Procédures modérées
Evaluation de dispositifs médicaux basés sur l’échographie chez des modèles porcins de maladies du foie.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Tous mis à mort en fin de protocole, 31 porcs vont être utilisés pour tester des sondes échographiques sur des maladies du foie. Six sont opérés sans réveil, les 25 autres relèvent d'une souffrance modérée. Une maladie hépatique de type cirrhose leur est provoquée par chirurgie, puis suivie toutes les deux semaines par biopsies, prises de sang et échographies sous anesthésie, avant une intervention finale. Le RNT justifie la mise à mort en indiquant que garder vivants ces animaux rendus malades ne ferait qu'augmenter leur souffrance.
Objectifs
Ce projet présente plusieurs objectifs. L’objectif principal est de tester de nouvelles sondes échographiques pour améliorer le diagnostic et/ou traitement des patients souffrant de pathologies du foie. Actuellement, la détection des pathologies du foie (fibroses, cirrhose) se fait tardivement, notamment par une survenue tardive des symptômes cliniques qui conduisent les patients à passer une IRM, avec souvent des temps d’attente long, pour obtenir un diagnostic. L’échographie est un moyen accessible et rapide à mettre en œuvre et pourrait constituer une alternative intéressante au diagnostic des pathologies du foie, qui représentent un enjeu de santé majeur. En effet, les maladies chroniques du foie touchent des centaines de millions de personnes. Parmi elles, la fibrose hépatique, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (CHC) constituent des stades successifs d’un même continuum pathologique, objet de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’explorer les mécanismes biologiques précoces de la fibrose et de l’évolution vers la cirrhose et ses complications, en identifiant les signaux échographiques exploitables pour un diagnostic en amont. Il offrira également une base robuste pour évaluer la sensibilité, la spécificité et la fiabilité de nouvelles technologies de détection échographique, afin d’améliorer le diagnostic des patients atteints de pathologies hépatiques, et d’adapter leur prise en charge le plus tôt possible. En effet, la détection tardive des maladies du foie constitue un obstacle majeur à une prise en charge efficace. Il représente ainsi une avancée concrète à la fois pour la recherche, le diagnostic médical et la santé publique.
Procédures
Un lot d’animaux aura une première chirurgie qui permettra d’induire une maladie du foie sous anesthésie générale. Dans le cas où le développement de cette maladie se ferait correctement, les animaux auront toutes les deux semaines, sous anesthésie générale, un contrôle (biopsies, prise de sang, échographie) permettant de vérifier l’évolution de la maladie et de tester des dispositifs médicaux. Enfin après 8 semaines, les animaux auront une chirurgie finale permettant de tester un autre dispositif dans les conditions cliniques similaires chez l’humain. Un second lot d’animaux aura une chirurgie finale sous anesthésie générale permettant de tester un dispositif de guidage lors d’une résection du foie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sans réveil sont liés à l’induction de l’anesthésie : stress à la contention, injection intramusculaire (douleur transitoire au niveau du site d’injection). Les effets indésirables pour le modèle chronique peuvent être en plus de l’induction à l’anesthésie : le réveil qui peut s’accompagner de nausées, désorientation, hypothermie, irritation trachéale. Les effets indésirables liés au développement du modèle peuvent être : une inflammation locale, une diminution transitoire de l’appétit et de l’activité, ainsi qu’un inconfort abdominal (ascite), fièvre, diarrhée, jaunisse.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour des analyses macroscopiques des organes ou encore des analyses histologiques. De plus, le modèle ayant pour but de rendre les animaux malades, cela ne serait qu’augmenter leur souffrance inutilement de les maintenir en vie.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle alternatif permettant de reproduire les différents stades de pathologies du foie autre que le modèle animal vivant. De plus, l’objectif du projet est de pouvoir tester des dispositifs médicaux permettant de détecter de façon précoce les signes de survenue des différents stades et d’éventuellement les traiter. Le modèle doit donc évoluer de façon à reproduire les pathologies humaines. Seul le modèle animal offre actuellement cette possibilité.
Réduction
Des tests préliminaires seront réalisés sur des cadavres de porc, ainsi que des organes explantés, afin de tester l’ergonomie des sondes et identifier les emplacements adéquats au préalable des tests sur modèles vivants. Les animaux ne répondant pas favorablement au traitement d’induction de la pathologie seront réaffectés à une autre partie du projet, réduisant ainsi le nombre total d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux donné est un nombre maximal. Dans le cas où la quantité de données est récoltée plus tôt, les animaux ne seront pas tous utilisés. Lorsque cela sera possible, des animaux issus d’autres projets pourront être réutilisés pour celui-ci après une récupération complète validée par la vétérinaire.
Raffinement
Toutes les procédures sont effectuées sous anesthésie générale avec couverture antalgique. Pour le modèle de cirrhose, les animaux seront surveillés très rigoureusement en animalerie afin de ne pas dépasser les points limites déterminés en amont. Les animaux sont surveillés quotidiennement, une grille d’évaluation de l’état de santé de l’animal est établie avec la conduite à tenir. Une vidéosurveillance 24h/24 permet un suivi des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance. Les porcs sont maintenus en groupe social dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie. Ils reçoivent des jouets et dispositifs favorisant leurs comportements naturels comme le fouissage et mâchouillement. Un temps d’acclimatation avec douche tiède, promenade et distribution de récompenses permet l’habituation des animaux à l’homme et aux manipulations. La Structure en charge du bien-être animal accompagne la mise en œuvre des procédures. Avec le vétérinaire désigné, elle conseille les responsables du projet dans l’amélioration de leurs pratiques en faveur du bien-être des animaux et de l’application des 3R. Le protocole pourra être raffiner en fonction des résultats obtenus sur les premiers animaux. Les doses d’agents irritants, pourront par exemple être diminuée dans le cas où le traitement serait trop agressif pour les animaux.
Choix des espèces
Le porc charcutier représente un modèle animal très intéressant pour la mise en place de ce type de modèle car : - Sa taille et son anatomie montre de nombreuses similitudes à celle de l’Homme, ce qui rend les procédures compatibles avec les dispositifs médicaux existant. La vascularisation hépatique et portale est très comparable à celles de l’humain. Un porc charcutier de 3 à 4 mois, qui pèse entre 30 et 50 Kg, nous permet d’avoir un modèle hépatique et vasculaire pertinent pour réaliser différentes interventions dans les mêmes conditions que chez le patient (taille des instruments, volumes des organes, voies d’abord, ergonomie, orientation…) Pour des raisons de poids et de manutentions à la fin de la procédure, les animaux engagés dans la procédure 1 seront de l’ordre de 30 kg à J0. La croissance de jeune porcs charcutiers étant continue et rapide, des animaux trop lourds à J0 ne seraient plus transportable à la fin de la procédure.
Identification de gènes impliqués dans le développement du médulloblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6858 souris vont être utilisées pour ce projet sur le médulloblastome, une tumeur cérébrale de l'enfant, dont 6114 classées en souffrance sévère. Des fragments de tumeur sont greffés sous la peau ou des cellules injectées dans le cerveau, suivies d'imagerie sous anesthésie, de traitements répétés et de tests de mémoire. Toutes seront tuées pour analyses. Ce chiffre de près de sept mille animaux, dont la grande majorité en souffrance sévère, accompagne des bénéfices thérapeutiques décrits au conditionnel et à long terme.
Objectifs
Le médulloblastome (MB) est une tumeur pédiatrique invasive du cervelet. Il représente la tumeur maligne du système nerveux central la plus fréquente chez l'enfant. Même si le taux de guérison a été amélioré pour atteindre 70 à 80% de survie suite aux traitements classiques, associant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie, les effets secondaires associés sont sévères et 20 à 30% des patients restent incurables et ne survivent pas. Quatre groupes de MB ont été identifiés possédant des caractéristiques moléculaires et cliniques différentes et répondant différemment aux traitements. Le groupe 3 (20 à 25% des cas), le plus problématique d'un point de vue clinique, est métastatique, de très mauvais pronostic et résistant aux thérapies actuelles. Les MB de ce groupe restent encore mal caractérisés. Il est donc urgent d'identifier les événements oncogéniques (processus capables d’induire de la tumeur) participant à leur carcinogenèse afin de proposer des stratégies thérapeutiques alternatives. In vitro, nous avons sélectionné et validé l'importance dans la progression tumorale de plusieurs gènes dont l'expression est augmentée dans le MB de groupe3 par rapport aux trois autres groupes dans nos modèles de lignées cellulaires. Nous allons implanter des cellules de MB génétiquement modifiées chez la souris pour évaluer si la modulation de l’expression de notre gène d'intérêt influence la croissance tumorale. Nous analyserons également in vivo les effets d’inhibiteurs pharmacologiques ciblant les processus dans lesquels nos gènes d’intérêt sont impliqués. Nous évaluerons si un traitement avec ces molécules conduit à une régression du MB ainsi qu’à une augmentation de la survie des souris. Au préalable, ces inhibiteurs pharmacologiques, potentiels agents thérapeutiques, seront testés in vitro dans différents modèles. Seuls les plus prometteurs seront testés in vivo. La réalisation de ce projet de recherche pourrait permettre d'identifier de nouveaux acteurs clés de la carcinogenèse du MB et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces MB agressifs résistants à l'ensemble des thérapies actuelles.
Bénéfices attendus
L’étude portant sur l’identification d'oncogènes et de gènes suppresseurs de tumeur dans le médulloblastome permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des tumeurs et la rechute. Ce projet a pour but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer le traitement de ces cancers tout en diminuant les effets secondaires indésirables associés. Les bénéfices directs attendus sont de deux ordres : l'un cognitif pour une meilleure compréhension des mécanismes tumoraux et de résistance aux traitements, l’autre, d’ordre sociétal en santé humaine avec le potentiel développement de nouvelles thérapies plus efficaces pour soigner des patients atteints de cancers pédiatriques. En effet, la validation de cibles thérapeutiques permettra l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques notamment des thérapies ciblées qui s’inscrivent dans le développement d’une médecine personnalisée. Cette forme de médecine plus précise cible de manière spécifique le type de tumeur propre à chaque patient. Les thérapies ciblées peuvent être combinées à d’autres traitements tels que la radiothérapie ou la chimiothérapie déjà bien connus mais ayant des effets secondaires lourds. Dans le cas de combinaison de traitement, on peut envisager de diminuer les doses et ainsi réduire les effets secondaires. Cette stratégie thérapeutique permettrait donc d’améliorer l’efficacité des traitements tout en diminuant les effets délétères. De plus, les thérapies ciblées préservent davantage les cellules saines et donc impactent moins la qualité de vie des patients contrairement aux chimiothérapies ou à la radiothérapie. Les effets indirects attendus en réduisant les effets secondaires indésirables pourront donc avoir un effet sociétal en diminuant les handicaps associés et permettant une meilleure intégration des patients dans la société, mais aussi avoir un impact économique en réduisant la nécessité de soins liés aux effets secondaires. La bonne connaissance de nos modèles nous garantira une qualité au niveau de nos expériences ce qui contribuera à l’enrichissement des connaissances à travers la publication de nos résultats dans des journaux scientifiques.
Procédures
Dans un premier lot, des fragments de tumeurs seront greffés aux souris anesthésiées (1 fois par expérience/ 10 minutes/ souris) ou des cellules tumorales seront injectées aux animaux éveillés (1 fois au cours de l’expérience/ 1 minute/ souris). Les animaux seront ensuite suivis, et les tumeurs mesurées à l’aide d’un pied à coulisse (1 à 2 fois par semaine/ 1 minute/souris). Les animaux recevront un ou plusieurs traitements (7 administrations max /semaine) soit par injection soit par voie orale,. (Environ 1 minute/souris) Dans un second lot, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des souris anesthésiées (1 fois au cours de l’expérience/ 10 minutes/souris), puis suivies à l’imagerie sous anesthésie (1 fois par semaine/ environ 20 minutes/souris). Ces mêmes animaux recevront un ou plusieurs traitements (max/ 7 semaines) soit par injection soit par voie oral. (Environ 1 minute/souris) Afin d’évaluer la capacité d’apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaine (chaque séance ayant une durée de moins de 10min par animal).
Impact sur les animaux
À la suite de la greffe des cellules ou de fragments de tumeurs, une perte de poids peut être observée jusqu’à environ 4 jours post-greffe. Ces souris développeront des tumeurs. En fonction de la zone d’implantation, les nuisances attendues seront différentes. Pour les tumeurs se développant au niveau du flanc, les souris pourront rencontrer une gêne liée à la croissance tumorale, lors des déplacements notamment. Pour les tumeurs se développant au niveau du cerveau, les souris pourront ressentir des troubles neurologiques tels que troubles de motricité, perte d’équilibre. La tête penchée peut être un signe clinique spécifique survenant à l’injection de cellules au niveau cérébral, caractérisant une perte de l’équilibre. Les nuisances attendues lors des administrations d’agents pharmacologiques sont liées à l’administration en elle-même (douleur légère de courte durée suite aux injections, stress de courte durée lié à la contention de l’animal lors des administrations orales) ainsi qu’à la composition du solvant utilisé pouvant entraîner une sensation de brûlure. Un léger stress ou angoisse peuvent être ressentis lors des anesthésies pour les séances d’imagerie. Les nuisances attendues lors des tests comportementaux sont liées au stress provoqué par les modifications apportées à l’environnement des animaux : conditions du test, type d’hébergement, expérimentateur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des données générées à partir d'un grand nombre d'échantillons de patients atteints de MB permettent de mettre en évidence l’importance de certains gènes régulant la progression du MB. Cependant, il reste encore à valider ces cibles in vitro puis dans un modèles intégrés in vivo comme la souris. Concernant l’étude sur le médulloblastome, nous disposons au laboratoire de nombreux modèles in vitro : des cellules neuronales en culture, des lignées cellulaires humaines sur lesquelles de nombreux résultats prometteurs in vitro ont déjà pu être obtenus. Des expériences préliminaires in vitro sur cellules tumorales seront toujours réalisées en amont de l’approche in vivo chez la souris afin de ne poursuivre qu’avec les axes de recherche les plus solides. De la même façon, tous les composés de thérapies ciblées seront testés in vitro, et ne seront testés in vivo que ceux pour lesquels les résultats seront prometteurs. Des travaux sont également en cours en ce moment dans notre laboratoire sur l’obtention d’organoïdes de cervelet à partir de cellules humaines souches induites pluripotentes (iPS) ce qui nous permettra dans l’avenir d’augmenter nos approches in vitro et de remplacer une partie des animaux utilisés à des fins expérimentales. Enfin, l’étude de la toxicité des nouveaux traitements ne peut s’envisager que sur animal. Nous chercherons en particulier à évaluer l’effet de ces traitements sur la croissance tumorale mais aussi à travers des tests comportementaux permettant de s’assurer du moindre impact sur les déficits moteurs ou cognitifs semblables à ceux observés chez les patients. Aussi, malgré le développement et l’utilisation de méthodes alternatives au laboratoire l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Pour minimiser le nombre d’animaux, nous aurons recours à des études longitudinales avec l’utilisation de l’imagerie du petit animal (suivi du même animal au cours du temps). Des études préliminaires (pilotes) seront réalisées pour l’administration d’agent pharmacologique en fonction des données déjà publiées ou non. Les Patient derived Xenograft de médulloblastome (PDX) sont établies à partir de tumeurs fraîchement opérées. Au contraire des lignées, ces greffes primaires sont très stables et restent très proches de la tumeur d'origine. En cancérologie, elles sont reconnues pour mimer les processus tumoraux chez l'Homme et constituent donc un modèle de choix pour valider nos traitements thérapeutiques potentiels. L’utilisation de ces PDX (maintenues sur animaux vivants) est mutualisée avec les autres projets de l’équipe ce qui contribue également à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux estimé dans ce projet est un nombre maximum, qui sera certainement réduit. Pour limiter le nombre d’animaux, nous travaillerons par lot de manière à avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par groupe sera de 8 souris si possible. Le nombre d’animaux par groupe devra être augmenté (12 à 15 animaux par groupe) pour les études comportementales pour atteindre une puissance statistique suffisante pour conclure. Chaque expérience sera répétée 2 fois et une 3ème si nécessaire, (dans le cas de résultats discordants entre les 2 premières expériences). Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Dès que cela n’implique pas de stress ou de l’angoisse supplémentaire, une méthode d’anesthésie sera utilisée pour réaliser le geste technique nécessaire à l’expérimentation. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux et/ou généraux pendant l’opération et si besoin en post-opératoire. Le réveil de l’animal se fera sous lampe chauffante et sera surveillé par l’expérimentateur. Des méthodes sont mises en place durant la chirurgie pour le bien-être de l’animal avec par exemple l’utilisation d’un coussin chauffant, l’utilisation de vaseline pour éviter le dessèchement des yeux, et en post-opératoire en favorisant l’accès à la nourriture molle en déposant au fond de la cage des cupules d’aliment gélifié. Nous habituerons les animaux quelques jours avant la chirurgie à se nourrir à base de ces cupules d’aliments gélifiés pour diminuer encore le stress et l’angoisse. Une surveillance accrue est mise en place post-chirurgie, avec changement des cupules d’aliments gélifiés le lendemain, ajout de croquettes humifiées au fond de la cage. L’expression d’un marqueur par les cellules tumorales permettra de suivre leur croissance dans le cerveau par une méthode non invasive d’imagerie. Les animaux greffés seront observés régulièrement par l’expérimentateur pour le suivi de la croissance tumorale soit par mesure à l’aide d’un pied à coulisse soit par imagerie en fonction du site d’implantation et pour vérifier leur état général de santé. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux, mettre en place les soins adaptés voire mettre à mort l’animal.
Choix des espèces
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes dans des lignées murines immunodéficientes. De plus, le modèle murin est un modèle de choix puisque les tumeurs spontanées sont rares et la croissance tumorale induite par greffe est relativement rapide. Les souris arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation d’une semaine minimum à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats. En fonction des résultats obtenus, il est possible que nous utilisions des souriceaux à la place des adultes cependant dans un premier temps, le stade adulte semble être plus approprié pour adapter un traitement pharmacologique par exemple. Le Médulloblastome étant une tumeur pédiatrique, il se peut que nous passions sur un modèle murin au stade juvénile pour se rapprocher au mieux du microenvironnement de la tumeur étudiée.
Développement d’un modèle murin d’initiation du cancer colorectal par induction locale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
L'objet réel du projet est de mettre au point un modèle de cancer du côlon réutilisable dans d'autres études, présenté comme un "outil fiable" pour de nombreuses équipes. 180 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, classées en souffrance modérée et toutes tuées pour analyse. Un polype est induit dans le côlon par une sonde rectale ou par injection chirurgicale sous anesthésie, avec apparition de tumeurs sur 16 à 24 semaines. La finalité affichée est la production d'un modèle animal servant à d'autres travaux, en amont de toute avancée thérapeutique.
Objectifs
Dans le cancer du côlon chez l’homme, les tumeurs commencent souvent par de petits amas de cellules appelés polypes, qui se forment dans le côlon. Mais dans les souris utilisées habituellement pour la recherche, ces polypes se développent surtout dans l’intestin, et très peu dans le côlon. Cela rend l’étude du cancer du côlon plus difficile. Nous cherchons donc à mettre au point une méthode qui permettrait de créer un polype précisément dans le côlon de la souris, pour que ce modèle ressemble davantage à la maladie humaine. Grâce à ce modèle, les chercheurs pourront comprendre comment les cellules du côlon se transforment en cellules tumorales, étudier comment le polype interagit avec son environnement dans le côlon et observer les premières étapes de la formation d’une tumeur. Une fois mis au point, ce modèle pourra être réutilisé dans plusieurs projets de recherche sur le cancer colorectal, ce qui évitera de recommencer tout le travail de mise au point à chaque fois. Il deviendra un outil fiable, pratique et utile pour de nombreuses équipes de recherche.
Bénéfices attendus
Notre projet consiste à créer chez la souris un modèle de cancer du côlon qui ressemble vraiment à ce qui se passe chez l’être humain. Cela permettra aux chercheurs d’étudier comment un simple polype (une petite excroissance dans le côlon) peut évoluer et devenir un cancer. Nous voulons aussi comprendre le rôle de tout ce qui entoure la tumeur, appelé microenvironnement : ce sont les cellules, les tissus et les molécules autour du polype, qui peuvent aider ou freiner son développement. Grâce à ce modèle, nous espérons découvrir ce qui se passe au tout début de la maladie et peut-être trouver des marqueurs qui permettraient de mieux diagnostiquer ou suivre le cancer du côlon chez l’homme. Ce projet est très important, car les premières étapes du cancer colorectal sont encore mal connues et difficiles à étudier sans un bon modèle.
Procédures
Les animaux auront soit une administration unique par voie rectale à l’aide d’une sonde de cathéter (moins de 10 minutes) ou une injection unique directement dans le côlon nécessitant une intervention chirurgicale. Les actes s’effectueront sous anesthésie générale gazeuse (moins de 30 minutes). Ils recevront une dose d’analgésique 30 minutes avant l’anesthésie, 8h après l’intervention et deux dose le lendemain (moins d’une minute).
Impact sur les animaux
La drogue utilisée n’est pas dangereuse aux doses utilisées, mais elle peut parfois provoquer une petite irritation. L’introduction d’une sonde rectale peut entraîner un léger inconfort. Après une intervention chirurgicale, les animaux peuvent ressentir une sensibilité et une petite inflammation autour de la zone opérée. Des petits amas de cellules (polypes) apparaitrons dans le côlon après traitement. Nous avons estimé les effets indésirables attendus sur les animaux en fonction du temps : 16 à 20 semaines après traitement : inconfort léger, parfois un peu moins d’activité ou un pelage moins soigné. 20 à 24 semaines après traitement : inconfort modéré, avec possible sensibilité abdominale, baisse d’énergie ou petites perturbations du transit.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et les organes d’intérêts seront récupérés pour une analyse histologique post mortem.
Remplacement
Ce projet vise à développer un modèle murin du cancer colorectal., afin de mieux comprendre comment débute le cancer colorectal. Pour étudier ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser des organismes vivants complets, car ils possèdent l’ensemble des interactions naturelles présentes dans un corps (circulation sanguine, système immunitaire, environnement cellulaire complexe…). Les modèles murins utilisés dans ce projet reproduisent de manière fidèle les premières étapes de la formation des tumeurs intestinales. À ce jour, aucun modèle en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permet de reconstituer toutes les composantes d’un tissu vivant dans son intégralité. C’est pourquoi l’utilisation de ces modèles animaux reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées dans ce projet.
Réduction
Nous avons choisi le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en nous appuyant sur des données scientifiques et des méthodes statistiques. Nous utilisons des animaux des deux sexes afin de limiter le nombre total d’animaux élevés et utilisés. Nous commencerons par la méthode qui est moins invasive. Si elle fonctionne, la méthode plus lourde ne sera pas utilisée, ce qui réduira encore le nombre d’animaux nécessaires. Une fois la meilleure technique validée, elle pourra servir dans d’autres projets, évitant de répéter les mêmes étapes et contribuant à diminuer l’utilisation d’animaux à long terme.
Raffinement
Nous avons mis en place toutes les mesures nécessaires pour assurer le bien-être des animaux. Leur état sera vérifié chaque jour, et les procédures seront réalisées sous anesthésie pour éviter la douleur et réduire le stress. Les animaux seront maintenus au chaud jusqu’à leur réveil. Nous surveillerons attentivement tout signe de malaise (perte de poids, diarrhée, saignement, isolement…). En cas de problème, des actions rapides seront mises en place pour soulager l’animal, comme une alimentation plus facile à consommer, des améliorations de l’environnement ou l’administration d’antidouleurs en complément si besoin.
Choix des espèces
Ce projet nécessite un modèle animal proche de l’humain sur le plan physiologique. La souris utilisée ici reproduit très fidèlement les premières étapes du cancer colorectal, car elle développe les mêmes types de polypes que ceux observés chez l’homme. Aucune autre espèce ou modèle de laboratoire ne permet d’étudier aussi précisément le début de cette maladie. C’est pourquoi ce modèle de souris génétiquement modifié est indispensable pour mener à bien ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de 2-3 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature ou lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g.
Rôle des contacts microglie-synapses dans les mécanismes de consolidation de la mémoire chez la souris (EU 1/3)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Crâne aminci et implant collé sous anesthésie de quatre heures, contention de la tête, restriction d'eau et jets d'air aversifs en cas de mauvaise réponse: 3480 souris subissent ce protocole d'apprentissage. Le RNT en classe 2895 en souffrance légère et 585 en modérée, toutes tuées à l'issue. L'étude porte sur le rôle des cellules immunitaires du cerveau dans les troubles de mémoire après une anesthésie prolongée. Le porteur qualifie le stress lié à la contention et aux jets d'air de "difficile à évaluer" faute de signes physiques, sans le mesurer autrement.
Objectifs
L’anesthésie générale est utilisée tous les jours à l’hôpital, notamment lors d’opérations chirurgicales ou pour maintenir un patient endormi en soins intensifs. Dans certains cas, notamment lorsqu’elle dure longtemps, elle peut être suivie de troubles de la mémoire ou de la concentration. Ce phénomène a été observé chez plusieurs patients après leur séjours en réanimation, notamment pendant la pandémie de COVID-19, mais les causes exactes de ces effets restent encore mal connues. Le sommeil et l’anesthésie peuvent sembler similaires (on ne bouge plus, on ne sent plus les choses, l’activité du cerveau ralentit), mais ils ne reposent pas sur les mêmes mécanismes. De plus, le sommeil est réparateur pour le cerveau, alors que l’anesthésie prolongée pourrait avoir des effets plus néfastes sur son fonctionnement. Chez la souris, il a été montré que rester longtemps sous anesthésie modifie certaines connexions dans le cerveau. Jusqu’à présent, les chercheurs ont surtout étudié les neurones, les cellules qui permettent la communication dans le cerveau. Mais les cellules immunitaires du cerveau, les microglies, pourraient aussi jouer un rôle important. Ces cellules aident normalement à entretenir et à remodeler les connexions dans le cerveau, surtout pendant l’apprentissage ou lorsqu’on forme des souvenirs. Ce projet multi-établissement (3 établissements utilisateurs), vise à mieux comprendre comment l’anesthésie prolongée pourrait perturber les interactions entre neurones et microglies chez la souris, à différents moments de la mémoire : quand on apprend, quand on consolide l’information, et quand on se souvient. Ces recherches pourraient aider à mieux comprendre pourquoi certaines personnes ont des troubles de la mémoire après une anesthésie, et à trouver des solutions pour mieux les prévenir.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’approfondir notre compréhension des effets à long terme de l’anesthésie générale prolongée sur le cerveau, notamment sur la mémoire et les capacités cognitives. En explorant pour la première fois le rôle potentiel des microglies dans ces effets, il pourrait: 1) Améliorer la compréhension des troubles cognitifs post-anesthésie, en identifiant les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués, au-delà des seuls neurones. 2) Contribuer à la recherche médicale humaine, en proposant des pistes pour prévenir ou limiter les séquelles cognitives chez les patients ayant subi une anesthésie prolongée (par exemple après chirurgie lourde ou séjour en réanimation). 3) Orienter de futures stratégies thérapeutiques ciblant la plasticité cérébrale et les cellules gliales pour favoriser une meilleure récupération cognitive. 4) Fournir un nouveau modèle préclinique expérimental pour étudier les effets de l’anesthésie sur la mémoire, intégrant non seulement l’activité neuronale mais aussi les interactions cellules gliales-neurones. 5) Réduire les impacts socio-économiques des déficits cognitifs post-opératoires, en apportant des solutions de prévention ou d’accompagnement adaptées à ces patients.
Procédures
Une chirurgie sous anesthésie pour placer implant et des électrodes d'enregistement sur le crane (4h00) au sein de l'EU1/3. Habituation à la contention longue de la tête au sein de l'EU2/3 (10 jours par session quotidienne allant progressivement de 5 minutes à 3h00). Comportement (tâche de discrimination tactile par les vibrisses) et imagerie, 2 sessions de 3h maximum/jour pendant 3 jours avec des pauses de 3 heures minimum au sein de l'EU2/3. Restriction hydrique pendant 12 heures répétées 6 fois maximum. Mise à mort sous anesthésie générale (animaux inconscients) au sein de l'EU3/3.
Impact sur les animaux
Nous réalisons une chirurgie afin de coller un implant sur le crâne de la souris, implantons des électrodes sur le crane et dans les muscles de la nuque pour évaluer leur activité et déterminer si la souris est endormie ou éveillée, et amincissons le crâne sans corrompre l'intégrité du système nerveux central sous anesthésie. Cette chirurgie peu invasive réalisée sous analgésie et anesthésie entraine des douleurs post opératoire pendant 48h00. Les complications au stade de la chirurgie sont extrêmement rares. Nous réalisons ensuite une habituation progressive des souris par renforcement positif pour qu'elles restent en condition tête restreinte pendant les sessions d'apprentissage et de rappel et pendant la phase de sommeil (séances allant de 5 minutes à 3 heures progressivement sur 7 jours). Il arrive rarement que certaines souris présentes des difficultés à s'habituer. Cette contention entraine certainement un stress léger, difficile à évaluer car nous n'observons pas de manifestations physiques (grattage, vocalisations, mictions/défécations, posture ou comportements compulsifs), le stress potentiel, est atténué par le renforcement positif (récompense avec des friandises). Afin de motiver les souris à s'engager dans la tâche d'apprentissage une restriction hydrique est réalisée pendant 12 h max sur 24h, cette restriction d'accès à l'eau peut être reproduite pendant 3 jours, elle entraine un inconfort transitoire de la souris (sensation de soif). Un stimulus aversif, puff d'air (durée 1s) en cas de mauvaises réponses est utilisé dans la phase initiale de l'apprentissage pour aider les souris à comprendre la tâche à réaliser, le puff d'air est utilisé uniquement si elle ne répondent pas aux pénalités de temps. Ces puffs d'air utilisé en dernier recours et potentiellement répétés peuvent engendrer un stress, difficile à quantifier en absence de signes cliniques. 2 séances de comportement et d'imagerie en tête restreinte de 3 heures maximum chacune ont lieu chaque jour et sont répétées au maximum pendant trois jours, ses séances peuvent occasionner un stress identique voir plus faible que lors de l'habituation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Les organes d'intérêt pour l'étude sont alors prélevés et d'autres organes sont collectés pour constituer un banque de tissus à disposition d'autres équipes et laboratoires (muscles ou rétine).
Remplacement
Il s’agit d’un projet de recherche fondamental visant à étudier le rôle d’une protéine jusqu’à présent inconnue. Les expériences réalisées dans ce projet ne peuvent donc pas être modélisées par informatique. Nous utilisons généralement des cultures cellulaires ou des explants de cerveaux mais modifier l’environnement des microglies entraine un changement morphologique et fonctionnel. Afin de comprendre le rôle des microglies dasn le cerveau sain, il faut donc les étudier in vivo. Les données obtenues seront partagées avec des mathématiciens afin de modéliser la morphodynamique microgliale.
Réduction
Les lots et procédures ont été élaborés de manière à optimiser les groupes contrôles et à éviter la redondance. Il s’agit de travaux originaux jamais réalisés sur la base de notre connaissance de la littérature. Les comparaisons seront faites en utilisant des statistiques non paramétriques ne nécessitant pas de distribution normale et compatible avec nos effectifs réduits pour la partie in vivo. D'autre part, dans certaines expériences ex vivo et in vivo, chaque souris est son propre contrôle ce qui permet de réduire drastiquement le nombre d'expériences et d'animaux requis.
Raffinement
Notre expérience du modèle nous permet d’affirmer que la morbidité due à l’implantation de la fenêtre est quasi nulle. Après plus de 10 ans d'expérimentation avec ce modèle, nous n'avons observé qu'une désimplantation et aucun signe de souffrance ou de stress. Nous veillerons à limiter le mal être des animaux en réalisant des habituations progressives de nos souris à la manipulation. La gestion de la douleur et de l'inflammation sera réalisée de la façon suivante : injection d'anesthésique local avant la chirurgie, injection d'anti inflammatoire non stéroidiens en s.c en début de chirurgie, puis 24 et 48h après. En complément le bien-être des animaux sera évalué de façon quotidienne. Ils seront observés dans leur cage pendant plusieurs minutes puis pesés. L’évaluation se fera selon un scorage établi tenant compte de différents paramètres classiquement utilisés (posture, poids, toilettage) de sorte à identifier les points limites. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (nid et roue d'activité), tout au cours de l'expérience. Une partie des expérimentations seront réalisées ex vivo. Les expérimentations ex vivo sur tissus post-mortem ont été pensé pour compléter l'approche in vivo sur animal vigile tout en réduisant la nécessité de prélèvements impliquant des gestes invasifs ou la durée d'inconfort des animaux. Le transport des souris d'une UE à l'autre (5 minutes de transport) se fait dans des cages opaques et en triple emballage pour limiter le stress lié au transport.
Choix des espèces
Les souris permettent d’avoir recours à des animaux transgéniques. Il existe une abondante littérature sur le fonctionnement synaptique chez la souris ce qui évitera de reproduire certaines expériences pour valider notre modèle. Enfin l'architecture corticale est proche de celle de l'homme et il s'agit donc d'un des meilleurs modèles non primate pour étudier la plasticité synaptique. Les souris seront des souris jeunes adultes utilisées entre 6 et 10 semaines car la taille du crâne n'évolue plus dans le temps.
Caractérisation du microenvironnement tumoral dans des modèles murins orthotopiques et génétiques d’adénocarcinome canalaire pancréatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
852 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit des gavages, une autre deux chirurgies successives, une greffe de cellules tumorales dans le pancréas puis une injection dans la rate pour provoquer des métastases au foie. Le projet étudie le rôle de cellules immunitaires dans la progression d'un cancer du pancréas très agressif. Le porteur présente les organoïdes comme incapables de reproduire le processus métastatique et conclut à la nécessité du modèle vivant.
Objectifs
L’adénocarcinome canalaire pancréatique est un cancer très agressif, qui se propage fréquemment vers le foie. Chez de nombreux patients, des métastases hépatiques sont déjà présentes au moment du diagnostic. Il se développe à partir de lésions précancéreuses (appelées PanIN), mais les mécanismes qui conduisent à leur progression vers un cancer invasif et à la formation de métastases restent mal compris. Des études récentes montrent que le foie peut être modifié avant même l’arrivée des cellules tumorales, créant un environnement favorable aux métastases, appelé niche pré-métastatique. Les macrophages, cellules immunitaires importantes du microenvironnement tumoral, semblent jouer un rôle clé dans ces processus. Cependant, leur implication précise dans la progression de l'adénocarcinome canalaire pancréatique et dans l’apparition des métastases hépatiques n’est pas encore clairement établi. L’objectif principal de ce projet est d’étudier le rôle des macrophages dans la progression des lésions précancéreuses vers un cancer invasif et dans l’initiation des métastases hépatiques, en utilisant un modèle murin génétique. Plus spécifiquement, ce projet vise à : Étudier l’évolution des macrophages dans le pancréas au cours de la progression tumorale. Analyser le rôle des macrophages du foie dans la formation de la niche pré-métastatique. Évaluer l’impact de la modification des macrophages sur la croissance tumorale et la dissémination métastatique. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre le rôle des macrophages dans le développement du PDAC et des métastases hépatiques, et pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à la progression des lésions précancéreuses vers un cancer pancréatique invasif, en s’intéressant en particulier au rôle du microenvironnement tumoral. Il vise également à améliorer nos connaissances sur la formation des métastases de ce cancer, un problème majeur de santé publique. La présence de métastases empêche souvent les patients de bénéficier d’une chirurgie, qui reste actuellement le traitement curatif le plus efficace pour ce cancer. Mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dissémination tumorale est donc essentiel. Ce projet analysera les changements qui affectent les macrophages au cours du développement tumoral et de la formation de la niche métastatique, ainsi que leur rôle dans ces processus. Les résultats pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Enfin, les données produites seront partagées en libre accès afin de soutenir d’autres travaux de recherche utilisant les mêmes modèles expérimentaux.
Procédures
Certains animaux auront 3 ou 4 gavages, durée 1 minute. D'autres animaux auront deux chirurgies successives : Injection de cellules tumorales dans le pancréas (greffe orthotopique, durée 10 minutes) puis injection dans la rate de cellules tumorales (10 jours plus tard) pour induire des métastases hépatiques (durée 10 minutes). Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée.
Impact sur les animaux
Les gavages induiront un stress transitoire léger. Les souris modèles présenteront par la suite une fragilité liée à l’activation de l’oncogène après l’administration de tamoxifène. Le développement progressif de lésions PanIN puis d’un cancer pancréatique invasif (PDAC) peut entraîner une contrainte chronique modérée, se traduisant notamment par une perte de poids, une diminution de l’activité et une altération de l’état général. Dans le modèle orthotopique, induit par chirurgie, les souris subiront deux interventions chirurgicales. Un stress léger et transitoire pourra être ressenti avant l'anesthésie. Ces procédures en elles-mêmes peuvent provoquer une douleur temporaire, et une légère perte de poids. Par la suite, la croissance des tumeurs, en particulier au niveau du foie, peut également entraîner des douleurs et un amaigrissement progressif. L’intensité globale des nuisances est estimée comme modérée selon le stade de la maladie, le modèle utilisé et les points d'arrêt prévus.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures. Dans le modèle génétique génétique, les souris seront mises à mort à différents stades de la progression tumorale afin de permettre l’analyse des tissus, notamment le pancréas, le foie, les poumons et la rate. Ces prélèvements sont nécessaires pour étudier le microenvironnement tumoral et pré-métastatique à l’aide de différentes techniques biologiques. La mise à mort de tous les animaux est indispensable pour permettre l’analyse des tissus.
Remplacement
Bien que des modèles in vitro avancés, tels que les organoïdes et tumoroïdes, existent pour étudier le cancer, ils ne permettent pas de reproduire correctement le processus métastatique, qui implique des interactions complexes entre plusieurs organes. Ce projet s’intéresse en particulier au rôle du système immunitaire, notamment des macrophages et des monocytes circulants, dans la progression du cancer pancréatique depuis les lésions précancéreuses jusqu’au PDAC invasif. L’étude de ces interactions nécessite un environnement physiologique complet et un suivi à long terme, qui ne peuvent pas être obtenus avec des modèles in vitro seuls. Des approches in vitro seront néanmoins utilisées en complément pour confirmer certains résultats obtenus chez l’animal, contribuant ainsi à réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, elles ne peuvent pas remplacer entièrement l’expérimentation animale dans le cadre de ce projet.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été limité au strict minimum, en s’appuyant sur les données de la littérature et sur des calculs statistiques d’effectif. Après la mise à mort, de nombreuses cellules, y compris des populations rares, seront collectées afin d’étudier leur rôle dans les tumeurs pancréatiques et les métastases hépatiques à différents niveaux d’analyse (cellulaire, moléculaire et transcriptomique). Chaque animal permettra ainsi de produire un grand nombre de données, optimisant l’utilisation de chaque individu et contribuant à la réduction globale du nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes, dans la limite de cinq animaux par cage, afin d’éviter l’isolement, sauf en cas de nécessité liée à des comportements agressifs. Leur environnement est enrichi avec du matériel adapté (papier, abris en carton) pour réduire le stress. Les animaux sont surveillés quotidiennement par l’équipe de recherche et le personnel de l’animalerie afin d’assurer un suivi rigoureux de leur état de santé. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués pour limiter toute souffrance. Les procédures ont été adaptées pour réduire au maximum les nuisances. Des anesthésies locales ou générales sont utilisées lorsque nécessaire lors des injections, avec des aiguilles fines. Pour les prélèvements sanguins, des dispositifs permettant de contrôler précisément les volumes prélevés sont employés.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent pour notre étude car il nous permet d'utiliser des modèles de tumeurs issus de lignées cellulaires murines ainsi qu'un modèle spontanné qui se rapprochent des pathologies humaines. Ses ressemblances en termes de physiologie nous permettent d'étudier le rôle du système immunitaire dans le processus tumoral dans sa globalité.
Mise en oeuvre d’études pharmacocinétiques chez la souris SCID dans le domaine de l’oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Immunodéficientes par construction, 2000 souris SCID vont être utilisées sur cinq ans pour mesurer le devenir de molécules anticancéreuses dans l'organisme. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et seront tuées à la fin de chaque étude. Chaque animal reçoit le produit testé puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang en 24 heures, avant un prélèvement terminal sous anesthésie. Le RNT reconnaît qu'aucun calcul statistique n'a fixé l'effectif, l'estimation reposant sur le nombre utilisé les années précédentes.
Objectifs
Ce projet consiste à administrer aux animaux une molécule (classe thérapeutique: oncologie) et de déterminer certains paramètres pharmacocinétiques de la molécule administrée. Les souris sont régulièrement utilisées pour la recherche en oncologie dans les domaines de santé humaine. L’enjeu de ce projet est de réaliser des études chez les souris SCID (modèle de souris immunodéficients) et d'étudier la pharmacocinétique de molécules dans l’organisme notamment l'absorption, la distribution par la circulation sanguine, le métabolisme et l'élimination.
Bénéfices attendus
L'intéret de ce projet est de pouvoir mener différentes études en testants différents éléments d'essais sur des souris SCID. Cela permettra d'identifier les composés intéressants qui pourront peut être déboucher sur de nouveaux médicaments humains. Les différents protocoles entrant dans le scope de ce projet seront primordiaux pour avoir des données sur les paramètres phamacocinétiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents types d'interventions : -Premier cas: administration de l'élément testé. Cela sera fait sur animal vigile par un personnel formé afin d'éviter tout stress à l'animal, - Puis des prélèvements de sang seront réalisés. 9 prélèvements maximum sur 24h. La durée d'un prélèvement est inférieure à la minute. Deuxième cas: les animaux placés sous anesthésie générale ( anesthésique gazeux) seront soumis à un prélèvement sanguin terminal. Durée du prélèvement de l'ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Suite aux différentes administrations et durant les prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir du stress, de la peur à la contention. Les prélèvements sanguins seront réalisés à différents sites de prélèvements, cependant il peut y avoir de la douleur, des lésions internes. Tous ces gestes seront réalisés par un personnel expérimenté et formé afin d'éviter au maximum toutes ces nuisances.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les prélèvements sanguins répétés et la perte des conditions de stérilité augmentent significativement le risque de souffrance et d’infections, rendant leur maintien incompatible avec un bon niveau de bien‑être. Cela sera pratiqué par un personnel expérimenté conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
Pour les études rentrant dans le scope de ce projet, le responsable de chaque étude s'assurera qu'il n'y a pas de methode de remplacement possible. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.
Réduction
Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 400 souris par an soit 2000 souris sur 5 ans. Ce nombre d'animaux est basé sur le nombre d'animaux réellement utilisé dans le projet des années précédentes. Le nombre d'animaux inclus dans chaque étude entrant dans le scope de ce projet sera réduit au minimum pour avoir des résultats interprétables. Par exemple, en utilisant la technique du micro sampling (prélèvement de 30 μL de sang par animal), cela permettra de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés car 9 points de prélèvements pourront être réalisés sur le même animal. Pas de test statistique réalisé en amont
Raffinement
Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu ( enrichissement stérilisé). Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 3 ou 6 dans des cages comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger irradié). Les animaux seront observés au minimum une fois par jour pour une prise en charge rapide. Pour préserver les sites de prélèvements au maximum, un point de compression sera réalisé aprés chaque prélèvement avec la possibilité d'appliquer de la glace afin d'éviter la formation d'hématome. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible et le nombre de prélèvement de sang par site sera réduit au minimum.
Choix des espèces
La souris SCID est l'espèce utilisée dans ce type d'étude. Cette espèce est bien décrite et caractérisée dans la littérature et son utilisation est conseillée (OECD) pour les essais de produits pharmaceutiques dans le domaine de l'oncologie. Majoritairement adultes. Souris d'environ 20-30g
Dynamique des activités neuronales dans le cortex cérébral et les noyaux à sérotonine au cours d’un arrêt de l’oxygénation cérébrale et lors d’une réanimation chez le rat-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Électrodes implantées dans le cerveau sous anesthésie de deux heures, puis maintien sous anesthésie pendant dix-huit heures d'enregistrements pendant l'arrêt de l'oxygénation du cerveau: 448 rats subissent des variantes de ce protocole d'anoxie et de réanimation. Le RNT en classe 98 en souffrance sévère, 50 en modérée et 300 sans réveil. Le projet cherche des marqueurs de la mort cellulaire et un corrélat neuronal des expériences de mort imminente, rapprochées des effets de drogues psychédéliques. Tous seront tués à l'issue pour l'étude histologique de leur cerveau.
Objectifs
Un arrêt de l’apport en oxygène au cerveau total et prolongé, consécutif à un arrêt cardiaque et/ou respiratoire, est souvent responsable de graves lésions neurologiques et demeure l’une des principales causes de décès. Les processus neuronaux à l’origine des lésions et ceux accompagnant la récupération des fonctions cérébrales lors d’une réanimation réussie restent aujourd’hui mal connus. L'élucidation de ces processus représente un enjeu majeur en neurosciences puisqu’elle pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients. Les récentes recherches sur des modèles animaux reproduisant les conditions d’une privation en oxygène au cerveau ont cependant permis des avancées dans notre compréhension des changements électriques du cortex cérébral qui surviennent successivement dans l'électroencéphalogramme (EEG) lors d’une privation d’oxygène : une première bouffée d'activités rapides, suivie d’un ralentissement et une atténuation des activités qui finissent par s’annuler et être remplacées par un EEG plat. Survient alors une onde de grande amplitude, qui marque l’arrêt d’activité des neurones du cortex et le début des processus de mort cellulaire. Si le cerveau est rapidement réoxygéné, les neurones récupèrent leur activité. Cette restauration des activités du cortex se traduit par la survenue d’une deuxième onde EEG appelée « onde de réanimation ». Les activités rapides au début de l’arrêt de l’apport en oxygène que l’on retrouve chez les patients ressemblent à celles observées au cours de l’éveil alors que les patients sont visiblement inconscients. Il a donc été suggéré qu’elles pourraient constituer un corrélat neuronal pour les expériences de mort imminente (EMI), qui sont souvent associées à de vives perceptions sensorielles et un sentiment de bien-être profond. Il a par ailleurs été montré de fortes similitudes entre les EMI et les effets hallucinatoires des drogues psychédéliques agissant sur un des grands systèmes de neuromodulation, le système à sérotonine. L’ensemble de ces observations nous a conduit à émettre l’hypothèse d’une participation du système à sérotonine aux EMI et aux changements séquentiels d’activité dans le cortex. MODIFICATION : Le protocole a été ajusté pour intégrer la stimulation et l'enregistrement des systèmes de communication chimique (neuromodulation). L'objectif est de mesurer leur influence sur l'activité cérébrale durant le cycle complet de l'anoxie-réoxygénation (avant, pendant et après l'arrêt de l'oxygène).
Bénéfices attendus
L'anoxie cérébrale globale consécutive à un arrêt cardio-respiratoire ou à un accident vasculaire cérébral, est une cause majeure de décès et 57 pourcent des patients conservent des déficits neurologiques permanents de degrés divers, principalement causés par des lésions ischémiques/anoxiques corticales. Ce projet permettra tout d’abord de mieux comprendre les mécanismes cérébraux conduisant à la mort cellulaire lors d’une anoxie cérébrale et ceux qui sous-tendent la récupération des activités et fonctions cérébrales lors d’une réanimation. Nous espérons trouver des nouveaux marqueurs électriques permettant de prédire la capacité du cerveau à récupérer après une anoxie. Dans ce contexte, nos travaux de recherche fondamentale devraient ainsi permettre à plus long terme une meilleure prise en charge des patients qui arrivent à l’hôpital après un arrêt cardiaque. Notre étude nous permettra également de faire progresser nos connaissances sur les mécanismes neuronaux à l’origine des sensations et perceptions qui accompagnent les expériences de mort imminente. Nous déterminerons plus particulièrement le rôle d’un des grands systèmes de neuromodulation cérébrale dans ces phénomènes qui demeurent pour le moment mystérieux.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale (une fois par animal, durée environ 2h), avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées, permettant la mise en place d’électrodes d’enregistrement au niveau de différentes régions cérébrales et la mise sous respiration artificielle. Les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant (MODIFICATION : 18h supplémentaires maximum), pendant lesquelles des enregistrements intracérébraux seront réalisés puis ils seront euthanasiés par une méthode règlementaire. Une autre partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées (une fois par animal, durée environ 1h30) durant laquelle une injection intracérébrale de traceurs sera réalisée pour colorer certains neurones. Les animaux seront gardés en vie une semaine puis seront euthanasiés selon une méthode règlementaire. MODIFICATION : Enfin, la dernière partie des animaux sera soumise à une première procédure chirurgicale avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées (une fois par animal, durée environ 2h) durant laquelle une à deux injections intracérébrales seront réalisées, et des dispositifs d’enregistrements ou de stimulation de l’activité cérébrale seront mis en place. Trois à quatre semaines après, une seconde procédure chirurgicale sera réalisée (une fois par animal, durée environ 2h), avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées, permettant la mise en place d’électrodes d’enregistrement au niveau de différentes régions cérébrales, et la mise sous respiration artificielle. Les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant 18h supplémentaires maximum, pendant lesquelles des enregistrements intracérébraux seront réalisés en parallèle des stimulations et enregistrements via les dispositifs préimplantés, puis ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les interventions chirurgicales peuvent entraîner certains effets indésirables : un stress lié aux manipulations avant l'opération, de la douleur suite à l'acte chirurgical, ainsi qu'un risque rare de complications (saignements ou infections). L'anesthésie peut également impacter les fonctions vitales de l'animal, provoquant une baisse de la température corporelle (hypothermie), un ralentissement du cœur et de la respiration, ou encore une sécheresse oculaire. MODIFICATION : L’implant sur la tête des animaux pourra générer un inconfort et présentera un risque de perte et, ou, d’infection. une partie des animaux seront hébergés seuls pendant 4 semaines maximum, s’agissant d’animaux sociaux cela impliquera un stress.)
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales afin de réaliser des études histologiques sur leur cerveau.
Remplacement
Nous prévoyons de tester une partie de nos hypothèses en réalisant sur ordinateur un modèle biophysique des neurones enregistrés ce qui permet de remplacer en partie les expériences chez l’animal. Cependant, ce projet de recherche fondamental, qui vise à comprendre les évènements électriques cérébraux survenant pendant l’arrêt de l’oxygénation cérébrale mais aussi lors de sa restauration, requiert de réaliser des enregistrements électrophysiologiques à différentes échelles (extracellulaires et intracellulaires) chez le rat pour être mené à son terme. En effet, ce type de préparation in vivo est la seule permettant de maintenir intacte les propriétés des neurones individuels et des réseaux neuronaux, condition absolument nécessaire à la survenue spontanée des évènements électriques cérébraux produits lors d’un arrêt transitoire de l’apport en oxygène au cerveau.
Réduction
Une stratégie expérimentale méthodique a été mise en place pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous combinerons également différents protocoles d’enregistrements cellulaires (différents tests sur l’activité et les propriétés des neurones à l’échelle unitaire, enregistrements de longue durée et si possible de plusieurs neurones/animal) au sein d’une même expérience, ce qui nous permettra de n’utiliser que les animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et reproductibles. Enfin, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance (448 animaux au total) et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’une à deux semaines à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. Avant chaque expérience, une phase d’acclimatation de 30 à 40 minutes est observée, durant laquelle les animaux, placés seuls dans leur cage dans la salle d’expérimentation, ne sont pas manipulés afin de limiter le stress. Les animaux bénéficient d’un accès à la nourriture et à l’eau à volonté, ainsi que d’un environnement enrichi. Lors des enregistrements de l’activité cérébrale des animaux anesthésiés, une attention particulière est portée à la réduction de l’inconfort, de la douleur et du stress grâce à une surveillance continue des paramètres physiologiques (activité cérébrale, fréquence cardiaque, température, pression artérielle, saturation en oxygène). Des protocoles d’intervention adaptés, incluant l’utilisation appropriée d’anesthésiques généraux ou locaux et de myorelaxants, sont appliqués. MODIFICATION : Pour les injections intracérébrales et les implantations de dispositifs d’enregistrement ou stimulation chez des animaux anesthésiés, un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). La chirurgie sera réalisée avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée. La profondeur de narcose sera contrôlée tout au long de la chirurgie. La température de l’animal sera maintenue à partir de l’induction de l’anesthésie et jusqu’à son réveil complet (tapis chauffant puis chambre réveil chauffée à 37 degrés Celsius). Du gel oculaire sera appliqué pour prévenir toute sécheresse oculaire et du sérum physiologique sera injecté par voie sous-cutanée pour éviter toute déshydratation. Les zones d’incisions et de chirurgie seront préalablement aseptisées. Après la chirurgie, l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil puis il sera transféré dans sa cage. Un suivi quotidien sera assuré en post-chirurgie pendant 3 jours minimum puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de procédure. Si la procédure nécessite un hébergement individuel, l’enrichissement sera complété et cet hébergement limité à 4 semaines. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées chez des rats. Le rat constitue une espèce de choix pour les enregistrements intracellulaires in vivo en raison de leur taille et d’une très bonne cartographie anatomique de leur cerveau permettant un positionnement précis des électrodes d’enregistrement dans les différentes structures cérébrales. Nous utiliserons des rats adultes (âgés de deux à trois mois). Ces critères nous permettent d’effectuer nos expériences sur des rats ayant terminé leur développement cérébral. Les rats adultes fournissent une représentation plus fiable des conditions cérébrales observées chez les adultes humains. Etant donné que la plupart des cas d‘anoxie cérébrale (par arrêt cardiaque) touchent des adultes, étudier les dynamiques cérébrales survenant lors de l’arrêt et la reprise de l’oxygénation cérébrale sur des rats adultes permettra de mieux comprendre ses mécanismes et ses conséquences au sein de cette population.
Role du GLP-1 dans l’homéostasie des cellules souches intestinales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris perdant plus de 20 % de leur poids en une semaine sont retirées et tuées. 800 souris vont être utilisées, dont 120 opérées sans réveil, l'ensemble classé entre souffrance modérée et sans réveil. Les chirurgies provoquent une ischémie de l'intestin, suivie ou non d'une reperfusion, avec injections et prélèvements de sang. Le projet étudie le rôle d'une hormone, le GLP-1, dans l'atteinte de la barrière intestinale, avec un brevet déjà déposé sur son usage possible comme biomarqueur.
Objectifs
L'intestin, au-delà de sa fonction d'absorption des nutriments, constitue une formidable barrière entre le milieu externe et le milieu interne. Une perturbation de cette fonction barrière, caractérisée par une altération de la perméabilité intestinale , est associée à des pathologies inflammatoires chroniques et aiguës telles que l'ischémie mésentérique aiguë (IMA). L'infarctus de l'intestin est une urgence médicale qui ne peut être diagnostiquée précocement. Il s'agit de l'évolution de l'IMA, provoquée par un apport sanguin insuffisant à l'intestin, entraînant la mort intestinale. Son taux de mortalité est de 60 à 90 % en raison de la gravité de la maladie et de l'échec d'un diagnostic rapide. Au cours des dernières années, d’importants efforts cliniques et précliniques ont été déployés pour trouver des biomarqueurs capables de prédire les dommages gastro-intestinaux avant qu’ils ne deviennent irréversibles et ne se propagent au reste du corps. Un diagnostic plus précoce de l'ischémie intestinale permettrait des interventions plus précoces, pouvant aboutir à : 1) éviter une intervention chirurgicale ; 2) moins de morbidité postopératoire et une survie améliorée si la chirurgie était indiquée. Cela aurait également un impact direct sur l'utilisation des ressources de santé postopératoires, tant au niveau des soins aux patients que de la prestation des services de santé. Identifier un biomarqueur spécifique de l’IMA, utilisable en cas d'urgence clinique, constituerait une avancée majeure. Nous avons récemment identifié un nouveau biomarqueur sérique pour l'IMA : le Glucagon-like peptide 1 (GLP-1). Bien que les peptides de type glucagon soient largement utilisés en clinique, ils ne sont toujours pas utilisés comme biomarqueurs en biologie clinique. Les objectifs du projet actuel sont de comprendre le rôle du GLP-1 dans la perturbation de la barrière intestinale au cours de l'IMA.
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. Le GLP-1 endogène sécrété lors d’une perturbation de la fonction barrière intestinale a-t-il un rôle dans cette fonction barrière notamment sur les cellules souches intestinales. ? Si oui, est il bénéfique ou non. ? 2. La sécrétion de ce GLP-1 vient il protéger les organes à distance de par ses propriétés anti-inflammatoires ? 3. Les agonistes GLP-1, actuellement utilisés en clinique humaine, pourraient ils être utilisés ou non lors de perturbation de la fonction barrière ? Ce travail présenté ici est la partie préclinique d’un projet de plus grande envergure pour lequel un brevet a été déposé et qui consiste à déterminer si ce GLP-1 pourrait être un biomarqueur de l’ischémie mésentérique. Comprendre pourquoi ce GLP-1 est sécrété de façon précoce lors de l’ischémie reperfusion et son rôle potentiel dans cette pathologie permettrait éventuellement, de pouvoir traiter de façon précoce les patients afin de réduire les conséquences drastiques sur l’intestin, conduisant le plus souvent à la mort de l’individu.
Procédures
L’ensemble des procédures décrites dans ce projet repose principalement sur des procédures chirurgicales dont l’objectif est d’induire une perturbation de l'homéosatsie des cellules souches intestinales en réalisant des ischémies mésentériques suivies ou non d’une reperfusion. La durée minimale de la chirurgie est de 30 minutes lors d’une ischémie et 20 minutes si elle est suivie d’une reperfusion. Certaines procédures vont nécessiter des injections intra-péritonéales (IP), ou des prélèvements de microgoutte de sang pour mesurer la glycémie. Ces manipulations se font soit sous anesthésie locale (prélèvement sanguin) soit sur animaux vigiles (injections IP) et ne prennent que quelques secondes quand réalisées par un opérateur maitrisant les gestes techniques ce qui sera le cas.
Impact sur les animaux
Les expérimentations d’ischémie et ou ischémie/reperfusion de ce projet se feront sur des animaux anesthésiés et il n’y aura aucun réveil de l’animal. Les seules manipulations sur animaux non anesthésiés seront les injections intrapéritonéales des molécules pharmacologiques ou les prélèvements de microgouttes de sang par la queue. Nous serons plus particulièrement attentifs lors des traitements chroniques de 2 semaines car il est parfaitement écrit dans la littérature que les molécules pharmacologiques utilisées réduisent la prise alimentaire. Ainsi un suivi de la masse corporelle toutes les 48h sera réalisé. Si aucun effet négatif ne sont décrits dans la littérature concernant les effets de ces molécules pharmacologiques nous seront également vigilants à tous signes susceptibles de traduire un inconfort voir une souffrance des animaux.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu une sécrétion hormonale (GLP-1) dont les effets peuvent avoir lieu localement au niveau de l’intestin lui-même mais également au niveau d’autres organes distants. Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests statistiques adéquats. En fonction de la distribution normale ou non des données, nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques sachant qu’il y a des variations individuelles des animaux, que ce soit dans les phases d’ischémie, de reperfusion ou bien lors de la mise en culture des cellules souches intestinales. L’utilisation de la dislocation cervicale réduit également considérablement la variabilité individuelle de tous les paramètres mesurés (Sanguins : cytokines, Perméabilité ; prélevement et Extraction de cellules souches intestinales...) engendrée par les difficultés de prélèvement chez les animaux ayant eu une ischémie.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un enrichissement de leur milieu adapté comme des maisons leurs permettant de se cacher. Lors des traitements chroniques (2 semaines), ils bénéficieront d’un suivi de leur état général avec mesure de la masse corporelle toutes les 48h. Toutes les procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entraîner une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale (isoflurane 50mg/kg). En cas de perte de poids des animaux supérieure à 20% en 7 jours, ou tout autre signe suggérant une souffrance de l’animal (posture, absence de toilettage, craintif, etc) l’animal concerné sera retiré du projet (euthanasie par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane). Aucun animal ayant subi une ischémie avec ou sans reperfusion ne sera réveillé et seront tous euthanasiés encore endormis. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau intestinal. Elle exprime les mêmes protéines. En particulier le GLP-1 suit le même comportement chez l’Homme et la Souris. De plus nous avons vérifié que ce GLP-1 était également sécrété lors des ischémies expérimentales réalisées chez l’Homme. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous serons probablement amenés à travailler sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifique du gène codant pour le glucagon, Elles sont issues du fond génétique C57BL6/J. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent et se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris C57BL6/J non génétiquement modifiées. Il est également probable que nous utiliserons une lignée de souris OGM exprimant le marqueur des cellules souches intestnales (LGR5) couplé à une GFP. Cela permet de récuper spécifiquement les cellules souches (après un passage au Facs).
Etude de l’effet d’une solution d’acide hypochloreux sur l’inflammation et la cicatrisation de plaies cutanées chez des souris saines et modèles de diabète (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
480 souris vont être utilisées dans ce second volet de l'étude, dont 408 rendues diabétiques, toutes tuées et leurs tissus prélevés. Des plaies cutanées leur sont infligées et suivies jusqu'à la fermeture de la peau, avec des anesthésies répétées et des incisions de la queue pour la glycémie. Le projet teste une solution d'acide hypochloreux sur la cicatrisation des plaies chroniques du pied diabétique. Le RNT invoque une "urgente nécessité" de nouveaux traitements, alors que le travail relève de la recherche fondamentale et fait suite à des résultats déjà obtenus sur cellules.
Objectifs
La thérapie locale des ulcères du pied repose principalement sur le débridement de la plaie et la protection des plaies à l’aide de pansements mais la cicatrisation reste longue et peut échouer. Il y a une urgente nécessité à trouver de nouveaux traitements et augmenter la compréhension du défaut de cicatrisation chez les diabétiques. Les études d’efficacité de molécule pro-cicatrisantes sont principalement effectuées sur des animaux sains avec quelques études sur des animaux pathologiques et exclusivement réalisées sur des plaies aiguës de type coupure. Toutefois, la peau d’un patient diabétique et d’un sujet sain sont différentes, de même qu’une plaie liée à la gravité par application de la pression du corps sur les pieds est très différente d’une coupure. Ce projet de recherche fondamentale a pour objectif de mieux comprendre l’impact de l’acide hypochloreux sur la détersion des plaies et son effet dans le retard de cicatrisation des plaies chroniques diabétiques. Ce projet se déroulera sur deux EU différentes.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de l’impact de l’acide hypochloreux dans le retard de cicatrisation des ulcères de modèles murins diabétiques permettra d’étoffer les connaissances concernant cette pathologie et les mécanismes d’action du traitement testé. Ainsi l’utilisation d’acide hypochloreux pour la prévention de l’infection des plaies chroniques amènera une nouvelle piste dans le traitement du pied diabétique.
Procédures
Les 160 souris diabétiques de type 1 recevront un total de 5 injections (durée 15 secondes, contention comprise) dans l’abdomen d’un produit provoquant une hyperglycémie chronique. Des plaies cutanées seront réalisées sur 408 animaux et leur cicatrisation sera soit arrêtée la première semaine, soit suivie jusqu’à la fermeture complète de la peau sur un maximum de 25 jours pour les souris diabétiques présentant un retard de cicatrisation. Il existera une répétition d’anesthésie gazeuse pour induire des plaies ainsi que pour le suivi de la cicatrisation. Enfin, toutes les souris seront soumises a des mesures de glycémie maximum nécessitant une incision de la queue (durée totale de 15 secondes), espacées de minimum 3 jours.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent perdre du poids (principalement les souris diabétiques de type 1). Les animaux diabétiques présentent une polydipsie (consommation importante d’eau de boisson) et une polyurie (production importante d’urine). Les soins liés aux plaies peuvent être douloureux. Les anesthésies répétées, nécessaires pour les soins et le suivi de cicatrisation, peuvent affaiblir les animaux. Les souris seront hébergées individuellement durant la période de suivi de cicatrisation, ce qui peut créer un stress pour ces animaux sociaux.
Devenir
Mise à mort en fin d’expérimentations et prélèvement des tissus.
Remplacement
La cicatrisation est un processus naturel qui permet à la peau de se refermer. Le diabète conduit, entre autres, à des défauts de cicatrisation de la peau avec un allongement de la durée de fermeture pouvant conduire à une infection. Souhaitant étudier les impacts d’une solution d’acide hypochloreux sur la cicatrisation diabétiques, à la fois dans son action de détersion des plaies mais aussi d’impact moléculaires sur ce tissu lésé complexe, notre projet requiert une approche intégrée qui n’est rendue possible que par l’utilisation du modèle souris. De plus, ce projet souhaite étudier l’impact d’une solution d’acide hypochloreux sur la cicatrisation diabétique dans ces phases précoces ou intermédiaires, nécessitant le prélèvement de la peau lésée, impossible à réaliser sur un patient atteint de retard de cicatrisation, au risque d’empirer sa pathologie. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux. Ce projet de recherche fait suite à des résultats obtenus sur cellules.
Réduction
Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Le projet de recherche utilise 2 modèles de souris diabétiques, sur lesquelles seront réalisées 2 types de plaie cutanée et le suivi de la cicatrisation avec ou sans acide hypochloreux. De par l’expertise de l’équipe et les études tissulaires post-expérimentations requises, 8 souris sont nécessaires par groupe pour la cicatrisation complètes et 6 souris par groupe pour les études sur peaux saines et les jours intermédiaires de cicatrisation. Les tests de toxicités de la procédures 1 seront réalisés séquentiellement, permettant une réduction du nombre d’animaux nécessaire. En effet, nous commenceront par tester la solution pure d’acide hypochloreux, si celle-ci ne provoque pas d’inflammation sur la peau saine, nous ne testeront pas les dilutions. D’un point de vue statistique, nous avons prévu d’utiliser des tests statistiques non paramétriques adaptés aux petits groupes et des analyses de variance suivi de post-tests pour évaluer les différences intra- ou inter-individuelles pour toutes les mesures.
Raffinement
Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées tous les jours et pesées 1 fois par semaine. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Un anti-douleur sera administré durant les premiers jours de cicatrisation afin de prendre en charge la douleur des animaux.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie et une organisation cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier l’induction des plaies et les processus de cicatrisation, tout en complétant l'analyse jusqu'à une échelle cellulaire et moléculaire. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 4 semaines pour débuter le modèle diabétique et pour que les souris soient sexuellement matures au moment de l’induction des plaies cutanées.
Évaluation des effets du composé X sur la prise alimentaire en conditions de pair-feeding chez la souris obèse maintenue en condition de thermoneutralité.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Derrière l'évaluation d'un composé anti-obésité se trouve le développement commercial d'une molécule pour un client, que le RNT nomme explicitement. 88 souris rendues obèses vont être utilisées, réparties entre souffrance légère et modérée, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Hébergées seules jusqu'à 49 jours malgré leur caractère social, elles reçoivent des administrations quotidiennes du composé. Le porteur présente l'étude in vivo comme une étape réglementaire "incontournable" avant un premier essai chez l'humain.
Objectifs
L’obésité mondiale a presque triplé depuis 1975 et concernait plus d’un milliard de personnes en 2022 selon l’OMS. Elle constitue aujourd’hui un fardeau majeur de santé publique. Plusieurs approches thérapeutiques sont en développement, notamment des molécules récemment autorisées comme la sémaglutide, dont l’efficacité est avérée mais qui suscite certaines inquiétudes en raison d’une perte concomitante de masse musculaire, problématique chez les sujets obèses déjà à risque de faiblesse musculaire. Le présent projet s’inscrit dans une phase précoce de développement d’un nouveau composé anti-obésité (composé X). Les objectifs du projet seront d'évaluer l’efficacité du composé X sur différents paramètres associés à l’obésité dans un modèle murin obèse et de déterminer si la perte de poids observée est exclusivement liée à une diminution de la prise alimentaire. Pour cela, un groupe d'animaux, recevant le véhicule mais recevant une ration calorique journalière équivalente à celle consommée par les animaux traités, permettra d’évaluer si les effets du composé X sur le poids sont uniquement attribuables à la réduction de l’ingestion calorique. Si la perte de poids s'avère identique dans les deux groupes, il sera alors possible de conclure que le composé X diminue le poids corporel par son seul impact sur la prise alimentaire.
Bénéfices attendus
L’obésité constitue aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique, associé à une augmentation importante de la morbidité et de la mortalité, notamment en raison de complications métaboliques, cardiovasculaires et musculo-squelettiques. Malgré la disponibilité de nouvelles thérapeutiques, les options actuelles présentent des limites, notamment des effets indésirables ou une perte de poids accompagnée d’une diminution de la masse musculaire, ce qui représente un risque supplémentaire chez les personnes obèses. Le présent projet vise à évaluer un nouveau composé anti-obésité en phase précoce de développement. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à : 1) Hébergement individuel (maximum 49 jours); 2) Administrations quotidiennes des composés (maximum 21 administrations, durée: 1 minute); 3) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (maximum mesures 19, durée : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures maximum, durée de la mesure : 2 minutes).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations des traitements occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
A l'issue de l'étude, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape réglementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par à l'aide de tests statistiques appropriés. Les animaux seront randomisés pour l'attribution de leur groupe. Par ailleurs, compte tenu du fait que nous n'attendons pas d'effet sexe-dépendant du candidat médicament, l'étude sera menée sur les deux sexes.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l'étude mais les animaux conserveront des contacts visuels et olfactifs entre eux. Une attention particulière sera apportée à l'enrichissement des cages qui sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Le prélèvement sanguin prévu en fin d'étude sera précèdé d'une anesthésie afin de limiter toute douleur et stress chez les animaux. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans le tube de couleur rouge permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée (2 visites par jour) et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (avec 60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 18 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par le composé testé, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 12 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.
Rôle de la lipide kinase PIKfyve dans la cardiomyopathie diabétique EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras pendant douze semaines, elles reçoivent des injections quotidiennes sur la même durée, des échographies cardiaques hebdomadaires sous anesthésie et des tests de tolérance au glucose de deux heures. L'objectif est de préciser le rôle d'une enzyme dans la cardiomyopathie diabétique, les retombées pour les patients restant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que seul le recours à un "organisme entier" permet de prévoir la réponse à la molécule testée.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque (IC) est l’une des premières causes de mortalité/morbidité dans le monde. Le diabète est une complication majeure de l’IC, et l’augmentation épidémique actuelle de l’obésité et du diabète font que la cardiomyopathie de type diabétique devient un problème majeur de santé publique, pour lequel les solutions thérapeutiques sont très limitées. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle d’une enzyme spécifique dans le développement de la cardiomyopathie de type diabétique et également de tester de nouvelles thérapeutiques pour lutter contre cette pathologie. Le projet se déroule dans deux Etablissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre le rôle d’une enzyme dans la progression de la cardiomyopathie diabétique, problématique majeure de santé publique, et permettra d'améliorer nos connaissances sur la progression de cette pathologie multifactorielle et complexe. A long terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer les traitements existants et offrir de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrant de cette pathologie, réduisant ainsi la morbi-mortalité associée.
Procédures
Les souris suivront plusieurs types d’interventions : alimentation modifiée enrichie en graisse pendant 12 semaines ; des examens hebdomadaires du cœur par échocardiographie (une fois par semaine, environ 10 min, sur animal anesthésié) ; des mesures de la composition corporelle (% masse grasse) réalisées en début et à la fin du protocole (sur animal vigile, 2 min par mesure) ; des injections journalières pendant 12 semaines (durée environ 10 secondes chacune, sur animal vigile) ; des exercices physiques adaptés, en début et en fin de protocole (quelques minutes par séance) ; un test de tolérance à l’insuline et au glucose en début, milieu et fin de protocole (intervention de 2h). L'ensemble des interventions auront lieu dans l'établissement utilisateur 1.
Impact sur les animaux
Certains régimes peuvent entraîner une prise de poids, une fatigue ou une réduction de mobilité. Des traitements peuvent provoquer une tension élevée ou une inflammation. Les signes de douleur ou d’inconfort seront surveillés, et des mesures seront prises pour soulager les animaux ou les retirer de l’étude si nécessaire. Les anesthésies nécessaires aux échocardiographies peuvent entraîner une récupération lente ou une hypothermie passagère.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de protocole afin de permettre les prélèvements d’organes et leurs analyses, qui ne peuvent pas être réalisés sans mise à mort.
Remplacement
L’utilisation du modèle murin est indispensable pour étudier l’interaction entre les différents types cellulaires cardiaques, les systèmes vasculaire et immunitaire. Seul le recours à un organisme entier permet de prévoir la réponse thérapeutique à la molécule testée.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant la variabilité biologique et sans compromettre les résultats scientifiques attendus. Chaque animal sera utilisé pour mesurer un maximum de caractéristiques du développement de la pathologie (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires). Ceci permettra de limiter au maximum le nombre de souris utilisées au final.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, nous mettrons en place plusieurs mesures visant à assurer le bien-être des animaux et à réduire au maximum la douleur et la souffrance associées aux procédures expérimentales : - litière absorbante, renouvelée régulièrement, permettant les comportements naturels (fouille, creusage, nidification). De plus, les animaux obèses seront suivis plus régulièrement (remplissage des biberons, changement de litière plus fréquent si nécessaire). - interaction sociale préservée : les souris seront hébergées en groupes de 5 individus pour éviter l’isolement. - accès libre à l’eau et à la nourriture. Les échocardiographies seront réalisées sous anesthésie légère avec maintien thermique et du gel oculaire sera appliqué pour prévenir la déshydratation. - Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance, de détresse ou d’inconfort : poil ébouriffé, posture anormale, signes de déshydratation, détection de signes de douleur (respiration anormale, mouvements réduits, vocalisations inhabituelles), analyse du comportement : isolement, diminution des interactions sociales, réduction de l’activité locomotrice, perte de poids. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé et qualifié, afin de réduire la durée et le stress des interventions. Ces mesures permettront de limiter au maximum la souffrance animale tout en assurant la qualité et la fiabilité des résultats obtenus dans cette étude. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied (moins de 10 minutes), à l’écart du public, dans les cages de transport sécurisées. Les cages seront placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.
Choix des espèces
L’espèce souris a été choisie car elle représente le modèle mammifère le plus couramment utilisé pour les études sur l’insuffisance cardiaque et le plus représentatif de la pathologie humaine. Ainsi, les résultats obtenus seront plus facilement transposables à l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge de 2 mois, correspondant à un stade jeune adulte, adapté aux objectifs de l’étude.
Impact de la modification de la structure tissulaire sur la surveillance immunitaire – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
4443 souris vont être utilisées pour une zone de peau fibrosée de moins d'un centimètre carré dans le bas du dos, chacune recevant des injections répétées d'un agent inflammatoire cinq jours par semaine pendant deux semaines. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et seront tuées pour analyses. Le projet observe comment la rigidité du tissu modifie la migration des cellules immunitaires dans la peau. L'effectif de plus de quatre mille animaux n'est rattaché qu'à un objectif de connaissance fondamentale, sans justification détaillée du nombre.
Objectifs
La peau est le plus grand organe du corps humain, indispensable à notre survie. Elle agit comme une barrière protectrice et joue un rôle crucial dans notre système immunitaire. La peau est composée de trois couches. 1)L’épiderme, la couche la plus superficielle 2)Le derme, la couche intermédiaire, contient des fibres de collagène et d’élastine qui lui donnent élasticité et fermeté. Il abrite également des vaisseaux sanguins, des nerfs, ainsi que des follicules pileux. 3) l’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau et est essentiellement composée de tissus adipeux et conjonctif. Elle fournit une isolation thermique. Dans le derme et l’épiderme, les cellules immunitaires patrouillent à la recherche de pathogènes ou de signaux de danger pour la mise en place d’une réponse immunitaire efficace, qu’elle soit spontanée suite à une infection ou à l’apparition d’une tumeur, ou induite par un vaccin par exemple. Ce processus est aussi essentiel pour le maintien de la tolérance immunitaire, et ainsi éviter les maladies auto-immunes. Certaines cellules immunitaires (les cellules dendritiques) se déplacent dans les tissus en prélevant des échantillons de leur environnement. Elles migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques drainant leur tissu d’origine. Ces 2 étapes (échantillonnage en périphérie et migration vers les ganglions) sont clefs dans la mise en place de la réponse immunitaire et le maintien de la tolérance. Dans les tissus, la migration des cellules dendritiques est guidée par des signaux chimiques et physiques, qui sont profondément modifiés en cas d’inflammation. Notre projet vise à comprendre comment la modification des propriétés mécaniques de la peau modifie la migration et l’efficacité des cellules immunitaires dans la peau et dans les ganglions. La compréhension de ces mécanismes mis en jeu pourra s’appliquer à d’autres pathologies dans lesquelles la modification de la structure du tissu est majeure. La modification de la structure tissulaire et de ses propriétés physiques est maintenant connue dans de nombreuses pathologies notamment au sein de divers cancers, où le la modification du collagène semble favoriser la survenue de métastases en inhibant la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Comprendre comment l’installation d’une fibrose modifie les propriétés mécaniques des tissus et la migration des cellules immunitaires permettra d’obtenir des connaissances fondamentales sur la migration des cellules dans les tissus. Nous focalisons nos recherches sur les cellules dendritiques, cellules sentinelles du système immunitaire indispensable pour le déclenchement d’une réponse immunitaire spécifique. Nos premiers résultats mettent en évidence une accumulation de cellules dendritiques en cas de fibrose, qui sont incapables de migrer au ganglion lymphatique. Nous souhaitons adapter cette DAP afin de préciser les mécanismes moléculaires mis en cause dans ce défaut de migration. Ces mécanismes pourront être utilisés dans de nombreuses autres pathologies où la modification de la structure du collagène joue un rôle majeur dans la progression de la maladie et la réponse immunitaire, notamment en cas de cancer, où la migration des cellules dendritiques est également défectueuse. La modification proposée permettra d’identifier des mécanismes précis qui régulent la migration des cellules dendritiques, et pourra s’appliquer à d’autres pathologies (cancer).
Procédures
Dans un premier lot, les animaux anesthésiés recevront des traitements par injection à raison de maximum 1 injection par jour, 5 jours par semaine pendant 2 semaines (durée de chaque anesthésie de 5 minutes maximale). Certains de ces animaux recevront également un second traitement soit par injection à raison d’1 injection par jour pendant 5 jours consécutifs au maximum (durée du geste inf à 10sec) soit par application cutanée (application unique – durée du geste de 3 minutes). Dans un second lot, les animaux vigiles recevront une application cutanée unique de produit (durée du geste inférieure à 3 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des injections de produits seront celles liées à la piqûre (douleur de courte durée). L’injection d’un agent inflammatoire induira une inflammation chez les animaux. L’inflammation se caractérise par la douleur, le gonflement, la rougeur et la chaleur qui peuvent entraîner une gêne chez l’animal. Néanmoins, il s’agit ici d’une inflammation locale et non générale, et modérée. La gêne est caractérisée par l’apparition d’une desquamation principalement entre les 12e et 16e jours après injection, et la présence d’un érythème dont l’intensité est maximale du 9e au 14e jour. Les animaux seront suivis pendant 6 semaines afin d’étudier la résolution de l’inflammation, mais nous ne nous attendons pas à des effets rémanents après la fin des injections. La surface attendue de la zone fibrotique de la peau du bas du dos de la souris est inférieure à 1cm. Nous porterons notre attention spécifique sur cette zone. Nous ne nous attendons pas à des conséquences sur la mobilité des souris, la zone fibrotique étant à distance des articulations des membres supérieurs et inférieurs. Un éventuel effet sur la mobilité n’a d’ailleurs pas été décrit dans la littérature.L’application cutanée d’un marqueur fluorescent sans addition de molécule pro-inflammatoire induira une réaction locale éventuelle (mais non décrite dans la littérature). L’application cutanée d’un marqueur fluorescent associé à une molécule proinflammatoire pourra induire un aspect inflammatoire local (rougeur, chaleur).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L’influence du microenvironnement tissulaire sur la migration des cellules immunitaires a été démontré par de nombreuses équipes au cours de la dernière décennie. Ces cellules répondent à des signaux de dangers, largement étudiés in vitro , comme par exemple la présence de composants bactériens. Néanmoins, il s’agit d’un effet direct d’un agent inflammatoire sur les cellules, qui ne prend pas en compte le contexte complexe et la réponse du tissu, qui répond également à la présence de signaux de dangers. Il n’est donc pas possible d’extrapoler ces données sans avoir une description précise et quantitative des propriétés du microenvironnement in vivo. L’utilisation de différents modèles in vitro (matrice en fibres 3D) ou ex vivo (explants de peau humaine) ne permettent pas de reconstituer la complexité du tissu cutané : - Sa structure en 3 couches (épiderme, derme, hypoderme) et la structure des fibres de collagène formant le tissu de soutien aux cellules. - Nombreux types cellulaires présents : kératinocytes dans l’épiderme, fibroblastes dans le derme, adipocytes (manquant dans les modèles in vitro), extrémités neuronales (non présents dans les modèles in vitro) et l’infiltrat immunitaire comportant de multiples types cellulaires différents. L’objectif de ce projet est de fournir cette description, afin ensuite de pouvoir établir des modèles in vitro conformes aux propriétés des tissus observées in vivo. Cela permettra alors d’isoler les propriétés du tissu une par une et de tester leur effet individuel sur les cellules immunitaires, afin d’identifier les paramètres les plus importants. Par ailleurs, Le modèle in vivo est indispensable pour déchiffrer le dialogue entre différentes cellules immunitaires et la migration d’un organe à l’autre, dans un organisme vivant intégré dont le système immunitaire est proche de celui de l’homme, comme la souris. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet, afin d’avoir un tissu et un système immunitaire complets et fonctionnels.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les expériences de mise au point seront réalisées sur des échantillons prélevés sur des animaux utilisés pour d’autres expériences (mise à mort pour prélèvement d’autres organes que la peau). Une première expérience sera réalisée afin de déterminer les meilleurs temps expérimentaux à utiliser. Les échantillons issus de cette expérience seront également utilisés pour les analyses des procédures suivantes. Le maximum d’échantillons d’intérêt a été et sera prélevé lors de la mise à mort des souris (peau, ganglions, sérum) et conservés pour des analyses ultérieures. Cela permettra de concentrer ensuite la caractérisation sur ces conditions expérimentales et donc de limiter le nombre total d’animaux utilisés. Grâce à nos résultats préliminaires, nous avons pu supprimer une procedure initialement prevue qui n’a plus de rationnel scientifique. A partir de données publiées et accessibles, nous avons ici déterminé le nombre d’animaux nécessaire comme étant le plus petit nombre d’animaux permettant de mettre en évidence une différence significative dans notre modèle expérimental (induction de fibrose cutanée).
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales, les animaux sont suivis attentivement afin d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Pour cela : -Les souris sont habituées à l’animalerie (accoutumance après transfert) et habituées à être manipulées par le même expérimentateur avant le début de la procédure, afin de limiter le stress après le début de la procédure. -Un suivi clinique renforcé sera réalisé pendant les 30 min suivant l’injection sous-cutanée, puis 6h après, puis une fois par jour pendant 10 jours, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. -Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point limite, les animaux seront sortis de la procédure (traitement antalgique, mise à mort). -Le suivi des animaux pour les procédures suivantes sera adapté en fonction de ce qui a été observé dans les procédures antérieures (au fur et à mesure de l’avancée du projet). Nous n’avons pas observé d’effet secondaire inattendu lors des premières expériences réalisées. Pour éviter l’inconfort et la douleur lors des procédures, des anesthésiques et analgésiques adaptés seront utilisés.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.