnelles.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au minimum nécessaire pour garantir la robustesse statistique des résultats. Une formation sur vidéos réduit le nombre d’animaux nécessaires à l’entraînement expérimental. Après avoir réalisé un calcul pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires, des groupes de souris seront constitués pour comparer de manière fiable les effets des deux types d’irradiation : conventionnelle et FLASH. Aucune répétition inutile ne sera effectuée, et chaque souris participera à plusieurs analyses complémentaires (cliniques, comportementales et histologiques), maximisant ainsi les données recueillies par individu.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe social dans des cages contenant de la litière, du coton pour la nidation, des bâtons de bois à ronger et un tunnel par cage. L'ensemble des procédures sera réalisé par du personnel qualifié. Avant le début de l’expérience, les souris seront acclimatées pendant deux semaines, puis habituées aux tests comportementaux. Les procédures ont été conçues pour minimiser la douleur, le stress et l'inconfort. Les irradiations auront lieu sous anesthésie générale. Des mesures préventives comme l’utilisation de chaufferettes pour éviter l’hypothermie et l’application d’un onguent ophtalmique pour protéger la cornée seront mises en place. Ensuite, leur état sera contrôlé régulièrement avec des points limites établis permettant de soustraire l’animal à la douleur.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce pour valider l’effet FLASH en irradiation cérébrale est justifié par son utilisation répandue et bien documentée en radiobiologie, avec des résultats transposables à l’humain. Sa taille permet une irradiation ciblée du cerveau avec le dispositif d’irradiation, et les mécanismes biologiques impliqués sont similaires à ceux observés chez l’homme. Les tests comportementaux sont validés pour évaluer de manière fiable les effets du FLASH sur les fonctions cognitives. En utilisant des souris de la même lignée génétique, on réduit la variabilité entre individus et ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Les souris seront âgées de 8 semaines, un stade de jeune adulte où le cerveau est complètement développé et où les animaux présentent un poids stable, garantissant une réponse physiologique homogène. Cela permet d’assurer la fiabilité des analyses comportementales et histologiques après irradiation.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour l'apprentissage de gestes techniques par des stagiaires d'un diplôme universitaire. Chaque animal subit une contention et au plus deux gestes, injection ou prélèvement sanguin, avant d'être tué pour la partie anatomie et autopsie de la formation. Les souris utilisées sont des animaux de réforme, d'anciens reproducteurs. Le porteur revendique une formation pratique "indispensable", après une phase sur mannequin en silicone jugée insuffisante pour manipuler un animal vivant.

Objectifs

Le Diplôme Inter-Universitaire (DIU) « Formation règlementaire destinée aux personnes concevant des procédures expérimentales, application aux modèles rongeurs et lagomorphes » est une formation, qualifiant des personnes amenées à concevoir des procédures expérimentales et les appliquer. Elle doit donc permettre l’acquisition de compétences théoriques et pratiques pour la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Pour répondre à cet objectif, les travaux pratiques proposés permettent une familiarisation progressive des stagiaires avec l’animal de laboratoire par une partie théorique reprenant les 3R, le modèle souris et la présentation des différents gestes techniques, ainsi qu’une partie technique. La partie technique fait l'objet de cette demande d'autorisation de projet, au cours de laquelle les gestes techniques de base en expérimentation animale, sont enseignés aux étudiants du DIU (préhension, contention, injections et prélèvements de sang). Les travaux pratiques sont réalisés en effectif réduit, sous la supervision d’ingénieurs et de techniciens animaliers. Des enseignements plus théoriques d’éthique, de physiologie du stress et de douleur viennent compléter les connaissances afin que les stagiaires soient en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de pouvoir former les futurs concepteurs et réalisateurs de projets scientifiques, aux bonnes pratiques en expérimentation animale. À court terme, cette formation permet le respect des bonnes pratiques et la prise en compte du bien-être animal. À long terme, un geste réalisé de manière sûre sera reproductible et donc bénéfique pour les protocoles scientifiques menés.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une contention et deux gestes techniques maximum : une injection sous cutanée (40s) ou une prise alimentaire volontaire (1 min) associée à une injection dans l’abdomen (40s) ou un prélèvement de sang à la veine de la queue / mâchoire (1 minute)

Impact sur les animaux

Les injections peuvent provoquer une douleur transitoire de faible intensité au point d’injection. Les prélèvements sanguins peuvent également provoquer chez les animaux une douleur transitoire et un inconfort de faible intensité. La réalisation de ces gestes par des personnes peu expérimentées peut provoquer un stress passager pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour la dernière partie des travaux pratiques concernant l'enseignement de l'anatomie et l’autopsie du rongeur

Remplacement

Avant la mise en oeuvre de gestes effectués sur l’animal, les stagiaires seront formés via des vidéos et avec une souris de simulation Mimicky. La souris de simulation Mimicky est une souris en silicone permettant la préhension, la contention, l’administration orale ou l’injection dans la veine de la queue. Cependant, cette souris de simulation n’est pas suffisante pour l’apprentissage de la préhension d’un animal vivant et mobile. Les animaux vivants ne seront utilisés qu’en cas de besoin, pour les personnes souhaitant se former aux gestes techniques. Ce projet correspond à un enseignement pratique pour des personnels amenés à réaliser des protocoles d’expérimentation animale en autonomie. Les habilitations à l’expérimentation animale sont essentiellement théoriques. Cette formation pratique est donc indispendable pour améliorer les conditions de manipulation des animaux et la fiabilité des résultats obtenus dans les futurs projets de recherche.

Réduction

La stratégie de remplacement par l’utilisation d’animaux de simulation et de vidéos est choisie préférentiellement. Certains gestes pourront également être réalisés sur animaux morts. Les animaux utilisés ne seront pas produits pour cet enseignement, mais sont des animaux de réforme (anciens reproducteurs). Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est limité à 1 par stagiaire. Si le stagiaire est déjà à l’aise avec les gestes qu’il doit effectuer pour ses futurs projets ou s’il ne souhaite pas manipuler de souris car il travaille sur une autre espèce, les animaux ne seront pas utilisés. Pour la majorité des étudiants, la formation sera limitée à l’apprentissage de la préhension, de la contention et d’une injection.

Raffinement

Les gestes de base en expérimentation qui seront réalisés lors de cette formation ne seront réalisés qu’après une bonne maitrise de la contention des animaux, sans stress. Les animaux ne subiront jamais plus de deux gestes techniques, en plus de la contention. Des canules souples seront utilisées pour l'administration orale par gavage (uniquement réalisée par le formateur). Les gestes enseignés sont choisis afin d’éviter le plus possible la contention de l’animal : L’injection en sous cutanée, entre les homoplates, sera privilégiée car ne nécessite pas de contention stricte mais une immobilisation de l’animal sur la grille. Le prélèvement à la veine de la queue sera privilégié car il peut se faire sur animal vigile, sans contention. Les animaux recevront une anesthésie locale pour le prélèvement de sang à la mâchoire.

Choix des espèces

Le DIU est destiné aux personnes concevant des procédures expérimentales appliquées, en partie, aux modèles rongeurs. De plus, la majorité des animaux utilisés à des fins scientifiques étant des rongeurs, former les étudiants sur la souris est essentiel pour mener à bien leurs futurs projets selon les bonnes pratiques Le stade de développement sera dépendant des animaux de réforme fournis. Les animaux seront âgés de 14 semaines à 6 mois.

Trois jours avant l'accouplement puis à sept jours de gestation, 120 femelles reçoivent des pompes osmotiques implantées sous la peau pour diffuser un antiépileptique, et leurs 304 descendants sont ensuite soumis à des tests de motricité et de sociabilité entre 45 et 60 jours, 112 subissant en plus une injection dans le cerveau. 484 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de relier l'exposition prénatale à ces médicaments et l'autisme par des mécanismes épigénétiques. Toutes sont tuées à l'issue pour analyse des tissus, y compris les petits qui peuvent naître avec une malformation de la queue.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique sont des troubles du développement qui touchent environ trois fois plus d'hommes que de femmes. Ces troubles se manifestent principalement par des difficultés dans les interactions sociales et des comportements répétitifs. Les facteurs environnementaux, comme l'exposition à certains médicaments pendant la grossesse, jouent un rôle important dans l'apparition de ces troubles. Par exemple, des médicaments utilisés pour traiter l’épilepsie, comme l'acide valproïque, ont été confirmés comme pouvant augmenter le risque d’autisme chez l’enfant à naître. D'autres médicaments, comme le topiramate ou la lamotrigine, sont également utilisés pour traiter l’épilepsie, mais leurs effets sur la descendance n'ont pas été clairement étudiés. Bien que ces médicaments n’affectent pas directement le code génétique, ils peuvent influencer l'expression des gènes à travers des mécanismes appelés épigénétiques. Cela signifie qu'une exposition à ces médicaments à des moments critiques du développement de l'embryon ou du fœtus pourrait changer la façon dont certains gènes fonctionnent, augmentant ainsi le risque d’autisme. Notre étude se concentre sur des modèles animaux pour comprendre le rôle de ces mécanismes épigénétiques et le lien entre la prise de ces médicaments par la mère pendant la grossesse et l'autisme chez l’enfant.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à mieux comprendre les risques liés à l'utilisation de certains médicaments antiépileptiques chez les femmes enceintes, et leur impact sur les descendants. À court terme, nous espérons que cette recherche nous aidera à identifier les régions du génome affectées par ces médicaments chez les animaux, ce qui permettra à moyen terme de les étudier chez des personnes atteintes d’autisme qui ont été exposées à ces médicaments avant leur naissance. Cela pourrait conduire à des tests diagnostiques et à la découverte de nouveaux traitements pour l'autisme.

Procédures

3 jours avant l'accouplement et à nouveau à 7 jours de gestation, des pompes osmotiques seront implantées sous anesthésie générale (10 min par implantation) en sous cutané chez les 120 femelles adultes. LES 304 DESCENDANTS seront soumis à des tests de motricité et d'évaluation de leur sociabilité, en condition vigile ; entre l'âge de 45 et de 60 jours, chaque souris subira 5 tests d'une durée maximale de 10 minutes pour les 4 premiers tests et de 35 minutes pour le cinquième test. Les tests seront réalisés sur 5 jours consécutifs avec 1 test par jour. 112 SOURIS AURONT UNE INJECTION CEREBRALE DE 1 HEURE.

Impact sur les animaux

Traitement prénatal : léger stress des mères lors de la manipulation - Chirurgie pour mise en place de la pompe et CHIRURGIE STEREOTAXIQUE : douleur post-opératoire minorée par des antalgiques traitement et inconfort transitoire au réveil - Pompe osmotique sous cutanée : gène légère pendant la durée de l’expérience -Avec le modèle d'injection unique d'acide valproïque, il a été constaté une taille des portées inférieure à ce qui était attendu. D’après notre expérience, pas de nuisances visibles sur la mère. -Pour les descendants exposés aux antiépileptiques : légère altération de la motricité et de la sociabilité. L’espérance de vie des petits n’est pas affectée après le sevrage. -Les tests comportementaux, Pour chaque souris du projet : L’ensemble des tests comportementaux évaluant le développement et la motricité générale pourront engendrer un stress léger et transitoire lié à la manipulation chez les souris et à la découverte d'un nouvel environnement. - Identification des petits : légère douleur transitoire due à la pose de bague dans le pavillon de l’oreille - Malformation de la queue (malformation congénitale) possible chez les petits issus de mères traitées avec les antiépileptiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses de tissus.

Remplacement

Ce projet inclut une étude du comportement, en particulier des aspects sociaux et moteurs, qui ne peut pas être reproduite en laboratoire sur des cellules ou via des modèles informatiques avec les connaissances actuelles. Il y a des éléments obtenus par des études cliniques, in silico et in vitro, sans animaux, qui indiquent une association entre anti-épileptiques et autisme. A ce stade de l'avancée des connaissances, seul une étude in vivo dans un organisme entier avec un réseau de neurones permet d'apporter la preuve du lien de cause à effet.

Réduction

Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques pour l’interprétation des résultats obtenus. Le nombre d'animaux à utiliser par expérience a été calculé de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs malgré la variabilité interindividuelle. De plus nous mettrons en place une stratégie d’accouplement restreinte au juste nécessaire en réalisant les accouplements par étapes successives jusqu’à obtention du nombre d’animaux nécessaires à nos études.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites stricts et précis et des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, une pesée est réalisée 1 fois par semaine. Après leur naissance, les animaux resteront avec leur mère jusqu’au sevrage (J21-J28), hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fournie par l’animalerie avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum.. La prise de sang terminale pour l’analyse épigénétique sera réalisée sous anesthésie avec une couverture antalgique. Les animaux seront placés en habituation dans la pièce de comportement minimum 30 minutes avant le début des tests. Les cages d’hébergement présentent des capteurs et sont suivis par logiciel permettant d’améliorer le bien-être animal et de surveiller et vérifier les cages 24heures sur 24. Enfin afin de respecter le bien-être animal, nous avons choisi à la place d'injections quotidiennes, l'implantation de pompes sous-cutanées délivrant le traitement en continu.

Choix des espèces

Les rongeurs sont à ce jour les espèces modèles ayant un système nerveux moteur proche de l’Homme. Les souris ont l’avantage d’être un modèle de choix pour les études comportementales. La souche de souris que nous utilisons est consanguine ainsi ces animaux présentent un fond génétique identique entre eux. De plus un environnement contrôlé au sein de notre animalerie nous permetta d’identifier des marques épigénétiques spécifiquement liées à l’exposition à l’agent étudié. Les mères et les pères effectueront les reproductions entre l’âge de 12 et 20 semaines (femelles) et 25 semaines (mâles), âge optimal pour la reproduction. Les souris de la descendance seront incluses dans le projet dès leur naissance et manipulées entre Jour 45 et Jour 60 pour les analyses comportementales, âge de référence pour la mise en évidence de troubles du spectre autistique sur le plan comportemental avec les outils utilisés.

Opérées pour une injection virale dans le cerveau puis soumises à trois sessions d'enregistrement électrophysiologique sous anesthésie, 20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale de prélèvement. L'objectif déclaré est de cartographier un circuit reliant cortex préfrontal, thalamus et hippocampe pour comprendre les mécanismes de la dépression. Les retombées thérapeutiques annoncées restent au conditionnel et à long terme, l'étude visant d'abord à décrire l'activité de ce circuit. Le porteur affirme que la complexité du cerveau des mammifères rend le modèle animal irremplaçable, tout en concluant que ces travaux préparent un remplacement futur.

Objectifs

Des découvertes scientifiques récentes ont identifiées la dysrégulation des circuits neuronaux, en particulier ceux émergeant du cortex préfrontal, comme jouant un role central dans les mécanismes neuropathologiques des troubles psychiatriques tels que la dépression. Ce projet vise à caractériser les mécanismes électrophysiologiques du circuit neural reliant le cortex préfrontal, le noyau réuniens du thalamus et l'hippocampe. L'objectif est de comprendre comment l'activation du cortex préfrontal par des techniques pharmacogénétiques se propage à travers ce circuit pour influencer l'activité neuronale dans les structures cérébrales impliquées dans la régulation de l'humeur.

Bénéfices attendus

Cette recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques sous-tendant les troubles de l'humeur, en particulier la dépression. Les connaissances acquises sur le fonctionnement de ce circuit neural essentiel contribueront au développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant spécifiquement ces voies neuronales. Cette étude fournira également des bases scientifiques importantes pour la recherche translationnelle en psychiatrie.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie pour injection virale réalisée sur animal anesthésié et analgésié ( durée 60-90 minutes). Puis ils subiront 3 injections d’une molécule active réalisée sur animal vigile (durée moins de 1 minute) afin de faire trois sessions d'enregistrements de l’activité électrique des cellules nerveuses du circuit ciblé sur animal anesthésié et analgésié ( 3 sessions de 60 minutes chacune). Des injections intrapéritonéales d'activateur pharmacogénétique seront administrées (20 souris, 3 injections). Les animaux seront soumis in fine à une chirurgie terminale afin de prélever du tissu pour analyse.

Impact sur les animaux

La procédure de chirurgie pour injection virale pourrait induire une douleur modérée ainsi que des réactions inflammatoires locales. La gène occasionnée par le capot collé sur le crâne pour protéger la zone d'enregistrement est mineure, celui-ci pesant moins d’un gramme. L'injection de l'activateur chemogénétique peut induire une douleur aiguë de courte durée liée à l'injection. Ce composé n'a pas d'effets secondaires non spécifiques connus à la dose utilisée. Aucun effet secondaire comportemental n’est attendu suite à l’activation du cortex préfrontal, hormis un effet antidépresseur et un effet anxiolytique léger.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement et analyse des tissus.

Remplacement

La complexité du cerveau des mammifères est unique. Bien qu'il soit maintenant possible d'étudier de nombreux problèmes neurobiologiques sur des cellules isolées ou des cultures de tissus, l'utilisation de modèles animaux ne peut être remplacée dans ce projet. Les connaissances sur les mécanismes électrophysiologiques du circuit préfrontal-réuniens-hippocampe sont bien trop limitées, et de fait aucun modèle in silico (tels que les cérébroïdes) in vitro n'existe pour modéliser l'activité de ce circuit complexe. Il s'agit d'un réseau neuronal faisant intervenir plusieurs types cellulaires spécifiques et régions du cerveau, avec de nombreuses protéines et neurotransmetteurs impliqués. En outre, l'étude de l'activité électrophysiologique in vivo est primordiale pour comprendre les patterns d'activation neuronale dans des conditions physiologiques. De plus, cette étude permettra d'en apprendre plus sur ce circuit et fera avancer les connaissances en vue d'un remplacement futur.

Réduction

La taille des échantillons a été déterminée sur la base d'une vaste expérience de laboratoire et a été vérifiée par une analyse de puissance mathématique. L'approche d'enregistrements séquentiels permet une réduction significative du nombre d'animaux nécessaires, chaque souris servant pour les trois sites d'enregistrement au lieu de nécessiter des groupes séparés pour chaque structure. Cette stratégie optimise l'utilisation des animaux selon les principes des 3R.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages enrichies leur permettant d'exprimer les comportements naturels de l'espèce : matériel de nidification (carrés coton, frisure), tunnel (également utilisé pour le change des animaux) et bâton à ronger. La chirurgie d’injection virale est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Durant toute la procédure l’animal est placé sur un tapis chauffant thermostaté à 37°C et relié à une sonde rectale afin de limiter l’hypothermie induite par l’anesthésie. Une pommade ophtalmique sera appliquée sur les yeux empêchant la déshydratation oculaire. Avant le début de la chirurgie, une couverture antalgique multi-modale sera faite. L’hydratation de l’animal sera assurée pendant et après la chirurgie par injection d’une solution saline stérile. Puis , l'animal sera replacé au sein de sa cage, maintenue sous lampe chauffante infrarouge afin de maintenir sa température corporelle jusqu'à son réveil complet. Puis l’état de santé des animaux sera suivi pendant 3 jours et évalué à l’aide d’une grille de score. Des points limites ont également été pré-définis afin de déterminer quand arrêter chaque procédure expérimentale afin de prévenir la souffrance animale et garantir la qualité des résultats. Les enregistrements électrophysiologiques sont également réalisés sous anesthésie, et avec analgésie post-opératoire En fin de procédure la chirurgie terminale sera réalisée sur l’animal après arrêt respiratoire. Le système de skull cap permet de réduire considérablement le stress lié aux interventions répétées en évitant de nouvelles incisions cutanées. Les animaux seront habitués à être manipulés pour minimiser le stress lors de la procédure.

Choix des espèces

Les cerveaux murins et humains possèdent de nombreuses similitudes, notamment des régions et circuits analogues (système limbique, cortex préfrontal) permettant de modéliser des réactions et phénotypes neurobiologiques comparables à ceux observés chez l'homme. Le circuit d'intérêt pour le projet est bien conservé entre la souris et l'homme, avec des projections anatomiques et des propriétés électrophysiologiques similaires. Les techniques d'enregistrements électrophysiologiques aigus sont largement établies et standardisées chez la souris, permettant une caractérisation précise de l'activité neuronale dans ces structures. L'utilisation de la souris s'inscrit dans la continuité de nos projets de recherche précédents, permettant une comparaison directe des résultats électrophysiologiques avec les données comportementales déjà obtenues dans notre laboratoire. Notre étude sera effectuée chez l'adulte jeune (8-14 semaines). L'étude repose sur l'exploration des enregistrements électrophysiologiques et nécessite que les systèmes neurobiologiques soient totalement matures (développement total des systèmes cognitifs et émotionnels, et des structures cérébrales cibles).

Lavages vaginaux d'abord quotidiens, puis chirurgie de retrait des ovaires et greffe de tissu ovarien de truie dans un muscle: 65 souris immunodéprimées vont être utilisées, classées en souffrance modérée. Le prélèvement de sang et de tissus en fin de protocole rend leur réveil impossible, elles seront donc toutes tuées. Le projet évalue si du tissu ovarien de jeune truie reprend sa croissance après congélation. La finalité tient à la filière porcine, avec la conservation de races d'élevage à forte valeur commerciale.

Objectifs

Notre équipe de recherche a été sollicitée dans le cadre de ce projet afin d’intervenir chez les races porcines à petit effectif pour lesquelles des chirurgies consistant à retirer les ovaires sont réalisées en pratique courante en élevage et permettent l’accès à du tissu ovarien au titre de déchets biologiques. Dans ce contexte, cette étude de transplantation de tissu ovariens de truie sur souris a pour objectif d’évaluer la reprise de croissance de la greffe de truie après cryoconservation (procédé de conservation à très basse température). En effet, un retour de la fonctionnalité permettrait d’étudier la croissance d’un tel tissu et de valider leur bonne qualité après cryoconservation.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, peu d’études ont été réalisées sur le tissu ovarien de truies prépubères. Par conséquent, à court terme, notre étude pourrait permettre d’acquérir davantage de données sur la croissance des cellules du tissu prépubère et surtout d’apporter des éléments de compréhension nouveaux sur l’effet de la cryoconservation sur la fonctionnalité de ce type de tissu. Par ailleurs, l’âge des donneuses (~2mois) utilisées dans notre étude permettra d’apprécier l’éventuelle mise en place de mécanismes de blocage/activation de la croissance de tissu ovarien certe prépubère mais très précoce. A plus long terme, des bénéfices pour la filière porcine pourraient découler de ce projet dans la mesure où la qualité de ce tissu cryoconservés serait validée par une reprise de croissance post greffe. En effet, la filière porcine pourrait de ce fait bénéficier d’un outil supplémentaire de conservation patrimoniale de races à fortes valeure ajoutée. En association avec d’autres biotechnologies de la reproduction comme la maturation in vitro et la fécondation in vitro cette méthode permettrait d’envisager l’obtention d’animaux vivants et serait utile à la filière aussi bien dans un objectif patrimonial que de sauvegarde dans un contexte sanitaire de plus en plus complexe (Peste porcine africaine PPA, Syndrome dysgénésique et respiratoire du porc SDRP…).

Procédures

L’ensemble des animaux sera soumis à des lavages vaginaux d’abord quotidiennement puis toutes les 2 semaines à partir de l’apparition des premieres cellules prouvant la bonne reprise de la greffe, la contention nécessaire à ce geste est estimé à quelques minutes par animal. Tous les animaux seront anesthésiés (gazeuse) pour la réalisation de la procédure chirurgicale. Ils resteront anesthésiés (gazeuse) le temps de la réalisation des différents actes, soit au maximum 1h environ. Toutes les souris recevront une injection de 500µL de sérum physiologique sous la peau durant la chirurgie et 12h post chirurgie. Enfin des administrations d’analgésiques seront également réalisées avant la chirurgie et durant les 3 jours suivants (animale vigile), ces dernières seront faîtes 2 fois par jour sous la peau. La durée de ces gestes est estimée à quelques secondes (moins d'une minute par animal).

Impact sur les animaux

Tout au long de l’étude, les animaux seront manipulés et subiront une contention ainsi qu’un lavage vaginal à l’aide d’une irrigation vaginale au sérum physiologique. Cet acte sans douleur générera du stress. Les animaux seront soumis à des actes chirurgicaux (retrait des ovaires et greffe dans le muscle) pouvant engendrer de l'inconfort, une douleur modérée et du stress, durant quelques jours après la chirurgie (estimé à 3 jours) qui sera réduite au maximum par le suivi post-opératoire et les traitements analgésiques. Des complications avant et après la chirurgie ainsi que des signes de rejet de greffe peuvent aussi être observés chez les animaux. Ces souris possédant pas d'immunité, une attention particulière sera portée sur l'apparition de signe d'infection chez les animaux. Les contentions et injections pour les traitement provoqueront un stress et une douleur transitoire chez les animaux.

Devenir

Le volume de sang prélevé pour analyses en fin de protocole ainsi que les prélèvements tissulaires réalisés rendent impossible le réveil de l’animal à la fin de l’anesthésie.

Remplacement

A l’heure actuelle, la greffe reste le meilleur moyen d’évaluer les capacités fonctionnelles de ce tissu ovarien dans la mesure où les méthodes alternatives in vitro (culture de cellules) ne sont pas complètement maitrisées chez la truie et tiennent peu compte de l'environnement tissulaire. Dans un objectif d’étude de la fonctionnalité du tissu, le recours à des cellules isolées ne rélète que partiellement la fonction ovarienne et l’absence de l’environnement cellulaire classique ne permet pas d'assurer le développement cellulaire normalement observable dans un organisme vivant.

Réduction

Les résultats obtenus lors des premiers essais de greffe nous ont permis d’obtenir des données préliminaire et d’effectuer des calculs statistiques du nombre minimal d’individus nécessaires pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d'enrichissement adaptés à l’espèce. Les portoirs et cages sont placés de façon à ce que les animaux ne soient pas trop exposés à la lumière avec la présence d’un environnement sonore (radio) afin de réduire le stress des animaux durant le déroulé du projet. Les animaux recevront une récompense alimentaire après les manipulations stressantes (notamment les rinçages vaginaux) de façon à induire un renforcement positif. Les animaux seront hébergés par cages de 5 souris, et opérés en respectant cette répartition afin de gérer les phases de réveils des animaux au mieux. Durant la période post-opératoire (3 jours) une surveillance accrue des animaux sera effectuée avec l’utilisation de grilles de quantification de la douleur. Les animaux seront suivis de façon biquotidienne pour l’observation de l’état général, de l’état des cicatrices et du comportement des animaux. Une injection d’analgésique avant l'opération ainsi que 2 fois/jour durant les 3 jours suivants sera effectuée. Après cette période les animaux seront observés quotidiennement dans leur cage et un examen clinique avec pesée sera réalisé 1 fois par semaine. Un vétérinaire pourra, le cas échant, réaliser un examen clinique approfondi sur les animaux. Des points limites suffisament prédictifs ont été définis.

Choix des espèces

Le recours au modèle rongeur (souris) comme receveur permet l’utilisation d’animaux naturellement immunodéprimés, ayant un cycle de vie ainsi qu’un cycle reproducteur courts et une taille réduite. De plus, ce modèle a déjà été validé comme supportant la greffe de tissu ovarien provenant de nombreuses espèces. Les souris adultes seront reçues à 8 semaines de façon à être matures sexuellement et d’un gabarit suffisant pour les étapes de chirurgie.