Procédures modérées

Une injection ou une implantation de biothérapie à J0, puis une mise à mort programmée à J2, J14, J90 ou J120 pour examiner les organes: le protocole tient en peu de gestes. 4 080 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse anatomopathologique. Le projet a pour objet d'évaluer la toxicité de ces produits, et le porteur écrit dans le même document qu'aucun effet indésirable n'est attendu à la suite du traitement. Présenté comme un projet générique sur cinq ans, il déclare un effectif dont le porteur indique lui-même qu'il représentera "une capacité bien inférieure" à ce qui est demandé.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la toxicité de nouvelles biothérapies. L’évaluation de la toxicité de ces biothérapies chez le petit animal est un pré-requis pour obtenir l’autorisation d’utiliser ces médicaments innovants en essai clinique chez l’homme. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après injection (J2, J14, J90 et J120) pour évaluer une toxicité aigüe, subaiguë, subchronique et la formation de tumeurs. Il s’agit d’un projet générique présenté pour une durée de 5 ans, faisant intervenir différents types de biothérapies en essayant d’anticiper les besoins. Les lots d’animaux envisagés correspondent à différents cas de figure et représenteront en réalité une capacité bien inférieure à ce qui est indiqué dans cette saisine.

Bénéfices attendus

Avant de proposer une nouvelle biothérapie chez l’homme, il est nécessaire de démontrer son innocuité chez le petit animal. Pour cela, une analyse systématique de différents organes doit être réalisée pour identifier d’éventuelles lésions associées au traitement. Ces études sont requises pour obtenir les autorisations des instances réglementaires pour la mise en place d’essais cliniques chez l’homme

Procédures

Pour mener ce projet, les souris recevront la biothérapie par injection ou implantation. Une seule injection sera réalisée à J0 sur les animaux vigiles ou anesthésiés.

Impact sur les animaux

• L’ensemble des animaux en expérimentation seront observés quotidiennement et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés. Si un animal présente un des signes de souffrance décrits précédemment, il sera euthanasié. • Injection des traitements : Douleur légère au site d’injection, courte durée attendue. Pas d’effet thérapeutique ou indésirable attendus à la suite de l’utilisation de ce traitement.

Devenir

À la fin de l’étude, les souris seront euthanasiées. Cela est nécessaire pour permettre de récupérer les organes et réaliser l’analyse anatomopathologique des différents organes de la souris et observer une éventuelle toxicité des traitements

Remplacement

Avant de proposer une biothérapie chez l’Homme, il est important de démontrer l’innocuité de ce traitement dans un modèle pré-clinique pertinent. A ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro permettant de vérifier la toxicité d’un traitement sur l’ensemble des organes d’un organisme. Il n’est pas possible de prévoir une méthode substitutive pour répondre à la question scientifique de ce projet.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les étude de toxicité réalisées précédemment au laboratoire et les recommandations des instances réglementaires d’évaluation des essais cliniques pour proposer des groupes de 10 souris avec une égalité entre le nombre de mâles et de femelles.

Raffinement

Surveillance liée aux procédures : Les souris seront observées quotidiennement pour surveiller l’apparition potentielle de lésions et de signes d’infection. Les signes de souffrances seront activement recherchés de manière hebdomadaire et la douleur sera évaluée en utilisant la grille d’évaluation proposée par l’animalerie. La mesure du poids sera réalisée une fois par semaine. Mesures correctrices : • Antalgie : Injection sous cutanées d’antalgique 1fois/jour jusqu’à amélioration des symptômes. • Support nutritif : Mise à disposition dans la litière de la cage de croquettes humidifiées.

Choix des espèces

Ces expériences sont réalisées chez la souris immunodéficiente car les tests de toxicité doivent être réalisés dans une espèce animale chez laquelle le produit testé est biologiquement actif. La souche a été choisie pour permettre l’injection de biohérapies d'origine humaine en évitant une réponse immunitaire et leur rejet. Les animaux sont utilisés à semaine 12, âge de maturité des animaux.

90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever la tumeur, les ganglions et la rate. Chacune reçoit une injection de cellules de cancer colorectal dans le flanc droit, puis un transfert de lymphocytes T sept jours plus tard, la tumeur devenant palpable au cinquième jour et l'expérience s'arrêtant entre le dixième et le treizième jour. Le porteur indique que les travaux in vitro sur le rôle de la protéine HELIOS ont déjà été menés et que l'activation des lymphocytes ne peut pas être reproduite hors de l'organisme. Il classe le projet en recherche fondamentale et renvoie au conditionnel les applications en immunothérapie, qui pourraient à terme rendre les traitements existants plus efficaces.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier chez la souris le rôle d’une protéine appelée HELIOS dans le fonctionnement des cellules immunitaires appelées lymphocytes T CD8. Ces cellules sont essentielles pour éliminer les cellules cancéreuses. Nous voulons savoir si la déficience d’HELIOS dans les cellules CD8 rend ces cellules plus actives ou, au contraire, moins efficaces. Pour cela, des lymphocytes T CD8 normaux ou dépourvus de HELIOS seront transférés dans des souris atteintes d’une tumeur appelée MC38, un modèle bien établi du cancer colorectal. Nous observerons ensuite comment les cellules immunitaires (les lymphocytes T CD8) s’activent, se multiplient et se déplacent dans la tumeur afin de comprendre l’influence directe de HELIOS sur leur comportement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire dans le cancer afin d’améliorer la réponse aux traitements d’immunothérapie. Nous avons mis en évidence une combinaison de traitement dans notre équipe qui améliore grandement l’efficacité des immunothérapies. Cette amélioration semble être dépendante de la protéine HELIOS. Notre étude, aidera à déterminer si la protéine HELIOS limite ou favorise l’action des lymphocytes T CD8, qui jouent un rôle majeur dans la lutte antitumorale. Les connaissances acquises pourraient servir de base au développement de nouvelles approches d’immunothérapie, c’est-à-dire des traitements visant à renforcer les défenses immunitaires des patients atteints de cancer. Ces travaux relèvent de la recherche fondamentale, mais ils pourraient à terme contribuer à rendre les thérapies existantes plus efficaces ou à en concevoir de nouvelles, mieux ciblées et moins toxiques. Les résultats permettront d’identifier si HELIOS agit comme un modulateur intrinsèque limitant la prolifération et la persistance des CD8 dans le microenvironnement tumoral. Ces données sont essentielles pour concevoir des stratégies d’immunothérapie plus ciblées, capables d’améliorer la réponse antitumorale sans la suppression de la réponse immunitaire anti-tumorale. En outre, ce modèle expérimental apportera une base de connaissances utile à la recherche translationnelle sur la régulation des réponses immunitaires dans le cancer.

Procédures

Les souris seront soumises à deux types de manipulations principales : Implantation tumorale : Chaque souris recevra, sous anesthésie gazeuse, une injection de cellules tumorales dans le flanc droit. Cette injection de 3 secondes provoque la formation d’une petite tumeur localisée, généralement palpable à partir du 5ᵉ jour. Cette phase dure environ 10 à 13 jours avant l’euthanasie des animaux. Transfert adoptif de lymphocytes T CD8 : Sept jours après l’implantation tumorale, les souris recevront une injection de lymphocytes T CD8 (cellules du système immunitaire), soit normales, soit dépourvues du facteur d’intérêt. Cette injection est rapide (moins de 10 secondes) et réalisée sous anesthésie pour éviter toute douleur.

Impact sur les animaux

La procédure est classée en sévérité modérée. La classification modérée signifie que les animaux peuvent ressentir un inconfort temporaire, mais pas de douleur prolongée ni de souffrance sévère. L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite mais ne semble pas attendue étant donné que l’expérience sera stoppée 10 et 13 jours après injections des cellules tumorales. Les animaux atteignant les points limites seront immédiatement mises à mort selon la note de la grille de score. L’ensemble des procédures sera conduit sous anesthésie gazeuse, et les animaux bénéficieront d’un enrichissement environnemental pour réduire le stress.

Devenir

Les 90 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les organes

Remplacement

Avant de réaliser les expériences sur les animaux, des études en laboratoire (in vitro) ont déjà été menées pour évaluer le rôle de HELIOS dans les lymphocytes CD8. Cependant, les phénomènes d’activation et de migration de ces cellules dépendent de nombreux échanges entre différents types de cellules et ne peuvent pas être reproduits correctement hors de l’organisme. L’expérimentation animale reste donc nécessaire pour répondre à la question scientifique posée.

Réduction

Trois groupes expérimentaux avec des effectifs de n=15 (N=5 x 3 répétitions) à J10 et n=15 à J13 seront utilisés. L’expérience sera donc répétée 3 fois. Le nombre d’animaux a été limité à 90 souris au total (3 groupes de (5 *2 temps *3 répétitions)), soit le minimum permettant une analyse statistique valide. Chaque souris fournira plusieurs échantillons (tumeur, ganglions, rate), maximisant la quantité de données par individu. Les analyses multiparamétriques réduisent le besoin de répétitions supplémentaires. Chaque souris fournira plusieurs types de données (cytométrie, histologie, mesure tumorale), ce qui maximise la quantité d’informations recueillies sans augmenter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis quotidiennement par les personnels animaliers ils seront suivis au min 3 fois par semaine par les techniciens de l’étude et quotidiennement si une des variables mesurées dans la grille des points limites montrent une possible dégradation de l’animal (perde de poids, modification du comportement) Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

Un examen Doppler d'une heure trente sous anesthésie tous les cinq jours, une imagerie de bioluminescence deux fois par semaine, jusqu'à cinq cycles de traitement: sept actes techniques sont prévus par animal. 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau et analyser la tumeur. Un lentivirus leur est injecté par stéréotaxie dans le ventricule latéral pour induire un glioblastome dont le porteur attend une perte de masse musculaire, une gêne de la mobilité et une dégradation de l'état général. Seules des femelles sont utilisées, le porteur indiquant que ces tumeurs se développent de la même façon chez les mâles et que la signature de sénescence étudiée vaut quel que soit le sexe.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'effet de drogues dites sénolytiques (drogues qui éliminent les cellules sénescentes) seules ou en combinaison avec d'autres traitements, dans un nouveau modèle immunocompétent de tumeur cérébrale de type glial appelée glioblastome. Le modèle de glioblastome de type mésenchymateux proposé dans le projet récapitule au mieux les altérations moléculaires identifées chez les patients en utilisant une nouvelle technologie d'invalidation de l'expression de gènes. Une demande de modification est nécessaire afin de passer ce projet en multisites car un équipement spécifique se trouve dans un autre établissement utilisateur. La modification n’engendre pas d’augmentation du nombre d’animaux.

Bénéfices attendus

Le glioblastome est la tumeur cérébrale adulte primaire la plus fréquente et agressive dont les patients ne survivent pas plus de 15 mois en moyenne à ce jour. Ce projet devrait générer un modèle préclinique immunocompétent de glioblastome de type mesenchymateux qui récapitule au plus près les altérations moléculaires des glioblastomes de patients. En effet, afin de traduire de façon efficace nos résultats de recherches fondamentales à la clinique il est indispensable de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine. Nos résultats devraient permettre de proposer des nouvelles aprroches thérapeutiques pour la prise en charge des patients avec un glioblastome.

Procédures

La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 7 actes techniques incluant une injection intra-crâniale de lentivirus nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par utilisation d’imagerie par bioluminescence, une mesure du flux sanguin cérébral par examen Doppler, des traitements, des prélèvements sanguins puis finalement une euthanasie. La chirurgie prendra environ 30-40min sur animal anesthésié et analgésié en pré et post-opératoire (établissement 1). Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs sur animal vigil (établissement 1). La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines sur animal anesthésié. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min (établissements 1 ou 2). Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés sur souris vigiles pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. Les animaux recevront au maximum 5 cycles de traitement (établissement 1). L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines sur souris vigile (établissement 1). Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigil (durée de quelques secondes, 4 fois par animal) (établissement 1). L'examen Doppler d'une durée d'1h30, sera réalisé tous les 5 jours sur des animaux anesthésiés (établissement 2).

Impact sur les animaux

Ce projet comporte deux étapes où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale est invasive, il s'agit d'une injection stéréotaxique de lentivirus dans le ventricule latéral effectué sous anesthésie/analgésie mais qui entraîne des nuisances (risques anesthésiques, douleur post-opératoire, risque infectieux). Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées). Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et les animaux seront pesés quotidiennement pendant les 5 jours suivant la chirurgie et deux fois par semaine par la suite. De la douleur légère de courte durée pourrait être ressentie lors des prélèvements sanguins. Dans de très rares cas un hématome ou une perte de sang hémorragique pourrait être observée. L’imagerie Doppler mesure la perfusion sanguine cérébrale et tumorale de manière non invasive et nécessite une anesthésie qui peut engendrer une hypothermie et des difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris et d'analyser la tumeur cérébrale induite pendant la procédure, au niveau moléculaire et histologique.

Remplacement

En parallèle de ce projet in vivo, nous caractériserons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patient collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare car la survie des patients après diagnostic est inférieure à 15 mois. Cette étude fondamentale demeurera néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans un modèle animal. Dans un souci de remplacement et réduction, nous projetons de générer des organoides à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle d'organoides conservant le microenvironnement global (notamment, la microglie, les monocytes et les cellules T infiltrants, les cellules endothéliales et les péricytes). Un projet collaboratif visant à générer des organoides de glioblastomes incluant de la microglie et des monocytes infiltrants est en cours. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, nous utiliserons dans ce projet 812 souris. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 18 animaux. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, ganglions, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescence sera localisée dans le cerveau disséqué à la loupe binoculaire et nous réaliserons plusieurs type d'analyses sur chaque tumeur. Immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques. Pour les animaux du lot 2, de l'imagerie permettra de quantifier les flux sanguins cérébral et intratumoral au cours de la croissance tumorale permettant d’accumuler un grand nombre de résultats pertinents par animal.

Raffinement

Pour réduire le stress post-opératoire, les animaux seront logées par groupes de 5 souris par cage pendant une période d'acclimatation de 7 jours minimum avant la procédure chirurgicale. Tous les animaux auront un enrichissement ICM : carré de coton et bâton à ronger. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Le transfert d'un site à l’autre sera réalisé dans une boite de transfert avec litière et enrichissement prélevés dans la cage de stabulation. La cage sera placée dans un sac à l’abris de la lumière du jour et le transfert (d’une durée de 5 minutes) se fera à pied. Pendant la chirurgie et l'examen Doppler, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter leur déshydratation. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. Nous avons établi dans l’équipe une grille de suivi post-opératoire pour les animaux pouvant développer des tumeurs cérébrales. Cette grille sera consultée et une fiche de suivi de l’animal sera remplie à chaque examen, présente au dos de l'étiquette de cage. Nous analyserons la croissance tumorale par imagerie et le poids des animaux deux fois par semaine. En fin de processus d’expérimentation, si une souris est isolée nous regrouperons cet animal avec des animaux sujets au même traitement et lorsque cela ne sera pas possible nous apporterons de l’enrichissement supplémentaire dans la cage sous forme de maisonnette. Lors des prélèvements sanguins, si le saignement ne stoppe pas rapidement, une compression plus longue avec un papier essuie tout propre sera directement effectuée sur le point de prélèvement. En cas d'apparition de prostration et de difficulté à récupérer (anomalie cardiorespiratoire), l'animal sera pris en main pour effectuer des frictions afin de le stimuler. De la nourriture hydratée sera déposé à côté de lui dans la cage. Si cet état perdure plus de quelques minutes, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour induire de novo des glioblastomes. En effet ce type de tumeur est diagnostiqué chez des sujets adultes d'âge médian de 59 ans, cette tumeur se développe donc à l'âge adulte. Notre projet, qui vise à évaluer l'effet de drogues sénolytiques dans un nouveau modèle immunocompétent de glioblastome, utilisera uniquement des souris femelles. En effet, les modèles de glioblastomes murins se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles. De façon plus importante dans une étude récente, nous avons montré que l’enrichissement de la signature murine de sénescence chez les patients avec un glioblastome est un facteur de mauvais pronostique quel que soit le sexe. Ces résultats montrent donc que l’étude de la sénescence dans le contexte des glioblastomes peut être réalisée sur un seul sexe. Nous avons choisi pour ce projet de travailler sur des femelles.

Déjà capturés et manipulés jusqu'à huit fois au cours de leur vie pour certains, les cincles plongeurs de cette population de rivière sont repris chaque année depuis une dizaine d'années. 2 300 oiseaux adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous relâchés sur leur site de capture. Pris au filet, ils attendent jusqu'à deux heures dans un pochon, puis sont bagués, mesurés, soumis à une mesure du rythme cardiaque et d'un comportement de lutte, avant une prise de sang, un prélèvement de plumes et un prélèvement de sécrétions de la glande uropygienne. Le porteur reconnaît que le cumul de ces gestes peut peser sur l'oiseau et que le stress s'accumule sur toute une vie, tout en indiquant qu'aucun effet négatif majeur n'a été mis en évidence jusqu'ici.

Objectifs

En populations naturelles, les individus sont soumis à des variations des conditions environnementales qui peuvent être d'origine naturelle ou anthropique. Parmi ces dernières, la présence de polluants de natures diverses, liée aux activités industrielles, agricoles et/ou à l'urbanisation, peut fortement impacter le fonctionnement des organismes et des populations. Les actions de restauration des milieux au travers de mesures de dépollution restent pourtant souvent d'une efficacité limitée en raison du manque d'informations sur les concentrations de multiples polluants à une échelle spatiale fine ainsi que de leur impact biologique réel sur l'écosystème concerné. Le projet a pour objectif de fournir une cartographie détaillée des concentrations de différents types de polluants (métaux lourds, polluants organiques persistants, microplastiques) et de caractériser leur impact de façon conjointe (« effets cocktail » potentiels) sur une population d'un petit passereau considéré comme un bioindicateur du milieu des rivières courantes de basse et moyenne montagne, le cincle plongeur. Les rivières sont des milieux particulièrement sensibles à la pollution du fait de la concentration des polluants dans l'environnement alentour via le ruissellement. Sur la zone d'étude, des échantillons biologiques (plumes, sang, sécrétions) sont prélevés sur les oiseaux de façon faiblement invasive et compatible avec le suivi à long terme de la population. Ils permettent de mesurer (1) d'une part les concentrations de différents types de polluants très présents dans cette zone fortement exploitée par l'homme et anthropisée depuis des siècles, et (2) d'autre part des paramètres physiologiques, mais aussi comportementaux et d'histoire de vie (reproduction, survie) des individus. L'étude des liens entre ces concentrations mesurées de polluants auxquels les individus sont effectivement exposés (et donc présents dans leur organisme) et du fonctionnement physiologique (marqueurs des processus immunitaires, hormonaux, métaboliques...) permettra de mieux comprendre l'impact biologique réel des polluants au niveau individuel, et les implications au niveau de la population. Cette cartographie et ces résultats seront donc mis à disposition des acteurs locaux de la société civile, permettant de cibler les zones les plus impactées afin d’optimiser les actions de gestion et de restauration de la biodiversité des écosystèmes rivulaires dans la zone d'étude.

Bénéfices attendus

Nos analyses permettront de comprendre de façon fondamentale l'action des polluants sur les organismes en conditions naturelles et qui sont donc soumis à différentes sources de stress en même temps ; elles permettront également de façon plus appliquée. d’établir une cartographie détaillée à l'échelle locale des niveaux d'exposition aux polluants et de leurs effets sur le fonctionnement des organismes, qui sera mise à disposition des acteurs locaux associatifs et institutionnels comme outil de sensibilisation du public et pour cibler les zones les plus impactées afin d’optimiser les actions de gestion, restauration et préservation de la qualité de l'eau des rivières et de leur biodiversité sur ce territoire. Le manque d'informations sur les variations dans l’espace et le temps des concentrations de différents polluants à une échelle spatiale fine et surtout sur leurs effets biologiques conjoints sur les individus et les populations limite en effet souvent fortement la possibilité de mettre en oeuvre des actions efficaces de ce type face à diverses sources de pollution. Dans un contexte de "santé globale", l'enjeu est à la fois environnemental mais aussi sanitaire, car les activités humaines liées à l'eau sont nombreuses dans la zone d'étude (pêche, sports d'eau , baignade...). Pour atteindre ce but, le suivi exhaustif de la population étudiée permet d'accéder à l'ensemble des paramètres biologiques d'intérêt, chez une espèce qui intègre les mesures de polluants et de leurs effets le long de la chaîne trophique. Le transfert des résultats et connaissances concernant la pollution par différentes substances, sa dynamique au cours du temps et ses conséquences sur l'écosystème des rivières vers différents partenaires de la société civile est aussi un objectif du présent projet.

Procédures

Les oiseaux sont capturés grâce à des filets spéciaux et soumis à une série de manipulations, mesures et de prélèvements une fois par an (lors de leur première capture uniquement, dans le cas où ils seraient recapturés plus tard la même année). Une fois sortis du filet, ils sont placés en attente dans des pochons dédiés, au calme, le temps de la capture de l'ensemble des individus présents sur la zone (maximum 2h). Au moment des manipulations, réalisées sur site, ils sont d'abord identifiés individuellement par baguage, puis mesurés : masse, longueur du tarse, du crâne et du bec, de l'aile, de la queue. Une série de mesures comportementales et physiologiques est ensuite réalisée : mesure du rythme respiratoire et du rythme cardiaque, comportement de lutte. Différents prélèvements sont alors réalisés : (1) prise de sang ; (2) prélèvement de plumes (plumes de couverture du corps à différents endroits et une plume de la queue) ; (3) sécrétions de la glande uropygienne. Enfin, diverses informations sont notées : le sexe et l'âge des oiseaux, l'état des plumes et la présence de mue, la présence d'une plaque incubatrice (pour les femelles reproductrices), la présence de blessures éventuelles, liées à la capture ou antérieures. L'ensemble de ces opérations de mesures et prélèvements dure environ 20 à 30 minutes. Une fois l'ensemble des manipulations effectuées, l'oiseau est relâché directement sur le site de capture (entre 30 min et 2h30 après la capture selon le temps d'attente au départ).

Impact sur les animaux

Le coeur du projet est de pouvoir explorer les liens entre concentrations de différents polluants et leurs effets biologiques sur les individus à différents niveaux, y compris physiologique. Ceci implique de disposer des mesures des polluants et des mesures physiologiques simultanément, sur les mêmes individus, et donc de récolter l'ensemble des échantillons nécessaires sur chaque oiseau. Au cours d'une capture, chaque oiseau sera donc soumis à l'ensemble des gestes d'échantillonnages : (1) prise de sang, (2) prélèvement de plumes, (3) prélèvement de sécrétions de la glande uropygiale, en plus (4) des opérations d'identification (baguage) et des mesures morphologiques. Les effets individuels de chacun de ces prélèvements ou manipulations restent limités, mais le cumul de ces effets pourrait avoir une résultante impactant l'oiseau, parce qu'ils impliquent un temps de manipulation plus long, et/ou parce qu'ils occasionnent des stress et douleurs prolongés / multiples. Le principal effet indésirable attendu est donc un niveau de stress potentielement élevé de l'oiseau durant la capure et les manipulations. Par ailleurs, afin d'étudier la dynamique éventuelle des effets des polluants au cours de la vie des individus (et en particulier les processus de vieillissement), les oiseaux seront échantillonnés et mesurés chaque année. Ainsi un oiseau sera manipulé à chaque première capture de l'année au cours de sa vie, avec un effet potentiellement cumulatif du stress engendré sur l'ensemble de la vie. Une fraction importante des oiseaux subira donc les prélèvements et manipulations plusieurs fois (entre 2 et 8 fois jusqu'ici, la durée de vie moyenne de cette espèce étant d'environ 2 à 3 ans).

Devenir

L'objectif du projet étant de comprendre les effets à long terme des polluants sur des oiseaux en conditions naturelles, les mesures et échantillonnages réalisés visent à impacter le moins possible le devenir des oiseaux (survie, comportement, reproduction futurs) et donc à être compatibles avec le suivi à long terme de la population. Une fois les manipulations effectuées sur les oiseaux, ils sont donc tous relâchés dans leur milieu naturel, au site de capture.

Remplacement

L'objectif étant de comprendre les effets des polluants sur des animaux en conditions naturelles à long terme, l'utilisation d'expériences in vitro ou in silico n'est pas envisageable et seuls les prélèvements et mesures sur oiseaux vivants en population naturelle est possible.

Réduction

Le nombre d'oiseaux impliqués dans le projet correspond à la taille de la population reproductrice suivie (environ 460 adultes maximum par an), soit 2300 oiseaux adultes manipulés au maximum durant tout le projet) ; ceci permettra d'utiliser les modèles statistiques complexes appropriés pour quantifier l'effet des polluants sur les différents paramètres biologiques tout en tenant compte de nombreux facteurs individuels (sexe, âge, histoire des oiseaux) et environnementaux (date, rivière, altitude...) susceptibles d'affecter l'action des polluants. L'exhaustivité de l'échantillonnage de la population est nécessaire pour étudier les liens avec les différents paramètres et en particulier les paramètres démographiques tels que la survie et le succès reproducteur à l'échelle de la vie, qui ne peuvent être estimés fiablement qu'avec un effort de suivi suffisamment important, mais aussi pour estimer le déterminisme génétique des traits (héritabilité) au travers du pedigree établi via les captures et le suivi de la reproduction.

Raffinement

Le suivi de la population est réalisé depuis une dizaine d'années, et les procédures utilisées lors de la capture et manipulation des oiseaux ont été ajustées au cours de cette période afin de réduire au maximum leur impact sur le devenir des oiseaux et le fonctionnement de la population. L'expérience acquise par les manipulateurs leur permet de réduire au strict minimum le temps nécessaire au démaillage et à la manipulation des oiseaux. Afin de réduire le stress des oiseaux, ceux-ci sont placés dans des pochons spécialement conçus et opaques pendant les temps d'attente, et leur tête est gardée dans le pochon tant que les manipulations le permettent ; cette procédure est reconnue comme limitant le stress des oiseaux. Les manipulations se font en évitant les gestes et buits brusques ou mouvements non nécessaires, qui occasionnent du stress chez les oiseaux. Durant toute la manipulation de l'oiseau, le manipulateur reste vigilant et observe l'oiseau sans interruption afin de détecter les signes de stress intense et peut décider de relâcher l'oiseau immédiatement avant la fin des prélèvements ou mesures si ces signes deviennent trop forts. Ces précautions permettent de réduire quasiment à zéro le risque de mortalité pendant la capture. Les effets à plus long terme du stress de la capture, plus difficiles à évaluer directement, sont régulièrement estimés au travers des données de survie, mouvement et comportement des oiseaux collectées au cours du suivi général, et font l'objet d'une évaluation régulière. Jusqu'ici, aucun effet négatif majeur évident n'a pu être mis en évidence sur la base de ces données.

Choix des espèces

Le cincle plongeur a été choisi comme espèce d'étude en raison de : (1) sa situation élevée dans la chaîne trophique des rivières (c'est un prédateur d'invertébrés aquatiques), entraînant des niveaux de bioconcentration de polluants importants, et donc la possibilité de les quantifier et de détecter leurs effets biologiques mêmes faibles; (2) une variation importante des niveaux et type de pollution entre rivières étudiées, permettant de quantifier les effets de ces polluants ; et (3) la possibilité de suivre individuellement un grand nombre d'oiseaux et leur reproduction au cours de leur vie, grâce à une forte densité locale, assurant des tailles d'échantillons importantes et donc une puissance statistique satisfaisante, en particulier par rapport aux processus populationnels (survie, dispersion). Le cincle plongeur est une espèce protégée, dont le statut de conservation actuel est "préoccupation mineure" sur la liste rouge de l'UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature, qui fait référence pour l'établissement du statut de conservation des espèces), reflétant une absence de vulnérabilité spécifique (effectifs stables en France). Il est considéré comme un bioindicateur des écosystèmes rivulaires. Les prélèvements seront réalisés sur les oiseaux adultes, qui sont installés sur leurs territoires au moment de la capture et ont donc pu bioconcentrer les polluants présents dans l'environnement pendant une durée suffisante pour permettre leur détection et l'exploration de leurs effets biologiques.

Homozygotes pour une mutation qui provoque des dépôts de calcium dans les artères, ces souris meurent d'une rupture de l'aorte entre 42 et 56 jours de vie. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans autre intervention que le développement de ce phénotype. Les prélèvements d'organes sont échelonnés à 7, 14, 21, 28, 35 et 42 jours, l'âge de 42 jours servant de plafond au-delà duquel aucun animal n'est maintenu en vie. Le porteur indique qu'aucune de ces souris ne peut être réutilisée ni adoptée parce qu'elles sont génétiquement modifiées, et présente leur mise à mort avant l'apparition des signes cliniques comme une gestion "éthique et réglementaire" du phénotype.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’assurer la gestion éthique et réglementaire d’un phénotype dommageable associé à une mutation génétique entraînant des dépôts anormaux de calcium dans plusieurs organes chez la souris. Les animaux présentant ce phénotype (souris homozygotes pour la mutation) développent un problème grave caractérisé par des accumulations importantes de calcium dans leurs artères, pouvant entraîner une mort précoce entre 42 et 56 jours de vie ; pour éviter toute souffrance, elles seront euthanasiées avant ou au début de l’apparition des signes cliniques. Les souris hétérozygotes et sauvages serviront respectivement à la reproduction pour maintenir la lignée et comme témoins pour les expériences. Ce projet permettra d’identifier les mécanismes biologiques responsables des dépôts anormaux de calcium liés à la déficience de la protéine d’intérêt. Les connaissances acquises pourront être transposées à l’homme, en particulier pour mieux comprendre les calcifications liées au vieillissement ainsi que celles observées dans des maladies rares comme le syndrome de Keutel, associé à une déficience de cette protéine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des dépôts anormaux de calcium dans les tissus liées à la déficience d’une protéine empechant ce phénomène et que l’on peut retrouver dans des maladies rares comme le syndrome de Keutel, mais également dans des pathologies chroniques fréquentes telles que l’athérosclérose, le diabète ou l’insuffisance rénale.

Procédures

L’intervention prise en compte dans ce projet correspond au développement spontané d’un phénotype dommageable d’origine génétique, caractérisé par l’apparition progressive de dépôts anormaux de calcium dans plusieurs organes. Ce phénotype qui peut entrainer la mort par rupture de l'aorte entre 1.5 et 2 mois de vie constitue la nuisance à laquelle les animaux peuvent être exposés . Aucune autre intervention n’est réalisée sur les animaux vivants. Les prélèvements d’organes sont effectués exclusivement après euthanasie (hors DAP)

Impact sur les animaux

Le problème qui apparait chez ces souris entraîne une mortalité par rupture de l'aorte entre 1.5 et 2 mois de vie. Ce décès est précédé par des signes cliniques tels qu’un aspect chétif et une posture prostrée, indiquant un risque accru de mortalité dès le stade le plus précoce d’apparition du problème qui se situe autour du jour 42 (J42) après la naissance. La majorité des expériences prévues seront réalisées entre J7 et J30, avant l’apparition de ce problème. Pour les rares souris devant être sacrifiées à J42, c'est-à-dire au moment où problème peut apparaitre, seules celles ne présentant jusqu'à ce stade aucun signe de fragilité ou d’attitude prostrée seront conservées pour prélévements d'organes. En cas d’apparition de tels symptômes ou de tout autre critère de points limites, les animaux seront immédiatement pris en charge par les zootechniciens et/ou les chercheurs qui assureront un suivi quotidien.

Devenir

Tous les animaux devront être euthanasiés à la fin de la procédure pour prélévements d'organes aux différents stades J7, J14, J21, J28, J35 et J42. Comme il s'agit d'animaux génétiquement modifiés, il n’est pas possible de les réutiliser dans d’autres projets ni de les placer en adoption.

Remplacement

Les dépôts anormaux de calcium apparaissent dans de nombreux organes et tissus et peuvent être influencées par de nombreux paramètres spécifiques à ces organes. Les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions à l’origine de la mise en place de ces phénomènes. A ce jour, il n’existe pas d’alternative de remplacement et seule l’utilisation d’un modèle animal est possible pour l’étude de ces calcifications

Réduction

La reproduction des souris est réalisée de façon à obtenir uniquement le nombre d’animaux nécessaire pour nos recherches. Nous prenons en compte les particularités de la lignée, dont les portées comptent généralement entre 4 et 8 petits. En moyenne, 25 % de ces souris seront des témoins, 25 % des souris présentant la mutation étudiée (toutes deux utilisées pour les expériences), et les 50 % restants (souris porteuses d’une seule copie de la mutation) permettront d’entretenir la lignée et de produire de nouveaux animaux pour les futures études. De plus, nous prévoyons de prélever plusieurs organes sur chaque souris afin de maximiser les données recueillies et ainsi limiter le nombre total d’animaux nécessaires. Enfin, comme les effets de la mutation ne dépendent pas du sexe, nous incluons à la fois des souris mâles et femelles dans nos analyses.

Raffinement

Les souris seront surveillées chaque jour par les soigneurs et/ou les chercheurs pour s’assurer qu’elles ne présentent aucun signe de souffrance. Si un animal montre des signes d’inconfort ou de mal-être, des mesures seront prises rapidement pour le soulager. À la naissance des petits, leur nid sera rendu plus confortable avec l’ajout de coton, en complément des éléments déjà présents dans les cages, comme des tunnels, pour favoriser leur bien-être. Le raffinement spécifique des souris mutées repose sur une anticipation stricte de l’évolution du phénotype dommageable. Aucun animal n’est maintenu au-delà de l’âge auquel des complications graves peuvent survenir (J42=âge plafond). La surveillance est renforcée avec des critères cliniques précoces déclenchant une euthanasie immédiate, garantissant l’absence de souffrance prolongée.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé dans ce projet est une référence reconnue par la communauté scientifique internationale spécialisée dans l’étude des calcifications anormales dans des tissus qui normalement ne sont soumis à ces phénomènes. Actuellement, c’est le seul modèle animal génétiquement modifié qui présente des caractéristiques similaires à celles observées chez les personnes atteintes du syndrome de Keutel. Chez ces souris, les calcifications apparaissent très tôt et évoluent différemment selon les organes. Par exemple, elles commencent dès la première semaine de vie dans les artères et dès la deuxième semaine dans le système respiratoire. Pour bien comprendre comment ces calcifications se développent, l’étude doit débuter avant leur apparition (vers 7 jours de vie) et se poursuivre jusqu’à ce qu’elles soient complètement installées (vers 42 jours). Afin de suivre précisément cette évolution, nous réaliserons des observations quotidiennes tout au long de cette période.

200 cochons, 200 moutons et 60 bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour une nécropsie et une analyse histopathologique. Chaque animal subit une ou deux chirurgies, dont la création d'une lésion nerveuse ou une ligature de vaisseaux, avec jusqu'à douze examens d'imagerie sur six mois, un jeûne de 12 à 16 heures avant chaque anesthésie et des transports de 35 kilomètres entre deux établissements. Le porteur écrit que les nuisances attendues sont exactement les mêmes que celles attendues chez un futur patient humain, et annonce une douleur postopératoire pouvant durer plusieurs jours. Il présente le recours à l'"organisme entier" comme une obligation réglementaire pour valider des dispositifs implantables, et indique que l'effectif a été fixé sans aucune approche statistique.

Objectifs

Le système nerveux central (SNC) est constitué du cerveau et moelle épinière. Le rôle du système nerveux central est d’organiser, de contrôler et de réguler des fonctions essentielles de l’organisme comme la motricité, l’équilibre, la perception (sensibilité, vision, audition, odorat…), les fonctions intellectuelles et cognitives, les émotions, le comportement, ainsi que le fonctionnement de certains organes. Le projet de recherche s’intéresse aux nouvelles approches thérapeutiques et diagnostiques dans le traitement des pathologies du système nerveux central. Par exemple, les études de développement et de faisabilité suivantes rentreront dans le cadre de ce projet (liste non exhaustive) : -Dispositif implanté permettant d’améliorer la biodisponibilité intracérébrale de molécules thérapeutiques -Optimisation de systèmes de neuro-navigation pour localiser et traiter une affection sans endommager les structures attenantes -Dispositifs de libération locale de réactifs visant à traiter une pathologie -Dispositifs visant à enregistrer une activité cérébrale pour comprendre ou évaluer un trouble de la cognition, du développement -Dispositifs visant à mesurer des paramètres biochimiques ou biologiques en intracérébral,... L’objectif est de conduire des études permettant d’évaluer l'efficacité et la sécurité de nouveaux dispositifs médicaux et de nouvelles approches chirurgicales visant à évaluer, restaurer ou modifier les fonctions du cerveau et de la moelle épinière. Ce projet se déroulera dans 2 Etablissements Utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2.

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins de faible volume à des fins de biologie médicale sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. Les fréquences maximales des prélèvements pouvant être d’un prélèvement par jour sur une courte période de quelques jours à une semaine ou d’un prélèvement par semaine jusqu’à 6 mois. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Préalablement aux anesthésies générales, les animaux seront mis à jeun pour une durée de 12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins. - Le nombre maximal d’examens d’imagerie par animal pourra aller jusqu’à 12 sur une période de 6 mois. - Des procédures chirurgicales d'implantation de dispositif cardio-vasculaire avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'implantation de dispositif associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. Les actes chirurgicaux d'implantation de dispositif et/ou d'évaluation de technique chirurgicale avec ou sans réveil seront réalisés dans l'EU 1/2. Le suivi clinique et fonctionnel des animaux après les procédures chirurgicales pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2. Pour les études chroniques, les évaluations finales avec euthanasie pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 24 heures pour les ovins/caprins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type lésion nerveuse, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens d'imagerie, scanners, IRM par exemple), par l'interrogation des dispositifs, et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (anti-inflammatoires non stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées, autorisés par la Direction Départementale de la Protection des Population, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants ( dispositifs d'abreuvement, tapis et revêtements antidérapants, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV). Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - Le système nerveux central du mouton, du bovin et du porc reproduisent fidèlement la physiologie humaine et le processus de cicatrisation est similaire à celui observé chez l'homme. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements de chirurgie interventionnelle et d'imagerie standards utilisés chez l'Homme. - L'ovin est le modèle pertinent pour l'évaluation de la durabilité des dispositifs chez l'Homme. - Le modèle porcin est pertinent pour l'évaluation de la thrombogénicité des dispositifs ainsi que pour évaluer les systèmes d'ancrage des dispositifs. - Le modèle veau est pertinent pour sa taille de ses structures anatomiques (developpement du rachis cervical, thoraciaue et lombaire). Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

Un gavage par jour pendant trente jours, et deux prises de sang sur animal vigile pour une partie d'entre elles: 664 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées d'une tumeur sous anesthésie gazeuse, elles sont toutes mises à mort à l'issue pour analyser les tumeurs et les organes. Le porteur attend des pertes de poids, des diarrhées, une déshydratation et de la fatigue liées aux anticancéreux testés. Le traitement évalué est déjà en essai clinique chez l'humain pour un type de cancer du pancréas, et ce que le projet promet pour la thyroïde et la peau reste des données précliniques destinées à argumenter la faisabilité d'essais, à moyen terme.

Objectifs

Certains types de cancer de la thyroïde, du pancréas et de mélanome ont des similitudes dans leur développement et manquent actuellement de traitements efficaces. Un nouveau traitement a montré son efficacité seul dans ce type de cancer du pancréas. L'objectif est de démontrer l'efficacité de ce traitement en association (bithérapie) avec le traitement conventionnel dans ces types de cancers du pancréas, de la thyroïde et de mélanomes. L'approche expérimentale consiste à administrer ces traitements à des souris développant ces cancers.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent l'amélioration de la santé humaine et sont d'établir des données précliniques robustes d'efficacité pour argumenter la faisabilité d'essais chez l'humain. Les retombés sont attendus à moyen terme. Alors que ce nouveau traitement est en cours d’évaluation clinique en monothérapie dans un certain type de cancer du pancréas, ce projet permettrait d’élargir l’évaluation aux cancers de type similaire mais se développant à partir de la thyroïde et de la peau et d’explorer des schémas thérapeutiques en association.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une seule injection de cellules tumorales sous anesthésie générale gazeuse. Ce geste dure 3 minutes. Les souris pour lesquelles la greffe de cellules tumorales a prise seront soumises vigiles à un gavage pour administrer les traitements anticancéreux une fois par jour pendant 30 jours. Le gavage dure 10 secondes. Une partie des souris du projet (11%) sera soumise à 2 prélèvements sanguins de manière vigile à 1 semaine d'intervalle. La durée du prélèvement sanguin est de 30 secondes, comprenant 1 seconde de ponction, 10 secondes de recueil et 20 secondes d'hémostase par compression.

Impact sur les animaux

-La contention, manipulation et anesthésie gazeuse peuvent induire un stress. -L'injection des cellules tumorales et l'administration des traitements par gavage peuvent engendrer un stress et une douleur légère de courte durée. -Les traitements médicamenteux anticancéreux peuvent induire une perte de poids, une déshydratation, des diarrhées et une fatigue.-Les prélèvements de sang répétés toutes les semaines peuvent occasionner un léger stress et des douleurs légères de quelques secondes.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue du projet car il est nécessaire d'analyser les tumeurs dans leur totalité et les organes pour évaluer l'efficacité et la tolérance du traitement.

Remplacement

Les cultures cellulaires en 2 ou 3 dimensions, les organoïdes et la modélisation in silico (modélisation par calculs informatisés) sont mobilisés en amont pour réduire le nombre d’animaux, mais ils ne permettent pas d’évaluer de façon fiable les réponses antitumorales, la tolérance systémique ou l’optimisation des schémas d’exposition (dose, séquence, intermittence). Dans ce contexte, le modèle in vivo demeure la référence pour obtenir des données prédictives et cliniquement pertinentes sur l’efficacité et la sécurité des traitements testés.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les effectifs seront ajustés à la baisse au mieux pour les procédures principales grâce à des procédures pilotes utilisant un petit nombre de souris. Enfin, la chronologie en cascade des procédures permet de n'en faire certaines que sous condition des résultats trouvés aux premières.

Raffinement

Les souris seront anesthésiées et sur tapis chauffant pour l'injection des cellules ainsi que pour le réveil. Les points limites sont déterminés de manière stricte et selon les recommandations en vigueur. Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour l'étude du développement tumoral. Le modèle utilisé est immunodéprimé ce qui permet d'étudier des lignées cancéreuses humaines. Les souris seront réceptionnées à l'animalerie à 6 semaines pour pouvoir être greffées à 7 semaines. Cet âge est choisi car il reflète la physiologie “adulte jeune” avec un poids et métabolisme déjà stabilisés.

330 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tumeurs. Elles reçoivent une injection de cellules de neuroblastome humain dans le flanc, un traitement dilué dans l'eau de boisson, puis sont manipulées trois fois par semaine pendant 90 jours ou jusqu'à ce que la tumeur atteigne 1 500 mm3. Les cages sont privées de tunnels pour éviter que les tumeurs se blessent contre l'enrichissement, et du glucose est ajouté à l'eau parce que le traitement lui donne un goût désagréable. Les effets de la transformation des cellules cancéreuses en neurones ayant déjà été étudiés en culture, le porteur affirme que l'animal est "absolument nécessaire" et que la pousse tumorale ne peut s'étudier que dans un "organisme complet".

Objectifs

Le neuroblastome est un cancer pédiatrique responsable de 15% de la mortalité infantile liée aux cancers. Diagnostiqué le plus souvent pendant la première année de vie, c’est le premier cancer extra-crânien chez l’enfant. Pour les patients présentant un neuroblastome à haut risque, le taux de survie à 5 ans reste en-dessous de 50%. La compréhension de cette pathologie et le développement de nouvelles thérapies représentent ainsi un enjeu majeur en santé pédiatrique. Des thérapies permettant d’induire la transformation des cellules cancéreuses en neurones fonctionnels et l’arrêt de la multiplication des cellules de neuroblastome, sont employées mais ont une efficacité limitée. Le but du projet est de déterminer les effets d’une différenciation neuronale forcée, c’est-à-dire une transformation des cellules cancéreuses en neurones fonctionnels, dans trois lignées cellulaires humaines de neuroblastome. Ces lignées cellulaires seront implantées dans des souris nous permettant de travailler avec un modèle d’étude complexe et physiologiquement représentatif des différentes situations pathologiques rencontrées chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les effets de la transformation de cellules de neuroblastome (cancéreuses) en neurones fonctionnels ayant déjà été étudiés in vitro, cette nouvelle étude nous permettra d’identifier les effets de la transformation cellulaire dans un contexte/environnement physiologique complet. Il sera ici possible d’étudier les impacts de l’organisme sur le développement des tumeurs, notamment les effets de la vascularisation sur la pousse tumorale. Ce projet nous permettra également de mieux comprendre au niveau moléculaire les mécanismes permettant de transformer une cellule cancéreuse de neuroblastome en neurone fonctionnel qui arrête de se multiplier. Ainsi, ce projet permettra potentiellement de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques en cancérologie pédiatrique.

Procédures

Les animaux seront soumis chacun à une unique injection sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc. Cette intervention se fera sur animaux vigiles, et durera 10 secondes. Les animaux recevront un traitement dilué dans l'eau de boisson pendant toute la durée de l'expérimentation ou bien 4 jours par semaine pour l'une des procédures. Les animaux seront manipulés 3 fois par semaine pour être pesés et pour que la taille des tumeurs soit mesurée (30 secondes par acte) pendant 90 jours ou jusqu’à ce que les tumeurs atteignent 1500 mm3. Les tumeurs seront prélevées en fin d'expérimentation après mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront chacun une unique injection sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc. Cette procédure, bien que très rapide, peut induire du stress à l’animal ainsi qu’une douleur légère. Puisqu’il est attendu que des tumeurs se développent, ces dernières pourraient gêner les animaux dans leurs déplacements. Aussi, les cages ne seront pas enrichies en tunnels afin d’éviter toute blessure au niveau des tumeurs contre l’enrichissement. De plus, la doxycycline acidifie l’eau et apporte un gout désagréable à l’eau de boisson. Selon des tests préliminaires, du glucose est donc ajouté à l’eau de boisson afin d’éviter que les animaux ne cessent de s’hydrater. Pour s’assurer de la consommation d’eau, les biberons seront pesés pendant les phases de traitement. Pour finir, le neuroblastome est une pathologie connue pour son fort potentiel métastatique chez les patients, en particulier dans la moelle osseuse et le foie. Dans nos conditions d’expérimentation, nous ne savons pas si des greffes auront ce potentiel métastatique et nous serons donc particulièrement attentifs à l’état général des animaux (respiration normale, posture, comportement, yeux plissés).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs pour des analyses au laboratoire.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la capacité à former des tumeurs et d’étudier la prolifération dans un contexte de transdifférenciation. Ces travaux ayant déjà été menés en in vitro sur des cultures monocouches, il est maintenant nécessaire de travailler avec un modèle intégré représentatif du contexte pathologique observé chez les patients humains. L’animal est absolument nécessaire pour son côté physiologique intégratif et l’étude de pousse tumorale ne peut s’effectuer que dans un organisme complet, prenant en compte l’influence de la physiologie de l’animal et du microenvironnement.

Réduction

Les expérimentations de greffes de ces lignées cellulaires étant peu décrites dans la littérature, nous devons tester plusieurs souches murines immunodéficientes pour rechercher le modèle présentant la meilleure efficacité de prise en greffe. Nous grefferons les 3 lignées cellulaires dans 3 modèles murins et nous choisirons le modèle murin qui montre la meilleure efficacité de prise en greffe pour chaque lignée cellulaire. Le nombre d’animaux requis a été calculé grâce à un logiciel de tests statistiques, permettant de déterminer le nombre d’animaux suffisant afin d ‘obtenir des résultats statistiques significatifs.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, ceux-ci seront habitués à être manipulé (contention) pendant une semaine entre la semaine d’acclimatation à l’animalerie et le début de la procédure expérimentale. L‘implantation des cellules de lignées cancéreuses impliquant le développement tumoral, un suivi de poids des souris ainsi que de volume des tumeurs sera réalisé trois fois par semaine. Des points limites qui auront pour effet l’arrêt de la procédure ont été déterminés. Pour faciliter et uniformiser le suivi des animaux, une grille de calcul des points limites sera utilisée.

Choix des espèces

Les modèles de greffes de cellules humaines cancéreuses sur souris sont déjà bien établis et caractérisés et dans le cadre de nos travaux, nous avons besoin de souris immunodéficientes afin de permettre la prise en greffes de cellules humaines dans la souris. L’immunodéficience des animaux permet d’éviter le rejet des greffes. Les lignées cellulaires humaines seront greffées dans trois souches de souris arborant des systèmes immunitaires plus ou moins affaiblis voir absent.

2 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant un allergène sur les oreilles trois à cinq fois par semaine, sous anesthésie générale de trente à quarante-cinq minutes. L'épaisseur de leurs oreilles est mesurée cinq fois par semaine pendant quatre semaines, sous anesthésie gazeuse à chaque mesure. Toutes sont mises à mort pour prélever la peau des oreilles et les ganglions. Le porteur classe les effets attendus comme une inflammation légère pouvant induire un grattage léger, et prévoit la mise à mort immédiate des souris qui se grattent jusqu'à se blesser.

Objectifs

Ce projet s’intéresse aux mécanismes qui expliquent les maladies allergiques de la peau, en particulier la dermatite atopique (ou eczéma atopique). Cette maladie inflammatoire, fréquente dans les pays industrialisés, évolue par périodes de crises entrecoupées d’accalmies. Elle est liée à un mauvais fonctionnement du système immunitaire, qui réagit de manière excessive à des éléments pourtant banals de notre environnement. Les lésions cutanées apparaissent notamment parce que certaines cellules immunitaires, les lymphocytes T, sont attirées et activées dans la peau. Ces cellules perturbent la barrière naturelle de la peau et libèrent des substances inflammatoires (appelées cytokines) qui aggravent l’inflammation, favorisent les démangeaisons et réduisent les défenses antimicrobiennes de la peau. Le grattage exercé entretient ce cercle vicieux. Des travaux ont montré que, après une poussée, une partie de ces lymphocytes T se transforment en cellules « mémoires » qui restent durablement dans la peau, sur les zones déjà touchées. Ces cellules jouent un rôle clé dans les rechutes et expliquent la sévérité et le caractère chronique de la maladie. Les traitements actuels, comme les corticoïdes locaux, calment bien l’inflammation, mais n’empêchent pas la formation ni la persistance de ces cellules mémoires. Cela explique pourquoi ils ne permettent pas d’éviter les rechutes à long terme. L’objectif de ce projet est double : 1) Mieux comprendre comment ces cellules mémoires se forment et se maintiennent dans la peau. 2) Développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces cellules, afin de mieux contrôler l’évolution et la chronicité de la dermatite atopique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de la dermatite atopique, en particulier le rôle des cellules mémoires de l’immunité. Nous chercherons à préciser l’action de certaines molécules clés (messagers inflammatoires, récepteurs présents à la surface des cellules et régulateurs de l’activité des gènes) qui influencent le cycle de vie de ces cellules. Ces travaux pourront aussi servir de preuve de concept : ils montreront l’intérêt de cibler spécifiquement ces protéines des cellules mémoires pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. L'objectif à long terme étant de trouver des cibles thérapeutiques potentielles, laissant place au développement d'un traitement empêchant les récidives.

Procédures

400 animaux recevront une application sur la peau d'un produit allergisant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les animaux recevront des applications du même produit sur leurs oreilles (3 fois /semaine pendant 1 semaine), afin d'induire une réaction allergique chronique (inflammation). En fonction des groupes d'animaux (1440 animaux recevant une application d'un produit), ils recevront soit le produit décrit précédemment soit deux autres produits possibles (qui ne nécessitent pas de rasage préalable ni d'application sur le ventre) qui leur seront appliqués séparément sur leurs oreilles (3 fois / semaine pendant 2 semaines ; 5 fois / semaine pendant 1 semaine et demi). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 30 à 45 min (3 ; 6 ; 8 injections au maximum sur toute la durée du protocole) . Les animaux pourront également être injectés (4 injections suplémentaires au total) avec un produit permettant d'induire sélectivement la suppression de cellules cibles. Ce traitement sera réalisé sur animal endormi par injection du produit (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 4 semaines, afin de suivre de manière quantitative l'inflammation (l'augmentation de l'épaisseur des oreilles étant un des signes de l'inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés (durée de l'anesthésie gazeuse : 30secondes) afin d'éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur ou inflammation au point d’injection et un stress généré lors des injections ; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou l'application de l'allergène sur la peau ; iii) une légère inflammation (pouvant induire un grattage léger) au niveau des oreilles ou du ventre, après application de l'allergène ; iv) certains des animaux ont un sytème immunitaire réduit qui dans la nature leur serait défavorable, mais cela n'aura pas de répercution dans ce protocole car elles évolueront dans un milieu controlé et protégé.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leurs peaux (oreilles) et leurs ganglions. Ces différents organes sont ensuite utilisés pour analyser la réponse immunitaire et histologique.

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de reproduire de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. En effet, les cellules que nous étudions dans ce projet sont des cellules qui initialement circulent dans le sang et qui migrent dans la peau suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal. Egalement, il nous est impossible de constituer une étude avec des participants naïfs (biopsie sur la première lésion de dermatite atopique sans traitements antérieurs). En effet, l'ensemble des patients venant se faire traiter à l'hôpital ont déjà reçus des traitements, ce qui fausserait complètement l'analyse et l'interprétation de nos résultats.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. En effet, les expériences d'induction de poussée d'eczéma génèrent classiquement des réponses d'intensité variable chez les animaux, aussi, un minimum de 10 animaux par groupe expérimental est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Les animaux ne réagissant pas ou peu à l'induction de poussée d'eczéma seront tout de même gardés dans l'étude et les statistiques. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. En effet, le nombre d’animaux utilisés pourra diminuer en fonction des résultats obtenus. Tout comme les 5 points de temps qui pourront être réduits si aucun résultats n'est sorti du précédent point de temps.

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, nous réaliserons une observation clinique des animaux 5 fois par semaine. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés (anesthésie générale ou locale) pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non mais egalement pour éviter un risque de propagation de l'allergène qui pourrait entrainer des lésions d'eczema sur les pattes ou la face. Afin de limiter la douleur liée aux injections répétées, les souris seront injectées alternativement à gauche et à droite. Lors des injections, nous veillerons consciencieusement à ne pas toucher les mamelles des souris afin de ne pas les blesser. Dès lors, les animaux présentant des signes de grattage excessif allant jusqu'à entrainer l'apparition de plaies seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les maladies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes . Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de facteurs impliqués dans l'inflammation ou l'induction de populations spécifiques mémoires. Nous utiliserons des animaux adultes de 6 semaines à 8 mois car ces animaux possédent un système immunitaire complètement mature. Nous avons choisi d'inclure des animaux de tous âges afin d’utiliser au mieux les animaux transgéniques qui seront disponibles et parce que nous savons, grâce à des expériences antérieures, que la réponse attendus chez des souris de 8 mois est comparable à celle observée chez des animaux plus jeunes. Au maximum, certains animaux seront gardés jusqu'à 1 an après guérison.