Procédures modérées

Toutes tuées à l'issue pour récupérer leurs tumeurs et leurs organes, 1300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des ARN thérapeutiques contre le cancer, en particulier colorectal. Des cellules tumorales, humaines chez des souris immunodéprimées ou murines chez des souris immunocompétentes, leur sont greffées sous la peau des flancs, puis chaque souris subit cinq à six injections de luciférine et autant d'imageries de 30 minutes sous anesthésie, trois prises de sang derrière l'œil et des injections de traitements dans la veine, dans la tumeur ou dans l'abdomen, trois à cinq fois par voie employée. La croissance des tumeurs entraînera une perte de poids, de la fatigue et une anémie, et le porteur écrit que le traitement par indisulam "pourrait engendrer certaines toxicités". Il affirme que le recours à la souris est "indispensable" pour comprendre l'effet des traitements dans un "organisme entier", notamment leur toxicité. Il indique ne pas avoir encore évalué la toxicité des ARN thérapeutiques, prévue lors des expériences de mise au point, et place leur éventuel développement en clinique à "plus long terme".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but d'évaluer le potentiel antitumoral d’ARN thérapeutiques sur des modèles précliniques de cancer. Malgré de nombreuses avancées, en particulier avec l’arrivée des thérapies ciblées puis des immunothérapies, les thérapeutiques anticancéreuses actuellement disponibles restent limitées et des résistances émergent le plus souvent, nécessitant un changement de stratégie thérapeutiques. Il est donc essentiel de développer des nouveaux traitements, dont les mécanismes d’actions seraient différents des traitements actuellement utilisés, afin d’élargir le spectre des options thérapeutiques ais également de pouvoir adapter le traitement au patient et aux caractéristiques biologiques et moléculaires tumorales. Les arylsulfonamides sont une classe de drogue dont l’intérêt pour le traitement des cancers a été évalué. Nous avons récemment développé une approche thérapeutique via des ARN thérapeutiques, et avons fait la preuve de concept in vitro de leur activité antitumorale. Nous souhaitons donc avec ce projet valider nos observations in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l'utilisation d'ARN thérapeutiques pour le traitement des cancers, en particulier le cancer colorectal. A plus long terme, ce projet pourrait aboutir au développement en clinique de ces mêmes ARN thérapeutiques.

Procédures

- Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : Durée 10 minutes - 1 fois par animal / Injection intrapéritonéale de luciferine pour bioluminescence : Durée 1 minute - 5 à 6 fois par animal - Anesthésie gazeuse durant l'imagerie : Durée 30 minute - 5 à 6 fois par animal / Prélèvements sanguins retroorbitaires - Durée 2 minutes - 3 fois par animal / Injection de traitements par voie IV - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / Injection de traitements par voie intratumorale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / Injection de traitements par voie intrapéritonéale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal

Impact sur les animaux

La greffe de lignées cellulaires tumorales, suivi de la croissance des tumeurs, engendreront une altération de l'état général des animaux avec perte de poids, fatigue, et anémie principalement. Le traitement par indisulam pourrait engendrer certaines toxicités, même si la littérature décrit des toxicités systémiques limitées chez l'homme et la souris (rares anémies). Nous n'avons pas encore évalué la toxicité potentielle des ARN thérapeutiques, mais celle-ci sera évaluée grâce aux expériences de mise au point.

Devenir

Des tests sur des cellules tumorales cultivées au laboratoire nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles animaux est indispensable mieux comprendre leur effet dans un organisme entier, nottament concernant la toxicité. Cette étape est primordiale puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme. Afin d'évaluer l'effet de nos traitements sur les tumeurs, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie et mise à mort systématique de l'ensemble des animaux du projet. L'étude biologique des tumeurs au laboratoire, ainsi que celles des tissus des autres organes est indidspensable pour évaluer les effets antitumoraux mais également la toxicité des traitements testés.

Remplacement

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules normales en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action du traitement dans un organisme entier proche de l'homme, incluant des paramètres comme le développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques etc. qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux, nous utiliserons les mêmes animaux pour évaluer à la fois la prise et la croissance tumorale, la dose des traitements et leur toxicité. Nous utiliserons également les mêmes souris pour nos contrôles positifs et négatifs dès que ce sera possible. Cette association nous permet de réduire le nombre de souris contrôles utilisées. Le nombre d’animaux par lot sera également réduit au maximum afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. L'environnement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature pour ce type d'éxpérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiée immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale des xénogreffes de cellules humaines. L'utilisation d'un modèle syngénique nous permettra de valdier nos observations dans un système immunocompétent ce qui est essentiel pour envisager un dévellopement chez l'homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans littérature pour ce type d'expérimentation, les animaux utilisés seront de 8 à 12 semaines.

Pour étudier comment des mutations du gène CHRNA5, liées chez l'humain à un risque accru de dépendance à l'alcool, modifient les émotions et le comportement social, des souris porteuses de ces mutations sont comparées à des souris non modifiées. 756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles ont accès chaque jour à un biberon d'alcool pendant 6 à 12 semaines (144 souris), subissent une chirurgie du cerveau pour y injecter un virus ou implanter un dispositif (468), un enregistrement de l'activité cérébrale d'une heure sous anesthésie profonde (144), une activation ou une inhibition de zones du cerveau par la lumière à l'état éveillé (180), une contention de 15 minutes jusqu'à quatre fois (144), un test de comportement social de 10 minutes par jour pendant cinq jours (612) ou un isolement de 10 jours en cage individuelle avec roue (72). Le porteur présente la contention comme un "léger stress" dans la liste des procédures, puis écrit que ce "stress est modéré" et que les souris "finissent par s'y habituer".

Objectifs

Les problèmes liés à la consommation d'alcool sont très courants et dangereux dans notre société. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), 5 % des décès dans le monde sont causés par une consommation excessive d'alcool. Pour mieux comprendre ce problème et trouver des solutions, il est important de savoir comment notre corps et notre environnement influencent cette dépendance. Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Toutefois, il reste difficile d'étudier ce lien chez les humains. Pour mieux comprendre, des chercheurs ont utilisé des rats qui avaient cette différence génétique. Ces rats avaient un risque plus élevé de rechute dans l’alcool après une période d’abstinence. De plus, ce gène joue un rôle important dans certaines parties du cerveau qui sont liées à la mémoire et aux relations avec les autres. Et les connexions entre ces zones du cerveau sont aussi liées à l’anxiété et au comportement social. L’objectif de cette recherche est d’étudier comment cette différence génétique affecte les émotions et les comportements sociaux, ainsi que la communication entre certaines parties du cerveau. Pour cela, nous utiliseront des souris spéciales qui ont cette même différence génétique, et les compareront à des souris normales. Nous observerons comment cela influence leurs comportements et leur consommation d'alcool, en étudiant aussi les différences entre les mâles et les femelles. Ensuite, nous enregistreront l’activité du cerveau des souris pour comprendre comment cette différence génétique change la manière dont les parties du cerveau communiquent entre elles. Puis nous essayeront de manipuler cette communication pour voir comment cela affecte les comportements sociaux des souris. Enfin, nous tenteront de remettre en place la version normale du gène dans le cerveau des souris pour voir si cela améliore leur comportement.

Bénéfices attendus

Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Mais on ne sait toujours pas vraiment comment cela fonctionne. Malgré les graves conséquences de la dépendance à l'alcool sur la société, il existe très peu de traitements qui fonctionnent bien, et la plupart des personnes dépendantes rechutent après avoir essayé d'arrêter de boire. Les personnes qui souffrent de dépendance à l'alcool peuvent avoir des comportements très différents. Par exemple, certaines peuvent être anxieuses ou avoir des comportements antisociaux. Il est cependant compliqué de savoir si ces comportements sont causés par la consommation d'alcool ou s'ils étaient déjà présents avant. Notre projet a pour but de mieux comprendre comment les émotions et les comportements sociaux sont liés à la consommation d'alcool. Nous voulons savoir si ces comportements viennent de la consommation ou s'ils existaient avant. De plus, nous voulons prendre en compte les différences entre les sexes, car les réactions des hommes et des femmes peuvent être différentes. Ce projet pourrait nous aider à plusieurs niveaux. En tenant compte des émotions et pas seulement de la quantité d'alcool consommée, nous espérons comprendre comment cette différence génétique augmente le risque de dépendance. Si nous découvrons des comportements chez les animaux qui ressemblent à ceux observés chez les humains, cela pourrait nous aider à tester des traitements adaptés aux différents types de dépendance. Cela pourrait aussi conduire à des soins plus personnalisés, qui prendraient en compte la personnalité, le type de consommation d’alcool et le sexe de chaque personne, pour une meilleure efficacité. Enfin, nous cherchons à comprendre quelles parties du cerveau sont affectées par l'alcool et comment cela influence les comportements sociaux et émotionnels. Cela pourrait permettre de créer de nouveaux médicaments pour aider les personnes à arrêter de boire et à éviter les rechutes, en fonction de leur profil émotionnel et social.

Procédures

Les animaux passeront par plusieurs étapes dans cette étude : Ils auront accès à un biberon avec une solution d'alcool, une fois par jour, pendant 6 à 12 semaines (144 animaux). Ils subiront une petite opération sous anesthésie, d'environ 30 à 45 minutes, pour implanter un dispositif dans le cerveau (468 animaux). L’activité de leur cerveau sera mesurée sous anesthésie profonde pendant environ 1 heure après avoir stimulé une région spécifique du cerveau (144 animaux). Une technique utilisant la lumière permettra d'activer ou de désactiver certaines parties du cerveau chez des animaux éveillés, pendant 3 minutes (180 animaux, dont 90 pour l'activation et 90 pour la désactivation). Ils participeront à un test pour observer leur comportement social pendant 10 minutes par jour, sur une période de 5 jours (612 animaux). Ils seront soumis à un léger stress de restriction de leurs mouvements pendant 15 minutes, jusqu’à 4 fois au total, avec au moins une semaine de repos entre chaque session (144 animaux). Un petit échantillon de sang sera prélevé sous leur mâchoire. Certains animaux auront ce prélèvement une fois (288 animaux), d'autres deux fois, avec au moins une semaine d'écart entre les deux prélèvements (252 animaux). MODIFICATION: CERTAINS ANIMAUX SERONT PLACES EN ISOLEMENT SOCIAL DANS UNE CAGE CONTENANT UNE ROUE D'ACTIVITE PENDANT UNE PERIODE DE 10 JOURS AVANT D'ETRE REPLACES EN CAGE COLLECTIVE (72 ANIMAUX).

Impact sur les animaux

Les animaux participeront à différents traitements et tests au cours de cette étude : Consommation d'alcool : Ils auront accès à un biberon contenant de l'alcool une fois par jour pendant 6 à 12 semaines. Cela peut leur donner une sensation de détente et d'euphorie. Opération du cerveau : Ils subiront une intervention sous anesthésie pour injecter un virus ou placer un dispositif dans leur cerveau, ce qui dure environ 30 à 45 minutes. Le jour suivant, ils peuvent perdre un peu de poids, mais ils le récupèrent généralement en trois jours. Ils ressentent une légère douleur, bien contrôlée par des médicaments contre la douleur qu’ils reçoivent avant et après la chirurgie. Il peuvent être confronté au saignement après la chirurgie, l’infection de la plaie qui est bien gérée par une désinfection à la Bétadine et un suivi par l’expérimentateur. Dans de rares cas le dispositif implanté dans leur cerveau peut se décrocher. Enregistrement de l'activité cérébrale : Nous allons enregistrer l'activité de certaines parties de leur cerveau pendant environ une heure, sous anesthésie générale profonde, après avoir stimulé une région spécifique. Activation ou inhibition du cerveau par la lumière : Nous utiliserons une technique spéciale qui permet d'activer ou de calmer certaines parties du cerveau des animaux éveillés pendant 3 minutes. L'activation peut causer une légère anxiété temporaire, tandis que l'inhibition a un effet de diminution du stress. Test de reconnaissance des émotions : Les animaux seront observés lors d’un test qui dure 10 minutes par jour pendant 5 jours, pour observer leur comportement et réaction emotionelle. Cela peut provoquer un léger stress. Stress modéré : Les animaux seront placés dans un dispositif qui limite leurs mouvements pendant 15 minutes, jusqu'à 4 fois, avec une semaine entre chaque session. Ce stress est modéré, et les animaux finissent par s'y habituer. Prélèvement sanguin : Un petit échantillon de sang sera prélevé sous leur mâchoire. Cela est rapide mais peut causer une légère douleur et un stress momentané au moment où l’aiguille entre dans la peau. Certains animaux subiront ce prélèvement une fois, et d'autres deux fois, avec une semaine d'intervalle. MODIFICATION: CERTAINS ANIMAUX SERONT HEBERGES INDIVIDUELLEMENT DANS UNE CAGE CONTENANT UNE ROUE D'ACTIVITE PENDANT UNE PERIODE DE 10 JOURS AVANT D'ETRE REPLACES EN CAGE COLLECTIVE CE QUI PEUT GENERER UNE STRESS TEMPORAIRE LIE A L'ISOLEMENT.

Devenir

A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Ce projet étudie la manière dont les souris reconnaissent les émotions et comment cela est lié à la consommation d'alcool. À ce jour, il n'existe pas d'autres méthodes pour faire ces recherches sans utiliser des animaux. De plus, nous voulons comprendre comment certaines mutations génétiques influencent ces comportements. C'est pourquoi nous devons utiliser des souris spéciales qui ont les mêmes mutations que celles que l'on retrouve chez l'humain

Réduction

Nous optimisons le nombre d'animaux utilisés en réalisant plusieurs tests sur chaque animal au lieu de multiplier les groupes. Ainsi, les animaux passeront par différentes étapes de manière séquentielle (comme des opérations, des prélèvements, ou des tests de comportement). Avant de lancer un protocole complet, nous faisons d'abord des essais sur un petit groupe de 4 à 5 animaux pour voir si cela vaut la peine de poursuivre. Cela nous aide à éviter d'utiliser trop d'animaux. Si les résultats sont prometteurs, nous passons à un groupe de 12 animaux, qui est le nombre minimum que l’on estime nécessaire pour avoir des résultats fiables. Nous vérifions également que les données sont bien réparties avant de les analyser avec des méthodes statistiques appropriées.

Raffinement

Nous ferons tout pour garantir le bien-être des animaux pendant l'étude. Lors des opérations, ils recevront une anesthésie pour les endormir et des médicaments pour soulager la douleur. Si l'opération dure longtemps, nous les hydraterons avec une injection pour qu'ils ne soient pas deshydratés au reveil. Tous les animaux vivront dans un environnement confortable, avec des matériaux pour construire des nids et des endroits où se cacher. Ils seront gardés ensemble pour maintenir leurs liens sociaux, et des techniciens vérifieront leur état chaque jour. Si un animal montre des signes de douleur, les techniciens préviendront immédiatement le responsable de l'étude pour prendre des mesures. Si nécessaire, nous donnerons des médicaments ou des crèmes pour les aider à guérir. Nous pouvons aussi leur fournir de la nourriture spéciale pour les aider à manger. Après certaines opérations, nous utiliserons des matériaux doux pour éviter d’endommager les implants. Les tests qui leur permettent d’interagir chaque jour contribuent aussi à leur bien-être. Tous ceux qui s’occupent des animaux sont formés pour le faire correctement. Enfin, si un animal doit être euthanasié, cela se fera de manière douce, sans douleur, pour minimiser ses souffrances.

Choix des espèces

La souris est un animal souvent utilisé pour étudier le cerveau chez les vertébrés. Son système nerveux est organisé de manière similaire à celui des humains, et elle partage environ 95% de ses gènes avec nous, ce qui permet de transposer les résultats obtenus chez la souris à l'humain de manière assez fiable. De plus, la souris peut être génétiquement modifiée, ce qui nous aide à comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans de nombreuses maladies. Par exemple, grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées, nous pouvons étudier comment certaines mutations génétiques humaines affectent des molécules ou des récepteurs spécifiques dans le cerveau. Les souris adultes ont été choisies pour cette étude car elles présentent une maturation complète des systèmes physiologique et neurologique, nécessaire à l’analyse des processus socio-emotionnels. Plus spécifiquement, nous utiliserons des souris modifiées pour exprimer des mutations des récepteurs nicotiniques, liées à la dépendance à l'alcool chez l'humain. Les souris montrent également une variété de comportements sociaux et de réponses émotionnelles, ce qui en fait un modèle pertinent pour notre recherche sur les émotions et la consommation d'alcool.

Intubés sous anesthésie générale, 2 300 rats reçoivent dans les poumons une substance qui y provoque une fibrose, puis un traitement quotidien pendant quatre semaines. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour récupérer leurs organes. Le protocole prévoit des imageries cardiaques d'une vingtaine de minutes sous anesthésie, parfois l'implantation chirurgicale d'une pompe sous la peau, puis une chirurgie finale de mesure de pression dans le ventricule droit et l'artère pulmonaire, une ponction de sang dans le cœur et une mise à mort par surdose d'euthanasiant. Le porteur décrit un inconfort respiratoire pouvant aller jusqu'à la détresse, sans jamais nommer ni la substance qui induit la fibrose ni les composés testés.

Objectifs

La fibrose idiopathique pulmonaire (FPI) est une pathologie pulmonaire chronique rare représentant la forme la plus fréquente de fibrose pulmonaire et dont la prévalence est de 18 cas pour 100 000 habitants dans le monde. La durée médiane de survie après l’établissement du diagnostic est estimée entre 2 et 5 ans. La FPI se caractérise par une rigidification du tissu pulmonaire affectant son fonctionnement et entrainant une insuffisance respiratoire pouvant aboutir, à terme, à des troubles cardiaques. Cette pathologie se manifeste ainsi par un essoufflement progressif, une toux sèche, une fatigue et une diminution de la tolérance à l’exercice. Plusieurs facteurs de risque sont associés à cette pathologie tels que le tabagisme et la pollution atmosphérique, les infections virales chroniques ou encore sont d’origines génétiques. Les stratégies pharmacologiques actuelles ne permettent pas de guérir la maladie mais seulement de ralentir sa progression et s’accompagnent d’effets secondaires importants. La seule stratégie curative repose sur une transplantation pulmonaire très invasive qui s’accompagne d’un risque important de complications post-opératoires et dont les greffons sont en quantités limitées. Il est donc nécessaire de pouvoir développer et tester de nouveaux composés permettant de soigner cette pathologie. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans un modèle préclinique chez le rat dont la pathologie est induite par l’administration d’une substance connue pour être à l’origine de fibrose pulmonaire chez l’Homme. Ce modèle repose sur l’administration de cette substance dans la trachée. L’efficacité du candidat médicament sera comparée à un ou plusieurs traitements de référence.

Bénéfices attendus

Le modèle de fibrose pulmonaire induite par l'administration d'une substance entrainant la fibrose apparait comme un modèle élaboré, présentant des marqueurs de l'inflammation précoces suivi par l’installation progressive de la fibrose des tissus pulmonaires, observée dans la maladie de la FPI chez l’Homme. Ainsi, des caractéristiques fonctionnelles et tissulaires aussi bien au niveau pulmonaire que cardiaque sont présentes chez les animaux induits, de manière similaire aux patients atteints de FPI. À terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.

Procédures

Les animaux sont d'abord mis sous anesthésie générale avant d'être intubés puis une canule est glissée dans les voies respiratoires de l'animal et une injection liquide contenant la substance induisant la fibrose est administrée rapidement (durée de l'intervention: 6-8 min) dans les poumons. Durant les 4 semaines suivantes, les animaux seront traités quotidiennement avec plusieurs composés ou des composés de références selon différentes voies d'administration (voie orale, intraveineuse, injection dans l'abdomen ou en sous-cutanée: durée de chaque administration = 1min). Au cours du protocole, les animaux seront à nouveau anesthésiés de manière générale afin de pouvoir effectuer des imageries cardiaques (environ 20 min par passage) intermédiaires (c'est-à-dire à 2 semaines post-administration) pour contrôler les répercussions de l'induction de la pathologie et l'effet potentiel des candidats médicaments ai cours du protocole. Une autre imagerie cardiaque sera effectuée en fin de protocol puis une chirurgie sera effecutée sous anesthésie et analgésie afin de réaliser des mesures de pression dans le ventricule droit et dans l'artère pulmonaire puis pourront être soumis à un prélèvement sanguin par ponction directe dans le coeur avant d'être mis à mort par surdose d'euthanasiant (durée 15min). En parallèle, ces animaux pourront subir un prélèvement sanguin par ponction directe de la veine du cou réalisée sous anesthésie générale ou dans la veine de la queue sans anesthésie (durée: 5 min par prélèvements).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration dans les voies respiratoires avec la substance induisant la fibrose pulmonaire réalisée sous anesthésie générale et par intubation entrainant un risque d’irritation des voies respiratoires. L’administration de cette substance entraine une réponse inflammatoire pulmonaire rapide responsable d’un inconfort respiratoire et pouvant provoquer une détresse respiratoire plus ou moins sévère en fonction de la sévérité de la lésion. Dans les heures qui suivent l’administration de cette substance, une baisse de la mobilité peut être observée ainsi qu’une perte d’appétit et une baisse de l’hydratation entrainant une perte de poids. Une chirurgie d’implantation de pompe contenant les composés pourra être réalisée nécessitant une ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou une gêne notamment avec la présence de la pompe et de la diffusion des substances via celle-ci. L’administration répétée de candidat médicament par voie orale, dans l'abdomen, intraveineuse ou sous-cutanée est une source de stress puisqu’il est nécessaire d’appliquer une contention chez le rat afin de pouvoir réaliser ces gestes. Un des effets indésirables potentiels est lié à l'administration du candidat médicament. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules avec peu de recul. Le traitement par injection dans l'abdomen peut entrainer une inflammation de l'abdomen. Le traitement par voie orale peut entrainer des fausses routes associées à des troubles respiratoires. Des prélèvements de sang seront réalisés soit sur animal sous anesthésie générale lorsque ce dernier sera effectué à la veine du cou soit sur animal vigile soumis à une contention, impliquant des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille pouvant être à l’origine 1) d’une douleur, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant. Une nouvelle anesthésie générale est nécessaire pour chaque imagerie cardiaque ou lorsque des prélèvements sanguins à la veine du cou seront nécessaires. De même, en fin de protocole, des mesures des flux sanguins seront effectuées dans le ventricule droit et l’artère pulmonaire sur animal anesthésié, pouvant être suivie par un prélèvement de sang dans le coeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de récupérer les organes pour faire des analyses approfondies sur l'effets des composés.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composés in vivo. Afin d’évaluer l’effet de candidat médicament sur les marqueurs de l’inflammation et de fibrose des tissus pulmonaires ou cardiaques, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, bien qu'une évaluation initiale de l'effet des composé peut-être effectué dans des modèles in vitro (permettant de faire un premier trie des composés les plus pertinents), ces derniers ne permettent pas d’induire et d’étudier les répercussions intégrées au niveau cardiorespiratoire et systémique, ni d’évaluer le devenir du candidat médicament.

Réduction

Le modèle de fibrose pulmonaire induite chez le rat à la suite de l’administration d'une substance connue pour induire de la pibrose dans les poumons est connu pour être reproductible permettant d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Ajouté à cela, dans le cas où une imagerie cardiaque est pratiquée à un temps intermédiaire (à 2 semaines post-induction) en plus des mesures terminales, les animaux pourront 1) être répartis de manière aléatoire permettant ainsi d’homogénéiser les différents groupes et de diminuer ainsi la variabilité entre ces derniers, et 2) de faire un suivi sur plusieurs semaines sur les mêmes animaux limitant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations . Les animaux seront hébergés par 2 ou 3 par cage selon leur poids. Des enrichissements multiples leur sont proposés (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation par l'Homme ainsi qu’aux environnements nouveaux afin de réduire le stress. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié aux différentes procédures. L’administration de la substance induisant la fibrose dans les poumons sera réalisée sous anesthésie générale et les animaux seront surveillés en phase post-opératoire sur tout le reste de la journée. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après l’administration de la substance induisant la fibrose. Une réhydratation pourra être effectuées en cas de signes de déshydratation. Les prélèvements sanguins ainsi que les doses et volumes d’injection d’analgésiques ou des traitements avec les candidats médicaments seront réalisés selon les recommandations éthiques [doses et volume adaptées en fonction des voies d’administration. Après chaque prélèvement de sang, une une héhydratation sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 2 fois le volume prélevé injecté en sous cutanée) afin de compenser la perte de sang. Les imageries cardiaques et prélèvements sanguins à la veine du cou seront réalisés sous anesthésie générale tout comme les mesures de flux sanguins. Ces derniers se feront également sous analgésie. Pour chaque anesthésie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et seront maintenus à une température comprise entre 36,5 et 37,5°C, et du gel ophtalmique sera déposé sur les yeux.

Choix des espèces

Le rat est largement utilisé en préclinique pour le modèle de fibrose pulmonaire. Il présente des structures alvéolaires et bronchiolaires suffisamment comparables à celle de l’Homme pour obtenir une réponse pro-inflammatoire suivie par l’installation de la fibrose pulmonaire, toutes deux typiques de la FPI. L'analyse des flux sanguins (pression artérielle et cardiaque) et imageries cardiaques sont également sensiblement comparables et peuvent être partiellement transposables à celles observées chez les patients FPI. Le rat présente une bonne tolérance physiologique à la substance induisant la pathologie dont le développement est stable et reproductible chez cette espèce. Le rat permet également de réaliser des prélèvements sanguins longitudinaux ainsi que de collecter des volumes sanguins suffisants pour étudier de manière plus précise la pharmacocinétique d’un composé dans l’organisme. Des rats âgés de 5-7 semaines le jour de l’administration intratrachéale de cette substance (entre 180-300g) seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids.

Trois administrations d'alun et d'allergène du blé à une semaine d'intervalle, quatre prélèvements de selles, trois prises de sang et un gavage final destiné à déclencher la réaction allergique : 180 souris subissent ce protocole entre leur quatrième et leur septième semaine de vie. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus du système immunitaire et de l'intestin. L'additif visé, un phosphate tricalcique nanoparticulaire, entre aujourd'hui dans les préparations infantiles et a servi d'adjuvant vaccinal. Le porteur écrit que le protocole ne suscite pas ou peu de douleur et n'emploie donc aucun anesthésique en dehors de la mise à mort, après avoir décrit des souris recroquevillées une à deux heures sous l'effet de l'alun, une chute de leur température corporelle et des respirations sifflantes d'anaphylaxie.

Objectifs

Le projet vise à identifier comment un additif alimentaire, reconnu comme un nanomatériau et incorporé dans les formulations alimentaires pour équilibrer l’apport en phosphate et calcium, peut conduire à des désordres du système immunitaire via sa capacité à stimuler le système immunitaire et/ou son affinité pour des protéines identifiées comme allergènes. L’augmentation de la prévalence des allergies alimentaires observée depuis une vingtaine d’années coïncide avec l’augmentation de la consommation d’aliments ultra-transformés. Parmi les aliments ultratransformés, on trouve ceux contenant des additifs alimentaires, dont le risque de déclencher des réactions allergiques commence à être évoqué pour ceux contenant des nanoparticules. Les nanoparticules ont une grande capacité de couplage avec des protéines et donc des allergènes. Ces mélanges nanoparticules/allergènes peuvent à la fois favoriser l’exposition des allergènes dans le corps et interagir avec le système immunitaire en impactant la réponse immunitaire du corps. L’une des formes de l'additif contient 100% de nanoparticules. Elle a servi pendant plusieurs années de support à des vaccins comme adjuvant et est actuellement employée dans les préparations infantiles pour augmenter l’apport en calcium des nouveaux-nés. Notre question est donc : est-ce que l’additif alimentaire a un potentiel effet adjuvant de la réaction allergique chez le jeune enfant et notamment vis-à-vis d’un allergène majeur chez l’enfant : le blé ? L’allergène choisi est la gliadine native de blé, une protéine du blé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme d’action d’un additif alimentaire dans la sensibilisation au blé. Par la comparaison des différents paramètres mesurés, le protocole répondra aux hypothèses formulées suivant la bibliographie, à savoir : 1) L'additif participe à la sensibilisation et au déclenchement de l’allergie alimentaire en favorisant l’exposition des allergènes et/ou limitant la digestion des protéines dans l'intestin. Ce mécanisme est basé sur les grandes capacités de couplage entre l'additif et les protéines dont les allergènes. 2) L'additif a la capacité de stimuler le système immunitaire, comme lorsqu’il est adjuvant de vaccins.

Procédures

Lors de ce protocole, toutes les souris subiront 4 prélèvements de selles, un juste avant la sensibilisation 1 = S1, un avant la sensibilisation 2 = S2, un avant la sensibilisation 3 = S3 et un la veille de la mise à mort. Les souris auront également 3 prises de sang espacées d’une semaine au minimum (avant les sensibilisations 1, 2 et 3). Les groupes sensibilisés soit 90 souris par sexe subiront 3 administrations à 1 semaine d’intervalle (S1, S2, S3), puis toutes les souris, soit 180, subiront 1 gavage oral. Les prélèvements de selles, les prises de sang et le gavage oral sont réalisés sur souris vigile. Chaque prélèvement de selles dure 10 minutes par souris et chaque prise de sang dure entre 1 à 2 minutes par souris. Chaque gavage oral dure une quinzaine de secondes par souris.

Impact sur les animaux

La phase de sensibilisation et la phase de déclenchement de l’allergie alimentaire peuvent contribuer à des nuisances. Lors de l’administration de l'allergène une légère douleur passagère peut être ressentie au point d'injection. L’alun entraine aussi une douleur passagère, les souris se recroquevillent, qui dure 1 à 2h. Les souris sensibilisées à l’alun sont à nouveau surveillées 3h après. Une baisse de la température corporelle des animaux est également observée quand l’animal déclenche une réaction allergique. Les souris pourraient ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration de l’allergène par gavage. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris. Aussi, des symptômes caractéristiques de l’anaphylaxie peuvent être observés comme une respiration difficile et sifflante. Généralement, les effets surviennent entre 0 et 30 minutes après le gavage pour déclencher la réaction allergique et peuvent persister pendant une trentaine de minutes. Lors de la prise de sang à la queue une irritation passagère à la queue peut être ressentie.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude du système immunitaire et de la fonction intestinale.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de la réponse allergique, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.

Réduction

Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les molécules d'intérêt dans l'allergie conduit à utiliser des groupes de 30 souris chacun. Dans la mesure où cette étude pourrait générer une alerte en santé publique, nous avons des groupes de 30 animaux.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi des signes généraux et le suivi des points limites sont effectués au quotidien afin de minimiser l’inconfort et la douleur. Pour minimiser la douleur stomacale provoquée par l'alun, de la nourriture est déposée à proximité de la souris dans la cage pour faciliter son accessibilité. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront herbergées dans les cages d’un portoir ventilé (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages. Ce protocole ne suscitant pas ou peu de douleur chez la souris et afi de ne pas interférer avec les résultats du protocole, aucun anesthésique ne sera utilisé, mis à part à la mise à mort.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris mâles et femelles. Les souris constituent un modèle reconnu dans le cadre des études du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette espèce et de la bibliographie existante. De plus, nos modèles d’allergie ont été établis sur cette espèce. Des analyses des molécules impliquées dans l'allergie seront réalisées. L’utilisation de ces souris nous donne accès à de nombreux outils sur le système immunitaire, notamment les anticorps présents dans l'allergie. Les souris utilisées auront 3 semaines de vie à réception (fraichement sevrées), , 4 semaines de vie à la première sensibilisation (adolescence), 7 semaines au moment du gavage oral et de la mise à mort (âge de maturité sexuelle complète).

Exposées jusqu'à 22 heures par jour aux ondes de la 5G à partir du septième jour de gestation, 76 rates sont hébergées seules pendant onze à dix-huit jours d'affilée, puis réunies avec leur portée. Les ratons naissent sous exposition et la subissent jusqu'à leur 80e jour de vie. Du premier au vingt-et-unième jour ils passent des tests sensori-moteurs, puis des tests de sociabilité, de cognition et de coordination locomotrice pouvant durer une heure par jour, avec des animaux stimulus non exposés. Le porteur indique que l'exposition pourrait provoquer des malformations, des retards de croissance et des signes comportementaux anormaux. Au total 1 198 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à des temps précis de leur développement pour des analyses ex vivo.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact d’expositions aux champs électromagnétiques radiofréquences liés aux télécommunications, notamment à la fréquence de la 5ème génération de téléphone portable, sur le développement précoce, la sociabilité et la cognition chez le rat. L’étude portera sur des animaux exposés durant la gestation jusqu’à l’âge adulte, et évalués du début de leur vie postnatale jusqu’à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à apporter des éléments de réponse aux questions scientifiques et aux préoccupations sociétales relatives aux effets potentiels des expositions précoces aux champs électromagnétiques radiofréquences sur le développement du système nerveux.

Procédures

Observations cliniques et pesées (5 min) : au moins tous les 2 jours, au maximum tous les jours. Hébergement individuel des 76 femelles gestantes : dès leur réception, environ 3e et 10ᵉ jour de gestation jusqu’à la mise bas (11 et 18 jours en continu) pour respectivement les procédures 1 er 2. Exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences (jusqu’à 22h/jour) : tous les jours durant au maximum 3 mois, du 7ème jour de gestation à 80 jours après la naissance ; placement des cages d’hébergement dans la chambre d’exposition et exposition. Observation de la croissance physique et tests sensori-moteurs (5 min) : du 1er au 21ème (sevrage) jour de vie postnatal ; manipulation des animaux pour les observer et les positionner pour les tests. Test de sociabilité, et évaluation des fonctions cognitives et de la coordination locomotrice (jusqu’à 1h/jour) : 1 fois/âge/test d’intérêt ; manipulation des animaux pour les positionner pour les tests.

Impact sur les animaux

De manière générale, la manipulation des animaux lors des examens cliniques et des tests comportementaux peut provoquer un certain niveau de stress, susceptible d’influencer leurs réactions à la préhension ainsi que leur activité. La manipulation des ratons, l’ajustement des portées et les éventuelles adoptions impliqueront un stress pour les mères pouvant impacter le développement de leur descendance. Par ailleurs, l’exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences pourrait entraîner des effets systémiques pouvant occasionner de la souffrance. Des malformations, des retards de croissance et des signes cliniques anormaux, notamment comportementaux, pourront alors être observés.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort à des temps précis de leur développement pour réaliser des analyses ex vivo et conclure sur le niveau de risque de l’exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences pour leur santé.

Remplacement

Pour ce qui est du remplacement, les approches cliniques, in vitro et in silico, par leurs limitations éthiques et techniques, ne peuvent pas répondre seules au questionnement concernant l’impact des expositions aux champs électromagnétiques radiofréquences sur le développement sensoriel et moteur précoce, la sociabilité, et la maturation des fonctions cognitives et locomotrices, nécessitant de fait le recours aux études in vivo.

Réduction

Au plan de la réduction, plusieurs paramètres biologiques seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés. Les échantillons collectés après la mort seront exploités pour l’analyse de plusieurs marqueurs biologiques d’intérêt fortement questionnés dans le cadre de l’étude des effets des champs électromagnétiques radiofréquences. Le nombre d’animaux qui sera utilisé a été déterminé sur la base de l’effectif minimum nécessaire pour mettre au point les protocoles de test adaptés à l’évaluation de paramètres développementaux chez le rat et de les appliquer à l’étude des effets de l’exposition précoce à des champs électromagnétiques radiofréquences. Il a été établi à partir des données bibliographiques disponibles sur des études antérieures d’intérêt réalisées chez l’animal qui permettront une analyse statistique robuste et une extrapolation pertinente des résultats à l’homme. Des tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution seront utilisés pour les comparer et ainsi évaluer les effets de l’exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement des conditions expérimentales, chaque animal fera l’objet d’une observation quotidienne et sera pesé au minimum tous les deux jours. Les conditions d’hébergement seront enrichies afin de favoriser le bien-être et l’expression des comportements naturels. Les femelles gestantes seront hébergées individuellement, puis avec leur portée après la naissance. À partir du sevrage, les jeunes seront hébergés par sexe et par groupe, afin de favoriser leur socialisation. Un fond sonore musical sera diffusé en journée pour les habituer progressivement aux bruits associés aux manipulations et ainsi réduire le stress lié aux interventions expérimentales. Du matériau leur permettant de nidifier et des bâtons en bois à ronger seront disposés dans les cages d’hébergement, pour contribuer au comportement maternel, à l’enrichissement cognitif et au bien-être général des animaux. Des mesures complémentaires de raffinement concerneront la stabulation et la manipulation. Des points limites ont été définis pour détecter précocement tout signe de douleur ou de détresse. Pour chacun de ces critères, des actions correctives adaptées ont été prévues, en cohérence avec les paramètres étudiés, afin d’assurer le suivi attentif et le bien-être optimal des animaux.

Choix des espèces

Le rat est un animal de référence pour les études de toxicologie. En particulier, ses systèmes neurobiologiques et physiologiques ont été largement étudiés en laboratoire. Il existe une documentation très complète dans le domaine, dans la littérature et les ouvrages spécialisés. Ces recherches ont été effectuées majoritairement chez le rat. Dans un souci de comparer les données de ce projet avec les résultats obtenus précédemment concernant les effets des champs électromagnétiques radiofréquences sur les fonctions cérébrales, nous avons choisi d’utiliser la même espèce. Dans un 1er temps, des femelles avec leur portée, et des juvéniles et des adolescents seront exposés à des champs électromagnétiques radiofréquences et testés au plan comportemental pour mettre au point les conditions d’essai pertinentes à tester. Dans un 2ème temps, des femelles seront exposées aux champs électromagnétiques radiofréquences d’intérêt définis, durant la gestation jusqu’au sevrage, et leurs descendants du sevrage jusqu’à l’âge adulte. Ceux-ci seront évalués à quatre stades clés de leur développement : néonatal, juvénile, adolescent et adulte, au plan de leur croissance physique, développement neuromoteur, sociabilité et maturation des fonctions cognitives. Pour réaliser les tests de sociabilité aux stades juvénile et adolescent, des animaux stimuli, non exposés, seront utilisés en complément.

169 des 316 souris passent jusqu'à sept minutes sous irradiation, les autres reçoivent des injections. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélever leurs organes. Une colite ou une tumeur leur est induite, avec diarrhée, déshydratation, perte de poids progressive et posture anormale, pour comprendre comment naissent des lymphocytes T dits de type souche, que le porteur déclare impossibles à produire in vitro faute d'en connaître les mécanismes, et dont ce même projet pourrait un jour permettre la production sans animaux. Le choix de la souris est justifié par les résultats antérieurs du laboratoire et par les lignées transgéniques disponibles, les cages étant placées sur un portoir réservé aux lignées immunodéprimées.

Objectifs

Les cellules du système immunitaire ne sont pas toutes identiques. Certaines, appelées lymphocytes T de type « souche », ont une capacité étonnante : elles peuvent se régénérer, vivre longtemps et donner naissance à d’autres cellules spécialisées chargées de défendre l’organisme. Dans le cas du cancer, ces cellules sont un atout : elles forment une réserve durable de lymphocytes capables de reconnaître et d’éliminer les cellules tumorales. Mais dans les maladies inflammatoires chroniques, comme les maladies inflammatoires de l’intestin, leur rôle semble moins favorable. Elles pourraient entretenir, au fil du temps, une inflammation excessive en servant de « réservoir » pour des cellules qui attaquent les tissus de manière continue. Nos travaux cherchent à mieux comprendre ces lymphocytes T de type souche. Nous voulons savoir comment ils apparaissent, quels signaux les transforment en cellules inflammatoires, et quel impact ils ont réellement dans des contextes aussi différents que le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Pour cela, nous utiliserons deux modèles expérimentaux chez la souris (un modèle de colite et un modèle de cancer) afin d’identifier ces cellules, d’étudier leur fonctionnement et, à terme, de mieux cibler leur action pour améliorer les traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à décrypter le rôle précis des lymphocytes T de type souche, en tant que réservoirs de lymphocytes T pro-inflammatoires ou anti-tumoraux à long terme. Mieux comprendre leur biologie pourrait permettre : - De développer des stratégies thérapeutiques ciblées visant ces cellules dans les maladies inflammatoires chroniques. - Et d’optimiser l’immunothérapie dans le cancer, en exploitant leur potentiel bénéfique.

Procédures

169 souris seront soumis à une irradiation qui durera quelques minutes (max 7 min). Les 316 souris vont être injectées et ces injections dureront quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables : Pour le modèle de colite sont : • Diarrhée ou selles molles, • Perte de poids progressive liée à l'inflammation intestinale. • Déshydratation, en cas de diarrhée importante. • posture anormale. Pour le modèle tumoral sont : • Inflammation locale : rougeur ou gonflement au site de la tumeur. • Perte de poids progressive, • Posture anormale. l’irradiation des souris peut provoquer une légère léthargie (activité diminuée) et une perte de poids modérée.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélevement d'organes afin d'analyser phénotypiquement et fonctionnellement les cellules immunitaires.

Remplacement

La génération des lymphocytes T de type souche est impossible in vitro car on ne connait pas encore les mécanismes moléculaires permettant leur génération. Pour l’instant, aucune méthode alternative in vitro n’est adaptée afin de remplacer totalement le modèle murin. Toutefois, nos résultats pourraient permettre à terme la génération des ces lymphocytes in vitro et permettrait de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de cette pathologie.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif pour ne pas à avoir à répéter des procédures. Chaque animal inclus dans l'analyse est utilisé de façon optimale pour permettre l'analyse simultanée d'un maximum de paramètres et réduire encore le nombre d'animaux. Nous ne produisons ni ne commandons plus d'animaux que ceux nécessaires à chaque expérience. Enfin, l’excédent de cellules sera congelé pour utilisation ultérieure ce qui nous permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans une animalerie à statut sanitaire contrôlé. Ils sont hébergés dans des cages ventilées, placées sur un portoir réservé aux lignées immunodéprimées. Les cages, la litière, l’enrichissement, la nourriture et l’eau sont stérilisés avant utilisation. Les animaux sont manipulés et transférés sous une hotte de change désinfectée selon un protocole spécifique. Ces mesures permettent de réduire au minimum le risque d’infection ou de pathologie non désirée.

Choix des espèces

Nos résultats précédents ainsi que la majorité des données de la littérature sur lesquelles nous nous appuyons ont été obtenus chez la souris. Il est à noter que les résultats que nous avons obtenu au niveau des lymphocytes T dans le modèle de colite chez la souris nous ont permis de valider ce mécanisme chez les patients, ce qui démontre la pertinence des approches que nous utilisons. Enfin, il existe déjà des modèles de souris transgéniques dont l'utilisation permettra de répondre à certaines de nos questions. La souris représente donc un modèle particulièrement adapté à notre étude pour décrypter les mécanismes qui contrôlent la génération de la population T de type souche et les facteurs qui influencent leur programme de différenciation en cellules nocives. Pour toutes les procédures, nous utiliserons des animaux adulte (entre 8 et 12 semaines) qui possèdent un système immunitaire mature.

Un cathéter est glissé dans l'urètre de souris et de rats anesthésiés, puis une bactérie est injectée directement dans leur vessie. 480 souris et 480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des traitements une à trois fois par jour pendant trente jours au maximum, avec jusqu'à deux séjours de 48 heures en cage individuelle et un prélèvement de sang par semaine, pour tester des candidats médicaments contre les infections urinaires. Le porteur chiffre l'inconfort du cathéter à trois minutes et la douleur des piqûres à cinq secondes, tout en décrivant par ailleurs la fièvre, la perte de poids, la baisse de la prise alimentaire et la détresse respiratoire que provoque l'infection.

Objectifs

Les infections urinaires figurent parmi les infections bactériennes les plus fréquentes, constituant un problème de santé publique majeur. La prévalence est très élevée, touchant plus de 150 millions de personnes par an dans le monde, avec une incidence particulièrement forte chez les femmes. Les solutions thérapeutiques existantes reposent principalement sur les antibiotiques, le choix dépendant du type et de la gravité de l'infection (cystite, pyélonéphrite). La nécessité de nouveaux traitements est urgente, car l'efficacité des antibiotiques actuels est rapidement compromise par l'évolution de la résistance aux antimicrobiens. Les recherches se concentrent sur des alternatives comme les vaccins, la thérapie par phages et les agents anti-virulence. L'objectif est de trouver des solutions à long terme, non-antibiotiques de préférence, pour gérer les infections urinaires récidivantes et préserver l'efficacité des traitements de dernier recours. Le projet propose l’évaluation préclinique de candidats médicaments pour déterminer leur efficacité contre des agents pathogènes responsables des infections urinaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont multiples avec un impact significatif sur la santé humaine. En caractérisant de nouveaux candidats médicaments, le projet vise à répondre à des besoins non satisfaits dans la lutte contre les infections urinaires, en particulier face à la résistance antimicrobienne. Le projet permettra de développer de nouveaux traitements ciblant plus efficacement les infections, en particulier dans les contextes où les thérapies actuelles échouent. Ce projet pourrait améliorer la gestion des infections résistantes et des cystites/pyélonéphrites difficiles à traiter.

Procédures

Pose d'un cathéter dans l'urètre sur animaux anesthésiés-3 min: 1 fois (modèle aigu) ou 2 fois (modèle chronique) au cours de leur vie. Les animaux seront infectés 1 fois (modèle aigu) ou 2 fois (modèle chronique) avec le germe pathogène par administration intra-vésicale sous anesthésie (1 min). Les animaux feront au maximum 2 sessions de 48 h en hébergement individuel et seront traités 1 à 3 fois par jour (selon les voies d'administrations) pendant 30 jours consécutifs maximum. Temps requis pour les différentes voies d’administration : Orale-10 à 20 secondes ; Intraveineuse - 30 secondes à 1 minute ; Sous-Cutanée- 5 à 10 secondes ; Intrapéritonéale- 5 à 10 secondes. Au maximum un prélèvement de sang hebdomadaire sur animaux anesthésiés. Le temps nécessaire pour effectuer un prélèvement de sang dans la veine caudale pour chaque souris est de 3-5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances principales concernent la douleur et l'inconfort induits par les injections, les inflammations, l'infection et l'isolement en hébergement individuel. L'anesthésie gazeuse induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (5 secondes). L'installation d’un cathéter intraurétral peut induire une inflammation locale de la vessie, causant un léger inconfort temporaire (3 minutes). L'infection par les agents pathogènes induit la pathologie avec des symptômes potentiels comme la fièvre, la perte de poids, la diminution de la prise alimentaire et hydrique, détresse respiratoire et une mobilité réduite. L’isolement en hébergement individuel pendant 48h peut être perturbant pour les animaux et induit un stress.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort et des prélèvements d'organes et de sang sont réalisés pour des mesures de charge microbienne, de paramètres inflammatoires ou des études d'histologie.

Remplacement

Préalablement à toute utilisation d'animal, nous intégrons dans nos projets des modèles cellulaires in vitro, et 3D tissulaires, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Ces alternatives non animales ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet dans lequel un des paramètres analysés est la fréquence et le volume d’urine produite.

Réduction

Le premier principe de réduction du nombre d’animaux sera appliqué via l'intégration dans ce projet, préalablement à toute utilisation d'animal, de modèles cellulaires et tissulaires. Le principe de réduction du nombre d’animaux sera appliqué aussi via l’estimation du nombre d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. L'estimation du nombre d'animaux nécessaire se fait par un calcul de puissance statistique: 12 animaux seront inclus par lot. En combinant ces approches, nous réduisons les expérimentations animales, tout en garantissant la précision des résultats.

Raffinement

La fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, tels que perte de poids, fièvre, modifications de la mobilité, ou respiration laborieuse, sont particulièrement surveillés. Si des signes de stress apparaissent, nous ajusterons l'environnement pour améliorer le bien-être des souris et notamment stimuler leurs sens et leurs comportements naturels. Nous augmenterons l’enrichissement physique par l’apport de cachettes (boîtes, tunnels) et de matériaux pour la construction de nids (papier déchiqueté, fibres) ainsi que l’enrichissement sensoriel par la modification régulière de la disposition de leur cage et des éléments à l’intérieur de la cage pour offrir de la nouveauté. L'introduction de nouveaux enrichissements se fera progressivement pour éviter un stress supplémentaire. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance des animaux. L’objectif est de garantir que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux à chaque fois que cela sera nécessaire.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles pertinents pour la caractérisation pré-clinique de molécules ciblant les infections urinaires pour des raisons principalement liées à ses caractéristiques biologiques, et notamment en raison de : (i) la similitude anatomique et physiologique des systèmes humain et murin. L'anatomie du système urinaire du rongeur (reins, uretères, vessie, urètre) est suffisamment similaire à celle de l'humain pour permettre l'étude de la progression de l'infection et de la réponse de l'hôte. (ii) Les mécanismes d'infection : Les souches bactériennes responsables des infections urinaires chez l'homme, notamment E. coli , peuvent être utilisées pour infecter la vessie et/ou les reins de la souris et du rat, reproduisant ainsi les stades d'infection (cystite, pyélonéphrite) et les mécanismes de virulence clés, comme la formation de communautés bactériennes intracellulaires dans les cellules de la vessie. Des animaux adultes seront utilisés afin de mimer au mieux la pathologie humaine : • Âge le plus touché : Les infections urinaires sont beaucoup plus fréquentes chez les femmes adultes en bonne santé que chez les enfants. Utiliser des animaux adultes permet de modéliser l'âge où la maladie est la plus prévalente chez l'humain. • Maturation du Système Urinaire : Le tractus urinaire d'un rongeur adulte est anatomiquement et physiologiquement plus proche de celui d'un humain adulte que celui d'un animal juvénile. La structure et la fonction de la vessie et des voies urinaires sont complètement développées et matures. • Réponse Immunitaire Mature : Les infections urinaires impliquent une réponse immunitaire complexe de l'hôte. Les rongeurs adultes possèdent un système immunitaire totalement mature et compétent